Name: 의 장기 강한 적응의 분자 판독 C. elegans (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 배우세요 C. elegans에서 GFP::EGL-4를 이용한 장기 후각 적응의 분자 판독법을. AWC 감각 신경원에서 GFP 표지된 단백질 키나아제 G의 핵 이동을 시각화하여 적응 상태를 신속하게 평가하고 유전자 스크리닝을 가능하게 합니다.

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우리는이 원고의주의 읽기에 대한 스콧 해밀턴과 O&#39;Halloran 연구실의 구성원을 감사드립니다. 우리는 또한 우수한 제안과 통찰력 의견을 익명 리뷰어를 감사합니다.

1. GFP의 건설 EGL-4 표현 동물 태그 <ol><li> odr-3 유전자 (직접 상류 시작 코돈의 사용 2,678 BP)를위한 발기인 아래 병진 융합 GFP :: EGL-4를 복제 (P) odr-3 :: GFP :: EGL-4. odr-3 프로모터 드라이브 amphid 뉴런 쌍 표현 : AWA, AWB, AWC, 그리고 약하게 ASH 인치 </li><li> (P) ofm-1 : 플라스미드 (P) odr-3 :: GFP :: 50 wildtype (N2) 동물에 EGL-4 표준 세균 라인 변환 기술 8을 사용 공동 분사 마커와 μl / NG를 삽입 : : GFP 9 일 (μl / 25 NG) 및 (P) odr-1 :: dsRed 10 (25 NG / μl). AWC 및 AWB amphid 뉴런 쌍의 odr-1 프로모터 드라이브 표현하고 coelomocytes의 ofm-1 프로모터 드라이브 표현. </li><li> 울트라 바이올렛 (UV) / trimethylpsoralen (TMP) 통합 프로토콜 단계 1.2에 설명 된 extrachromosomal 배열을 표현 형질 전환 동물을 대상11. </li><li> 블리치는 동물 12 동기화하고 OP50 E.를 포함하는 선충류 성장 미디어 (NGM) 접시에 올려 배양 L4 단계에 대장균. OP50 E.를 제거하는 M9 버퍼로 NGM 플레이트에서 L4 동물을 씻어 대장균 박테리아. </li><li> M9 버퍼를 제거하고 30 μg / 1.5 ML의 microcentrifuge 관 웜 펠렛로 ML의 TMP 작업 솔루션의 50-100 μl를 추가합니다. 주변 빛을 차단하고, 호일로 싼 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 15 분 동안 회전하는 것에 부드럽게 활발히 논의하기 위해 호일에 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 넣어. 큰 unseeded NGM 판에 TMP / 웜 솔루션에 웜을 전송합니다. </li><li> Stratalinker 2400을 사용하여 UV 350 μJ (X100)에 NGM 접시에 웜을 쉽게받을 수 있습니다. 그런 다음 OP50 포함 NGM 플레이트에 웜을 추가로 5 시간 동안 짙은 어둠 속 품다. </li><li> 약 10 시드 플레이트 (2-5 웜 각 판) 50 유전자 변형 웜을 선택합니다. 전송 P0 새로운 판에 3 일 동안은 24 시간입니다. </li><li> 250 clonal F1을 선택nimals (판 당 1 동물). 각 F1 판 2-4 F2 동물을 복제. ofm-1 (P)에서 :: 해부 형광 현미경으로 GFP 표현 패턴을 보면 100 % 전송 라인을 찾아 F3 동물을 확인합니다. </li><li> Outcross wildtype의 N2 동물과의 최종 통합 라인 (들) 5 회. 우리는 pyIs500으로 최종 통합 라인을 참조하고, GFP 등 GFP 태그 EGL-4 분자 :: EGL-4입니다. </li></ol> 2. 원자력 Translocation의 Assays을위한 재배와 동물의 유지 보수 <ol><li> 25 pyIs500 동물을 육성 ° OP50 E. 스탠다드 10cm NGM 플레이트에 C (제조법은 아래를 참조) 시드 대장균 박테리아 13 일 (그림 1). </li><li> 1 일에서 5 개의 10cm OP50 E.에 25 재배 플레이트 4-5 L4 pyIs500 동물 ° C를 선택 대장균은 25 접시 배양을 놓는 ° C (그 판 당 4-5 L4 동물입니다.) </li><li> 4 일에서 성인 P를 씻어S-자연적으로 흐르는 것과 버퍼를 사용하여 대형 NGM 플레이트에서 pyIs500 동물의 opulations (제조법은 아래를 참조). 그들은 플라스틱 피펫 팁의 측면에 집중하므로, 동물을 전송하는 일회용 유리 피펫을 사용합니다. </li></ol> 3. 