Name: 양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 배우세요 양서류 망막 슬라이스 준비와 광수용체 및 2차 신경세포 동시 전체세포 기록법을 통해 망막 시냅스 처리 과정을 연구하는 방법을. 이 기술은 신경과학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 실명 보건 부여 EY10542의 국립 연구소를 방지하기 위해 연구에 의해 투자되었다.

1. 망막 슬라이스 준비 <ol><li> 챔버 (디자인 그림 1)를 조립합니다. 장소에 진공 그리스의 두 구슬, superfusate 채널을 형성하고 망막 조각을 포함 할 수있는 녹음 챔버를 통해 이격 ~ 8~10mm. 제방 및 제한 파급 역할을하는 몇 밀리미터 멀리 밖으로 그리스의 두 구슬의 각 넘어 그리스의 두 번째 비드를 추가합니다. 기준 전극과 유체 접촉을 보장하기 위해 챔버의 끝에서 KimWipe의 작은 삼각형 조각을 놓습니다. </li><li> 진공 그리스의 두 개의 작은 구슬에 유리 현미경 슬라이드에 대한 평 니트로 셀룰로오스 막 (0.8 μm의 기공 ~ 5 × 10 ㎜)의 조각을 누르십시오. 이 고착 망막을 방지 할 수 피하고, 니트로 셀룰로오스 멤브레인의 중앙 바로 아래에 기름을 넣어. </li><li> 조직 슬라이서를 준비하려면 4 조각으로 두 배 가장자리 면도날을 중단하고 슬라이스 팔 하나를 첨부합니다. nitrocellul의 얇은 조각을 잘라OSE는 막 면도날의 최첨단의 녹음 챔버에 편평하게 놓여 있으며 따라서 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 깨끗하게 절단 할 수 있도록합니다. </li><li> 해부 역에서 얼음에 양서류 식염수 용액 (표 1)의 작은 비커를 유지합니다. </li><li> 잘린 도롱뇽를 안락사. 척수를 통해 sagitally 머리 속을 Hemisect. 면의 조각에 머리의 위치를​​ 절반 리놀륨 블록 위에 양서류 식염수에 적신. 머리의 나머지 절반은 하루에 나중에 사용하기 위해 촉촉한 종이 타월로 싸서 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 눈을 명백히. 작은 Vannas 가위를 사용하여 주변의 궤도에 눈을 연결하는 피부를 잘라. 주위의 안와 조직에서 눈의 앞쪽을 확보 한 후, 궤도에서 눈을 확보, 눈의 근육과 시신경을 잘라 눈 밑에 가위 앞으로 눈을 당기고 밀어 넣습니다. </li><li> 에 목화의 침대에 탈핵 눈에 배치리놀륨 블록. 반 머리를 폐기하십시오. 안구의 뒤쪽에서 초과 안와 지방을 트리밍합니다. </li><li> 날카로운 수술 용 칼날로 각막의 중앙에 작은 절개를합니다. 절개에 좋은 Vannas 가위를 슬라이딩 오라 세라를 향해 방사상으로 컷을 확장하여 각막을 제거합니다. 리놀륨 블록이나 컷 사이면을 회전하여 오라 세라 주위에 원주 방향으로 잘라. </li><li> 눈 주위의 모든 방법을 절단 한 후, 아이 컵의 측면에서 그들을 당겨 각막과 렌즈를 제거합니다. 리놀륨 블록의 하드 표면에 결과 아이 컵을 이동 양서류 식염수에 적신. 당신이 공막을 통해 모든 방법을 차단했는지 확인하는 좋은 톱질 동작을 사용하여 날카로운 면도날 분의로 컷. </li><li> 망막 표면에 니트로 셀룰로오스 막에 아​​이 컵 대신 하나 또는 두 개의 조각을 아래로 향하게. 잠수함 추가 식염수 남은 조각을 1 ~ 4 ° C.에 냉장고에 배치 </li><li> 창ntly 미세 집게를 가진 니트로 셀룰로오스 막에 아​​이 컵의 조각을 누릅니다. 망막 준수하는 데 도움이 KimWipe와 가장자리 차가운 양서류 식염수와 오점 몇 방울 잠수함 니트로 셀룰로오스 막과 아이 컵 조각. 차가운 양서류 식염수 멀리 거피 (때문에 표백 로돕신의 존재에 분홍색 나타날 수 있음) 망막을 분리하는 공막 / 맥락막 / 망막 색소 상피 세포의 여러 방울 다시 한번 물속에 아이 컵과 니트로 셀룰로오스 막. 필요한 경우, 망막을 무료로 시신경을 잘라. </li><li> 망막이 단단히 부착되지 않은 경우, 니트로 셀룰로오스 막에 더 단단히 망막을 당겨 KimWipe과 염분을 멀리 배수. 식염수를 교체합니다. 필요한 경우 반복합니다. </li><li> 차가운 양서류 식염수와 챔버를 입력하고 조직 슬라이서의 단계로 전송할 수 있습니다. 버니어 마이크로 미터를 돌려 다른 한 끝에서 작업, 얇은 스트립으로 망막 니트로 셀룰로오스 막 슬라이스125 μm의 단위로합니다. 부드럽지만 확실히 망막 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 통해 면도날을 누릅니다. </li><li> 녹음 챔버의 주요 채널로 니트로 셀룰로오스 막 지구를 이동하여 망막 조각을 전송합니다. 무료 막 지구를 들어 올린 후 슬라이스 침수 유지해야되고, 그 아래에 실을 움직이면서 제자리에 고정. 망막 레이어를 볼 수있게 90도 회전, 진공 그리스의 스트립 니트로 셀룰로오스 멤브레인의 가장자리를 포함합니다. </li><li> 유리 표면에 니트로 셀룰로오스 막 평면을 누릅니다. 