Name: 마우스 뇌 슬라이스의 Nicotinic 아 세티 콜린 수용체 기능을 공부하는 약물의 로컬 응용 프로그램 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 배우세요 성인 마우스 뇌 슬라이스에서 patch clamp 기법과 국소 약물 적용을 이용한 ligand-gated ion channel 기능 연구 방법을. 이 기법은 신경 과학 연구에서 생체 뉴런의 수용체 특성을 정밀 분석하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 건강의 국립 연구소 (NIH) 보조금 DA030396에 의해 지원되었다. 도움이 토론과 원고의 비판에 대한 Drenan 연구실의 구성원에게 감사드립니다. 미의 특별 감사는 성인 마우스 뇌 조각에 대한 조언에 대한 기술 지원 및 조나단 토마스 팅에 대한 김 버렸네.

1. 뇌 슬라이스 준비 및 전기 생리학을위한 솔루션의 준비 <ol><li> 뇌 조각의 준비를위한 솔루션은 이전에 3, 4를 설명했다. 93 N-메틸 D-glucamine, 2.5 KCl, 1.2 아냐 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 : N-메틸 D-glucamine (NMDG) 기반 다음과 같은 구성의 절단 및 복구 솔루션을 (MM)를 준비 포도당, 5 그렇단 + 아스 코브 산, 2 티오 우레아, 3 그렇단 + pyruvate, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0.5 CaCl 2 • 2H 2 O. NMDG과 300-310 mOsm로 조절합니다. 10 N HCL을 7.3-7.4로 pH를 조정합니다. <ol class="lalpha"><li> 각각의 2 M 주식 솔루션을 만들기 위해 Millipore 물에 MgSO 4 • 7H 2 O와 CaCl 2 • 2H 2 O를 해산. </li><li> 나열된 순서에 다른 구성 요소를 무게 분해하는 교반하면서 Millipore 물 부분적으로 채워진 용적 플라스크에 추가 할 수 있습니다. 모든이 추가되면 작성Millipore 물 용적 플라스크입니다. </li><li> pH를 측정하고 10 N HCL을 조정할 수 있습니다. </li><li> osmolarity를​​ 측정하고 필요한 경우 NMDG을 조정할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 아냐 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 포도당, 5 그렇단 + 아스 코브 산, 2 티오 우레아, 3 그렇단 다음 구성의 인공 뇌척수 (aCSF)을 (MM)를 개최 HEPES 준비 + pyruvate, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. 자당과 300-310 mOsm로 조절합니다. 1 N HCL 또는 NaOH로 pH를 7.3-7.4로 조정합니다. <ol class="lalpha"><li> 나열된 순서의 구성 요소를 무게 분해하는 교반하면서 Millipore 물 부분적으로 채워진 용적 플라스크에 추가 할 수 있습니다. 모든이 추가되면, Millipore 물과 용적 플라스크를 채 웁니다. </li><li> pH를 측정하고 필요한 경우 NaOH 또는 HCL을 조정할 수 있습니다. </li><li> osmolarity를​​ 측정하고 자당 필요한 경우로 조정합니다. </li></ol></li><li> 124 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 아냐 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12.5 포도당, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O에 다음 구성의 표준 aCSF 녹음 솔루션을 (MM)를 준비 자당과 300-310 mOsm로 조절합니다. 1 N HCL 또는 NaOH로 pH를 7.3-7.4로 조정합니다. </li></ol> 2. 급성 뇌 슬라이스의 작성 <ol><li> 이전에 3, 4에 설명 된대로 뇌 슬라이스 절단 및 복구가 이루어집니다. 버블이 결정 요리가 95 % 산소 / 5 % CO 2 가스 (carbogen), 얼음에 하나 접시, 33의 다른 ° ​​C.