항원 특정 규제 트랜스 생체 지연 형 과민 분석

우리는 잠재적으로 이식 거부의 높은 위험없이 이식 후 면역 억제제의 철수를 결정하는 데 사용할 수있는 유용한 진단 분석을 설명합니다. 분석은 지연 형 과민 반응의 원리를 사용하여받는 사람이 탑재 된 두 기증자 특정 이펙터 및 규제 면역 반응의 정확한 평가를 제공합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 트랜스 생체 내 DTH 분석을 사용하여 인간 피험자의 프로 및 항염증성 항원 특이적 반응을 모두 모니터링하는 것입니다. 먼저, 인간 피험자의 말초 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포를 분리합니다. 그런 다음 PBMC 제제와 PBS를 혼합합니다.

항원 검사 항원 및 항원 검사 플러스 항원 회수를 리콜합니다. 풋패드 prem 측정을 진행하고 준비된 혼합물을 스키드 마우스에 주입합니다. 풋패드는 24시간 후에 측정을 반복합니다. 3.

DTH 반응의 명확한 패턴은 조절적, 비조절적, 민감성이 가능합니다. trans vivo delayed type hypersensitivity assay는 항원의 원인이 이식 기증자의 세포인 allo react 반응과 같은 임상 매개변수를 결정하는 데 적용할 수 있습니다. 기존 in vitro 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 단일 분석 시스템을 사용하여 allo 항원, 자동 항원 또는 종양 항원에 대한 전염증 및 조절 반응을 모두 쉽게 감지할 수

제 연구실의 연구원인 Egon은 이제 산성 구연산염 포도당 튜브에 수집된 신선한 인간 말초 혈액을 사용하여 혈소판 활성화를 방지하는 절차를 시연할 것입니다. 표준 방법에 따라 림프구 분리 배지를 사용하여 PBMC를 분리합니다. PBMC 제제를 PBS로 세척하여 오염된 혈소판을 제거합니다.

눈에 띄는 적혈구 오염이 있는 경우 CK 용해 완충액을 사용하여 적혈구 용해를 수행합니다. 그런 다음 PBS Resus로 두 번 더 세척합니다. PBS에서 PBMC를 allo 항원에 대해 밀리리터당 1,000만 PBMC 농도로 현탁시킵니다.

앞서 보여준 절차를 사용하여 기증자의 말초 혈액에서 분리한 P BMC로 시작합니다. 그런 다음 소생합니다. PBS의 기증자 세포를 밀리리터당 1억 2천만 개의 세포 농도로 현탁시키고 PMSF 1마이크로몰을 첨가하여 단백질 분해를 방지합니다.

이제 2mm 프로브 소닉카로 7개의 1초 펄스를 사용하여 세포 현탁액을 초음파 처리합니다. 혈구 분석기를 사용합니다. 90% 이상의 세포가 파괴되었는지 확인합니다.

다음으로, 14, 000 RPM에서 섭씨 4도에서 20 분 동안 혼합물을 원심 분리하십시오. 상층액을 두 개의 안전한 잠금 튜브로 조심스럽게 옮기고 각 주입에 대한 표준 방법으로 단백질 농도를 측정합니다. 여섯 번째 P BMC를 2밀리리터로 나누기 10의 7곱하기 분취.

Safe Lock Tubes는 원심분리를 통해 세포를 펠릿화합니다. 먼저 35마이크로리터의 PBS에서 PBMC의 음성 대조군 현탁액을 준비합니다. 그런 다음 양성 대조군의 경우 리콜 항원, 파상풍, 톡소이드, 디프테리아, 톡소이드 25마이크로리터를 추가하고 PBS로 주입량을 35마이크로리터로 조정합니다.

공여자의 특이적 반응을 평가하기 위한 실험 설계에 따라, 세포 펠릿을 10마이크로리터의 공여자 항원과 25마이크로리터의 PBS에 총 35마이크로리터의 부피로 재현탁합니다. 실험적 공여자 항원 특이적 조절을 평가하기 위해 resus는 10마이크로리터의 공여자 항원과 25마이크로리터의 리콜 TT DT 항원을 추가하여 세포 펠릿을 35마이크로리터에 현탁시킵니다. 마취 후, isof 불소가 있는 스키드 마우스는 게이지 판독값이 안정화되었을 때 측정 부위를 일관되게 유지하기 위한 벤치마크를 제공하기 위해 한쪽 모서리가 발의 마지막 보행 패드에 닿도록 발판 중앙에 스프링이 장착된 캘리퍼를 배치합니다.

발패드 주입을 위한 기준선 발판 두께를 기록합니다. 바늘이 발가락을 가리키고 베벨이 위를 향하도록 주사기를 놓습니다. 이제 마우스의 뒷발 패드에 각 세포 서스펜션의 피하 주사를 시작합니다.

