Name: 의 장기 강한 적응의 분자 판독 C. elegans (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 배우세요 C. elegans에서 GFP::EGL-4를 이용한 장기 후각 적응의 분자 판독법을. AWC 감각 신경원에서 GFP 표지된 단백질 키나아제 G의 핵 이동을 시각화하여 적응 상태를 신속하게 평가하고 유전자 스크리닝을 가능하게 합니다.

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우리는이 원고의주의 읽기에 대한 스콧 해밀턴과 O&#39;Halloran 연구실의 구성원을 감사드립니다. 우리는 또한 우수한 제안과 통찰력 의견을 익명 리뷰어를 감사합니다.

1. GFP의 건설 EGL-4 표현 동물 태그 <ol><li> odr-3 유전자 (직접 상류 시작 코돈의 사용 2,678 BP)를위한 발기인 아래 병진 융합 GFP :: EGL-4를 복제 (P) odr-3 :: GFP :: EGL-4. odr-3 프로모터 드라이브 amphid 뉴런 쌍 표현 : AWA, AWB, AWC, 그리고 약하게 ASH 인치 </li><li> (P) ofm-1 : 플라스미드 (P) odr-3 :: GFP :: 50 wildtype (N2) 동물에 EGL-4 표준 세균 라인 변환 기술 8을 사용 공동 분사 마커와 μl / NG를 삽입 : : GFP 9 일 (μl / 25 NG) 및 (P) odr-1 :: dsRed 10 (25 NG / μl). AWC 및 AWB amphid 뉴런 쌍의 odr-1 프로모터 드라이브 표현하고 coelomocytes의 ofm-1 프로모터 드라이브 표현. </li><li> 울트라 바이올렛 (UV) / trimethylpsoralen (TMP) 통합 프로토콜 단계 1.2에 설명 된 extrachromosomal 배열을 표현 형질 전환 동물을 대상11. </li><li> 블리치는 동물 12 동기화하고 OP50 E.를 포함하는 선충류 성장 미디어 (NGM) 접시에 올려 배양 L4 단계에 대장균. OP50 E.를 제거하는 M9 버퍼로 NGM 플레이트에서 L4 동물을 씻어 대장균 박테리아. </li><li> M9 버퍼를 제거하고 30 μg / 1.5 ML의 microcentrifuge 관 웜 펠렛로 ML의 TMP 작업 솔루션의 50-100 μl를 추가합니다. 주변 빛을 차단하고, 호일로 싼 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 15 분 동안 회전하는 것에 부드럽게 활발히 논의하기 위해 호일에 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 넣어. 큰 unseeded NGM 판에 TMP / 웜 솔루션에 웜을 전송합니다. </li><li> Stratalinker 2400을 사용하여 UV 350 μJ (X100)에 NGM 접시에 웜을 쉽게받을 수 있습니다. 그런 다음 OP50 포함 NGM 플레이트에 웜을 추가로 5 시간 동안 짙은 어둠 속 품다. </li><li> 약 10 시드 플레이트 (2-5 웜 각 판) 50 유전자 변형 웜을 선택합니다. 전송 P0 새로운 판에 3 일 동안은 24 시간입니다. </li><li> 250 clonal F1을 선택nimals (판 당 1 동물). 각 F1 판 2-4 F2 동물을 복제. ofm-1 (P)에서 :: 해부 형광 현미경으로 GFP 표현 패턴을 보면 100 % 전송 라인을 찾아 F3 동물을 확인합니다. </li><li> Outcross wildtype의 N2 동물과의 최종 통합 라인 (들) 5 회. 우리는 pyIs500으로 최종 통합 라인을 참조하고, GFP 등 GFP 태그 EGL-4 분자 :: EGL-4입니다. </li></ol> 2. 원자력 Translocation의 Assays을위한 재배와 동물의 유지 보수 <ol><li> 25 pyIs500 동물을 육성 ° OP50 E. 스탠다드 10cm NGM 플레이트에 C (제조법은 아래를 참조) 시드 대장균 박테리아 13 일 (그림 1). </li><li> 1 일에서 5 개의 10cm OP50 E.에 25 재배 플레이트 4-5 L4 pyIs500 동물 ° C를 선택 대장균은 25 접시 배양을 놓는 ° C (그 판 당 4-5 L4 동물입니다.) </li><li> 4 일에서 성인 P를 씻어S-자연적으로 흐르는 것과 버퍼를 사용하여 대형 NGM 플레이트에서 pyIs500 동물의 opulations (제조법은 아래를 참조). 그들은 플라스틱 피펫 팁의 측면에 집중하므로, 동물을 전송하는 일회용 유리 피펫을 사용합니다. </li></ol> 3. 