Name: 항원 특정 규제 트랜스 생체 지연 형 과민 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 배우세요 항원 특성 규제 트랜스 생체 지연형 과민 반응 분석법을 통해 이식 환자의 면역 반응을 모니터링하는 방법을. PBMC 분리 및 스키드 마우스 발바닥 주입을 활용하여 면역억제제 중단의 안전성을 평가하고 이식 거부 위험을 최소화하는 진단 기술을 익히세요.

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저자는 이식 규제 DTH 반응에 대한 우리의 이해의 발전에 AM VanBuskirk의 기여를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 NIH 보조금에게 PO1AI084853 및 R01AI066219-06을 지원하고, EU가 후원 한 연구가 있었다.

1. 림프구의 준비 <ol><li> ACD (산성 구연산 포도당) 튜브에 혈액을 수집합니다. </li><li> 표준 방법에 따라 림프구 분리 매체를 사용하여 신선한 인간의 말초 혈액에서 PBMC를 분리합니다. </li><li> 오염 혈소판을 제거하는 PBS로 PBMC 세 번 씻으십시오. 혈소판은 트랜스 생체 DTH 분석을 방해 발견되었다. PBMC 준비의 최대 허용 혈소판 오염 ≤ 1X10 7 / 주입이다. </li><li> 눈에 띄는 적혈구 오염이있는 경우, 첫 번째 세척 후 ACK 용해 버퍼를 사용하여 적혈구의 용해를 수행합니다. PBS로 2 회 세척하여 ACK 버퍼를 제거합니다. </li></ol> 2. Alloantigen의 준비 <ol><li> 위와 같이 프로 시저를 사용하여 기증자의 말초 혈액에서 PBMC를 분리합니다. </li><li> 120x10 6 세포 / ㎖의 농도 (4X10 6 세포 / 30 μL)에서 PBS에서를 Resuspend 기증자 PBMC. </li><li> 단백질을 방지하기 위해 혼합물에 1 μM PMSF 추가분해. </li><li> 2 MM-프로브 sonicator로 일곱 1 초 펄스를 사용하여 세포 현탁액을 초음파 처리. (주 : 물자 감기를 유지하고 과도한 거품을 방지 거품이 발생하면, 세포 현탁액은 2 ~ 3 분 동안 얼음에 앉아 보자..) </li><li> 혈구를 사용하여 세포의&gt; 90 %의 중단을 확인합니다. </li><li> 냉장의 microfuge에서 20 분 동안 4 ° C에서 14,000 rpm으로 혼합물을 원심 분리기. </li><li> 새로운 2.0 ML 안전 잠금 튜브에 뜨는을 전송하고 단백질 농도를 결정한다. </li></ol> 3. 주사에 대한 세포의 준비 <ol><li> 2.0 ML 안전 잠금 튜브에 각각 주입 나누어지는 7X10 6 PBMC합니다. </li><li> 의 microfuge에서 분 동안 6,000 rpm으로 원심 분리하여 그 상등액을 제거합니다. </li><li> PBS에서 함께 또는 항원이없는 세포를 resuspend을. PBS로 35 μL를 주입 볼륨을 조정합니다. 다음 계획은 주사에 사용됩니다 : 부정적인 제어 : PBMC + PBS 긍정적 인 제어 : PBMC + TT / DT (25 &amp; 무; G / 주입) 실험 항원 특정 응답 : PBMC + 시험 자세 (4-8 ㎍ / 주입) 실험 항원 특정 규정 : PBMC + 시험 자세 + TT / DT </li></ol> 4. 사전 측정, 주입 및 사후 측정 <ol><li> isoflurane을 함께 CB17 SCID 마우스를 마취. 스프링 캘리퍼스를 사용하여 후면 발바닥의 두께를 측정한다. 측정 부위의 일관성을 유지하기 위해 벤치 마크를 제공하기 위해, 하나의 가장자리 다리의 마지막 산책 패드를 만지고, 발바닥의 중심에서 캘리퍼를 넣어. 게이지 판독 값이 안정 될 때 발바닥의 두께가 기록됩니다. </li><li> 천천히 28 게이지 바늘 ½ CC 인슐린 주사기를 사용하여 쥐의 발바닥에 피하 세포 현탁액을 주입. 바늘 발가락 향하게하고, 경사가 위를 향하도록 주입을 수행합니다. (참고 : 누수가 없는지 확인). </li><li> 주사 후 18 ~ 24 시간은, 발바닥 부종의 isoflurane을 반복 측정에 마우스를 마취. </li><li> Subtr발바닥 부종 값을 가져 포스트 분사 값에서 주입 전 각 발바닥의 두께 행동, 10 -4 인치의 단위로 데이터를 표현한다. 치료 (PBMC + 기증자 alloantigen, TT / DT, 또는 기증자 alloantigen + TT / DT)에서 얻은 발바닥 부종 값에서 제어 발바닥 부종 (PBMC + PBS)를 뺀 항원 특이 그물 붓기를 계산합니다. PBS에 배경 응답을 통해 ≥ 25X10 -4 인치의 항원 TT / DT를 호출하는 긍정적 인 제어 응답이 유효한 것으로 간주되는 테스트가 필요합니다. </li><li> 다음 공식을 사용하여 각 주사의 순 붓기를 비교하여 기증자의 항원의 존재 리콜 반응의 억제를 확인합니다 : <img alt="식 1" fo:src="/files/ftp_upload/4454/4454eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4454/4454eq1.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Carrodeguas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans+vivo+analysis+of+human+delayed-type+hypersensitivity+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity.</a> Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).</li>
<li>VanBuskirk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+allograft+acceptance+is+associated+with+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Human allograft acceptance is associated with immune regulation.</a> J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).</li>
<li>Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+and+injection+site+are+crucial+for+detecting+linked+suppression+in+transplant+recipients+by+trans-vivo+DTH+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay.</a> Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).</li>
<li>Burlingham, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+tolerance+to+a+maternal+kidney+transplant+is+selective+for+HLA+class+II%3A+Evidence+from+trans-vivo+DTH+and+alloantibody+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis.</a> Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).</li>