모든 조각에 망막이없는 경우에도 표면 장력을 깰 수 있도록하고 유체의 흐름을 개선하기 위해 관류 채널의 전체 길이를 따라 일정한 간격 (간격 ~ 1mm)에서 니트로 셀룰로오스 막 장소 스트립. </li></ol> 2. 쌍으로 전체 세포 녹음 <ol><li> 조각이 모두 전송 된 후, 고정, 수직의 단계로 녹음 챔버로 이동무대 현미경과 기준 전극 리드를 연결합니다. 긴 작동 거리, 침수, 40-60X 목표를 사용하여 슬라이스에 초점을 맞 춥니 다. 현미경은 진동을 감쇠하는 공기 테이블에 배치하고 전기 간섭을 줄이기 위해 패러데이 케이지로 묶어야합니다. </li><li> 100 % O 2 부풀어 양서류 생리 식염수와 1 ML / 분의 속도로 지속적으로 슬라이스를 Superfuse. 유입과 유출의 균형이 있는지 확인하고, 흡입을 연결합니다. 유출은 흡입 바늘의 베벨 끝을 회전하거나 가까이 또는 멀리 유출 바늘의 실의 끝에 KimWipe를 이동하여 조절 할 수 있습니다. 준비는 상온에서 보관 또는 펠티어 장치 또는 단순히 현미경 스테이지에 얼음 팩을 설정하여 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 어둡거나 적외선 조명 아래 조각을 검사하고 세포의 한 쌍의 식별 - 전체 셀 녹음 대상 - 광수 (봉 또는 콘) 및 인근의 수평 또는 바이폴라 셀. 봉 내가 할 수그들의 큰 세포 기관과 탁월한 막대와 같은 외부 세그먼트 (그림 2A)에 의해 dentified. 콘로드보다 작은 작은 테이퍼 외부 세그먼트가 있습니다. 양극성 세포와 수평 세포 somas은 내부 핵 계층의 세포 기관의 가장 바깥 쪽 행 (; 그림 2B 및 2C INL)에 있습니다. </li><li> 슬라이스를 준비하기 전에, 붕규산 유리 (1.2 mm 외부 직경, 유리 필라멘트 0.95 mm 내경)에서 마이크로 피펫을 제조하는 피펫 풀러를 사용합니다. 각 마이크로 피펫의 팁 직경 ~ 1-2 미크론이어야한다. </li><li> 비금속 충전 바늘 (예를 들어, 한 1 cc의 주사기 또는 MicroFil에서 제조)를 사용하여, 세포 내 용액 (표 1) 피펫을 채우고 전극 홀더에 부착합니다. </li><li> 약간 현미경 목표를 올린다. 목적 아래 광수 피펫을 배치 한 후 끝이 바로 조각 위에 오도록 내려. t와 반복그는 두 번째 피펫. </li><li> 앰프의 기준 현재 수준에서 오프셋을 조정합니다. 5-10 MV 탈분극 펄스 피펫 저항을 확인하십시오. 우리는 일반적으로 피펫을 사용하는 MΩ 10-15의 범위, 샤프트와 양서류 피펫 솔루션의 낮은 삼투압의 긴 테이퍼의 결과. 높은 삼투압 포유류 솔루션으로, 이와 같은 피펫은 MΩ ~ 8-12의 저항 값을 나타냅니다. 우리는 3-4 MΩ 양서류 솔루션의 저항 값이 큰 팁 직경을 사용하는 동안, 낮은 접속 저항에 의해 제공되는 장점이 세포막에 바다 표범 어업에 큰 어려움과 칼슘 전류와 기타 제 메신저의 더 빠른 런에 의해 상쇄된다 민감한 반응. </li><li> 약간의 양압 위치에게 시냅스 피펫을 적용하면서 연락처를 수평 또는 바이폴라 세포체 있도록. 다음 연접 피펫을 위치가 연락처 막대 또는 콘 광수의 세포체 있도록. 녹음 APPE피펫 팁은 오히려 소마보다 내부 세그먼트를 문의 할 때 AR 특히 콘에서 안정 될 수 있습니다. </li><li> 저항을 모니터링하면서, 시냅스 후 피펫에 긍정적 인 압력을 놓습니다. 때때로, 긍정적 인 압력 릴리스는 기가 옴 밀봉을 형성하기에 충분합니다. 그렇지 않은 경우, 1 ML의 주사기이나 입으로 부드러운 흡입을 적용합니다. 팁 저항 MΩ&gt; 100으로 성장 한 후, -60 MV의 개최 가능성을 적용합니다. 기가 옴 씰을 얻은 후, 모든 피펫 용량 과도을 null로 -70 MV의 개최 가능성을 적용, 광수 피펫의 밀봉 절차를 반복합니다. </li><li> 파열 입이나 차례의 각 셀에 흡입을 적용하는 주사기를 사용하여 패치. 막대, 콘 및 양극 세포는 부드러운 흡입과 파열 일반적으로 것입니다. 가로 셀 전체 셀 구성을 얻는 것은 &quot;기력&quot;F와 함께 제공되는 강력한 빠른 전압 펄스와 함께 큰 흡입 (3 CC의 주사기 예)가 필요할 수 있습니다패치 클램프 증폭기의 eature. 전체 셀 구성의 막 설립의 파열은 전체 셀 용량 과도의 모양으로 분명있을 것입니다. </li><li> 라이트 플래시를 적용하고 20 MV 증가 (그림 3과 4)의 -120 ~ +40 MV에서 전압을 일련의 단계를 제공함으로써 생리 학적 시냅스 후 세포의 ID를 확인합니다. </li><li> 세포의 쌍 시냅스 연결되어있는 경우, 광 수용체에 대한 간단한 (25-100 밀리 초), 60 MV 단계 탈분극을 제공합니다 (-10 mV에서, L-형 전압 게이트 칼슘 전류의 피크 부근)와보고 평가하기 두 번째 순서 뉴런에서 시냅스 후 전류 (그림 5)에 대한. 강한 탈분극 단계 콘 (그림 5) 소포 릴리스의 파열에 의한 시냅스 수평 또는 OFF 바이폴라 셀에 빠른 과도 안쪽 시냅스 후 전류를 연상한다. </li></ol>