장기 냄새 유발 원자력 Translocation의 Assays <ol><li> pyIs500 동물에게 세균을 제거 할 S-자연적으로 흐르는 것과 3 번 씻으십시오. 세차 사이에 동물을 원심 분리기하지 마십시오 아니라 동물 고정 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 중력에 의해 정착 할 수 있습니다. 다 박테리아가 제거되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다, 그 NGM의 pates는 잔여 박테리아가 부정적인 translocation 분석의 결과에 영향을 미칠 것이기 때문에, 오염에서 무료입니다. 또한, 우리는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를 autoclaving하는 측면에 집중하기 위해 동물을 일으키는 등 비 autoclaved 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를 사용하는 관의 내부 벽에 &quot;끈적&quot;재산을 생산하는 것으로 확인되었습니다. </li><li> 동물이 세차 사이에 정착하고 있지만, t를 구성하는그는 적응 솔루션을. 100 ML의 졸업생 실린더에 S-자연적으로 흐르는 것과 버퍼의 100 ML을 추가합니다. S-자연적으로 흐르는 것과에게 냄새를 적응 추가 Parafilm의 스트립을 사용하여 실린더를 밀봉. butanone 적응이 S-자연적으로 흐르는 것과 100 ML에 2 butaone 11 μl를 추가에 대한 benzaldehyde 적응은, S-자연적으로 흐르는 것과 100 ML에 benzaldehyde의 7.5 μl를 추가합니다. 수행하는 경우 부드럽게 (흔들하지 않음)이 포함 된 졸업 실린더가 S-자연적으로 흐르는 것과과 냄새 30 회 균일 한 에멀젼을 만드는 반전. </li><li> S-자연적으로 흐르는 것과의 마지막 세척 후, 동물이 모든 액체를 해결하고 제거 할 수 있습니다. 라벨 한 튜브 &quot;+ VE&quot;또는 &quot;적응&quot;과 다른 튜브 &quot;VE&quot;또는 &quot;unadapt&quot;. 그런 다음 적응 microcentrifuge 튜브 (+ VE)에 적응 믹스 1 ML을 추가하고 unadapted 제어 microcentrifuge 관 (-VE)에 S-자연적으로 흐르는 것과 1 ML를 추가합니다. 각 튜브에 100와 200 사이의 동물의 숫자를 유지하려고합니다. 연습으로, 그것은 눈으로 펠릿에 동물의 대략적인 수를 추정 할 수 있습니다. </li><li> 1.5 ML microcentrifuge 튜브 캡 보호를 삽입각 튜브 (터지는 오픈에서 뚜껑을 방지)와 80 분의 회선 근에 튜브를 삽입합니다. 우리는 60 분 및 80 분 사이의 냄새에 노출 비슷한 결과를 (장기 적응 응답에서 두 결과) 산출 것으로 나타났습니다. 그러나, 80 분 노출 우리 손에 더 일관된 결과를 제공합니다. 따라서 우리의 모든 장기 적응 assays는 80 분 냄새에 노출 (그림 2)를 사용하여 표준화합니다. </li><li> 80 분 후, S-자연적으로 흐르는 것과의 동물에게 3 번 씻는다. 동물이 각 빨래 사이에 중력에 의해 해결 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 단기 냄새 유발 원자력 Translocation의 Assays <ol><li> 단기 냄새 적응의 경우, 그러나 대신 80 분에 냄새를 적응 pyIs500 동물 잠복기 때문에, 30 분 노출을 사용하여 당 장기 냄새 유발 translocation의 assays (단계 3.1-3.4)와 같은 프로토콜을 사용 . 아래에 설명 된 악취 유발 핵 translocation의 assays의 정량화은 (5 단계) 장기 및 단기 적이에 대해 동일합니다m 노출. </li></ol> 5. 냄새 유발 원자력 Translocation 이벤트 점수를 <ol><li> DH 2 0에서 젤 전기 영동 아가로 오스를 용해하여 5 MM 나트륨 azide (할머니 3) 포함 2% 아가로 오스 패드를 확인합니다. 유리 현미경 슬라이드에 낸 세를 포함하는 용융 아가로 오스의 한 방울을 넣으십시오. 즉시 용융 아가로 오스의 드롭을 평평하게하는 최초의 슬라이드에 다른 유리 현미경 슬라이드를 놓습니다. 30 초에두고 부드럽게 현미경은 ~ 1 mm의 평면 아가로 오스 패드와 하나 현미경 슬라이드를두고 슬라이드 떨어져 애타게. </li><li> S-자연적으로 흐르는 것과의 마지막 세척 후, 웜은 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 정착하고 모든 액체를 제거 할 수 있습니다. 그런 다음 몇 가지 현미경 슬라이드의 아가로 오스 패드로 드롭 현명한 동물을 추가합니다. 