<li>Geissler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+allograft+acceptance+and+the+%27tolerance+assay%27%3A+In+vitro+anti-donor+T+cell+assays+show+hyporeactivity+to+donor+cells+but%2C+unlike+DTH%2C+fail+to+detect+linked+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression.</a> Transplantation. 72, 571-580 (2001).</li>
<li>Jankowska-Gan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+allograft+acceptance+and+the+%27tolerance+assay%27.+II.+donor+HLA-A%2C+-B+but+not+DR+antigens+are+able+to+trigger+regulation+of+DTH%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH.</a> Hum. Immunol. 63, 862(2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+H+Antigen+HA-1-specific+Regulator+and+Effector+CD8%2B+T+Cells%2C+and+HA-1+Microchimerism%2C+in+Allograft+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance.</a> J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).</li>
<li>Rodriguez, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+and+graft+survival+in+kidney+transplant+recipients+are+both+enhanced+by+human+leukocyte+antigen+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching.</a> Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD4%2BCD25low+adaptive+T+regulatory+cells+suppress+delayed-type+hypersensitivity+during+transplant+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance.</a> J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).</li>
<li>Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+type+determines+the+mechanism+of+bystander+suppression+by+adaptive+T+regulatory+cells+specific+for+the+minor+antigen+HA-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1.</a> J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).</li>
<li>Jankowska-Gan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+reduction+of+immunosuppression+in+older+renal+transplant+recipients+who+exhibit+donor-specific+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation.</a> Transplantation. 88, 533-541 (2009).</li>
<li>Jankowska-Gan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretransplant+immune+regulation+predicts+allograft+outcome%3A+bidirectional+regulation+correlates+with+excellent+renal+transplant+function+in+living-related+donor-recipient+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs.</a> Transplantation. 93, 283-290 (2012).</li>
<li>Knechtle, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+and+limited+use+of+tacrolimus+to+avoid+rejection+in+an+alemtuzumab+and+sirolimus+regimen+for+kidney+transplantation%3A+clinical+results+and+immune+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring.</a> Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).</li>
<li>Haynes, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-specific+indirect+pathway+analysis+reveals+a+B-cell-independent+signature+which+reflects+outcomes+in+kidney+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients.</a> Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).</li>
<li>Burlingham, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17-dependent+cellular+immunity+to+collagen+type+V+predisposes+to+obliterative+bronchiolitis+in+human+lung+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants.</a> J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).</li>
<li>Bobadilla, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TH-17%2C+Monokines%2C+Collagen+Type+V%2C+and+Primary+Graft+Dysfunction+in+Lung+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).</li>
<li>Olson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+prostate+tumor+antigen-specific+CD8%2B+regulatory+T+cells+are+inhibited+by+CTLA-4+or+IL-35+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade.</a> J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).</li>
</ol>