와 복구 솔루션을 NMDG로 가득 </li><li> 버블 크리스탈 1 요리 상온에서 carbogen과 aCSF를 개최 HEPES로 가득. </li><li> 오세영 + pentobarbital (200 밀리그램 / kg, IP)로 성인 마우스를 (2~12개월 세) 마취. 동물이 발가락 - 핀치에 대한 응답이 없을 때 절차를 진행합니다. </li><li> 필요한 경우, 나중에 genotyp에 꼬리 조직 샘플을 잘라동물 들죠. </li><li> 가슴에 고인을 열고, 마음을 노출하고, 내림차순 대동맥 클램프. 오른쪽 심방을 괴롭히다. </li><li> Transcardially 0-4 ° C NMDG 복구 솔루션의 5-10 ML과 동물을 perfuse. </li><li> 동물 목을 벨, 뇌를 제거하고 1 분에 대해 4 ° C NMDG 복구 솔루션에 배치합니다. </li><li> 얼음 차가운 금속 플레이트에서 관심 영역을 포함하도록 원하는 방향 (등, 수평, parasagittal, 코로나)에 뇌를 잘라. </li><li> 접사 진동 슬라이서의 건조 단계 표면에 superglue과 뇌 블록 (DSK-제로 1; Dosaka), 4 잠기 뇌 블록 carbogen과 ° C NMDG 복구 솔루션, 그리고 지속적으로 거품 솔루션입니다. </li><li> 관심 뇌 영역의 조각을 잘라. 슬라이스 두께는 특정 관심의 뇌 영역, 동물 연령, 수행 할 실험에 따라, 200-400 μm이다. </li><li> 즉시 절단 한 후에 품다 원하는 슬라이스는 33 carbogenated ° C NMDG 복구 soluti정확히 12 분에에 후 60 분의 초기 기간 동안 솔루션을 개최 carbogenated, 룸 온도 HEPES로 전송할 수 있습니다. 이 60 분의 부화 후, 슬라이스는 녹음에 사용할 수 있습니다. 조각들은이 녹음에 사용되는 때까지 하루 종일 솔루션을 가지고 HEPES에 보관됩니다. </li></ol> 3. 뇌 슬라이스의 뉴런에서 패치 클램프 녹음 <ol><li> 프로그램 불타는 브라운 풀러 (셔터 P-97 또는 이에 상응하는 수직 풀러)와 표준 패치 micropipette를 당겨. 기가 - 옴의 인감 형성을위한 최적의 아르 피펫은 일반적으로 MΩ 4-6의 저항이 </li><li> 수직 현미경 (니콘 FN-1)의 무대에, 녹음 챔버 (워너 인스트루먼트 RC-27L)에 한 조각을 전송합니다. 지속적인 superfuse (1.5-2.0 ML / 분) 32시 가열, 유지 carbogenated, 표준 기록 aCSF와 슬라이스 ° C. 또는 조각은 실온에서 유지 될 수 있습니다. </li><li> 사용 관심 뇌 영역을 찾아 센터10X 공기 목적 (니콘 계획 형석 10X, NA 0.3, WD : 16mm). </li><li> 40X에 가까운 적외선 (IR​​) 물 침적 목표 (; 0.80, WD : NA 니콘 APO 40XW 3.5 mm)을 사용하여 개별 뉴런 시각화 적외선 근처의 IR-차동 간섭 대비 (DIC) 광학 및 고속 연결이 커플 링 장치를 충전 (CCD) 비디오 카메라 (하마 마츠 C-7500). IR-DIC 관찰에서 건강한 뉴런은 부드럽고 밝은 회색 플라즈마 멤브레인을 나타냅니다. </li><li> 적절한 세포 녹음 솔루션 micropipette를 입력합니다. 135 칼륨 글루 콘산, 5 EGTA, 0.5 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 MG-ATP, 그리고 0.1 GTP (산도가 트리스베이스, osmolarity를 ​​7.25로 조정 : 대부분의 응용 프로그램의 경우, 우리는 다음과 같은 솔루션을 (MM)를 사용하여 290 자당과 mOsm)로 조정. 시각화 뉴런에서 전체 셀 녹음을 설정합니다. </li></ol> 4. 슬라이스의 뉴런에 대한 약물의 로컬 응용 프로그램 <ol><li> 위에서 설명한대로 표준 패치 클램프 micropipette를 당겨. 사용여러 약물 솔루션은 동일한 휴대폰으로 사용할 수있는 경우 유리의 조각에서 두 개의 동일한 &quot;자매&quot;팁을 생산하는 셔터 P-97와 같은 피펫을 끌어 당기는이 바람직하다. 그들이 위에 설명 된 세포 솔루션으로 가득 된 경우 MΩ ~ 5의 저항이 것 팁 크기는 최적입니다. </li><li> carbogenated, 표준 기록 aCSF에 희석 약물의 솔루션 백업은 micropipette. 