양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

이 절차의 전반적인 목표는 수생 호랑이 도롱뇽 망막에서 얇은 조직 조각을 준비하여 광수용체와 2차 수평 및 양극성 세포의 동시 전체 세포 전압 클램프 기록에 사용하는 것입니다. 이것은 먼저 도롱뇽의 눈을 절개하고 니트로셀룰로오스 막 조각에서 망막을 분리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 망막의 얇은 조각을 잘라 기록 챔버에 배치하는 것입니다.

다음으로, 챔버를 직립 고정 스테이지 현미경에 놓고 패치 피펫을 망막 절편 위에 배치합니다. 마지막 단계는 시냅스전(presynaptic), 광수용체(photoreceptor), 시냅스후 수평세포(postsynaptic horizontal) 또는 양극성 세포(postsynaptic horizontal cell) 또는 양극성 세포(postsynaptic horizontal cell)로부터 전체 세포 기록을 얻는 것입니다. 궁극적으로, 쌍을 이룬 전체 세포 기록은 시냅스 방출을 조작하고 망막의 세포 간 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

망막 슬라이스 제제는 원래 프랭크 웨블린(Frank Werblin)과 샘 우(Sam Wu)의 실험실에서 개발되었으며, 단일 세포 제제와 달리 슬라이스 제제는 손상되지 않은 접촉을 유지했으며, 전체 산 망막 제제와 달리 망막을 슬라이스하면 다양한 망막층이 노출되어 다양한 세포 유형에 즉시 접근할 수 있습니다. 망막 슬라이스에서. 준비는 여러 세포에 대한 동시 기록 및 이미징 실험을 포함한 전기 생리학적 기록에 사용할 수 있습니다.

이 제제는 망막 뉴런 간의 시냅스 상호 작용을 연구하는 데 매우 유용한 것으로 입증되었습니다. 이 비디오에서는 호랑이 도롱뇽 망막을 사용하여 슬라이스를 준비하는 방법을 설명하고 성공과 실패의 차이를 만들 수 있는 몇 가지 작은 세부 사항을 강조합니다. 챔버를 조립하여 이 절차를 시작합니다.

레코딩 챔버를 가로질러 8-10mm 간격으로 두 개의 진공 그리스 구슬을 배치하여 슈퍼 파제(super fase)를 위한 채널을 형성하고 레티놀 슬라이스를 두 번째 그리스 비트에 삽입하고, 이 두 개의 그리스 구슬 각각보다 몇 밀리미터 더 높은 곳에 레티놀 슬라이스를 삽입하여 유출을 제한하기 위한 부담금 역할을 합니다. 그런 다음 챔버 끝에 작은 삼각형 모양의 Kim wipe를 놓아 기준 전극과 유체가 접촉하도록 합니다. 그런 다음 니트로셀룰로오스 멤브레인 조각을 유리 현미경에 평평하게 누릅니다.

두 개의 작은 진공 그리스 구슬에 밀어 넣습니다. 조직 슬라이서를 준비합니다. 양날 면도날을 네 조각으로 나눕니다.

그런 다음 그 중 하나를 슬라이싱 암에 부착합니다. 니트로셀룰로오스 여과지를 얇게 잘라 면도날의 절단면이 기록실에 평평하게 놓이도록 합니다. 다음으로, 참수로 도롱뇽을 안락사시킨 후, 현미경으로 작은 베니스 가위를 사용하여 눈에 핵을 삽입하고, 눈을 주변 안와와 연결하는 피부를 자릅니다.

그런 다음 눈을 앞으로 당기고 가위를 그 아래로 밀어 눈 근육과 시신경을 절단합니다. 그 후, 적출된 눈을 리놀륨 블록의 솜 바닥에 놓습니다. 이제 날카로운 수술용 칼날로 각막 중앙을 작게 절개합니다.

미세한 베니스 가위를 절개 부위에 밀어 넣고 절개를 아우라 세라타를 향해 방사상으로 확장하여 각막을 제거합니다. 그런 다음 리놀륨 블록 또는 절단 사이의 면을 회전시켜 아우라 세라타 주위를 둘레로 자릅니다. 눈 주위를 완전히 자른 후 각막과 수정체를 아이컵 옆에서 당겨 제거합니다.