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트랜스 생체 DTH 분석은 이식, 암,자가 면역 질환 환자에서 세포 매개 반응을 평가하는 잠재적 인 임상 응용 프로그램과 새로운 진단 테스트입니다. 이 리콜 T 이펙터 반응을 모니터링하는 데 유용뿐만 아니라 때문에 가치가있다,뿐만 아니라 그것은 T 규제 응답을 검색 할 수 있습니다. 인간의 DTH 규제를 감지하는 신뢰할 수있는 방법은 단독 요법 또는 내성 시험에 대한 후보자 환자에서 면역 억제 금단의 안전을 예측할 수 있습니다. TV-DTH는 MHC의 allorecognition의 간접적 인 경로를 감지 매우 민감합니다. 그러나 TV-DTH는 그대로 기증자 MHC 분자에 직접 alloresponse을 감지 수정할 수 있습니다. DTH의 기증자 항원 결합 억제를 검색하려면 단일 기증자의 HLA 클래스 I 또는 클래스 II을 표현 EBV-LCL 세포는 환자의 PBMC와 coinjected 할 수 있습니다. EBV-LCL은 DTH 분석 항원의 소스로 사용되었을 때, 세포는 10,0...

<table><tbody><tr><td>채혈용 ACD 튜브</td><td>BD</td><td>02-684-26</td><td></td></tr><tr><td>림프구 분리 배지</td><td>Cellgro</td><td>25-072-CV</td><td></td></tr><tr><td>덜베코 인산 완충 식염수</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CM</td><td>칼슘 제외 &amp;amp; 마그네슘</td></tr><tr><td>ACK 용해 버퍼</td><td>BioWhittaker</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>TT/DT 또는 EBV</td><td>Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc.</td><td></td><td>TT/DT 25 &amp;mu;주입당 g EBV 8 &amp;mu;g/주입</td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 억제제 PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>세포 수 측정을 위한 에오신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-6003</td><td></td></tr><tr><td>동종항원</td><td></td><td></td><td>정제된 HLA 항원 또는 합성 동종 펩타이드를 공여자의 무세포 용해물 대신 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>50 ml 멸균 원심분리 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 피펫 및 피펫터</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 세이프락 튜브</td><td>Costar</td><td>3213</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;l, 100 &amp;mu;l, 10 &amp;mu;멸균 팁이 장착된 pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈구계수기</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>대형 원심분리기 및 마이크로 원심분리기</td><td>Beckman Coulter/Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/2cc 또는 1cc 인슐린 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>14-826-79</td><td>28게이지</td></tr><tr><td>Vibracell 초음파 파쇄기</td><td>Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc</td><td></td><td>2 mm 프로브</td></tr><tr><td>다이얼 두께 게이지</td><td>Mitutoyo, 일본</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCID 마우스</td><td>Harlan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소플루레인</td><td>Piramal Healthcare</td><td></td><td>흡입 마취</td></tr></tbody></table>

