LeafJ : 세미 자동 리프 형상 측정을위한 ImageJ 플러그인

이 절차의 목적은 고처리량 실험을 위해 잎 모양 측정을 자동화하는 것입니다. 이것은 먼저 나뭇잎을 해부하고 평판 스캐너로 이미징하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 leaf J 플러그인을 사용하여 잎을 감지하고 측정하는 것입니다.

세 번째 단계는 현미경 검사를 위해 잎을 준비하고 복합 현미경을 사용하여 사진을 찍는 것입니다. 마지막 단계는 터치스크린 태블릿을 사용하여 획득한 이미지의 매진 라인을 추적하는 것입니다. 궁극적으로 이러한 이미지 분석 조합을 통해 잎 모양, 세포 크기 및 세포 수의 차이를 보여줄 수 있습니다.

기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 속도입니다. 수동 측정보다 약 6배 빠릅니다. 개인은 다운스트림 분석에 적절한 잎 배치가 중요하고 슬라이드에 잎을 장착하는 것이 기술적으로 어려울 수 있기 때문에 이 방법이 어려울 수 있다는 것을 알고 있었습니다.

제가 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올린 것은 분석해야 할 잎이 약 15,000개에 달한다는 것을 깨달았을 때였고, 손으로 하는 것은 수개월이 걸리고 엄청나게 지루할 것이며, 식물 해부 기술이 신경 zue를 유발할 것임을 보여주었습니다. 내 연구실의 연구 과학자 8.5 x 11인치 투명 시트를 준비하는 것으로 시작합니다. 각 시트는 한 식물의 잎을 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰 직사각형 프레임으로 분할해야 하며, 두 번째 투명 시트를 인쇄된 시트에 테이퍼하여 잎이 마르는 것을 방지하는 덮개 역할을 해야 합니다.

식물, 유전자형 및 성장 상태를 표시하십시오. 26번째 원추 식물의 잎을 해부합니다. 투명도에 있는 잎을 가장 어린 것부터 가장 오래된 것까지 전술 순서로 배열합니다.

테두리를 건드리거나 다른 잎과 겹치지 않도록 프레임 내에서 나뭇잎을 세로로 배치합니다. 그렇지 않으면 문제가 발생합니다 분석하는 동안, 나뭇잎이 배열된 상태에서 수직으로 닿지 않거나, 프레임에 넣거나, 겹치지 않도록 방향을 잡는 것이 중요합니다. 두 번째 빈 투명 시트와 잎을 평평하게 유지하기 위해 랙으로 끼웁니다.

그런 다음 인치당 최소 600도트 해상도의 평판 스캐너를 사용하여 이미지를 생성합니다. 플러그인을 설치하여 시작하십시오. 이미지 J를 다운로드하고 리프 jja 파일을 이미지 J의 플러그인 폴더로 드래그합니다. 이미지 J를 사용하면 이제 리프 J 플러그인을 사용할 수 있습니다.

이미지 J에서 리프 이미지 파일을 계속 엽니다.이미지 J가 버전 1.45 s 이상인지 확인합니다. 이미지 색상 분할 채널을 클릭하여 이미지를 빨간색, 녹색 및 파란색의 세 가지 색상 채널로 분할합니다. 그런 다음 파란색 채널의 이미지에 임계값을 적용합니다.

이제 사각형 선택 도구를 사용하여 한 식물의 모든 잎을 선택한 다음 잎 J 플러그인을 선택합니다. 플러그인은 이제 실험 그룹 및 유전자형과 같은 실험의 다양한 조건을 설정할 수 있는 상자를 엽니다. 계속하기 전에 이러한 옵션을 편집한 다음 관심 영역에서 선택한 나뭇잎에 대한 조건을 선택하고 설명이 포함된 이름을 제공합니다.

continue를 누르면 리프 J가 자동으로 각 leaf의 윤곽을 고유한 ROI 이미지로 윤곽을 그립니다. J 루틴은 타원을 블레이드에 맞추고 필요한 경우 해당 타원의 주 축과 보조 축을 계산합니다. ROI 관리자 창을 사용하여 트레이스 라인을 편집합니다.