남은 아이컵을 양서류 식염수로 적신 리놀륨 블록의 단단한 표면에 옮깁니다. 날카로운 면도날로 미세한 톱질로 공막을 끝까지 절단할 수 있도록 3등분합니다. 그런 다음 하나 또는 두 개의 IUP를 망막 표면이 아래를 향하도록 니트로셀룰로오스 막에 놓습니다.

나머지 조각에 추가 식염수를 담그십시오. 그런 다음 나중에 추가 조각을 자를 경우를 대비하여 냉장고에 보관하십시오. 이제 한 쌍의 미세한 집게로 IUP 조각을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 부드럽게 누릅니다.

니트로셀룰로오스 막과 IUP 조각을 차가운 양서류 식염수 몇 방울에 담그십시오. 그런 다음 니트로셀룰로오스 막과 iup의 가장자리에 있는 Kim 물티슈 조각을 만져 식염수를 배출합니다. 그 후, IUP를 차가운 양서류 식염수 몇 방울과 함께 니트로 셀룰로오스 막에 담그십시오.

다시 말하지만, 공막(sclera choroid) 망막 색소 상피를 벗겨내어 망막을 분리합니다. 망막이 단단히 부착되지 않으면 김 물티슈로 식염수를 배출하십시오. 망막을 니트로셀룰로오스 막으로 더 단단히 당기려면 식염수를 교체하고 필요한 경우 절차를 반복하십시오.

다음으로, 차가운 양서류 식염수로 챔버를 채웁니다. 조직 슬라이서의 스테이지로 옮깁니다. 그런 다음 면도날을 부드럽지만 단단히 눌러 망막과 니트로셀룰로오스 막을 125미크론의 얇은 스트립으로 자릅니다.

망막 전체를 조각으로 자른 후 망막 조각을 하나씩 기록 챔버의 메인 채널로 옮깁니다. 슬라이스를 옮기려면 멤브레인 스트립을 제자리에 고정하고 그 아래의 챔버를 밀어 넣습니다. 슬라이스가 챔버의 중앙 부분 위에 있을 때 물에 잠긴 상태로 유지하십시오.

니트로셀룰로오스 멤브레인의 가장자리를 진공 그리스 스트립에 삽입하고 90도 회전합니다. 망막층을 보려면 모든 조각에 망막이 없더라도 니트로셀룰로오스 멤브레인을 유리 표면에 평평하게 누릅니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인 스트립을 약 밀리미터 일정한 간격으로 배치하여 표면 장력을 분해하여 유체 흐름을 개선하는 데 도움이 됩니다.

관류 채널의 전체 길이를 따라 슬라이스가 배치될 때까지 슬라이스를 하나씩 계속 전송합니다. 모든 슬라이스를 옮긴 후 기록 챔버를 정립 고정 스테이지 현미경의 스테이지로 이동합니다. 기준 전극 리드를 증폭기 헤드 stage의 접지선에 연결합니다.

긴 작동 거리 물 침수 40-60 x 대물렌즈를 사용하여 슬라이스에 초점을 맞춥니다. 다음 슈퍼. 산소로 거품을 일으킨 양서류 식염수와 분당 1mm의 속도로 조각을 융합합니다.

흡입 라인을 챔버의 출력 라인에 연결합니다. 그런 다음 흡입 바늘의 비스듬한 끝을 회전하거나 챔버 끝에 있는 김 닦아내기를 유출 바늘 끝의 구멍에서 더 가깝거나 더 멀리 이동하여 유입의 균형을 맞추기 위해 유출을 조정합니다. 어두운 빛이나 적외선에서 슬라이스를 검사하십시오.

다음으로, 한 쌍의 세포, 광수용체(photoreceptor) 및 도매를 위한 근처의 수평 또는 양극성 세포를 식별합니다. 세포 내 용액으로 실험하기 전에 준비된 Philip 피펫을 기록하고 전극 홀더에 장착합니다. 다음으로, 현미경 대물렌즈를 약간 들어 올립니다.

광수용체 피펫을 대물렌즈 아래에 놓습니다. 그런 다음 팁이 슬라이스 바로 위에 위치하도록 낮추고 동시에 초점을 조정합니다. 너무 멀리 가지 않기 위해.