항원 특정 규제 트랜스 생체 지연 형 과민 분석

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

지연 형 과민 반응 (DTH)은 숙주 면역 시스템은 최근 과거에 경험있는 외국 항원 (자세)에 대한 T 세포 의존 면역 반응의 생체 징후의 급격한입니다. DTH 반응은 종종 일반적으로 감작 후 몇 일 뒤에 초기 항원 경험과 도전 단계를 참조 감작 단계로 구분됩니다. 피부 테스트에 의해 입증 리콜 AG의 지연 형 과민 반응의 부족은 종종 anergy의 증거로 간주됩니다. 기존의 DTH 분석을 효과적으로 많은 미생물 감염을 진단하는 데 사용되었습니다. 이러한 림프구 침윤, 부종 및 조직 괴사와 유사한 면역 기능을 공유에도 불구하고, 직접 D​​TH 때문에 기증자의 항원 및 이식 손실 감작의 결과로 직접 분사의 가능성 이식 환자에서 가능한 진단 기술이 아니다. 이 문제를 방지하려면, 험투 마우스 &quot;트랜스 생체&quot;DTH 분석은 1,2 개발되었다. 이 테스트는 인간의 말초 혈액 단핵 세포 (말초 혈액) 및 특정 항원 pinnae에 피하 주사 또는 순진 마우스와 DTH와 같은 부종의 노상 18-24 시간 후 3 측정 된에 기본적으로 전송 DTH 분석이다. 식세포 나 높은 혈관 마우스 조직에서 T 세포 수지상 인간 항원 제시 세포에 의해 항원 프레 젠 테이션 염증 폭포를 트리거하고 붓기 반응의 결과로 마우스 면역 세포를 끈다. 반응은 항원 특이하고 사전 항원 감작이 필요합니다. TV-DTH 분석에 긍정적 인 기증자 반응 DTH 반응은 이식 환자는 이식 alloantigens 향해 염증성 면역 처리를 개발했다고 반영합니다. 이 분석의 가장 중요한 기능은 또한 방관자 억제를 일으키는 원인이 규제 T 세포를 감지하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 의 방관자 억제기증자의 항원의 존재 DTH 리콜 응답 허용 이식 2,4-14와 이식의 특징입니다. TV-DTH에 의해 alloreactivity 및 규제에 대한 이식의 모니터링은 거부 또는 악화 신장 기능의 높은 위험없이 면역 억제제의 감소 혜택을 누릴 수있는 환자의 하위 집합을 식별 할 수 있습니다. 유망한 지역은자가 면역 15,16의 모니터링 또한 종양 면역학 17 TV-DTH 분석의 응용 프로그램입니다.

1. TV-DTH 분석을 사용하여 기증자의 항원에 특정한 응답 신장 이식의 평가 신장 이식 기증자 반응 세포 성 면역을 테스트하기 위해 우리는 기증자의 항원 단독으로 또는 리콜 항원 파상풍 톡소이드 (TT)를 가진 환자의 PBMC를 주입했다. 양성 대조군 세포는 TT 형과 주입으로. 우리는 이식 지연 형 과민 반응의 세 가지 패턴 (그림 1)을 관찰합니다. 모든 환자는 자세 (TT)를 호출하기 위해 강력하게 대응했다. 환자 중 62 기증자의 항원 공여 항원의 존재 항원 반응을 리콜 표시된 연결 억제 (67 %)에 약한 반응을 특징으로 규제 패턴을 보여줍니다. 이 장기 이식 허용과 연관된 것으로 발견 된 패턴이다. 환자의 # 48 전시 기증자에 약한 반응의 기능을하지만 연결 억제 (또는 연결된 억제 &lt;50 %)가 비 규제 패턴. 이패턴이 자주 면역 억제제를 복용하는 환자에서 관찰되었다. 그러나 여전히 포스트 이식 면역 억제 약물을받는 일부 환자는 ...