장기 냄새 유발 원자력 Translocation의 Assays <ol><li> pyIs500 동물에게 세균을 제거 할 S-자연적으로 흐르는 것과 3 번 씻으십시오. 세차 사이에 동물을 원심 분리기하지 마십시오 아니라 동물 고정 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 중력에 의해 정착 할 수 있습니다. 다 박테리아가 제거되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다, 그 NGM의 pates는 잔여 박테리아가 부정적인 translocation 분석의 결과에 영향을 미칠 것이기 때문에, 오염에서 무료입니다. 또한, 우리는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를 autoclaving하는 측면에 집중하기 위해 동물을 일으키는 등 비 autoclaved 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를 사용하는 관의 내부 벽에 &quot;끈적&quot;재산을 생산하는 것으로 확인되었습니다. </li><li> 동물이 세차 사이에 정착하고 있지만, t를 구성하는그는 적응 솔루션을. 100 ML의 졸업생 실린더에 S-자연적으로 흐르는 것과 버퍼의 100 ML을 추가합니다. S-자연적으로 흐르는 것과에게 냄새를 적응 추가 Parafilm의 스트립을 사용하여 실린더를 밀봉. butanone 적응이 S-자연적으로 흐르는 것과 100 ML에 2 butaone 11 μl를 추가에 대한 benzaldehyde 적응은, S-자연적으로 흐르는 것과 100 ML에 benzaldehyde의 7.5 μl를 추가합니다. 수행하는 경우 부드럽게 (흔들하지 않음)이 포함 된 졸업 실린더가 S-자연적으로 흐르는 것과과 냄새 30 회 균일 한 에멀젼을 만드는 반전. </li><li> S-자연적으로 흐르는 것과의 마지막 세척 후, 동물이 모든 액체를 해결하고 제거 할 수 있습니다. 라벨 한 튜브 &quot;+ VE&quot;또는 &quot;적응&quot;과 다른 튜브 &quot;VE&quot;또는 &quot;unadapt&quot;. 그런 다음 적응 microcentrifuge 튜브 (+ VE)에 적응 믹스 1 ML을 추가하고 unadapted 제어 microcentrifuge 관 (-VE)에 S-자연적으로 흐르는 것과 1 ML를 추가합니다. 각 튜브에 100와 200 사이의 동물의 숫자를 유지하려고합니다. 연습으로, 그것은 눈으로 펠릿에 동물의 대략적인 수를 추정 할 수 있습니다. </li><li> 1.5 ML microcentrifuge 튜브 캡 보호를 삽입각 튜브 (터지는 오픈에서 뚜껑을 방지)와 80 분의 회선 근에 튜브를 삽입합니다. 우리는 60 분 및 80 분 사이의 냄새에 노출 비슷한 결과를 (장기 적응 응답에서 두 결과) 산출 것으로 나타났습니다. 그러나, 80 분 노출 우리 손에 더 일관된 결과를 제공합니다. 따라서 우리의 모든 장기 적응 assays는 80 분 냄새에 노출 (그림 2)를 사용하여 표준화합니다. </li><li> 80 분 후, S-자연적으로 흐르는 것과의 동물에게 3 번 씻는다. 동물이 각 빨래 사이에 중력에 의해 해결 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 단기 냄새 유발 원자력 Translocation의 Assays <ol><li> 단기 냄새 적응의 경우, 그러나 대신 80 분에 냄새를 적응 pyIs500 동물 잠복기 때문에, 30 분 노출을 사용하여 당 장기 냄새 유발 translocation의 assays (단계 3.1-3.4)와 같은 프로토콜을 사용 . 아래에 설명 된 악취 유발 핵 translocation의 assays의 정량화은 (5 단계) 장기 및 단기 적이에 대해 동일합니다m 노출. </li></ol> 5. 냄새 유발 원자력 Translocation 이벤트 점수를 <ol><li> DH 2 0에서 젤 전기 영동 아가로 오스를 용해하여 5 MM 나트륨 azide (할머니 3) 포함 2% 아가로 오스 패드를 확인합니다. 유리 현미경 슬라이드에 낸 세를 포함하는 용융 아가로 오스의 한 방울을 넣으십시오. 즉시 용융 아가로 오스의 드롭을 평평하게하는 최초의 슬라이드에 다른 유리 현미경 슬라이드를 놓습니다. 30 초에두고 부드럽게 현미경은 ~ 1 mm의 평면 아가로 오스 패드와 하나 현미경 슬라이드를두고 슬라이드 떨어져 애타게. </li><li> S-자연적으로 흐르는 것과의 마지막 세척 후, 웜은 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 정착하고 모든 액체를 제거 할 수 있습니다. 그런 다음 몇 가지 현미경 슬라이드의 아가로 오스 패드로 드롭 현명한 동물을 추가합니다. 