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망막 슬라이스 준비는 회로 및 시각 정보를 처리하는 망막에 의해 고용 메커니즘을 분석하기위한 매우 유용한 입증되었습니다. 사전 및 사후 시냅스 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음을 얻을 수있는 능력은 이러한 노력에 특히 도움이되었습니다. 다른 망막 층이 노출되기 때문에 쌍으로 전체 세포 녹음 평면 마운트 망막 준비보다 슬라이스로 달성하기가 훨씬 쉽습니다. 또한, 때문에 그들의 큰 망막 신경 세포의, 도롱뇽은 망막 준비로 오랜 역사를 가지고 있으므로 특히 잘 특성화 모델 시스템을 제공합니다. 연습으로, 도롱뇽 망막의 건강 조각은 정기적으로 준비 할 수 있습니다. 몇 가지 주요 단계가 성공과 실패의 차이를 만들 수 있습니다. 1) 그것은 완전히 유리 표면과 조각에 평평 있도록 면도날이 조직 슬라이서에 장착되어 있는지 확인하지만 조직과 underlyi 모두NG 니트로 셀룰로오스 막. 당신은 니트로 셀룰로오스 막을 통해 깨끗한 컷 한 경우 면도날은 유리 슬라이드의 표면을 공격, 당신은 희미한 클릭 소리가납니다. 2) 망막 니트로 셀룰로오스 막에 부착 가지고 있는지 확인하십시오. 그렇지 않으면, 망막의 절차 단계에서 막에서 멀리 떠 있습니다. 3)이 표면 세포의 대부분을 손상시킬 수로 공기를 잘라 조각을 노출하지 마십시오. 4) 망막 층이 해부 현미경 명백한가되도록 슬라이스와 니트로 셀룰로오스 막 유리 슬라이드에 평평하게 거짓말을해야합니다. 5) 녹음 챔버를 넘쳐 방지하기 위해 superfusate 유입과 유출의 비율을 균형. 이 갑작스러운 조직의 움직임을 일으킬 수 있습니다 솔루션 수준의 급격한 변화를 방지 할 수 있습니다. 6) 서로 가까운 세포의 건강한 쌍을 선택합니다. 부드러운 세포질을 가진 세포는 거친 세포질을 가진 세포보다 건강이다. 슬라이스 깊은 세포는 그대로 시냅스 죄수를 유지 가능성이 더 높습니다찾아낸 연락처. 7) 피펫 팁 세포에가는 길에 분해 또는 다른 조직이나 이물질에 대하여 닦았되지 않았는지 확인합니다. 8)는 파편이나 어려운 품질을 전체 셀 녹음을 얻을 수 있습니다 둘 다 거품으로 막혀 있지 않은지 확인하기 위해 피펫 저항을 확인하십시오. 오히려 니트로 셀룰로오스 필터 종이에 망막을 붙이는 것보다, 일부 연구자들은 한천 블록에 망막을 포함하고 망막 조각을 잘라 vibratome를 사용합니다. 우리는이 방법을 시도하지 않았지만, 김 등은 11.는 두 가지 방법의 장점을 설명합니다. 자신의 경험에서, 한천 기반의 접근 방식은 잘 묘사 망막 층과 평면 조각의 더 일관된 수익률을 제공하지만 필터 종이 기반의 접근 방식은 건강한 광수를 얻을 수 있습니다. 막대와 콘 멤브레인 전위의 변화로 빛을 transducing에 대한 책임이 있습니다. 쌍 녹음과 함께, 막대 또는 콘 막 잠재력은 속임수 장난감이 될 수 있습니다세포 유형을 식별하는 데 도움이 동안 중요하지 않을 수 있습니다, 직접 이렇게 빛이 응답을 생성 할 수있는 능력을 ated. 따라서 우리는 종종 하얀 빛의 조각을 준비합니다. 그림 반응에 의해 설명 그러나, 밝은 조명 아래에서 준비하는 경우에도 도롱뇽 망막 뉴런은 큰 빛 응답을 생성 할 수 있습니다. 3. 이 큰 외부 세그먼트 볼륨 발색단의 비교적 큰 저수지에 부분적으로 기인하지만 콘 12 11 시스 망막 재생하는 뮐러 세포의 능력을 반영 할 수 있습니다. 완전히 어두운 적응 빛의 응답을 얻기 위해, 하나는 적외선 조명 아래 조각을 준비 할 수 있습니다. 적외선 빛 아래에서 해부를 위해, 우리는 해부 현미경의 접안에 GenIII 이미지 승압기를 (Nitemate NAV3, 리튼 산업, 템피, 애리조나) 첨부 적외선 LED 플래쉬와 조직을 조명. 슬라이스 및 해부 현미경하에 실시되지 않는 다른 절차를 위해, 우리는 헤드 마운트 IMA를 고용GE의 증강. 패치 피펫의 배치를 위해, 우리는 똑바로 고정 단계 현미경에 장착 된 적외선에 민감한 CCD 카메라 (예 : Watec 502H, Watec 주식 회사, 미들, NY)를 사용하여 조각을 시각화. 이러한 예방 조치로, 하나는 단일 광자 감도 6, 13을 전시 막대 반응을 얻을 수 있습니다. 망막 조각에서 하나의 작업 제한이 큰 분야 망막 뉴런의 긴 세포 프로세스는 깔끔히 절차를 수행하는 동안 자신의 수상 돌기의 많은 손실 될 수 있습니다. 망막 슬라이스 준비 따라서 시냅스 연락처 세포체에 가까운 공정을 포함하는 세포의 생리학을 공부에 더 유용합니다. 양서류와 포유류의 망막은 동일한 세포 유형의 많은을 공유하고 유사한 생리적 메커니즘에게 14-16를 사용합니다. 도롱뇽 망막 포유류의 망막의 여러 측면에 대한 좋은 모델이지만, 한 가지 중요한 차이점은 포유류의 전용로드 경로의 존재로 나타납니다 invoAII 무 축삭 세포 14 위에 특수 막대 양극 세포의 아이브 연락처. 도롱뇽 망막의 추가 제한이 종을 위해 특별히 개발 된 유전 도구의 작은 수입니다. 그러나 다른 종의 타겟이 잘 보존 된 지역이 도롱뇽 성공적으로 사용할 수있는 항체 shRNA 시약, 등 수 많은 작은 분자 억제제 및 펩티드 시약. 또한, 기술에 몇 가지 수정을 망막 슬라이스는 이러한 도구 중 일부는 더 쉽게 사용할 수있는 다른 종에서 준비 할 수 있습니다. 짝을 전체 셀 녹음에 대한 유틸리티를 넘어 도롱뇽 망막 슬라이스 준비는 다른 접근 방식의 다양한 의무이다. 위에서 언급 한 바와 같이, 망막 슬라이스는 다양한 전압 클램프 프로토콜 17과 함께 빛 반응을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 망막 신경 세포는 칼슘에 민감한 형광 염료와 함께로드 할 수있는 +, 염소 - 또는 나+ 패치 피펫을 통해 또는 목욕 응용 프로그램 15,18-20으로 소개했다. 시냅스 리본 21에 바인딩 형광 펩타이드 패치 피펫을 도입 할 때 형광을 결합, 심하게 선택적 리본 22 손상에 대한 이미지 리본 10에 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 막대에서 개별 칼슘 채널과 콘 시냅스 터미널 (23)의 움직임을 모니터링하는 양자점과 함께 망막 슬라이스를 사용했습니다. 따라서, 수직 망막 슬라이스 기본 시냅스 메커니즘과 시각 신호 전달 경로의 첫 번째 시냅스에서 수행 고유 한 처리 기능을 연구하기위한 다양한 실험 준비입니다.