우리는 잠재적으로 이식 거부의 높은 위험없이 이식 후 면역 억제제의 철수를 결정하는 데 사용할 수있는 유용한 진단 분석을 설명합니다. 분석은 지연 형 과민 반응의 원리를 사용하여받는 사람이 탑재 된 두 기증자 특정 이펙터 및 규제 면역 반응의 정확한 평가를 제공합니다.

지연형 과민반응(Delayed-type hypersensitivity response, DTH)은 숙주가 이전에 노출되었던 외래 항원(Ag)에 대해 T 세포 의존적 면역 반응을 일으키는 신속한 체내 발현 양상입니다.

이 실험 절차의 전체적인 목표는 trans vivo DTH 분석법을 사용하여 인간 피험자의 항원 특이적 염증성 및 항염증성 반응을 모두 모니터링하는 것입니다. 먼저, 인간 피험자의 말초혈액에서 말초혈액 단핵세포를 분리합니다. 그런 다음, 분리된 PBMC 준비물을 PBS와 혼합합니다.리콜 항원 테스트 항원 및 테스트 항원과 리콜 항원 혼합물을 준비합니다. 발바닥 사전 측정 단계를 진행하고 준비된 혼합물을 SKID 마우스에 주입합니다. 24시간 후에 발바닥 재측정을 수행합니다. 셋.지연형 과민반응(DTH) 반응의 결정적인 패턴은 조절성, 비조절성 및 민감화된 반응으로 가능합니다. trans vivo 지연형 과민반응 분석법은 항원의 소스가 이식 공여자의 세포인 동종 반응 반응과 같은 임상 파라미터를 결정하는 데 적용될 수 있습니다. 기존의 in vitro 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 단일 분석 시스템을 사용하여 동종 항원, 자가 항원 또는 종양 항원에 대한 염증 촉진 반응과 조절 반응을 모두 쉽게 검출할 수 있다는 점입니다.제 실험실의 연구원인 Egon이 혈소판 활성화를 방지하기 위해 acid citrate dextrose 튜브에 수집한 신선한 인간 말초혈액을 사용하는 절차를 시연하겠습니다. 표준 방법에 따라 lymphocyte separation medium을 사용하여 PBMC를 분리하십시오. 오염된 혈소판을 제거하기 위해 PBS로 PBMC 준비물을 세척하십시오.적혈구 오염이 눈에 띄게 나타나는 경우, CK 용해 버퍼를 사용하여 적혈구를 용해하십시오. 그 후 PBS Resus로 두 번 더 세척합니다. 동종 항원 분석을 위해 PBMC를 1mL당 1,000만 PBMC 농도로 PBS에 현탁하십시오.이전 단계에서 보여준 절차를 사용하여 기증자의 말초혈액에서 분리한 P BMCs로 시작합니다. 그 후 재현탁합니다. 기증자 세포를 1 mL당 120 million cells 농도로 PBS에 현탁하고, 단백질 분해를 방지하기 위해 1 µM의 PMSF를 첨가합니다.이제 2 mm 프로브 소니케이터를 사용하여 1초 간격으로 7회 펄스를 주어 세포 현탁액을 초음파 처리합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포의 90% 이상이 파괴되었는지 확인합니다.다음으로, 혼합물을 4°C에서 14,000 RPM으로 20분 동안 원심분리하십시오. 상층액을 safe lock 튜브로 조심스럽게 옮기고, 각 주입분당 단백질 농도를 표준 방법으로 측정하십시오. 10⁶개의 PBMC를 2 mL씩 7회분으로 분주하십시오.Safe lock 튜브를 사용하여 원심분리로 세포를 펠렛화합니다. 먼저, 35 µL의 PBS에 PBMC 음성 대조군 현탁액을 준비합니다. 그 다음 양성 대조군을 위해 회상 항원인 tetanus toxoid와 diptheria toxoid를 25 µL 첨가하고, PBS를 사용하여 주입 부피를 35 µL로 맞춥니다.공여체 특이적 반응을 평가하기 위한 실험 설계에 따라, 세포 펠렛을 10 µL의 공여체 항원과 25 µL의 PBS에 재현탁하여 총 부피를 35 µL로 맞춥니다. 실험적 공여체 항원 특이적 조절을 평가하려면, 10 µL의 공여체 항원과 25 µL의 리콜 TT DT 항원을 첨가하여 세포 펠렛을 35 µL로 재현탁합니다. isof fluorine으로 마우스를 마취시킨 후, 측정 부위의 일관성을 유지하기 위한 기준점을 제공하기 위해 스프링 로드 캘리퍼의 한쪽 가장자리가 발의 마지막 보행 패드에 닿도록 하여 발바닥 중앙에 배치하고, 게이지의 수치가 안정될 때까지 기다립니다.발바닥 주사를 위해 기저 발바닥 두께를 기록하십시오. 바늘 끝이 발가락을 향하고 사면(bevel)이 위를 향하도록 주사기를 배치하십시오. 