이 50과 100 사이에 슬라이드 당 동물의 번호를 유지하는 것이 중요합니다. 슬라이드 당 너무 많은 동물이 골을 복잡하고 종종 푸른 빛이 여기 뒤에 산란 빛이 생성됩니다. 초과 액체가 수도김 부 작은을 사용하여 아가로 오스 패드에서 악한합니다. 패드에 0.5 mm의 유리 커버 슬립을 놓고 동물을 고정하는 할머니 3 수 있도록 2 분에 서 보자. 참고 동물 채점 후 슬라이드에서 복구 할 수 있습니다. M9 버퍼 한 방울로 시드 NGM 플레이트로 전송하면 동물 ~ 1 시간 후 할머니 3 마취에서 회복됩니다. </li><li> 이 시점에서는 각 실험은 슬라이드 실험 (+ VE) 슬라이드하고있는 슬라이드 (-VE) 슬라이드 컨트롤입니다 추적 할 키를 고안하고, 맹목적으로 GFP를 점수를 다른 사람에게 슬라이드를 통과 필수적입니다 : EGL-4 현지화 패턴. 이 모든 실험 바이어스에 대해 적용됩니다. </li><li> , 10X 40X 63X 배율과 목표 및 GFP / RFP 필터를 수직 형광 현미경을 사용하여 슬라이드 당 50과 100 동물 사이의 점수. 첫째, 밝은 분야 조명을 사용하는 10X 배율에 따라 동물을 찾습니다. 둘째, brigh를 해제하여 AWC 뉴런을 찾습니다t-필드 조명 및 RFP 필터를 사용합니다. AWB 및 AWC 뉴런의 (P) odr-1 :: dsRed 드라이브는 표현. 모양의 작고 원형 아르 AWB 셀 기관 (그림 2)와 비교 AWC 뉴런은 독특한 타원형 모양의 세포 기관을 갖추고 있습니다. </li><li> AWC 전지 본체가 위치한되면, GFP 필터로 전환 GFP의 지역화 기록 : 핵이나 세포질로 EGL-4. 카운터를 사용하면 실험이 슬라이드를 골면서 접안 렌즈로 계속 찾고 있습니다. 참고 : 단계 5.1-5.5는 통계적으로 의미가있는 데이터 (그림 1-2) 생산 별도의 일에 최소 3 번 반복됩니다. </li></ol> 6. 장기 냄새 적응에서 복구하는 동안 EGL-4 GFP 태그 모니터링 <ol><li> 단계 3.5 이후 시간 포인트 제로에서 AWC의 여러 aliquots과 핵 대 세포질 GFP에 대한 점수 :: EGL-4에 pyIs500 동물의 인구를 분할 (즉 80 분 노출 후) 및 multiple 이후의 시간 점 (그림 3). </li><li> NGM 접시에 일회용 유리 피펫을 사용하여 컨트롤 (-VE) 및 실험 (+ VE) 동물을 모두 전송합니다. </li><li> 동물이 시간의 다양한 길이에 복구 할 수 있도록 각 시점에서 GFP :: EGL-4in AWC의 재검토 현지화 5.1 5.5 단계에 있습니다. </li></ol> 7. 자료 NGM 번호판 :; 3g의 나트륨 염화물 (NaCl) 2.5 g Bacto-펩톤 21g Bacto-한천 : 1 L에 대해 1 L ddH 2 0에 추가 할 수 있습니다. 압력솥 미디어. 온도는 54 ° C.를 읽고 autoclaving, 멋진 한천이 끝날 때까지 , 1 ML 1 M의 황산 마그네슘 (MgSO 4), 1 ML 1 M의 염화칼슘 (CaCl 2), 에탄올 1 ML의 콜레스테롤 (5 MG / ML 주식) 25 ML 1M 칼륨 인산 버퍼 다음 솔루션을 추가합니다. 1 M 이염 기성 K 2 HPO 4 174.2 g / 몰 : 500 ML를 들어 : 400 ML ddH 2 O에 용해 87.1 g DibasiC K 2 HPO 4. ddH 2 O. 500 L에 볼륨 조절 500 ML 무균 필터 유닛을 사용하여 소독 필터링 할 수 있습니다. 1 M 일 염기의 KH 2 PO 4 136.1 g / 몰 : 1 L의 경우 : 800 ML ddH 2 O에서 136.1 g 일 염기의 KH 2 PO 4 분해. ddH 2 O. 1 개 L로 볼륨을 조정 500 ML 무균 필터 유닛을 사용하여 소독 필터링 할 수 있습니다. 1 M의 칼륨 인산 (K 3 PO 4) 버퍼 산도 6.0 : 1 L의 경우 : 1 L 무균 필터 유닛에서 1 M 일 염기의 KH 2 PO 4 868 ML를 추가합니다. 단위를 통해 필터링 할 수 있습니다 다음, 1 M 이염 기성 K 2 HPO 4 132 ML를 추가합니다. 장치가 모든 액체를 필터링 할 수 있습니다. 필터 장치를 제거하고 6.0 산도를 조정합니다. 실온에서 보관하십시오. S-자연적으로 흐르는 것과 : 1 L의 경우 : 50 ML 100 K 3 PO 4 버퍼를 추가 산도 ~ 6.0; 20 ML 5M NaCl AQ. 1 개 L에 기입ddH 2 O. 솔루션을 압력솥. M9 : 3g KH 2 PO 4, 6g 오세영 2 HPO 4, 5g NaCl, 1 ML 1 M MgSO 4, H 2 O. : 1 L의 경우 ddH 2 0 1 개 L로 입력합니다. autoclaving하여 소독.