<table><tbody><tr><td>티슈 슬라이서</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td></td></tr><tr><td>양날 면도날</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>Millipore</td><td>AAWP02500</td><td>Type AAWP 0.8 mm pore</td></tr><tr><td>Borosilicate glass pipettes</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW120F-4</td><td>1.2mm OD 0.95 mm ID</td></tr><tr><td>Ag/AgCl pellet</td><td>Warner</td><td>E206</td><td></td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>34ga 충전 바늘, 67mm 길이</td></tr></tbody></table>

양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

망막 신경 과학의 중심 과제 중 하나는 망막 신경 회로와 어떻게 그 연결이 뇌에 전달되는 신호를 형성에 대한 책임을 이해하는 것입니다. 광자는 시신경을 통해 처리와 뇌의 중심 대상으로 전달됩니다 다른 망막 신경 세포에 전달, 전기 신호로 그 에너지를 변환로드와 콘 광수에 의해 망막에 감지됩니다. 망막 3,4의 출력 세포 - 망막 회로 및 영상 처리에 중요한 초기 통찰력 망막 신경절 세포의 급상승 활동의 전기 생리학 녹음에서 나중에를 Cajal 1,2의 조직 학적 연구로부터 와서. 망막에 영상 처리에 대한 자세한 이해는 광수의 망막 신경절 세포에 대한 경로의 각 단계에서의 신호에 대한 이해가 필요합니다. 그러나 많은 망막 세포 유형은 가시 있습니다전기 생리학 녹음 상대적으로 액세스 할 수 있으므로 조직에서 깊은 이었죠. 이 제한은 망막 층의 각 내에 거주 세포가 명확하게 볼 수와 전기 생리학 녹음에 액세스 할 수있는 수직 슬라이스와 협력하여 극복 할 수 있습니다. 여기, 우리는 애벌레 호랑이 도롱뇽 (Ambystoma tigrinum)에서 망막의 수직 부분을 만들기위한 방법을 설명합니다. 이 혼합물은 원래 날카로운 미세 전극 5,6와 기록을 위해 개발되었지만 동시에 녹화하는 동안, 우리는 우리가 광수의 막 잠재력을 조작하는 광수와 2 차 수평 및 양극성 세포에서 이중 전체 셀 전압 클램프 녹음하는 방법을 설명하는 포스트 - 수평 또는 양극성 세포 시냅스 반응. 호랑이 도롱뇽의 광수이 t를 수행하기에 이상적인 준비하고, 포유 동물 종에 비해 상당히 크다그의 기술적으로 도전적인 실험 방법. 잘 토닉 신경 전달 물질의 방출 7의 높은 비율을 유지하기에 적합합니다로드와 콘 광수, 등 뉴런의 단지 소수에서 발견 전문 시냅스 구조 -이 실험은 시냅스 리본의 신호 특성을 프로빙을 향해 눈을 가진 설명 8 - 그리고 방법이 처음으로 망막 시냅스의 고유 한 신호 특성에 기여한다.