이제 각 세포 현탁액을 마우스의 뒷발바닥에 피하 주사하십시오.첫째, 음성 대조군 준비물을 오른쪽 발 패드에 천천히 주입합니다. 다음으로, PBMC와 TT dt의 양성 대조군을 왼쪽 발 패드에 주입합니다. 이제 마우스를 케이지로 돌려보냅니다.두 번째로, 오른쪽 발바닥에 PBMC와 allo 항원을 주입하고, 왼쪽 발바닥에는 PBMC, allo 항원 및 TT dt를 함께 주입합니다. 주입 후 18~24시간 사이에 누출이 없는지 확인하십시오. 각 마우스를 isof fluorine으로 마취시킨 후 발바닥 부종 측정을 반복합니다.주사 후의 발 패드 두께에서 주사 전의 두께를 빼서 발 패드 부종 값을 구합니다. 그런 다음, 처리군에서 얻은 발 패드 부종 값에서 대조군 발 패드 부종 값을 빼서 항원 특이적 순 부종을 계산합니다. 양성 대조군 판독값이 회상 항원 TT DT에 대해 25 × 10⁻⁴ inches 이상의 양성 대조군 반응을 보이는지 확인하십시오.테스트가 유효한 것으로 간주되려면 PBS에 대한 배경 반응이 필요합니다. 다음으로, 공여자 항원이 있을 때 재자극 반응의 억제 정도를 결정합니다. 이 실험은 신장 이식 수혜자의 공여자 항원 특이적 반응 및 조절 능력을 평가합니다.이식 수혜자의 지연형 과민반응에는 조절성, 비조절성, 감작성의 세 가지 주요 패턴이 있습니다. 모든 환자는 회상 항원 tt의 양성 대조군에 강하게 반응했습니다. 환자 번호 62는 공여 항원에 대한 약한 반응과 공여 항원이 존재할 때 회상 항원 반응에 대한 뚜렷한 연관 억제가 특징인 조절성 패턴을 보여줍니다.이는 장기 동종이식 내성과 연관이 있는 것으로 밝혀진 패턴입니다. 환자 48번은 비조절성 패턴을 보이며, 이는 공여자에 대한 반응은 약하지만 연관된 억제 반응은 나타나지 않는 특징이 있습니다. 이러한 패턴은 면역억제제를 복용하는 환자들에게서 빈번하게 관찰되었습니다.환자 8번은 공여자 항원에 대한 높은 반응성과 연관된 억제 반응의 부재를 특징으로 하는 공여자 감작 패턴을 보입니다. 이러한 반응은 이식편 거부 반응과 관련이 있습니다. 임상 사례 연구에서는 관찰 시험에 참여한 대상자의 P BMC를 대상으로 공여자 특이적 간접 경로, T 작동 세포 및 T 조절 세포 반응을 분석하여 임상적 내성에서 공여자 특이적 조절의 역할을 평가하였습니다.공여 항원에 대한 간접적인 T 세포 반응은 등록 그룹 전반에 걸쳐 뚜렷한 스펙트럼을 나타냅니다. 환자의 임상 상태가 내성 상태에서 만성 거부 상태로 진행됨에 따라 발바닥 부종이 증가합니다. 여기서 연결 억제 분석(linked suppression assay)은 T 조절 세포 반응의 항공여 간접 경로를 측정합니다.이 데이터는 가장 내성이 강한 환자부터 중간 단계, 그리고 내성이 가장 낮은 만성 거부 반응 환자에 이르기까지 조절 반응이 감소함을 보여줍니다. 종합해 볼 때, trans vivo DTH 분석으로 측정된 면역 조절은 신장 동종이식편 수용의 중요한 기전인 것으로 보입니다.유망한 분야 중 하나는 자가면역 모니터링에 TDTH 분석법을 적용하는 것입니다. 폐세기관지염 폐쇄성성 세기관지염(BOS) 증후군의 병리적 과정에서 5형 콜라겐의 역할에 관한 연구 결과, 콜라겐에 긍정적인 반응을 보인 폐 이식 수혜자의 pbmc에서 BOS 발생의 상대적 위험도가 가장 높게 나타났으며, 건강한 대조군이나 콜라겐에서는 관찰되지 않았습니다.신장 이식 후 반응성을 보인 4명의 Good Pasture 증후군 환자들은 빈번하게 collagen five에 반응했습니다. TDTH 분석법은 암 환자의 pbmc가 종양 특이 항원에 반응하는지 테스트하는 데에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 전립선암 환자에게 PAP 특이적 T 조절 세포가 존재하면 PAP 항원 백신 접종에 대한 반응이 제한될 수 있습니다.TRANSVAAL DTH 분석법은 이식, 암 및 자가면역질환 환자의 세포 매개 면역 반응을 평가하는 임상 응용 분야의 새로운 진단 검사입니다. 이 방법은 T 작동 세포의 회상 반응을 모니터링하는 데 유용할 뿐만 아니라, 작동 T 세포 또는 조절 T 세포를 검출하기 위해 특정 사이토카인 측정에 의존하지 않으므로 T 조절 반응을 검출하는 데에도 사용할 수 있어 가치가 있습니다. 또한 매우 유연하며 광범위하게 적용 가능합니다.