<ol><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803(1995).</li>
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</ol>

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GFP 태그 EGL-4 분자의 냄새 유발 핵 항목은 여기에 설명하는 것은 C.에서 후각 적응의 강력한 분자 기록을 제공합니다 elegans. 냄새 유발 핵 translocation의 assays은 간단하고 준비 시간을 몇 일을해야합니다. 우리가이 assays에 건설 한 pyIs500 동물은 AWC 신경 세포뿐만 아니라 GFP 태그 EGL-4 단백질을 표현을 비춰 마커를 표현합니다. 따라서, 우리는 뉴런의 클래스로 작업없이 경험이 거의있는 실험이 매우 빠르게합니다 (아마도 몇 다스의 동물을 검토 한 후) 핵 대 세포질 EGL-4에 대한 올바른 전지 및 채점을 식별 편안하게 할 수 있음을 느낀다. 독자는 C로 GFP 분석을 설명 기사 835를 목성을 참조하는 것이 유용 할 수 있습니다 elegans 15. 생성 된 데이터는 최고 품질의 것을 보장하기 위해 우리는 다...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Bacto 한천 </td><td> Difco </td><td> DF0140 - 07-4 </td><td> NGM 플레이트 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 피셔 화학 </td><td> S671-10 </td><td> NGM 플레이트 </td></tr><tr><td> Bacto 펩톤 </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> NGM 플레이트 </td></tr><tr><td> 이염 기성 인산 칼륨 </td><td> 피셔 화학 </td><td> S375-500 </td><td> S-자연적으로 흐르는 것과 버퍼와 NGM 플레이트 </td></tr><tr><td> 인산 칼륨 일 염기의 </td><td> 피셔 화학 </td><td> P285-500 </td><td> S-자연적으로 흐르는 것과 버퍼와 NGM 플레이트 </td></tr><tr><td> Kimwipes - 작은 </td><td> 킴벌리 - 클락 </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 백퍼센트 </td><td> 골드 방패 화학(주) </td><td> 43196-115 </td><td> chemotaxis assays를위한 diluting 냄새 </td></tr><tr><td> 칼슘 염화물 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C8106-500G </td><td> NGM 플레이트 </td></tr><tr><td> 마그네슘 황산염 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 150136-500G </td><td> NGM 플레이트 </td></tr><tr><td> 나트륨 Azide 99% </td><td> 피셔 과학 </td><td> ICN10289180 </td><td> 마취제 </td></tr><tr><td> 아가로 오스 - UltraPure </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> 아가로 오스 패드 </td></tr><tr><td> Benzaldehyde </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> B1334-100G </td><td> AWC 냄새 </td></tr><tr><td> Butanone, ACS 학년 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 360473-500ML </td><td> AWC 냄새 </td></tr><tr><td> Microcentrifuge 튜브 - 1.5 ML 컬러 </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> 파스퇴르 Pipet 일회용 유리 5-3/4 &quot; </td><td> 피셔 과학 </tD&gt; <td> 13-678 - 20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> UV 통합 </td></tr><tr><td> 필터 진공 병 - 500 ML </td><td> Nalgene </td><td> 09-740 - 25B </td><td></td></tr></tbody></table>

