마우스 뇌 슬라이스의 Nicotinic 아 세티 콜린 수용체 기능을 공부하는 약물의 로컬 응용 프로그램

이 절차의 전반적인 목표는 성체 마우스에서 파생된 급성으로 준비된 뇌 절편에서 뉴런의 리간드 개폐 이온 채널 기능을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 특수 인공 대뇌 척수액이 관류된 트랜스 카디(trans Cardi)를 투여한 성인 쥐에서 온전한 뇌를 추출함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 뇌의 관심 영역에서 원하는 방향으로 뇌 절편을 준비하는 것입니다.

다음으로, 현미경 아래 기록실에 배치된 개별 뇌 절편과 절편 내의 개별 뉴런을 식별하여 기록합니다. 마지막 단계는 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록이며, 두 번째 유리 마이크로 피펫을 사용하여 리간드 게이트 이온 채널을 활성화하기 위해 약물을 국부적으로 적용하는 것입니다. 궁극적으로, 리간드 게이트 이온 채널을 연구하는 이 방법은 살아있는 뉴런에 있는 네이티브 수용체의 생물물리학적 특성을 보여주는 데 사용됩니다.

목욕 적용 또는 YouTube 약물 전달과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 기록된 뉴런으로의 약물 전달이 매우 빠르고 국소적이라는 것입니다. 소량의 약물을 전달할 수 있으며 단일 슬라이스에서 여러 뉴런을 연구할 수 있습니다. 이 방법은 생물물리학 세포에 관여하는 천연 니코틴 수용체, 니코틴에 대한 생물학적 및 행동적 반응을 결정하는 것과 같은 니코틴 아세틸콜린 수용체 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 절차에서는 성체 쥐를 희생하고 뇌를 얻은 후 얼음으로 냉각된 금속판에 관심 영역을 포함하도록 원하는 방향으로 뇌를 다듬습니다. 다음으로, 진동하는 슬라이서의 건조한 무대 표면에 슈퍼 접착제로 뇌 블록을 부착합니다. 그런 다음 뇌 블록을 섭씨 4도 NMDG 회수 용액에 담그고 용액에 발암원으로 지속적으로 거품을 냅니다.

그런 다음 관심 있는 뇌 영역에서 각각 250미크론 두께의 조각을 자릅니다. 다음으로, 프로그래밍 가능한 화염 갈색 풀러를 사용하여 4-6메가 옴의 저항을 가진 표준 패치 마이크로 피펫을 당깁니다. 마이크로 피펫을 적절한 세포 내 기록 용액으로 채웁니다.

그런 다음 단면을 정립 현미경의 스테이지에 있는 기록 챔버로 옮기고 분당 1.5-2.0밀리리터로 A CSF를 기록하는 섭씨 32도의 탄산 표준으로 슬라이스를 지속적으로 슈퍼 융합합니다. 현미경 아래에서 10 x air 대물렌즈를 사용하여 관심 있는 뇌 영역을 찾고 중앙에 배치합니다. 그런 다음 IR 미분 간섭 대비 광학 장치에 연결된 40 x 근적외선 수침 대물렌즈를 사용하여 개별 뉴런을 시각화하고 고속 근적외선 전하 결합 장치 또는 CCD 비디오 카메라를 사용하여 IR DIC 관찰에서 건강한 뉴런은 세포 시각화 후 부드러운 연한 회색 원형질막을 나타냅니다.

기존 기술을 사용하여 전체 세포 기록을 수행합니다. 이제 이전과 같이 다른 표준 패치 클램프 마이크로 피펫을 당겨 약 5 메가 옴의 최적 저항으로 동일한 유리 조각에서 두 개의 동일한 자매 팁을 생성합니다. 마이크로 피펫 중 하나에 탄산 표준 기록에 희석된 약물 용액을 다시 채우고, CSF가 팁을 아래쪽으로 향하게 하고, 약물이 채워진 마이크로피펫을 튕겨 마이크로 피펫에 갇힌 기포를 제거합니다.

다음으로, 약물이 채워진 마이크로 피펫을 마이크로미터 매니퓰레이터에 부착된 피펫 홀더에 장착합니다. 피펫 홀더는 튜브와 함께 적절한 압력 배출 시스템에 연결해야 합니다. 유체 컬럼 뒤에 적절한 압력을 형성하기 위해 마이크로 피펫으로 압력을 3-4회 수동으로 배출합니다.

그런 다음 I-R-D-I-C를 사용하여 microm 매니퓰레이터를 사용하여 약물 피펫을 슬라이스로 내립니다. 관찰. 약물 마이크로 피펫을 조직 절편의 표면에 놓습니다. 한 번의 압력 배출을 실행하고 배출 및 마이크로 피펫 팁과 관련된 파편의 움직임에 대해 팁 부근을 모니터링합니다.