아래 팁을 가리킨 솔루션의 항목에 갇혀있는 공기 방울을 제거 할 수있는 약물이 가득한 micropipette을 버려야지. </li><li> 이러한 Picospritzer III (일반 밸브 (주))와 같은 적절한 압력 분출 시스템에 튜브로 연결 피펫 홀더에있는 약물이 가득한 micropipette를 탑재합니다. manipulators 일반적으로 (예를 들어, 셔터 MP-285) 패치 클램프 녹음에 사용되는 피펫 홀더는 동일한 해상도로 micromanipulator에 장착해야합니다. 또한, 머니퓰레이터는로와 슬라이스의에서 대각선 움직임을 허용해야합니다. 사람ually 유체의 열 뒤에 적절한 압력을 구축하기 위해 micropipette에 압력을 3-4 회를 꺼냅니다. </li><li> IR-DIC 광학 아래의 팁을 시각화하는 동안 micromanipulator 컨트롤 사용하여 슬라이스에 약물 피펫을 낮 춥니 다. 이상적으로, 하나는 시각적으로 확인하고 센터 이전에 슬라이스에 기록 micropipette을 낮추는에 셀 근처의 약물 피펫의 위치 다음에서 기록 할 수있는 뉴런을해야합니다. 약물 피펫을 위치하면 약물 피펫은 gigaohm 인감을 맺은 후 위치로 이동하는 경우 녹화를 중단 할 수있는 기록 세포의 주변에 조직의 움직임을 일으킬 수 있습니다. </li><li> IR 비디오 사용하여 조직 슬라이스의 상단 표면에 약물 micropipette를 배치. 한 압력 방출 및 모니터 1) 분사에 관한 파편의 움직임에 대한 팁 주변 및 팁이 막혔거나 차단되어있는 표지판 2) micropipette 팁을 실행합니다. 끝이 차단 / 막힌 경우, pipett를 철회전자하고 새로운 하나를 교체하십시오. </li><li> 이러한 슬라이스의 상단에서 대각선 녹화 셀을 접근 그 마지막 위치에, 약물 가득한 피펫의 끝은 기록 된 셀 기록 전극의 끝과 같은 초점 평면 (또는 약간 아래)에 1) 인 경우 , 그리고 2) 기록 세포 10-40 μm. 약물 가득한 피펫 팁이 기록 된 셀 위에있는 경우, 압력 방출의 힘은 gigaohm 인감을 방해 수 있습니다. </li><li> 전압 클램프 모드 또는 현재 클램프 모드에서 셀을 누른 상태에서 원하는 세포 반응을 기록합니다. 우리는 정기적으로 아세틸 콜린을 기록 및 / 또는 전압 클램프 모드에서 뉴런을 누른 상태에서 세포의 전류를 니코틴 -이 elicited. Picospritzer III를 사용할 때 압력 분사를 수동으로 트리거 될 수 있지만, 더 많은 재현 결과는 디지털 TTL 펄스를 수집 시스템 (축삭 Digidata 1440 및 pClamp 10.3)를 사용하여 압력 분사를 실행하는 것이 좋습니다. </li></ol> 5. 제어압전 번역기로 마약이 가득한 Micropipette <ol><li> 가능하면 단일 차원 압전 변환기에 약물이 가득한 피펫 홀더를 마운트 (예 : Piezojena PA-100 Burleigh PZM-150)가있는 아날로그 전압 입력 (다시 수집 시스템에서)을 허용 할 수 있습니다 고정밀 micromanipulator (셔터 MP-285)에 장착. 약물 가득한 피펫의 움직임에와 입국 / 출구의 타이밍과 속도를 포함하여 슬라이스, 부족이 더 쉽게 통제 및 실험에서 실험 재현 할 수 있기 때문 압전 번역 유용합니다. 피펫 만 압력 방출의 순간을 위해 압전 번역으로 셀 근처에 이동 될 때 nAChRs을 공부하면 약물이 가득한 피펫에서 니코틴 누설​​의 desensitizing 효과, 그들은 지금까지 발생한다 최소화하고 있습니다. </li><li> 압전 전압 제어 증폭기에 수동으로 제어 포텐를 사용하여 전압을 다이얼의 최대 값. </li><li> micromanipulator, 위치에게 피펫가 기록 된 셀에 내용을 추출하고, 수동으로 압전 전압 제어 증폭기에 0으로 전압을 줄여 피펫를 철회 할 슬라이스의 약물이 가득한 피펫을 사용합니다. </li><li> 기록 수집 시스템에서 아날로그 출력 신호를 사용하여, 250의 압력 분출 TTL 펄스가 발생하기 전에 밀리 초 300 밀리 초를 시작 기간 동안 슬라이스로 약물이 가득한 피펫 이동합니다. TTL 펄스가 끝난 후에 50 밀리 초를 시작, 250 밀리 초 기간 동안 피펫을 철회. </li></ol>