의 장기 강한 적응의 분자 판독<em&gt; c. elegans</em

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

지속적인 자극하는 동안 대부분의 감각 뉴런은 신호의 감도를 감소하여 반응을 적응합니다. 적응 반응은 모양의주의를 할 수 있으며, 오버 자극 세포를 보호합니다. C.의 후각 회로에 적응 elegans 먼저 콜버트와 Bargmann 1,2에 의해 설명되었다. 여기에서 저자들은 Amphid 윙 셀 타입 C (AWC) 감각 뉴런에 의해 감지 휘발성 냄새에 적응하는 능력에 돌연변이가 결함 분리하는 유전자 화면을 설계하는 데 사용되는 후각 적응 패러다임의 매개 변수를 정의. 때 wildtype C. elegans 동물들은 냄새로 자신의 응답을 수정합니다 30 분에 매력적인 AWC - 감지 냄새 셋에 노출 된 후 ~ 1 시간의 chemotaxis 행동 분석에 적응 냄새를 무시합니다. 때 wildtype C. elegans 동물들은 후 AC에 적응 냄새를 무시합니다 ~ 1 시간을위한 매력적인 AWC - 감지 냄새에 노출되어~ 3 시간에 hemotaxis 행동 분석. C.의 후각 적응의 두 단계 elegans는 단기 후각 적응 (30 분 냄새에 노출 후 유도), 그리고 장기 후각 적응 (60 분 냄새에 노출 후 유도)로 설명했다. 나중에 L&#39; Etoile의 외.에서 일, 4 AWC 뉴런의 단기 및 장기 후각 적응 모두 필요합니다 EGL-4라는 단백질 키나제 G (PKG)을 발견. EGL-4 단백질은 장기 후각 적응 반응하지만 AWC 4 단기 후각 적응 응답을위한 소모품에 필요한 핵 현지화 과정이 포함되어 있습니다. 녹색 형광 단백질과 태그 EGL-4함으로써, 장시간 냄새에 노출시 AWC의 EGL-4의 현지화를 시각화 할 수했습니다. 이 모든 기능을 사용하여 우리가 AWC 5 장기 후각 적응의 분자 표시 장치를 개발 할 수 있었던 EGL-4 (GFP :: EGL-4) 분자 GFP를 태그. 이 m을 사용하여후각 적응의 olecular 판독 우리는 AWC 6,7에서 GFP의 결함이 subcellular 지방화 패턴 :: EGL-4을 전시 돌연변이 동물을 식별하는 모두 순방향 및 역방향 유전 화면을 수행 할 수있었습니다. 여기 설명 : GFP 1) 건설 :: EGL-4 표현 동물, 2) 장기 냄새 유발 핵 translocation의 assays를위한 동물의 재배를위한 프로토콜 및 장기적인 악취 유발 3) 채점 핵 translocation 이벤트와 핵 GFP :: EGL-4 상태에서 복구 (재 sensitization).

AWC 전, 연장 냄새에 노출 후 GFP :: EGL-4in의 지역화 패턴의 예는 그림 2에 표시됩니다. 장시간 악취 노출, GFP :: EGL-4 이전은 AWC (그림 2B)의 세포 기질에 지역화하고 있으며, 80 분 냄새 노출 GFP 후 :: EGL-4는 AWC (그림 2D)의 핵에 번역되어 있습니다. 행동 수준에서 cytosolic GFP :: EGL-4 AWC에있는 동물은 냄새의 포인트 소스 (- chemotaxis 지수 3 가까운 1 되오니, 이용에 참고하여 그림 2C는 unadapted 동물의 chemotaxis assays의 대표 결과를 그래프)에 매료됩니다. AWC에 핵 GFP :: EGL-4을 전시 동물은 적응 냄새 (- chemotaxis 지수는 제로에 가까운 되오니, 이용에 참고하여 적응 동물의 chemotaxis assays에서 그림 2E 그래프</st...

여기에 장기 후각 적응의 분자 기록을 설명<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. 단백질은 키나제 G, EGL-4는, AWC라는 기본 감각 뉴런 쌍의 안정적인 적응 응답이 필요합니다. 세포 기질의 AWC의 핵에 장시간 냄새에 노출 EGL-4 translocates 동안.

의 장기 강한 적응의 분자 판독<em&gt; C. elegans</em

지속적인 자극이 주어지는 동안 대부분의 감각 뉴런은 신호에 대한 민감도를 낮춤으로써 반응을 적응시킵니다. 이러한 적응 반응은 ...