도롱뇽 망막의 수직 조각의 뉴런에서 빛 반응의 대표적인 흔적은 그림 3에 나와 있습니다. 콘, 수평 세포와 양극 세포 OFF는 모든 빛의 발병에 대한 응답으로 외부 전류를 표시합니다. 수평 및 양극성 세포 녹음에서 빛을 플래시 다음과 탁월한 내향 전류들은 빛의 오프셋 (offset)에 탈분극과 광 수용체에서 글루타메이트의 증가 릴리스에서 발생합니다. ON 바이폴라 셀 기호 반전 대사성 글루타민산 염 수용체 신호 폭포와 TRPM1 채널 9의 활성화로 인한 빛의 발병 내향 전류로 응답합니다. 수평 세포와 쌍극 세포들은 IV의 관계 (그림 4)에 의해 서로 구별 할 수 있습니다. 양극 세포는 높은 입력 저항을 가지고있는 동안, 수평 세포는 일반적으로 선형 또는 내심 IV를 정류하고 낮은 입력 저항 (그림 4A MΩ &lt;500)이(0.5-2 GΩ)와 나는 겉으로는 - 정류 - V (그림 4B)를 그림 5는 콘 수평 세포 페어 (그림 5A)와 콘 OFF 바이폴라 셀 쌍 (그림 5B)의 기록에서 대표적인 결과를 보여줍니다.. 각 -70 MV의 지주 잠재력 -10 mV에서 콘을 탈분극은 수평 또는 바이폴라 셀 콘 빠른 안쪽 EPSC 전류 전압 게이트 칼슘을 유발. 이 강력한 자극 ~ 47 PA / 리본 10 EPSC의 결과로 각 시냅스 리본에서 ~ 20 소포를 쉽게 - 박리 풀을 비우기에 충분합니다. 그림 5A의 수평 세포 EPSC는 연접 콘에서 5 리본 연락처를받은 것을 제안, 232 펜실바니아했다. 오프 바이폴라 셀 178 펜실바니아 EPSC (그림 5B)에서 유사한 추정치는 연접 콘에서 4 리본 연락처를 수신하는 것이 좋습니다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; 양서류 생리 식염수 </td><td> 시냅스 피펫 </td><td> 시냅스 피펫 </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 116 밀리미터 </td><td> 3.5 MM </td><td> 3.5 MM </td></tr><tr><td> KCl을 </td><td> 2.5 mM의 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 염화칼슘 </td><td> 1.8 mM의 </td><td> 1 밀리미터 </td><td> 1 밀리미터 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0.5 mM의 </td><td> 1 밀리미터 </td><td> 1 밀리미터 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 MM </td><td> 10 MM </td><td> 10 MM </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 5 밀리미터 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CS-글루타민산 * </td><td></td><td> 40 mM의 </td><td></td></tr><tr><td> CS-글루코 ** </td><td></td><td> 50 mM의 </td><td> 90 mM의 </td></tr><tr><td> 테트라 에틸 염화 </td><td></td><td> 10 MM </td><td> 10 MM </td></tr><tR&gt; <td> ATP-밀리그램 </td><td></td><td> 9 개 mm </td><td> 9 개 mm </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0.5 mM의 </td><td> 0.5 mM의 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5 밀리미터 </td><td> 5 밀리미터 </td></tr><tr><td> 산도 *** </td><td> 7.8 </td><td> 7.2 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> 삼투압 **** </td><td> 245 mOsm </td><td> 240 mOsm </td><td> 240 mOSM </td></tr></tbody></table> * CS-글루타민산은 피펫 용액에 40 밀리미터 CsOH를 40 mM의 L-글루타민산 산을 중화에 의해 이루어집니다. * CS-글루 콘 산염의 1 M 재고가 45~50% D-글루 콘산으로 CsOH를 용액을 중화에 의해 이루어집니다. *** pH는 피펫 솔루션에 대한 세포 솔루션 CsOH를 위해 NaOH를 함께 조정되어야한다. **** 바로 아래 피펫 솔루션의 삼투압을 유지하는 것은 세포 용액의 세포 부종을 방지하고 기록의 수명을 향상시킵니다. 테이블1. 이 프로토콜에서 사용되는 표준 세포와 세포 솔루션을위한 구성 요소 및 매개 변수입니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> 그림 1. 녹음 챔버 디자인. (AC) 상위, 측면 및 치수를 보여주는 기록 챔버의 장면 전환 전망. 챔버는 아크릴 2 mm 두께의 조각에서 가공된다. (D) 조립 챔버. Superfusate 테플론 튜빙 10 cm 길이 (; 유형 24LW 유입 관)를 통해 챔버로 들어갑니다. Superfusate은 챔버의 다른 측면에서 경 20 게이지 금속 튜브에 약한 흡입을 적용하여 제거됩니다. 이 출력 튜브에 인접한 자세 / AgCl을 펠렛 기준 전극입니다. 이 참조 전극 리드 headstage의 참조 입력에 연결됩니다. KimWipe의 작은 삼각형용액과 접촉을 유지하고 유출 관으로 솔루션의 흐름을 조절하는 기준 전극에 배치됩니다. 챔버의 기본은 챔버의 오목한 가장자리에 유리 현미경 슬라이드를 배치하여 형성된다. 슬라이드 진공 그리스의 구슬과 장소에서 개최됩니다. 망막 슬라이스로 니트로 셀룰로오스 막 스트립 흐름 솔루션을위한 채널을 형성하는 진공 그리스의 구슬에 포함됩니다. 이전 조각을 만들기 위해, 니트로 셀룰로오스 막 5 × 10 밀리미터 조각은 진공 그리스의 두 개의 작은 구슬 챔버에 부착되어 있습니다. 아이 컵의 조각이 니트로 셀룰로오스 막에 유리체면을 아래로 배치 망막을 준수되면 멀리 해제합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> 그림 2. 적이있는 염료 채워진 셀 쌍rtical 슬라이스 준비.) 동시에 전체 세포 녹음 중에 패치 피펫을 통해 소개 된 형광 염료를 대조로 가득 차 있었다 막대와 시냅스 결합 수평 세포의 이미지. 루시퍼 노란색 (2 MG / ML)로드 피펫 용액 (노란색)과 sulfarhodamine B (1 MG / ML), 수평 세포 피펫 용액 (보라색)에 포함 된에 포함되었습니다. 형광 이미지는 냉각 CCD 카메라 (오카 ER)을 탑재 고정 단계 현미경 (60X, 1.0 NA 물 침지 목적으로 니콘 E600 FN)에 장착 된 회전 디스크 공 촛점 현미경 (퍼킨 엘머 Ultraview LCI)를 사용하여 촬영 하였다. 이러한 이미지는) 콘의 이미지와 양극 세포 OFF 시냅스 결합을 어도비 포토샵. B를 사용하여 해당 망막 조각의 시야 이미지에 겹쳐 있었다. 양극 세포의 축삭 터미널 내부 핵 계층과의 국경에 가까운 내부 얼기 층의 바깥 쪽 (S1) sublamina에 ramifies. <strong&gt; C) 콘과 시냅스 결합 수평 세포의 이미지. 콘 단자 막대의 축삭 터미널보다 훨씬 더 큰합니다. 수평 세포는 ON 및 INL에서 OFF 형 양극성 세포가 쉽게 사전 녹화 구별 할 수없는 자신의 세포 기관의 직사각형 모양, 세포 기관으로 식별 할 수 있지만. 그러나, 하나는 ONL에 세포 기관을 가지고 내부 및 외부 세그먼트의 부재로 콘 구별 할 수있는 바이폴라 세포 OFF 콘 구동 변위 타겟팅 할 수 있습니다. 스케일 바는 20 μm의 수 있습니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> 그림 3. 흰색 빛의 밝은 500 밀리 플래시 님의 질문에 네 가지 망막 신경 세포에서 전압 클램프 아래에 기록 된 전류를 빛 유발. 콘 (A), 수평 세포 <stronG&gt; (B) 및 양극 세포 오프 (C) 모든 외부 전류로 빛에 반응했다. (D)에 양극 세포 내향 전류와 같은 빛을 자극에 반응했다. 오프 양극 세포 (C)에 의해 전시 기준 잡음은 광 수용체가 빛 hyperpolarize 때 감소 어둠 속에서 시냅스 소포의 지속적인 릴리스를 반영합니다. 이 네 가지 세포 반응은 흰색 조명 아래 준비 조각을 사용하여 별도의 기록에서 얻은했다. 이 예제에 사용되는 흰색 빛 자극의 강도는 1 × 10 5 광자 / 초 / μm의 2의 580 nm의 광자 플럭스에 해당하는 수평 및 양극성 세포 반응을 생산. <img alt="그림 4" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> 그림 4. H의 전류 - 전압 (IV)의 관계orizontal 오프 양극성 세포. (A) 상단 패널, -120에서 가로 셀에 20 MV 단위 (아래 패널)에 적용 +40 mV에서 150 밀리 초 전압 일련의 단계에 의해 유발 막 전류. 수평 세포는 일반적으로 낮은 입력 저항과 선형 또는 안쪽 정류 IV 관계가있다. 전압 일련의 단계 님의 질문에 답변 떨어져 양극 셀 (B) IV 관계. 양극 세포는 전압 문 칼륨 전류의 활성화로 인해 높은 입력 저항과 겉으로 정류 IV를 가지고. <img alt="그림 5" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> 그림 5. 짝 기록 된 데이터의 예. 콘 전압 게이트 칼슘 전류 (A) 기록 (콘 I 카 </s-70 MV (콘 V m)의 개최 가능성에서 -10 mV에서 100 밀리 단계의 질문에 답변 UB&gt;). 누출 용량 과도은 P / 8 누수 빼기 프로토콜을 사용하여 차감 하였다. 빠른 흥분성 (EPSC, HC PSC) 현재 시냅스 후이 두 세포가 시냅스 결합을 보여주는, 수평 세포에서 동시에 기록되었다 (B) EPSC는 또 다른 동일한 자극에 대한 응답으로 떨어져 양극 셀에 기록되었다. 콘.