이 50과 100 사이에 슬라이드 당 동물의 번호를 유지하는 것이 중요합니다. 슬라이드 당 너무 많은 동물이 골을 복잡하고 종종 푸른 빛이 여기 뒤에 산란 빛이 생성됩니다. 초과 액체가 수도김 부 작은을 사용하여 아가로 오스 패드에서 악한합니다. 패드에 0.5 mm의 유리 커버 슬립을 놓고 동물을 고정하는 할머니 3 수 있도록 2 분에 서 보자. 참고 동물 채점 후 슬라이드에서 복구 할 수 있습니다. M9 버퍼 한 방울로 시드 NGM 플레이트로 전송하면 동물 ~ 1 시간 후 할머니 3 마취에서 회복됩니다. </li><li> 이 시점에서는 각 실험은 슬라이드 실험 (+ VE) 슬라이드하고있는 슬라이드 (-VE) 슬라이드 컨트롤입니다 추적 할 키를 고안하고, 맹목적으로 GFP를 점수를 다른 사람에게 슬라이드를 통과 필수적입니다 : EGL-4 현지화 패턴. 이 모든 실험 바이어스에 대해 적용됩니다. </li><li> , 10X 40X 63X 배율과 목표 및 GFP / RFP 필터를 수직 형광 현미경을 사용하여 슬라이드 당 50과 100 동물 사이의 점수. 첫째, 밝은 분야 조명을 사용하는 10X 배율에 따라 동물을 찾습니다. 둘째, brigh를 해제하여 AWC 뉴런을 찾습니다t-필드 조명 및 RFP 필터를 사용합니다. AWB 및 AWC 뉴런의 (P) odr-1 :: dsRed 드라이브는 표현. 모양의 작고 원형 아르 AWB 셀 기관 (그림 2)와 비교 AWC 뉴런은 독특한 타원형 모양의 세포 기관을 갖추고 있습니다. </li><li> AWC 전지 본체가 위치한되면, GFP 필터로 전환 GFP의 지역화 기록 : 핵이나 세포질로 EGL-4. 카운터를 사용하면 실험이 슬라이드를 골면서 접안 렌즈로 계속 찾고 있습니다. 참고 : 단계 5.1-5.5는 통계적으로 의미가있는 데이터 (그림 1-2) 생산 별도의 일에 최소 3 번 반복됩니다. </li></ol> 6. 장기 냄새 적응에서 복구하는 동안 EGL-4 GFP 태그 모니터링 <ol><li> 단계 3.5 이후 시간 포인트 제로에서 AWC의 여러 aliquots과 핵 대 세포질 GFP에 대한 점수 :: EGL-4에 pyIs500 동물의 인구를 분할 (즉 80 분 노출 후) 및 multiple 이후의 시간 점 (그림 3). </li><li> NGM 접시에 일회용 유리 피펫을 사용하여 컨트롤 (-VE) 및 실험 (+ VE) 동물을 모두 전송합니다. </li><li> 동물이 시간의 다양한 길이에 복구 할 수 있도록 각 시점에서 GFP :: EGL-4in AWC의 재검토 현지화 5.1 5.5 단계에 있습니다. </li></ol> 7. 자료 NGM 번호판 :; 3g의 나트륨 염화물 (NaCl) 2.5 g Bacto-펩톤 21g Bacto-한천 : 1 L에 대해 1 L ddH 2 0에 추가 할 수 있습니다. 압력솥 미디어. 온도는 54 ° C.를 읽고 autoclaving, 멋진 한천이 끝날 때까지 , 1 ML 1 M의 황산 마그네슘 (MgSO 4), 1 ML 1 M의 염화칼슘 (CaCl 2), 에탄올 1 ML의 콜레스테롤 (5 MG / ML 주식) 25 ML 1M 칼륨 인산 버퍼 다음 솔루션을 추가합니다. 1 M 이염 기성 K 2 HPO 4 174.2 g / 몰 : 500 ML를 들어 : 400 ML ddH 2 O에 용해 87.1 g DibasiC K 2 HPO 4. ddH 2 O. 500 L에 볼륨 조절 500 ML 무균 필터 유닛을 사용하여 소독 필터링 할 수 있습니다. 1 M 일 염기의 KH 2 PO 4 136.1 g / 몰 : 1 L의 경우 : 800 ML ddH 2 O에서 136.1 g 일 염기의 KH 2 PO 4 분해. ddH 2 O. 1 개 L로 볼륨을 조정 500 ML 무균 필터 유닛을 사용하여 소독 필터링 할 수 있습니다. 1 M의 칼륨 인산 (K 3 PO 4) 버퍼 산도 6.0 : 1 L의 경우 : 1 L 무균 필터 유닛에서 1 M 일 염기의 KH 2 PO 4 868 ML를 추가합니다. 단위를 통해 필터링 할 수 있습니다 다음, 1 M 이염 기성 K 2 HPO 4 132 ML를 추가합니다. 장치가 모든 액체를 필터링 할 수 있습니다. 필터 장치를 제거하고 6.0 산도를 조정합니다. 실온에서 보관하십시오. S-자연적으로 흐르는 것과 : 1 L의 경우 : 50 ML 100 K 3 PO 4 버퍼를 추가 산도 ~ 6.0; 20 ML 5M NaCl AQ. 1 개 L에 기입ddH 2 O. 솔루션을 압력솥. M9 : 3g KH 2 PO 4, 6g 오세영 2 HPO 4, 5g NaCl, 1 ML 1 M MgSO 4, H 2 O. : 1 L의 경우 ddH 2 0 1 개 L로 입력합니다. autoclaving하여 소독.