이 영상의 전반적인 목적은 동물의 적응 상태를 나타내는 예쁜꼬마선충(sea elgan)의 장기 후각 적응에 대한 분자적 판독법의 개발 및 구현을 상세히 설명하는 것입니다. 이는 egg L four라고 불리는 단백질 키나아제 G에 녹색 형광 단백질 분자를 태깅하고, 이 융합 단백질을 amphi wing 세포 타입 C 또는 A WC 뉴런에서 발현시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, A WC 뉴런에서 GFP가 태깅된 egg L four 형태를 발현하는 동물들을 박테리아 먹이원인 OP 50이 포함된 선충 성장 배지 플레이트에서 배양합니다. 그다음 4일 후에, 배양 플레이트에서 동물 집단을 씻어내고 장기 후각 적응을 촉진하기 위해 A WC가 감지하는 냄새에 80분 동안 노출시킵니다.결과는 적응된 동물의 AWC에서는 GFP가 태그된 ALE4가 핵에 국소화되는 반면, 적응되지 않은 대조군 동물의 AWC에서는 GFP가 태그된 ALE4가 세포질에 위치함을 보여줍니다. 두 가지 녹색 형광 단백질을 통해 ALE4의 기능적 복제본을 생성함으로써, 우리는 AWC 내 ALE4의 세포 내 국소화를 추적하고 GFP 국소화에 기반하여 동물의 행동 상태를 설명할 수 있습니다. 이 분자 도구를 통해 지속적인 신경 자극 이후 세포 출력을 형성하는 다양한 돌연변이체 또는 처치의 역할을 신속하게 조사할 수 있습니다.본 프로토콜은 이 비디오에 동반된 서면 절차에 설명된 대로 GFP가 태그된 egg L four를 발현하는 동물을 제작하는 것으로 시작합니다. 최종 통합 라인은 IS 500으로, GFP가 태그된 egg L four 분자는 GFP egg L four로 지칭합니다. IS 500 동물을 OP 50 E coli 박테리아가 도말된 표준 10 centimeter NGM 플레이트 위에서 25 °C로 배양하십시오. 1일 차에, 픽(pick)이라 불리는 작은 백금선을 사용하여 25 °C에서 배양된 플레이트로부터 larval stage four 단계의 IS 500 동물 4~5마리를 걷어내어 OP 50 E coli가 도말된 10 centimeter 플레이트로 옮기십시오.이 과정을 추가로 4개의 플레이트에 반복합니다. 4일 차에 플레이트를 25 °C에서 배양합니다. 대형 NGM 플레이트에 basal buffer를 추가하고 부드럽게 회전시켜 IS 500 성체 개체군을 세척하여 회수합니다.이렇게 하면 동물들이 플레이트 표면에서 떨어져 버퍼 용액으로 이동합니다. 일회용 유리 피펫을 사용하여 플레이트에서 동물들을 흡입한 후 1.5 milliliter 에펜도르프 튜브로 옮깁니다. 세균을 제거하기 위해 500마리의 동물을 s basil로 세척하여 전위 분석(translocation assays)을 시작하십시오. 이때 원심 분리를 하지 마십시오.세척 단계 사이의 동물 처리 방법입니다. 동물들이 정지된 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브 내에서 중력에 의해 가라앉도록 둡니다. 잔류 박테리아는 전이 분석(translocation assay) 결과에 부정적인 영향을 미치므로, 모든 박테리아가 완전히 제거되고 NGM 플레이트에 오염이 없음을 확인하는 것이 매우 중요합니다.S basil로 세척 과정을 두 번 반복합니다. 100 mL 메스실린더에 S basil 버퍼 100 milliliters를 넣어 적응 용액을 조제합니다. 알데하이드 적응을 수행하는 경우, 100 milliliters의 ESP basil에 알데하이드 7.5 microliters를 추가하고 파라필름 조각을 사용하여 실린더를 밀봉합니다.바질과 향료가 들어 있는 메스실린더를 부드럽게 30회 반전 혼합합니다. 균일한 유탁액을 만들기 위해, 각 튜브당 개체 수를 100마리에서 200마리 사이로 유지하며 개체들을 각 튜브에 나누어 넣습니다. 어느 정도 숙달되면, 개체들이 가라앉은 후 육안으로 팔레트 내의 대략적인 개체 수를 추정할 수 있습니다.S. basil 세척 후, epi orph 튜브의 모든 액체를 제거하고 새 튜브 하나에는 양성(positive)으로, 다른 새 튜브에는 음성(negative)으로 라벨을 붙입니다. 그 다음, 양성 적응 마이크로 원심분리 튜브에 적응 혼합물 1 mL를 첨가하고, 음성 비적응 대조군 마이크로 원심분리 튜브에는 S. basil 1 mL를 첨가합니다. 각 튜브에 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브 캡 보호기를 씌운 후, 튜브를 로테이터에 놓고 80분 동안 회전시킵니다.80분 후, S basil로 동물을 3회 세척하며, 각 세척 단계 사이에 중력에 의해 동물이 가라앉도록 합니다. 