우리는 수생 호랑이 도롱뇽 (에서 얇은 망막 조각의 준비를 설명<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) 우리는 광수와 2 차 수평 및 양극성 세포에서 이중 전체 셀 전압 클램프 녹음을 획득하여 망막에있는 시냅스 처리를 공부하기 위해 이러한 분할 영역을 사용하는 방법을 설명합니다.

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

이 절차의 전반적인 목표는 수생 호랑이 도롱뇽 망막에서 얇은 조직 조각을 준비하여 광수용체와 2차 수평 및 양극성 세포의 동시 전체 세포 전압 클램프 기록에 사용하는 것입니다. 이것은 먼저 도롱뇽의 눈을 절개하고 니트로셀룰로오스 막 조각에서 망막을 분리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 망막의 얇은 조각을 잘라 기록 챔버에 배치하는 것입니다.다음으로, 챔버를 직립 고정 스테이지 현미경에 놓고 패치 피펫을 망막 절편 위에 배치합니다. 마지막 단계는 시냅스전(presynaptic), 광수용체(photoreceptor), 시냅스후 수평세포(postsynaptic horizontal) 또는 양극성 세포(postsynaptic horizontal cell) 또는 양극성 세포(postsynaptic horizontal cell)로부터 전체 세포 기록을 얻는 것입니다. 궁극적으로, 쌍을 이룬 전체 세포 기록은 시냅스 방출을 조작하고 망막의 세포 간 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.망막 슬라이스 제제는 원래 프랭크 웨블린(Frank Werblin)과 샘 우(Sam Wu)의 실험실에서 개발되었으며, 단일 세포 제제와 달리 슬라이스 제제는 손상되지 않은 접촉을 유지했으며, 전체 산 망막 제제와 달리 망막을 슬라이스하면 다양한 망막층이 노출되어 다양한 세포 유형에 즉시 접근할 수 있습니다. 망막 슬라이스에서. 준비는 여러 세포에 대한 동시 기록 및 이미징 실험을 포함한 전기 생리학적 기록에 사용할 수 있습니다.이 제제는 망막 뉴런 간의 시냅스 상호 작용을 연구하는 데 매우 유용한 것으로 입증되었습니다. 이 비디오에서는 호랑이 도롱뇽 망막을 사용하여 슬라이스를 준비하는 방법을 설명하고 성공과 실패의 차이를 만들 수 있는 몇 가지 작은 세부 사항을 강조합니다. 챔버를 조립하여 이 절차를 시작합니다.레코딩 챔버를 가로질러 8-10mm 간격으로 두 개의 진공 그리스 구슬을 배치하여 슈퍼 파제(super fase)를 위한 채널을 형성하고 레티놀 슬라이스를 두 번째 그리스 비트에 삽입하고, 이 두 개의 그리스 구슬 각각보다 몇 밀리미터 더 높은 곳에 레티놀 슬라이스를 삽입하여 유출을 제한하기 위한 부담금 역할을 합니다. 그런 다음 챔버 끝에 작은 삼각형 모양의 Kim wipe를 놓아 기준 전극과 유체가 접촉하도록 합니다. 그런 다음 니트로셀룰로오스 멤브레인 조각을 유리 현미경에 평평하게 누릅니다.두 개의 작은 진공 그리스 구슬에 밀어 넣습니다. 조직 슬라이서를 준비합니다. 양날 면도날을 네 조각으로 나눕니다.그런 다음 그 중 하나를 슬라이싱 암에 부착합니다. 니트로셀룰로오스 여과지를 얇게 잘라 면도날의 절단면이 기록실에 평평하게 놓이도록 합니다. 다음으로, 참수로 도롱뇽을 안락사시킨 후, 현미경으로 작은 베니스 가위를 사용하여 눈에 핵을 삽입하고, 눈을 주변 안와와 연결하는 피부를 자릅니다.그런 다음 눈을 앞으로 당기고 가위를 그 아래로 밀어 눈 근육과 시신경을 절단합니다. 그 후, 적출된 눈을 리놀륨 블록의 솜 바닥에 놓습니다. 이제 날카로운 수술용 칼날로 각막 중앙을 작게 절개합니다.미세한 베니스 가위를 절개 부위에 밀어 넣고 절개를 아우라 세라타를 향해 방사상으로 확장하여 각막을 제거합니다. 그런 다음 리놀륨 블록 또는 절단 사이의 면을 회전시켜 아우라 세라타 주위를 둘레로 자릅니다. 눈 주위를 완전히 자른 후 각막과 수정체를 아이컵 옆에서 당겨 제거합니다.남은 아이컵을 양서류 식염수로 적신 리놀륨 블록의 단단한 표면에 옮깁니다. 날카로운 면도날로 미세한 톱질로 공막을 끝까지 절단할 수 있도록 3등분합니다. 그런 다음 하나 또는 두 개의 IUP를 망막 표면이 아래를 향하도록 니트로셀룰로오스 막에 놓습니다.나머지 조각에 추가 식염수를 담그십시오. 그런 다음 나중에 추가 조각을 자를 경우를 대비하여 냉장고에 보관하십시오. 이제 한 쌍의 미세한 집게로 IUP 조각을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 부드럽게 누릅니다.니트로셀룰로오스 막과 IUP 조각을 차가운 양서류 식염수 몇 방울에 담그십시오. 그런 다음 니트로셀룰로오스 막과 iup의 가장자리에 있는 Kim 물티슈 조각을 만져 식염수를 배출합니다. 그 후, IUP를 차가운 양서류 식염수 몇 방울과 함께 니트로 셀룰로오스 막에 담그십시오.다시 말하지만, 공막(sclera choroid) 망막 색소 상피를 벗겨내어 망막을 분리합니다. 망막이 단단히 부착되지 않으면 김 물티슈로 식염수를 배출하십시오. 망막을 니트로셀룰로오스 막으로 더 단단히 당기려면 식염수를 교체하고 필요한 경우 절차를 반복하십시오.다음으로, 차가운 양서류 식염수로 챔버를 채웁니다. 조직 슬라이서의 스테이지로 옮깁니다. 그런 다음 면도날을 부드럽지만 단단히 눌러 망막과 니트로셀룰로오스 막을 125미크론의 얇은 스트립으로 자릅니다.망막 전체를 조각으로 자른 후 망막 조각을 하나씩 기록 챔버의 메인 채널로 옮깁니다. 