trans-vivo-delayed-type-hypersensitivity-assay-for-antigen-specific

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

지연 유형 과민성 (DTH)는 CCR7 - 효과기 기억 T의 lymphocytes로 인한 염증 반응이다. 여기 루이스 쥐에 적극적으로 DTH를 유발하고 염증 반응을 모니터링하는 방법을 보여줍니다.

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보조 매개 세포독성 T 림프구 생성을 모니터링하기 위한 면역학적 기술

여기서는 쥐 모델에서 자가면역 관절염의 면역 요법을 위해 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 기능적 항원(Ag) 특이적 조절 T 세포(Tregs)를 개발하는 방법을 제시합니다.

자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

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여기, 선물이 프로토콜을 이식, 허용 오차를 유발 하 고 생체 외에서 그리고 vivo에서 평가 받는에서 고유한 셀 하위 집합의 진압 용량 및 기증자 또는 외 인 항 원 받는 사람의 면역 상태.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 T, B 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가

이 프로토콜의 목표 vivo에서 의 검출에 대 한 항 원 특정 murine 모델에서 목표 셀의 살인을 허용 하는 것입니다.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

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여기에서는 종양 항 원에 대 한 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 반응에서 면역 우세의 검사를 가능 하 게 하는 유 세포 분석 기반의 생체 사 멸 분석 법을 설명 한다. 이 우아한 분석을 기계 론 적 연구와 약물 효능 테스트에 사용 하는 방법의 예를 제공 합니다.

종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

배우세요 항원 특성 규제 트랜스 생체 지연형 과민 반응 분석법을 통해 이식 환자의 면역 반응을 모니터링하는 방법을. PBMC 분리 및 스키드 마우스 발바닥 주입을 활용하여 면역억제제 중단의 안전성을 평가하고 이식 거부 위험을 최소화하는 진단 기술을 익히세요.

항원 특정 규제 트랜스 생체 지연 형 과민 분석

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