겔 전기영동 aros를 증류수에 녹여 5 mM sodium azide가 포함된 2%aros 패드를 만듭니다. 유리 현미경 슬라이드 위에 sodium azide가 포함된 mol 및 aros 한 방울을 떨어뜨린 후, 즉시 다른 유리 현미경 슬라이드를 첫 번째 슬라이드 위에 덮어 녹은 agros 방울을 평평하게 펴줍니다.30초 동안 그대로 둔 후 현미경 슬라이드를 조심스럽게 떼어내어, 약 1mm 두께의 평평한 aros 패드가 부착된 슬라이드 한 장만 남깁니다. 이 시점에서 각 실험자는 어떤 슬라이드가 양성 실험군이고 어떤 슬라이드가 음성 대조군인지 추적할 수 있는 식별 방법을 반드시 마련해야 합니다. 그다음, 마지막 세척 단계에서 벌레들이 가라앉으면 모든 액체를 제거하고, 여러 장의 현미경 슬라이드에 있는 aros 패드 위에 동물들을 한 방울씩 떨어뜨려 추가합니다.슬라이드당 동물 수를 50에서 100마리 사이로 유지하는 것이 중요합니다. 슬라이드당 동물 수가 너무 많으면 점수 산출이 복잡해지고 종종 산란광이 발생할 수 있습니다. 청색광 여기 후, 작은 킴와이프(kim wipe)를 사용하여 aros 패드의 과잉 액체를 흡수시켜 제거할 수 있습니다.0.5 millimeter 유리 커버슬립을 패드 위에 놓고, sodium azide가 동물을 고정시킬 수 있도록 2분 동안 그대로 둡니다. 다음으로, GFP egg L 4 국소화 패턴을 맹검법(blindly)으로 점수화할 다른 사람에게 슬라이드를 전달합니다. 이는 실험적 편향을 제어하기 위함이며, 10 x, 40 x 및 63 x 배율 대물렌즈와 G-F-P-R-F-P 필터가 장착된 정립 형광 현미경을 사용하여 슬라이드당 50마리에서 100마리의 동물을 점수화합니다.먼저, 명시야 조명을 사용하여 10배 배율에서 동물을 찾습니다. 그 다음, 명시야 조명을 끄고 RFP 필터를 사용하여 A WC 뉴런을 찾습니다. 프로모터 odor.하나의 DS red가 WB 및 A WC 뉴런의 발현을 유도합니다. A WC 뉴런은 작고 원형인 WB 세포체와 비교하여 특징적인 타원형 세포체를 가지고 있습니다. A WC 세포체를 찾았다면, GFP 필터로 전환하여 GFP egg L four의 국소화가 핵인지 세포질인지 기록하십시오.카운터를 사용하면 실험자가 접안렌즈를 계속 들여다보면서 슬라이드를 스코어링할 수 있습니다. 통계적으로 유의미한 데이터를 생성하기 위해 이 과정은 서로 다른 날에 최소 세 번 반복됩니다. 장시간의 냄새 노출 전후 A WC에서 GFP egg L four의 국소화 패턴 예시가 장시간 냄새 노출 전의 상태로 표시되어 있습니다.GFP egg L four는 80분간의 냄새 노출 후 A WC의 세포질에 국소화됩니다. 행동 수준에서 GFP egg four는 A WC의 핵에 국소화됩니다. WC에 세포질 GFP egg four를 가진 동물들은 점원 냄새원(point source of odor)에 끌립니다.이 그래프는 적응되지 않은 동물의 화학주성 분석 결과의 대표값으로부터 생성되었습니다. 화학주성 지수(CHEMOTAXIS index)가 1에 가깝다는 점에 유의하십시오. A WC에서 핵 G-F-P-E-L four를 나타내는 동물들은 적응 취기(adapting odor)의 점원(point source)에 끌리지 않습니다.이 그래프는 입양된 동물의 화학주성(CHEMOTAXIS) 분석 결과의 대표값으로부터 생성되었습니다. 화학주성 지수가 0에 가깝다는 점에 유의하십시오. egg L four가 A WC 뉴런의 핵으로 진입하면, egg L four가 더 이상 핵 내에 존재하지 않더라도 지속되는 A WC 생리학의 안정적이고 장기적인 변화를 유발합니다.80분 동안 냄새에 노출된 후, 동물들은 적응된 냄새의 점원(point source)을 무시하게 되며, 이러한 적응 현상은 120분 동안의 회복 기간 후에도 지속됩니다. 80분간 냄새에 노출되면 AWC의 핵에서 GFP Egl-4가 관찰됩니다. 이러한 핵 내 진입은 AWC에서 장기 적응을 유도하는 데 필요하며 충분한 조건입니다. 120분간의 회복 후, 이 동물들은 더 이상 핵 내 GFP Egl-4를 나타내지 않지만, 행동 수준에서는 여전히 적응 냄새인 알데하이드 점원을 무시합니다. 배양 시간은 포함되지 않습니다.이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 몇 시간 내에 완료할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오를 문서에서, 우리는 안정적이고 제어 형상과 odorant의 그라디언트의 건설을 허용하는 새로운 방법을 설명합니다. 우리는 간단히 다음과 그라디언트가 후각 결함 (전체 및 부분 후각 상실증)의 화면으로 사용할 수있는 방법을 설명하고 chemotaxis 행동보다 미묘한 기능을 연구하기 위해 서요.