팁이 막히거나 막혔다는 징후가 있는 경우 팁이 막힌 경우 피펫을 집어넣고 새 것으로 교체하십시오. 슬라이스의 맨 위에서 대각선으로 기록된 셀에 접근합니다. 최종 위치에 있을 때, 약물이 채워진 피펫의 팁은 기록된 세포 및 기록 전극의 팁과 동일한 초점면에 있으며, 기록된 세포로부터 약 10 내지 40미크론입니다.

약물로 채워진 피펫 팁이 기록된 세포 위에 있는 경우, 압력 방출로 인한 힘이 세포의 기가 씰을 방해한 다음 뉴런을 전압 클램프 모드로 유지하면서 아세틸콜린 및/또는 니코틴 유도 세포 전류를 기록할 수 있습니다. 피코 스프리처 3을 사용할 때 보다 재현성 있는 결과를 위해 압력 제거를 수동으로 트리거할 수 있지만, 획득 시스템과 디지털 TTL 펄스를 사용하여 압력 제거를 트리거하는 것이 좋습니다. 실험을 개선하기 위해 약물 충전 피펫 홀더를 아날로그 전압 입력을 수용할 수 있는 1차원 pizo 전기 변환기에 장착한 다음 고정밀 마이크로 매니퓰레이터에 장착할 수 있습니다.

pizo 전기 변환기는 진입 출구의 타이밍 및 속도를 포함하여 약물로 채워진 피펫의 슬라이스 안팎의 이동을 보다 쉽게 제어하고 실험에서 실험으로 재현할 수 있기 때문에 유용합니다. 다음으로, pizo 전기 전압 제어 증폭기의 수동으로 제어되는 전위차계를 사용하여 전압을 최대 값으로 조정합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 약물로 채워진 피펫을 슬라이스에 배치합니다.

기록 수집 시스템의 아날로그 출력 신호를 사용하여 pazo 전기 전압 제어 증폭기의 전압을 수동으로 0으로 줄여 피펫을 집어넣습니다. 압력 배출 TTL 펄스가 발생하기 전에 약물이 채워진 피펫을 슬라이스로 이동합니다. 펄스가 발생한 후 피펫을 집어넣습니다.

이 그림은 국소적으로 적용된 100마이크로몰 아세틸콜린에 대한 도파민 뉴런의 대표적인 반응을 보여주며, 이 그림은 국소적으로 적용된 100마이크로몰 니코틴에 대한 다른 도파민 뉴런의 대표적인 반응을 보여줍니다. 다음은 현재 클램프 모드로 유지되는 Alpha six L nine prime S 마우스 뇌 슬라이스에서 도파민 뉴런의 자발적 활동 전위입니다. 250밀리초의 압력 제거를 사용하여 1마이크로몰의 니코틴을 적용하면 작용, 잠재적 발화 속도 및 휴지 막 전위의 변화가 유발되었습니다.

P 클램프 소프트웨어의 임계값 검색을 사용하여 순간 발사 속도를 도출하여 아세틸콜린 반응 개별 상대장 뉴런의 유형에 따라 뉴런을 분류했습니다. 알파 6 L 9 프라임 마우스 브레인 슬라이스에서 전압 클램핑 후 압력 방출 유형 1 뉴런을 통해 1 마이크로 몰 니코틴의 국부 적용은 증가 된 IPC를 나타냈다. 니코틴 적용 후 2형 뉴런은 큰 내부 전류를 나타내고 니코틴 적용에 대한 반응으로 EPC를 증가시켰습니다.

Pizo 전기 번역기는 일관성을 제공하고 약물 누출을 방지합니다. Alpha six L nine prime S 마우스의 뇌 절편에 있는 VTA 도파민 뉴런이 전압 박수 모드로 기록되었습니다. 1 마이크로 몰 니코틴을 적용하는 동안, 니코틴으로 채워진 피펫을 압력 배출 전 최종 위치로 이동하고 파조 전기 변환기를 사용하여 배출 후 후퇴시켰다.

첫 번째 반응 후 2분 후에 두 번째 반응이 기록되어 N-A-C-H-R 탈감작이 발생하지 않았음을 입증했습니다. 실험은 10 마이크로 몰 니코틴을 적용하여 반복되었습니다. 다시 말하지만, 첫 번째 반응과 비교할 때 두 번째 반응에서 둔감화가 관찰되지 않았습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 이내에 수행할 수 있습니다. 어떤 경우에는 하루 이내에 단일 뇌 절편에서 10-15개의 뉴런을 연구할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 표면 니코틴 수용체의 완전한 활성화와 기가 씰의 무결성 사이의 균형을 유지하기 위해 약물로 채워진 피펫을 정확하게 배치하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.