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본 논문에서 제시하는 방법은 뇌 슬라이스 준비에 리간드 - 개폐 이온 채널 기능을 공부 폭넓게 유용합니다. 그러나, 상당히 실험 데이터이 방법을 활용에서 그 결과의 품질과 재현성에 영향을 미칩니다 요인이 있습니다. 예를 들어, evoked 전류는 약물이 가득한 피펫의 팁의 직경에 매우 민감합니다. 작은 팁 약물 솔루션, 낮은 저항을 제공하는 대형 팁이 기록 된 셀 기록 전극 사이의 gigaohm 인감를 중단 될 가능성이 높아집니다 꺼내기에 어려움을 초래하게됩니다. 제시된 방법의 또 다른 한계는 그 기록 세포의 10 μm 내에서 세포의 활동을 증가시킬 수 잠재적으로 기록 된 세포에 영향을 미칠 수있는 약물이 가득한 피펫에서 약물에 노출 될 수 있습니다. 같은 약물 피펫있는 셀을 여러 번에 약물을 적용하면 피펫을에게 반환하는 것이 중요합니다각 응용 프로그램에 대한 슬라이스에 정확히 같은 위치. 다음 한 응답 배치에도 작은 편차 (예 : 1-2 μm) 종종 관찰 피...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong시약의&gt; 이름</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; N-메틸 D-glucamine</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; M2004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KCl</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; P3911</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 아냐<sub&gt; 2</sub&gt; PO<sub&gt; 4</sub</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; S9638</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaHCO<sub&gt; 3</sub</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; S6014</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; H3375</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 포도당</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; G5767</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 오세영<sup&gt; +</sup&gt; 아스 코브 산</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; A4034</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 티오 우레아</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; T8656</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 오세영<sup&gt; +</sup&gt; pyruvate</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; P2256</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgSO<sub&gt; 4</sub&gt; • 7H<sub&gt; 2</sub&gt; O</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; 230391</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CaCl<sub&gt; 2</sub&gt; • 2H<sub&gt; 2</sub&gt; 0</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; 223506</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaCl</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; S9625</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 오세영<sup&gt; +</sup&gt; pentobarbital</td&gt;<td&gt; Vortech 제약</td&gt;<td&gt; 76351315</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 칼륨 글루 콘산</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; G4500</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MG-ATP</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; A9187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GTP</td&gt;<td&gt; 시그마</td&gt;<td&gt; G8877</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DSK-제로 1 기계를 진동</td&gt;<td&gt; 테드 펠라 주식회사</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-97 불타는 / 브라운 micropipette 풀러</td&gt;<td&gt; 셔터</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; RC-27 녹음 챔버</td&gt;<td&gt; 워너</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TC-344B 재관류 히터 컨트롤러</td&gt;<td&gt; 워너</td&gt;<td&gt; 640101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SH-27B 솔루션 히터</td&gt;<td&gt; 워너</td&gt;<td&gt; 640102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 니콘 FN-1</td&gt;<td&gt; 니콘</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; C-7500 CCD 비디오 카메라</td&gt;<td&gt; 하마 마츠</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picospritzer III</td&gt;<td&gt; 일반 밸브 (주)</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MP-285 Micromanipulator</td&gt;<td&gt; 셔터</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PA-100 압전 변환기</td&gt;<td&gt; piezosystem 예나 주식회사</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12V40 압전 증폭기</td&gt;<td&gt; piezosystem 예나 주식회사</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axopatch 200B</td&gt;<td&gt; 분자 장치 업체</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Digidata 1440A</td&gt;<td&gt; 분자 장치 업체</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