Drosophila의 유충에서 냄새 기반 행동의 고해상도 측정

여기 방법 C. 엘레간스 연관 학습과 단기 및 장기 연관 메모리를 테스트하기 위해 설명합니다. 이러한 인구 assays은 휘발성 odorants 향해 chemotax에 웜 기능을 채용하고 chemoattractant butanone과 함께 음식을 페어링에 긍정적인 연관 관계를 형성하고 있습니다. 에어컨 기간의 수를 늘리면 장기 기억을 유도.

C. 엘레간스 긍정적인 Butanone 학습, 단기 및 장기 연관 메모리 Assays

정량의 화학 주성 반응을 평가하는...

C. elegans의 주 화성 분석

특정 환경 스트레스 요인에 노출된 후, 선충 Caenorhabditis elegans는 광범위한 표현형 가소성을 거쳐 스트레스에 강한 'dauer' 유년기 단계로 들어갑니다.  우리는 dauer 동안 neuroplasticity의 제어된 유도 및 이미징을 위한 방법을 제시합니다.

C.에서 영속 특정 신경 세포 리모델링의 생체 내 이미징에서 엘레

C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

이 프로토콜 분석 초파리 애벌레 동시 optogenetic 그것의 후 각 신경의 자극에 대 한 응답에서의 탐색 동작 합니다. 630 nm 파장의 빛은 빨간색 이동 채널 rhodopsin 표현 개별 후 각 신경 세포를 활성화 하는 데 사용 됩니다. 애벌레의 움직임이 동시에 추적 하 고 디지털 기록, 사용자 작성 소프트웨어를 사용 하 여 분석.

초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

우리는 이전에 Caenorhabditis elegans 가 각각 대량 및 간격 훈련을 통해 단기 및 장기 연관 기억을 형성하는 프로토콜을 개발했습니다. 여기에서는 1- 프로판올과 염산을 각각 조건 자극과 무조건 자극으로 짝을 지어 혐오 연관 기억을 형성함으로써 C. elegans 의 컨디셔닝에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans에서 두 가지 화학 물질을 짝을 지어 혐오스러운 연관 학습 및 기억 형성

여기에서는 모델 유기체 C. elegans에서 고전적 조건화를 수행하여 연상 학습을 테스트하는 프로토콜을 제시합니다. 이 패러다임은 환경 내 염분의 농도를 음식의 유무와 짝을 이루는 것을 기반으로 하며, 이는 화학주축을 소금 쪽으로 또는 소금에서 멀어지게 합니다.

선충 Caenorhabditis elegans의 화학주축에서 연관 학습 측정

이 프로토콜은 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 휘발성 성 페로몬에 대한 반응을 추출하고 정량화하는 방법을 확립하여 화학적 통신 및 탐색 궤적을 연구하기 위한 도구를 제공합니다.

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)

학습 및 기억과 같은 인지 과정 중 세포 활동을 연구하는 데 있어 중요한 장벽은 생체 내 이미징 준비를 위해 마취제를 사용하는 것입니다. 마취는 초파리(Drosophila)를 포함한 여러 모델에서 단기 기억과 인지를 손상시킵니다.이 연구는 마취 없이 생체 내 이미징을 위해 성인 초파리를 준비하는 독특한 방법을 제시합니다.

생체 내 마취되지 않은 초파리 성충의 신경 활동 이미징

배우세요 C. elegans에서 GFP::EGL-4를 이용한 장기 후각 적응의 분자 판독법을. AWC 감각 신경원에서 GFP 표지된 단백질 키나아제 G의 핵 이동을 시각화하여 적응 상태를 신속하게 평가하고 유전자 스크리닝을 가능하게 합니다.

의 장기 강한 적응의 분자 판독

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