외부 모니터로 연결된 터치스크린 태블릿이 이 절차에 유용할 수 있습니다. 경계가 올바르게 정의되면 를 눌러 분석을 실행합니다. 자, 이제 잎 J는 꽃잎 길이와 잎 잎의 다양한 형상을 출력합니다.

최종적으로 측정 결과 및 관련 정보를 스프레드시트로 내보냅니다. 잎을 스캔한 후 F-A-A-F-A에 고정합니다. A 고정 잎은 섭씨 4도에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.

잎을 이미징하기 한두 시간 전에 앞으로 이동하여 FAA 고정제를 클로로하이드레이트 용액으로 변경하여 잎을 제거합니다. 제거되면 복합 현미경 이미지에서 40배 배율을 사용하여 상체가 위를 향하도록 슬라이드에 잎을 장착하고, 주정맥 양쪽에 있는 각 잎 중앙의 중간층을 상체나 정맥 근처의 세포를 피합니다. 이미지 처리의 어려움을 피하려면 나뭇잎을 장착할 때 슬라이드에서 모든 기포를 제거하고 다음 단계에서 초점이 맞는 이미지를 얻는 것이 중요합니다.

원하는 이미지를 수집한 후 이미지 J에서 이미지를 열고 터치스크린 태블릿과 스타일러스를 사용하여 이미지 JROI 관리자 도구로 잎 세포 윤곽을 추적합니다. 이것은 LEAF J 플러그인을 사용하지 않습니다. 실험을 위해 LEAF J를 사용하기 전에 플러그인의 정확성과 속도를 숙련된 연구원의 것과 비교했습니다. 전반적.

Leaf J는 수동 계산보다 5.7 더 빨리 완료되었으며 두 방법의 데이터를 비교한 결과 비교된 3,532의 모든 측정 매개변수에 대해 결과가 밀접하게 상관되어 있음을 보여주었습니다. 데이터 포인트 172는 이상치였습니다. 이러한 이상치 중 29개는 LEAF J 플러그인으로 인해 발생했으며 인적 오류로 인한 143개보다 훨씬 적습니다.

수동 측정 중에 leaf J는 오류 수를 더욱 줄이기 위해 업데이트되었습니다. LEAF J 측정에 대한 확신을 가지고 혼합 효과 모델을 사용하여 음영 회피를 분석하는 데 사용되었습니다. 처리와 잎 수는 고정 효과였고 복제는 무작위 효과였습니다.

많은 매개변수가 차양 처리에 의해 상당한 영향을 받았습니다. 또는 일부 매개변수는 음영의 영향을 크게 받지 않았습니다. 세포 매개변수의 정제 보조 이미지 분석을 사용하여 224개 식물의 877개 잎에서 총 8,629개의 세포에 이르는 애기장대 ANA의 67개 유전자형을 조사했습니다.

그런 다음 유전자형을 6개 등급으로 분류했습니다. 대부분의 유전자형은 정상적인 세포 크기와 수를 가지고 있습니다. 그러나 일부는 정상 세포 수로 더 큰 세포 크기를 가졌습니다.

식물을 재배할 때 무작위 배정 및 실험 설계를 사용하는 것이 이 절차를 시도하는 것이 중요하지만 포름알데히드와 염소수화물로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있음을 기억하십시오. 따라서 이 절차를 수행할 때 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 이 절차에 따라 자신의 실험 조건을 사용하여 잎 및 세포 모양 표현형의 고처리량 스크리닝을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

RNA 염기서열분석(RNA sequencing)과 같은 추가 방법을 사용하여 어떤 유전자가 효과적으로 형성되는지와 같은 질문에 답할 수 있습니다.