마우스 뇌 슬라이스의 nicotinic 아 세티 콜린 수용체 기능을 공부하는 약물의 로컬 응용 프로그램

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

담배 사용은 암, 심장 질환, 폐기종, 그리고 뇌졸중 등 수많은 건강 문제로 연결됩니다. 흡연에 중독 중추 신경계에 걸쳐 nicotinic 아세틸 콜린 수용체 (nAChRs)에 니코틴의 biophysical 및 셀룰러 행동에서 유래 유행 neuropsychiatric 장애입니다. 니코틴 중독과 관련된 뇌 영역에 존재하는 다양한 nAChR의 하위 유형을 이해하는 것은 중요한 우선 순위입니다. 이러한 전체 세포 패치 클램프 또는 두 전극 전압 클램프 녹음 등의 전기 생리학 기술을 채용 실험은 관심 nAChRs의 약리 특성에 유용합니다. 같은 포유류의 조직 배양 세포 또는 Xenopus laevis의 oocytes과 같은 세포 표현 nAChRs는 물리적으로 격리되어 있으며 따라서 쉽게 현대 약리학의 도구를 사용하여 공부하고 있습니다. 대상 수용체가 이미 알려진 특히 때 많은 진전은 이러한 기술을 사용하여 만들어졌습니다차 이소성 표현은 쉽게 달성했습니다. 심하게 실험실 쥐 쥐에서 채취 한 뇌 슬라이스 내의 뉴런에 : 종종, 그러나, 그것은 그들의 모국어 환경에서 nAChRs을 연구 할 필요가 있습니다. 예를 들어, 쥐 등 α4 L9&#39;A 마우스 1 α6 L9 &#39;S 마우스 2로 &quot;지나치게&quot;nAChR의 subunits을 표현, 특정 nAChR의 subunit 자신의 기능 표현을 바탕으로 뉴런의 모호 식별 할 수 있습니다. 뇌 조각의 뉴런에서 전체 세포 패치 클램프 녹음이 정기적으로 숙련 된 electrophysiologist에 의해 수행되어 있지만, 로컬 등 아세틸 콜린이나 뇌 슬라이스 내에 기록 된 셀 니코틴 같은 약물을 적용하는 도전입니다. superfusate에 약물의 희석은 (목욕 응용 프로그램) 빠르게 되돌릴 수 없습니다, 그리고 U-튜브 시스템은 쉽게 뇌 슬라이스와 함께 작동하도록 구성되지 않습니다. 이 논문에서, 우리는 빠르게 성인 m에 기록 된 뉴런에 nAChR - 활성화 약물을 적용하는 방법을 설명뇌 조각 ouse. 표준 전체 셀 녹음 조각의 뉴런로 만든되며, 이익의 약물로 가득 두 번째 micropipette는 기록 세포 근처의 위치로 maneuvered입니다. 약물 가득한 피펫에 가압 공기 또는 불활성 질소의 주입은 기록 세포에 피펫에서 배출되는 약물 솔루션의 작은 금액을 발생합니다. 이 방법을 사용 nAChR로 인한 전류는 밀리 초 정확도로 해결 될 수 있습니다. 약물 응용 프로그램 시간은 쉽게 변할 수 있으며, 약물이 가득한 피펫은 농도 - 반응 곡선은 단일 신경 세포를 만들 수 있도록 허용하는 새로운 피펫으로 후퇴하고 교체 할 수 있습니다. nAChR 신경 생물학의 맥락에서 설명했지만,이 기술은 뇌 조각의 뉴런의 리간드 - 개폐 이온 채널이나 수용체의 다양한 종류를 공부하는 데 유용해야합니다.

우리의 실험에서, 우리는 정기적으로 도파민 (DA) 생산 복부 tegmental 지역 (VTA)와 substantia nigra 갈 거예요 compacta (SNc)의 뉴런을에서 기록합니다. 전압 클램프 모드에서 아세틸 콜린하거나 세포에 니코틴의 압력 응용 ​​프로그램은 일반적으로 100-200 밀리 초 (그림 1A-B)에서 정상에 도달 빠른, 안쪽 양이온 현재이 높아집니다. 현재의 부패는 크게 작업의 사이트에서 약물의 확산에 의해 결정됩니다, 그리고 슬라이스의 효소가 존재 여부를 비활성 형태로 약물을 흡수 할 수 있습니다. 예를 들어, 이크 DA 뉴런 5 풍부 뇌의 영역에서 세포의 표면에있는 acetylcholinesterases에 의해 빠르게 분해됩니다. evoked 현재 (그림 1A)의 급속한 붕괴에이 결과를 표시합니다. 반면, 니코틴 분해하고 니코틴-evoked 전류로 빠르게이 강하게 activ 할 수 전류 (그림 1B)를</...