첫 번째, 음성 대조군 준비를 오른쪽 발 패드에 천천히 주입합니다. 다음으로, 왼쪽 발 패드에 PBMC와 TT dt의 양성 대조군을 주입합니다. 이제 마우스를 위해 마우스를 케이지로 되돌립니다.

둘째, 오른쪽 발패드에 PBMC 플러스 allo antigen을 주입하고 왼쪽 발패드에 PBMC plus allo antigen plus TT dt를 주입합니다. 주입 후 18-24시간 정도는 누출이 없는지 확인하십시오. 각 마우스에 불소를 마취하고 발바닥 부종 측정을 반복합니다.

주입 후 값에서 주입 전 각 발 패드의 두께를 빼서 발판 팽윤 값을 구합니다. 그런 다음 치료에서 얻은 발패드 팽윤 값에서 대조군 발바닥 팽창 값을 빼서 항원 특이적 순 팽창을 계산합니다. 양성 대조군이 양성 대조군 반응을 판독하여 25 곱하기 10에서 마이너스 4인치까지의 항원 TT DT를 회수하는지 확인합니다.

테스트가 유효한 것으로 간주되려면 PBS에 대한 백그라운드 응답이 필요합니다. 다음으로, 공여자 항원이 있는 경우 회상 반응의 억제를 결정합니다. 이 실험은 신장 이식 수혜자의 기증자 항원 특이적 반응 및 조절을 평가합니다.

이식 수혜자에서 지연형 과민증의 세 가지 주요 패턴이 있는데, 조절적(regulationy), 비조절적(non-regulationy), 민감성(sensitized)이다. 모든 환자는 회상 항원 tt의 양성 대조군에 강력하게 반응했습니다. 62번 환자는 공여자 항원에 대한 약한 반응과 공여자 항원이 있는 경우 항원 반응을 회상하기 위한 현저한 연결 억제를 특징으로 하는 조절 패턴을 보여줍니다.

이것은 장기 동종이식 내성과 관련이 있는 것으로 밝혀진 패턴입니다. 48번 환자는 비조절 패턴을 보였는데, 이는 기증자에 대한 반응이 약하지만 연계된 억제는 없는 특징이 있다. 이러한 패턴은 면역억제제를 복용하는 환자들에게서 자주 관찰되어 왔다.

8번 환자는 기증자 항원에 대한 높은 반응과 연계된 억제가 없는 것을 특징으로 하는 기증자 감작 패턴을 보입니다. 이 반응은 이식 거부 반응과 관련이 있습니다. 임상 사례 연구에서 관찰 시험에 등록된 피험자의 P BMC를 분석하여 임상 내성에서 기증자 특이적 조절의 역할을 평가하기 위해 기증자 특이적 간접 경로, T 효과기 및 T 조절 반응을 분석했습니다.

기증자 항원에 대한 간접 텍터 반응은 등록 그룹 전반에 걸쳐 뚜렷한 스펙트럼을 보여줍니다. 발패드 부종은 환자의 임상 상태가 내약에서 만성적으로 거부 반응으로 이동함에 따라 증가합니다. 여기서, linked suppression assay는 T 조절 반응의 항공여체 간접 경로를 측정합니다.

이러한 데이터는 가장 내성이 있는 환자부터 중간에서 가장 내성이 낮은 만성 거부 환자에 이르기까지 조절 반응의 감소를 보여줍니다. 함께 복용하면 됩니다. 트랜스 생체 내 DTH 분석법으로 측정된 면역 조절은 신장 동종이식 수용을 위한 중요한 메커니즘인 것으로 보입니다.

유망한 분야는 자가면역 모니터링에 TDTH 분석을 적용하는 것입니다. 세기관지염 OBL 증후군의 병리학적 과정에서 5형 콜라겐의 역할에 대한 본 연구에서는 콜라겐에 대해 긍정적인 반응을 보이는 환자에서 BOS 발병의 상대적 위험이 가장 높은 것으로 나타났습니다. 폐 이식 수혜자로부터 5개의 pbmc가 발생하지만, 건강한 대조군이나 콜라겐에서는 나오지 않습니다.

4 반응성 좋은 목초지 증후군 신장 이식 후에 환자는 빈번하게 콜라겐 5 반응이었다. TDTH 분석은 암 환자에서 종양 특이 항원에 대한 pbmc의 반응성을 테스트하는 데에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 전립선암 환자에서 PAP 특이적 T 조절 세포의 존재는 PAP 항원 백신 접종에 대한 반응을 제한할 수 있습니다.

TRANSVAAL DTH 분석법은 이식 암 및 자가면역 환자의 세포 매개 면역 반응을 평가하는 데 임상적으로 적용되는 새로운 진단 검사입니다. t effector recall 반응을 모니터링하는 데 유용할 뿐만 아니라 효과 또는 조절 T 세포를 검출하기 위해 특정 사이토카인 측정에 의존하지 않기 때문에 T 조절 반응을 검출하는 데에도 사용할 수 있기 때문에 가치가 있습니다. 매우 유연하고 광범위하게 적용할 수 있습니다.