<ol><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803(1995).</li>
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</ol>

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GFP 태그 EGL-4 분자의 냄새 유발 핵 항목은 여기에 설명하는 것은 C.에서 후각 적응의 강력한 분자 기록을 제공합니다 elegans. 냄새 유발 핵 translocation의 assays은 간단하고 준비 시간을 몇 일을해야합니다. 우리가이 assays에 건설 한 pyIs500 동물은 AWC 신경 세포뿐만 아니라 GFP 태그 EGL-4 단백질을 표현을 비춰 마커를 표현합니다. 따라서, 우리는 뉴런의 클래스로 작업없이 경험이 거의있는 실험이 매우 빠르게합니다 (아마도 몇 다스의 동물을 검토 한 후) 핵 대 세포질 EGL-4에 대한 올바른 전지 및 채점을 식별 편안하게 할 수 있음을 느낀다. 독자는 C로 GFP 분석을 설명 기사 835를 목성을 참조하는 것이 유용 할 수 있습니다 elegans 15. 생성 된 데이터는 최고 품질의 것을 보장하기 위해 우리는 다...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Bacto 한천 </td><td> Difco </td><td> DF0140 - 07-4 </td><td> NGM 플레이트 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 피셔 화학 </td><td> S671-10 </td><td> NGM 플레이트 </td></tr><tr><td> Bacto 펩톤 </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> NGM 플레이트 </td></tr><tr><td> 이염 기성 인산 칼륨 </td><td> 피셔 화학 </td><td> S375-500 </td><td> S-자연적으로 흐르는 것과 버퍼와 NGM 플레이트 </td></tr><tr><td> 인산 칼륨 일 염기의 </td><td> 피셔 화학 </td><td> P285-500 </td><td> S-자연적으로 흐르는 것과 버퍼와 NGM 플레이트 </td></tr><tr><td> Kimwipes - 작은 </td><td> 킴벌리 - 클락 </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 백퍼센트 </td><td> 골드 방패 화학(주) </td><td> 43196-115 </td><td> chemotaxis assays를위한 diluting 냄새 </td></tr><tr><td> 칼슘 염화물 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C8106-500G </td><td> NGM 플레이트 </td></tr><tr><td> 마그네슘 황산염 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 150136-500G </td><td> NGM 플레이트 </td></tr><tr><td> 나트륨 Azide 99% </td><td> 피셔 과학 </td><td> ICN10289180 </td><td> 마취제 </td></tr><tr><td> 아가로 오스 - UltraPure </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> 아가로 오스 패드 </td></tr><tr><td> Benzaldehyde </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> B1334-100G </td><td> AWC 냄새 </td></tr><tr><td> Butanone, ACS 학년 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 360473-500ML </td><td> AWC 냄새 </td></tr><tr><td> Microcentrifuge 튜브 - 1.5 ML 컬러 </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> 파스퇴르 Pipet 일회용 유리 5-3/4 &quot; </td><td> 피셔 과학 </tD&gt; <td> 13-678 - 20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> UV 통합 </td></tr><tr><td> 필터 진공 병 - 500 ML </td><td> Nalgene </td><td> 09-740 - 25B </td><td></td></tr></tbody></table>