두 번째 피펫에 대해 이 절차를 반복합니다. 다음으로, 5 - 10 millivolt 탈분극 펄스로 피펫 저항을 확인합니다. 증폭기의 기준선 전류 레벨에서 오프셋을 조정합니다.

그 후, 약간의 양압을 가하고 그 동안 시냅스후 피펫을 수평 또는 양극성 세포체와 접촉하도록 배치합니다. 그런 다음 시냅스전 피펫을 위치시켜 간상체 또는 원뿔 광수용체의 세포체와 접촉하도록 합니다. 저항 방출을 모니터링하는 동안, 시냅스후 피펫에 대한 양압, 때로는 양압의 방출이 기가 옴 밀봉을 형성하기에 충분합니다.

팁 저항이 100메가옴 이상으로 증가한 후 마이너스 60밀리볼트의 유지 전위를 적용합니다. 그런 다음 giga om seal이 확보되면 피펫 정전용량 과도 현상을 취소합니다. 패치 클램프 증폭기의 커패시턴스 보상 회로를 사용하여 광수용체 피펫으로 천장 절차를 반복하고 마이너스 70 밀리볼트의 유지 전위를 적용하고 피펫 커패시턴스를 취소합니다.

일시적인 경우 각 세포에 흡입을 가하여 패치를 파열시킵니다. 패치의 파열은 전체 세포 정전 용량 과도기의 출현으로 분명합니다. 이제 플래시 플래시를 적용하고 마이너스 120에서 플러스 40 밀리볼트까지 20 밀리볼트 단위로 일련의 전압 단계를 전달하여 시냅스후 세포의 정체성을 생리학적으로 확인하십시오.

세포가 시냅스적으로 연결되어 있는지 평가하려면 25-100밀리초 60밀리볼트를 전달합니다. 광수용체(photoreceptor)로 탈분극(depolarization)을 단계적으로 진행하고 시냅스 후 전류(post-synaptic currents)를 찾습니다. 2차 뉴런에서는 도롱뇽 망막의 수직 조각에 있는 뉴런의 빛 반응의 대표적인 흔적이 있습니다.

원뿔 수평 셀과 오프 바이폴라 셀은 모두 빛의 시작에 대한 응답으로 바깥쪽 전류를 표시합니다. 여기에서 수평 및 양극성 세포 기록에서 섬광에 따른 두드러진 내부 전류는 광 수용체가 광 오프셋에서 탈분극될 때 광수용체에서 글루타메이트 방출이 증가했기 때문에 발생합니다. 양극성 세포는 빛이 시작될 때 내부 전류로 반응하는데, 이는 대사성 글루타메이트 수용체 신호 캐스케이드를 전달하는 징후와 트립 1 채널의 활성화로 인해 발생합니다.

수평 셀과 바이폴라 셀은 전류 전압 관계에 의해 서로 구별될 수 있습니다. 수평 셀은 일반적으로 입력 저항이 500메가옴 미만인 선형 또는 내부 정류 전류 전압 관계를 갖고, 바이폴라 셀은 외부 정류 전류 전압 관계와 0.5에서 2기가 옴 사이의 더 높은 입력 저항을 갖습니다. 이 그림은 원뿔 수평 세포 쌍(cone horizontal cell pair)과 원뿔 오프 바이폴라 세포 쌍(cone off bipolar cell pair)의 기록에서 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다.

각각의 경우에서, 영하 70 밀리 볼트의 유지 전위에서 원뿔을 마이너스 10 밀리 볼트로 탈분극하면 원뿔에서 전압 게이트 칼슘 전류가 발생하고 시냅스 후 안쪽으로 빠르게 이동했습니다. 수평 또는 양극성 세포 Retinal slice의 전류. 제제는 망막의 해부학과 생리학에 관한 수백 건의 연구에서 사용되어 왔습니다.

동시에 여러 세포의 기록과 이미징을 용이하게 하기 때문에 여러 세포의 반응을 동시에 검사하는 데 특히 유리합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 망막을 해부하고, 얇은 망막 절편을 절단하고, 기록실에 배치하고, 시냅스로 연결된 자아 쌍에서 대량 녹음을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.