슬라이스를 옮기려면 멤브레인 스트립을 제자리에 고정하고 그 아래의 챔버를 밀어 넣습니다. 슬라이스가 챔버의 중앙 부분 위에 있을 때 물에 잠긴 상태로 유지하십시오.니트로셀룰로오스 멤브레인의 가장자리를 진공 그리스 스트립에 삽입하고 90도 회전합니다. 망막층을 보려면 모든 조각에 망막이 없더라도 니트로셀룰로오스 멤브레인을 유리 표면에 평평하게 누릅니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인 스트립을 약 밀리미터 일정한 간격으로 배치하여 표면 장력을 분해하여 유체 흐름을 개선하는 데 도움이 됩니다.관류 채널의 전체 길이를 따라 슬라이스가 배치될 때까지 슬라이스를 하나씩 계속 전송합니다. 모든 슬라이스를 옮긴 후 기록 챔버를 정립 고정 스테이지 현미경의 스테이지로 이동합니다. 기준 전극 리드를 증폭기 헤드 stage의 접지선에 연결합니다.긴 작동 거리 물 침수 40-60 x 대물렌즈를 사용하여 슬라이스에 초점을 맞춥니다. 다음 슈퍼. 산소로 거품을 일으킨 양서류 식염수와 분당 1mm의 속도로 조각을 융합합니다.흡입 라인을 챔버의 출력 라인에 연결합니다. 그런 다음 흡입 바늘의 비스듬한 끝을 회전하거나 챔버 끝에 있는 김 닦아내기를 유출 바늘 끝의 구멍에서 더 가깝거나 더 멀리 이동하여 유입의 균형을 맞추기 위해 유출을 조정합니다. 어두운 빛이나 적외선에서 슬라이스를 검사하십시오.다음으로, 한 쌍의 세포, 광수용체(photoreceptor) 및 도매를 위한 근처의 수평 또는 양극성 세포를 식별합니다. 세포 내 용액으로 실험하기 전에 준비된 Philip 피펫을 기록하고 전극 홀더에 장착합니다. 다음으로, 현미경 대물렌즈를 약간 들어 올립니다.광수용체 피펫을 대물렌즈 아래에 놓습니다. 그런 다음 팁이 슬라이스 바로 위에 위치하도록 낮추고 동시에 초점을 조정합니다. 너무 멀리 가지 않기 위해.두 번째 피펫에 대해 이 절차를 반복합니다. 다음으로, 5 - 10 millivolt 탈분극 펄스로 피펫 저항을 확인합니다. 증폭기의 기준선 전류 레벨에서 오프셋을 조정합니다.그 후, 약간의 양압을 가하고 그 동안 시냅스후 피펫을 수평 또는 양극성 세포체와 접촉하도록 배치합니다. 그런 다음 시냅스전 피펫을 위치시켜 간상체 또는 원뿔 광수용체의 세포체와 접촉하도록 합니다. 저항 방출을 모니터링하는 동안, 시냅스후 피펫에 대한 양압, 때로는 양압의 방출이 기가 옴 밀봉을 형성하기에 충분합니다.팁 저항이 100메가옴 이상으로 증가한 후 마이너스 60밀리볼트의 유지 전위를 적용합니다. 그런 다음 giga om seal이 확보되면 피펫 정전용량 과도 현상을 취소합니다. 패치 클램프 증폭기의 커패시턴스 보상 회로를 사용하여 광수용체 피펫으로 천장 절차를 반복하고 마이너스 70 밀리볼트의 유지 전위를 적용하고 피펫 커패시턴스를 취소합니다.일시적인 경우 각 세포에 흡입을 가하여 패치를 파열시킵니다. 패치의 파열은 전체 세포 정전 용량 과도기의 출현으로 분명합니다. 이제 플래시 플래시를 적용하고 마이너스 120에서 플러스 40 밀리볼트까지 20 밀리볼트 단위로 일련의 전압 단계를 전달하여 시냅스후 세포의 정체성을 생리학적으로 확인하십시오.세포가 시냅스적으로 연결되어 있는지 평가하려면 25-100밀리초 60밀리볼트를 전달합니다. 광수용체(photoreceptor)로 탈분극(depolarization)을 단계적으로 진행하고 시냅스 후 전류(post-synaptic currents)를 찾습니다. 2차 뉴런에서는 도롱뇽 망막의 수직 조각에 있는 뉴런의 빛 반응의 대표적인 흔적이 있습니다.원뿔 수평 셀과 오프 바이폴라 셀은 모두 빛의 시작에 대한 응답으로 바깥쪽 전류를 표시합니다. 여기에서 수평 및 양극성 세포 기록에서 섬광에 따른 두드러진 내부 전류는 광 수용체가 광 오프셋에서 탈분극될 때 광수용체에서 글루타메이트 방출이 증가했기 때문에 발생합니다. 양극성 세포는 빛이 시작될 때 내부 전류로 반응하는데, 이는 대사성 글루타메이트 수용체 신호 캐스케이드를 전달하는 징후와 트립 1 채널의 활성화로 인해 발생합니다.수평 셀과 바이폴라 셀은 전류 전압 관계에 의해 서로 구별될 수 있습니다. 수평 셀은 일반적으로 입력 저항이 500메가옴 미만인 선형 또는 내부 정류 전류 전압 관계를 갖고, 바이폴라 셀은 외부 정류 전류 전압 관계와 0.5에서 2기가 옴 사이의 더 높은 입력 저항을 갖습니다. 이 그림은 원뿔 수평 세포 쌍(cone horizontal cell pair)과 원뿔 오프 바이폴라 세포 쌍(cone off bipolar cell pair)의 기록에서 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다.각각의 경우에서, 영하 70 밀리 볼트의 유지 전위에서 원뿔을 마이너스 10 밀리 볼트로 탈분극하면 원뿔에서 전압 게이트 칼슘 전류가 발생하고 시냅스 후 안쪽으로 빠르게 이동했습니다. 수평 또는 양극성 세포 Retinal slice의 전류. 제제는 망막의 해부학과 생리학에 관한 수백 건의 연구에서 사용되어 왔습니다.동시에 여러 세포의 기록과 이미징을 용이하게 하기 때문에 여러 세포의 반응을 동시에 검사하는 데 특히 유리합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 망막을 해부하고, 얇은 망막 절편을 절단하고, 기록실에 배치하고, 시냅스로 연결된 자아 쌍에서 대량 녹음을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