의 장기 강한 적응의 분자 판독<em&gt; c. elegans</em

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

지속적인 자극하는 동안 대부분의 감각 뉴런은 신호의 감도를 감소하여 반응을 적응합니다. 적응 반응은 모양의주의를 할 수 있으며, 오버 자극 세포를 보호합니다. C.의 후각 회로에 적응 elegans 먼저 콜버트와 Bargmann 1,2에 의해 설명되었다. 여기에서 저자들은 Amphid 윙 셀 타입 C (AWC) 감각 뉴런에 의해 감지 휘발성 냄새에 적응하는 능력에 돌연변이가 결함 분리하는 유전자 화면을 설계하는 데 사용되는 후각 적응 패러다임의 매개 변수를 정의. 때 wildtype C. elegans 동물들은 냄새로 자신의 응답을 수정합니다 30 분에 매력적인 AWC - 감지 냄새 셋에 노출 된 후 ~ 1 시간의 chemotaxis 행동 분석에 적응 냄새를 무시합니다. 때 wildtype C. elegans 동물들은 후 AC에 적응 냄새를 무시합니다 ~ 1 시간을위한 매력적인 AWC - 감지 냄새에 노출되어~ 3 시간에 hemotaxis 행동 분석. C.의 후각 적응의 두 단계 elegans는 단기 후각 적응 (30 분 냄새에 노출 후 유도), 그리고 장기 후각 적응 (60 분 냄새에 노출 후 유도)로 설명했다. 나중에 L&#39; Etoile의 외.에서 일, 4 AWC 뉴런의 단기 및 장기 후각 적응 모두 필요합니다 EGL-4라는 단백질 키나제 G (PKG)을 발견. EGL-4 단백질은 장기 후각 적응 반응하지만 AWC 4 단기 후각 적응 응답을위한 소모품에 필요한 핵 현지화 과정이 포함되어 있습니다. 녹색 형광 단백질과 태그 EGL-4함으로써, 장시간 냄새에 노출시 AWC의 EGL-4의 현지화를 시각화 할 수했습니다. 이 모든 기능을 사용하여 우리가 AWC 5 장기 후각 적응의 분자 표시 장치를 개발 할 수 있었던 EGL-4 (GFP :: EGL-4) 분자 GFP를 태그. 이 m을 사용하여후각 적응의 olecular 판독 우리는 AWC 6,7에서 GFP의 결함이 subcellular 지방화 패턴 :: EGL-4을 전시 돌연변이 동물을 식별하는 모두 순방향 및 역방향 유전 화면을 수행 할 수있었습니다. 여기 설명 : GFP 1) 건설 :: EGL-4 표현 동물, 2) 장기 냄새 유발 핵 translocation의 assays를위한 동물의 재배를위한 프로토콜 및 장기적인 악취 유발 3) 채점 핵 translocation 이벤트와 핵 GFP :: EGL-4 상태에서 복구 (재 sensitization).