이 논문에서, 우리는 심하게 절연 뇌 조각의 뉴런에 리간드 - 개폐 이온 채널 기능을 연구 할 수있는 유용한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 패치 클램프 기술을 사용하여 기록 뉴런에 약물의 로컬 응용 프로그램에 대한 약물 채워진 micropipette의 사용을 포함한다.

마우스 뇌 슬라이스의 Nicotinic 아 세티 콜린 수용체 기능을 공부하는 약물의 로컬 응용 프로그램

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

이 절차의 전반적인 목표는 성체 마우스에서 파생된 급성으로 준비된 뇌 절편에서 뉴런의 리간드 개폐 이온 채널 기능을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 특수 인공 대뇌 척수액이 관류된 트랜스 카디(trans Cardi)를 투여한 성인 쥐에서 온전한 뇌를 추출함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 뇌의 관심 영역에서 원하는 방향으로 뇌 절편을 준비하는 것입니다.다음으로, 현미경 아래 기록실에 배치된 개별 뇌 절편과 절편 내의 개별 뉴런을 식별하여 기록합니다. 마지막 단계는 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록이며, 두 번째 유리 마이크로 피펫을 사용하여 리간드 게이트 이온 채널을 활성화하기 위해 약물을 국부적으로 적용하는 것입니다. 궁극적으로, 리간드 게이트 이온 채널을 연구하는 이 방법은 살아있는 뉴런에 있는 네이티브 수용체의 생물물리학적 특성을 보여주는 데 사용됩니다.목욕 적용 또는 YouTube 약물 전달과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 기록된 뉴런으로의 약물 전달이 매우 빠르고 국소적이라는 것입니다. 소량의 약물을 전달할 수 있으며 단일 슬라이스에서 여러 뉴런을 연구할 수 있습니다. 이 방법은 생물물리학 세포에 관여하는 천연 니코틴 수용체, 니코틴에 대한 생물학적 및 행동적 반응을 결정하는 것과 같은 니코틴 아세틸콜린 수용체 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 절차에서는 성체 쥐를 희생하고 뇌를 얻은 후 얼음으로 냉각된 금속판에 관심 영역을 포함하도록 원하는 방향으로 뇌를 다듬습니다. 다음으로, 진동하는 슬라이서의 건조한 무대 표면에 슈퍼 접착제로 뇌 블록을 부착합니다. 그런 다음 뇌 블록을 섭씨 4도 NMDG 회수 용액에 담그고 용액에 발암원으로 지속적으로 거품을 냅니다.그런 다음 관심 있는 뇌 영역에서 각각 250미크론 두께의 조각을 자릅니다. 다음으로, 프로그래밍 가능한 화염 갈색 풀러를 사용하여 4-6메가 옴의 저항을 가진 표준 패치 마이크로 피펫을 당깁니다. 마이크로 피펫을 적절한 세포 내 기록 용액으로 채웁니다.그런 다음 단면을 정립 현미경의 스테이지에 있는 기록 챔버로 옮기고 분당 1.5-2.0밀리리터로 A CSF를 기록하는 섭씨 32도의 탄산 표준으로 슬라이스를 지속적으로 슈퍼 융합합니다. 현미경 아래에서 10 x air 대물렌즈를 사용하여 관심 있는 뇌 영역을 찾고 중앙에 배치합니다. 그런 다음 IR 미분 간섭 대비 광학 장치에 연결된 40 x 근적외선 수침 대물렌즈를 사용하여 개별 뉴런을 시각화하고 고속 근적외선 전하 결합 장치 또는 CCD 비디오 카메라를 사용하여 IR DIC 관찰에서 건강한 뉴런은 세포 시각화 후 부드러운 연한 회색 원형질막을 나타냅니다.기존 기술을 사용하여 전체 세포 기록을 수행합니다. 이제 이전과 같이 다른 표준 패치 클램프 마이크로 피펫을 당겨 약 5 메가 옴의 최적 저항으로 동일한 유리 조각에서 두 개의 동일한 자매 팁을 생성합니다. 마이크로 피펫 중 하나에 탄산 표준 기록에 희석된 약물 용액을 다시 채우고, CSF가 팁을 아래쪽으로 향하게 하고, 약물이 채워진 마이크로피펫을 튕겨 마이크로 피펫에 갇힌 기포를 제거합니다.다음으로, 약물이 채워진 마이크로 피펫을 마이크로미터 매니퓰레이터에 부착된 피펫 홀더에 장착합니다. 피펫 홀더는 튜브와 함께 적절한 압력 배출 시스템에 연결해야 합니다. 유체 컬럼 뒤에 적절한 압력을 형성하기 위해 마이크로 피펫으로 압력을 3-4회 수동으로 배출합니다.그런 다음 I-R-D-I-C를 사용하여 microm 매니퓰레이터를 사용하여 약물 피펫을 슬라이스로 내립니다. 관찰. 약물 마이크로 피펫을 조직 절편의 표면에 놓습니다. 