simultaneous-whole-cell-recordings-from-photoreceptors-second-order

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 수생 호랑이 도롱뇽의 망막 통에 전체 셀 전압 클램프 레코딩 과정을 보여줍니다. 우리는뿐만 아니라 망막의 시각적인 자극하는 동안 패치 클램프 레코딩을 수행하는 방법으로 슬라이스의 준비를 보여줍니다.

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

여기 electrophysiological 레코딩을위한 마우스 망막의 어두운 적응 조각을 생성하는 절차를 설명합니다.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

이 문서는 해부하다와 마우스에서 분리된 망막 준비에서 기록하는 방법에 대한 설명을 제공합니다. 특히, 우리는 찬란 표시 신경절 세포 인구의 빛을 반응을 기록하고 이후 식별하고 그 형태를 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

여기 우리는 전기 생리학 및 Ca2 + 이미징에 적합 한천 - 임베디드 망막 조각의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 하나 하나 presynaptic 신경 터미널 직접 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 망막 microcircuits의 리본 형태의 시냅스를 공부하실 수 있습니다.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

이 문서는 그대로 마우스 망막에서 찬란 태그의 연결 인구에서 각각의 세포의 녹음을 묘사. 두 광자 여기 적외선을 사용하여 transgenetically 라벨이 세포들은 빛의 반응, 수용 필드 속성 및 형태학을 연구하기 위해 패치 - 클램프 녹음 대상으로했다.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

이 비디오는 어둡게 적응된 마우스 망막 조직 절편 제제에서 빛을 유발하는 시냅스 후 반응을 기록하는 것을 보여줍니다. 망막 절편은 기록 챔버에 배치되고, 기록 피펫은 망막 신경절 세포와의 전기적 연속성을 확립하는 데 사용됩니다. 광 펄스(light pulses)는 신경절 세포(ganglion cell)에서 흥분성 시냅스후 전위(excitatory post-synaptic potentials)를 생성하기 위해 적용되며, 이는 피펫에 의해 기록됩니다.

마우스 망막 절편의 뉴런에서 빛을 유발한 시냅스후 반응(Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices)

우리는 쥐의 눈에서 망막 절편을 준비하고 망막 뉴런의 빛 반응을 기록하는 방법을 보여줄 것입니다. 전체 절차는 어두운 환경에서 수행됩니다.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

이 프로토콜은 평면 장착 준비에서 망막 신경 세포에 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

우리는 망막 표면에 평행하게 절편의 평면과 성인 포유류 망막의 수평 슬라이스 준비를 개발했다. nonradially 중심 망막 신경 세포의 수지상 필드 패치 클램프 및 이미징 기술과 신호 처리의 연구를 허용, 절단되지 않았다.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

이 종이 전체 셀 패치 클램프 기록 Xenopus laevis tadpoles의 retinotectal 회로 공부 하는 데 사용 하는 세 뇌 준비를 다루겠습니다. 그것의 자신의 특정 이점 각 준비 신경 회로 기능을 공부 하는 모델로 Xenopus 올챙이의 실험 추적성에 기여 한다.

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

이 연구는 광수용체 세포체를 제거함으로써 면역조직화학, in situ hybridization 및 전기생리학 실험을 위해 더 빠른 항체 확산과 내부 망막 뉴런에 대한 패치 피펫 접근을 개선할 수 있는 대체 편평 장착 망막 제제를 제시합니다.

척추동물 망막의 내부 핵층 뉴런 연구를 위한 개선된 평판 준비로서의 망막 분할

배우세요 양서류 망막 슬라이스 준비와 광수용체 및 2차 신경세포 동시 전체세포 기록법을 통해 망막 시냅스 처리 과정을 연구하는 방법을. 이 기술은 신경과학 연구에 필수적인 도구입니다.

양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

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