AWC 전, 연장 냄새에 노출 후 GFP :: EGL-4in의 지역화 패턴의 예는 그림 2에 표시됩니다. 장시간 악취 노출, GFP :: EGL-4 이전은 AWC (그림 2B)의 세포 기질에 지역화하고 있으며, 80 분 냄새 노출 GFP 후 :: EGL-4는 AWC (그림 2D)의 핵에 번역되어 있습니다. 행동 수준에서 cytosolic GFP :: EGL-4 AWC에있는 동물은 냄새의 포인트 소스 (- chemotaxis 지수 3 가까운 1 되오니, 이용에 참고하여 그림 2C는 unadapted 동물의 chemotaxis assays의 대표 결과를 그래프)에 매료됩니다. AWC에 핵 GFP :: EGL-4을 전시 동물은 적응 냄새 (- chemotaxis 지수는 제로에 가까운 되오니, 이용에 참고하여 적응 동물의 chemotaxis assays에서 그림 2E 그래프</st...

여기에 장기 후각 적응의 분자 기록을 설명<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. 단백질은 키나제 G, EGL-4는, AWC라는 기본 감각 뉴런 쌍의 안정적인 적응 응답이 필요합니다. 세포 기질의 AWC의 핵에 장시간 냄새에 노출 EGL-4 translocates 동안.

의 장기 강한 적응의 분자 판독<em&gt; C. elegans</em

지속적인 자극이 주어지는 동안 대부분의 감각 뉴런은 신호에 대한 민감도를 낮춤으로써 반응을 적응시킵니다. 이러한 적응 반응은 ...

이 영상의 전반적인 목적은 동물의 적응 상태를 나타내는 예쁜꼬마선충(sea elgan)의 장기 후각 적응에 대한 분자적 판독법의 개발 및 구현을 상세히 설명하는 것입니다. 이는 egg L four라고 불리는 단백질 키나아제 G에 녹색 형광 단백질 분자를 태깅하고, 이 융합 단백질을 amphi wing 세포 타입 C 또는 A WC 뉴런에서 발현시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, A WC 뉴런에서 GFP가 태깅된 egg L four 형태를 발현하는 동물들을 박테리아 먹이원인 OP 50이 포함된 선충 성장 배지 플레이트에서 배양합니다. 그다음 4일 후에, 배양 플레이트에서 동물 집단을 씻어내고 장기 후각 적응을 촉진하기 위해 A WC가 감지하는 냄새에 80분 동안 노출시킵니다.결과는 적응된 동물의 AWC에서는 GFP가 태그된 ALE4가 핵에 국소화되는 반면, 적응되지 않은 대조군 동물의 AWC에서는 GFP가 태그된 ALE4가 세포질에 위치함을 보여줍니다. 두 가지 녹색 형광 단백질을 통해 ALE4의 기능적 복제본을 생성함으로써, 우리는 AWC 내 ALE4의 세포 내 국소화를 추적하고 GFP 국소화에 기반하여 동물의 행동 상태를 설명할 수 있습니다. 이 분자 도구를 통해 지속적인 신경 자극 이후 세포 출력을 형성하는 다양한 돌연변이체 또는 처치의 역할을 신속하게 조사할 수 있습니다.본 프로토콜은 이 비디오에 동반된 서면 절차에 설명된 대로 GFP가 태그된 egg L four를 발현하는 동물을 제작하는 것으로 시작합니다. 최종 통합 라인은 IS 500으로, GFP가 태그된 egg L four 분자는 GFP egg L four로 지칭합니다. IS 500 동물을 OP 50 E coli 박테리아가 도말된 표준 10 centimeter NGM 플레이트 위에서 25 °C로 배양하십시오. 1일 차에, 픽(pick)이라 불리는 작은 백금선을 사용하여 25 °C에서 배양된 플레이트로부터 larval stage four 단계의 IS 500 동물 4~5마리를 걷어내어 OP 50 E coli가 도말된 10 centimeter 플레이트로 옮기십시오.이 과정을 추가로 4개의 플레이트에 반복합니다. 4일 차에 플레이트를 25 °C에서 배양합니다. 대형 NGM 플레이트에 basal buffer를 추가하고 부드럽게 회전시켜 IS 500 성체 개체군을 세척하여 회수합니다.이렇게 하면 동물들이 플레이트 표면에서 떨어져 버퍼 용액으로 이동합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오를 문서에서, 우리는 안정적이고 제어 형상과 odorant의 그라디언트의 건설을 허용하는 새로운 방법을 설명합니다. 우리는 간단히 다음과 그라디언트가 후각 결함 (전체 및 부분 후각 상실증)의 화면으로 사용할 수있는 방법을 설명하고 chemotaxis 행동보다 미묘한 기능을 연구하기 위해 서요.