한 번의 압력 배출을 실행하고 배출 및 마이크로 피펫 팁과 관련된 파편의 움직임에 대해 팁 부근을 모니터링합니다.팁이 막히거나 막혔다는 징후가 있는 경우 팁이 막힌 경우 피펫을 집어넣고 새 것으로 교체하십시오. 슬라이스의 맨 위에서 대각선으로 기록된 셀에 접근합니다. 최종 위치에 있을 때, 약물이 채워진 피펫의 팁은 기록된 세포 및 기록 전극의 팁과 동일한 초점면에 있으며, 기록된 세포로부터 약 10 내지 40미크론입니다.약물로 채워진 피펫 팁이 기록된 세포 위에 있는 경우, 압력 방출로 인한 힘이 세포의 기가 씰을 방해한 다음 뉴런을 전압 클램프 모드로 유지하면서 아세틸콜린 및/또는 니코틴 유도 세포 전류를 기록할 수 있습니다. 피코 스프리처 3을 사용할 때 보다 재현성 있는 결과를 위해 압력 제거를 수동으로 트리거할 수 있지만, 획득 시스템과 디지털 TTL 펄스를 사용하여 압력 제거를 트리거하는 것이 좋습니다. 실험을 개선하기 위해 약물 충전 피펫 홀더를 아날로그 전압 입력을 수용할 수 있는 1차원 pizo 전기 변환기에 장착한 다음 고정밀 마이크로 매니퓰레이터에 장착할 수 있습니다.pizo 전기 변환기는 진입 출구의 타이밍 및 속도를 포함하여 약물로 채워진 피펫의 슬라이스 안팎의 이동을 보다 쉽게 제어하고 실험에서 실험으로 재현할 수 있기 때문에 유용합니다. 다음으로, pizo 전기 전압 제어 증폭기의 수동으로 제어되는 전위차계를 사용하여 전압을 최대 값으로 조정합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 약물로 채워진 피펫을 슬라이스에 배치합니다.기록 수집 시스템의 아날로그 출력 신호를 사용하여 pazo 전기 전압 제어 증폭기의 전압을 수동으로 0으로 줄여 피펫을 집어넣습니다. 압력 배출 TTL 펄스가 발생하기 전에 약물이 채워진 피펫을 슬라이스로 이동합니다. 펄스가 발생한 후 피펫을 집어넣습니다.이 그림은 국소적으로 적용된 100마이크로몰 아세틸콜린에 대한 도파민 뉴런의 대표적인 반응을 보여주며, 이 그림은 국소적으로 적용된 100마이크로몰 니코틴에 대한 다른 도파민 뉴런의 대표적인 반응을 보여줍니다. 다음은 현재 클램프 모드로 유지되는 Alpha six L nine prime S 마우스 뇌 슬라이스에서 도파민 뉴런의 자발적 활동 전위입니다. 250밀리초의 압력 제거를 사용하여 1마이크로몰의 니코틴을 적용하면 작용, 잠재적 발화 속도 및 휴지 막 전위의 변화가 유발되었습니다.P 클램프 소프트웨어의 임계값 검색을 사용하여 순간 발사 속도를 도출하여 아세틸콜린 반응 개별 상대장 뉴런의 유형에 따라 뉴런을 분류했습니다. 알파 6 L 9 프라임 마우스 브레인 슬라이스에서 전압 클램핑 후 압력 방출 유형 1 뉴런을 통해 1 마이크로 몰 니코틴의 국부 적용은 증가 된 IPC를 나타냈다. 니코틴 적용 후 2형 뉴런은 큰 내부 전류를 나타내고 니코틴 적용에 대한 반응으로 EPC를 증가시켰습니다.Pizo 전기 번역기는 일관성을 제공하고 약물 누출을 방지합니다. Alpha six L nine prime S 마우스의 뇌 절편에 있는 VTA 도파민 뉴런이 전압 박수 모드로 기록되었습니다. 1 마이크로 몰 니코틴을 적용하는 동안, 니코틴으로 채워진 피펫을 압력 배출 전 최종 위치로 이동하고 파조 전기 변환기를 사용하여 배출 후 후퇴시켰다.첫 번째 반응 후 2분 후에 두 번째 반응이 기록되어 N-A-C-H-R 탈감작이 발생하지 않았음을 입증했습니다. 실험은 10 마이크로 몰 니코틴을 적용하여 반복되었습니다. 다시 말하지만, 첫 번째 반응과 비교할 때 두 번째 반응에서 둔감화가 관찰되지 않았습니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 이내에 수행할 수 있습니다. 어떤 경우에는 하루 이내에 단일 뇌 절편에서 10-15개의 뉴런을 연구할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 표면 니코틴 수용체의 완전한 활성화와 기가 씰의 무결성 사이의 균형을 유지하기 위해 약물로 채워진 피펫을 정확하게 배치하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 더 나은 접근 장물과 스펙트럼을 사용하여 수용체의 형광 단백질 태그를 포함한 접근 방법의 조합을 사용하여 니코틴 중독의 메커니즘을 이해하기 위해 CNS의 뉴런의 특정 subtypes의 subcellular 지역 내에서 nicotinic 아세틸콜린 수용체 변화를 quantifying의 소설 기법을 개발했습니다 공촛점 이미징.