Drosophila의 유충에서 냄새 기반 행동의 고해상도 측정

여기 방법 C. 엘레간스 연관 학습과 단기 및 장기 연관 메모리를 테스트하기 위해 설명합니다. 이러한 인구 assays은 휘발성 odorants 향해 chemotax에 웜 기능을 채용하고 chemoattractant butanone과 함께 음식을 페어링에 긍정적인 연관 관계를 형성하고 있습니다. 에어컨 기간의 수를 늘리면 장기 기억을 유도.

C. 엘레간스 긍정적인 Butanone 학습, 단기 및 장기 연관 메모리 Assays

이 비디오는 기계감각을 평가하고 습관화까지의 시간을 정량화하는 예쁜꼬마선충(C. elegans) 행동 방법인 터치 습관화 분석을 소개합니다.

터치 습관화 분석: 예쁜꼬마선충의 비연관 학습을 연구하는 방법

정량의 화학 주성 반응을 평가하는...

C. elegans의 주 화성 분석

특정 환경 스트레스 요인에 노출된 후, 선충 Caenorhabditis elegans는 광범위한 표현형 가소성을 거쳐 스트레스에 강한 'dauer' 유년기 단계로 들어갑니다.  우리는 dauer 동안 neuroplasticity의 제어된 유도 및 이미징을 위한 방법을 제시합니다.

C.에서 영속 특정 신경 세포 리모델링의 생체 내 이미징에서 엘레

C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

우리는 이전에 Caenorhabditis elegans 가 각각 대량 및 간격 훈련을 통해 단기 및 장기 연관 기억을 형성하는 프로토콜을 개발했습니다. 여기에서는 1- 프로판올과 염산을 각각 조건 자극과 무조건 자극으로 짝을 지어 혐오 연관 기억을 형성함으로써 C. elegans 의 컨디셔닝에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans에서 두 가지 화학 물질을 짝을 지어 혐오스러운 연관 학습 및 기억 형성

여기에서는 모델 유기체 C. elegans에서 고전적 조건화를 수행하여 연상 학습을 테스트하는 프로토콜을 제시합니다. 이 패러다임은 환경 내 염분의 농도를 음식의 유무와 짝을 이루는 것을 기반으로 하며, 이는 화학주축을 소금 쪽으로 또는 소금에서 멀어지게 합니다.

선충 Caenorhabditis elegans의 화학주축에서 연관 학습 측정

이 프로토콜은 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 휘발성 성 페로몬에 대한 반응을 추출하고 정량화하는 방법을 확립하여 화학적 통신 및 탐색 궤적을 연구하기 위한 도구를 제공합니다.

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)

학습 및 기억과 같은 인지 과정 중 세포 활동을 연구하는 데 있어 중요한 장벽은 생체 내 이미징 준비를 위해 마취제를 사용하는 것입니다. 마취는 초파리(Drosophila)를 포함한 여러 모델에서 단기 기억과 인지를 손상시킵니다.이 연구는 마취 없이 생체 내 이미징을 위해 성인 초파리를 준비하는 독특한 방법을 제시합니다.

생체 내 마취되지 않은 초파리 성충의 신경 활동 이미징

배우세요 C. elegans에서 GFP::EGL-4를 이용한 장기 후각 적응의 분자 판독법을. AWC 감각 신경원에서 GFP 표지된 단백질 키나아제 G의 핵 이동을 시각화하여 적응 상태를 신속하게 평가하고 유전자 스크리닝을 가능하게 합니다.

의 장기 강한 적응의 분자 판독

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