만성 니코틴 관리와 마우스 노크 인의 Fluorescently 태그를 Nicotinic 수용체의 분광 공촛점 이미징

신경 세포막 매매 동적 세포막 단백질 가능 크게 영향 신경 전달을 제어한다. 지금까지, 그것은 성인의 신경 세포에서 신경 세포 내 이입 매매를 측정하기 위해 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 급성 뇌 조각의 표면 단백질 발현 생체의 급격한 변화를 측정 할 수있는 매우 효과적인, 양적 방법을 설명합니다.

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em&gt; 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는&gt; 접근

우리는 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChRs) 매개 시냅스 전달의 시냅스 전 메커니즘을 분석하기 위해 직접 라이브 이미징을 허용하는 복부 해마 – 측좌 회로의 유전자 키메라 제제를 in vitro에서 개발했습니다. 이 제제는 또한 시냅스 가소성의 시냅스 전후 메커니즘을 연구하기 위한 유익한 접근 방식을 제공합니다.

니코틴 유도 칼슘 신호 전달 및 복부 해마 축삭을 따라 신경 전달 물질 방출의 라이브 영상

이 프로토콜에서는 최적화 된 N의 구현을 보여 줍니다.-메 틸-D-glucamine (NMDG) 보호 복구 방법의 뇌 조각 준비. 단일 미디어 공식 안정적으로 다양 한 실험적인 응용 프로그램에 대 한 어떤 나이의 동물에서 건강 한 뇌 조각 얻을 하는 데 사용 됩니다.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

신경 생리학 신경 심리적 시험의 유효한 컴퓨터 배터리는 초기 단계 개발에서 새로 개발된 된 약물의 중추에 pharmacodynamic 효과 공부 하는 데 사용 됩니다. 설명 하기 위해 테스트 배터리, mecamylamine의 급성 효과 두 개의 길 항 제 약물에 의해 이러한 효과의 반전 설명 합니다.

연구 초기 단계 약물 개발에 해 약의 중추 신 경계에 Pharmacodynamic 효과 컴퓨터 테스트 배터리

선물이 추가 neurodegeneration 기본 초기 이벤트에 대 한 통찰력을 제공할 수 설립된 전 비보 두뇌 기술에 기반 한 메서드가 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험의 장점이 결합. 또한, 같은 해 부 비행기에서 치료 및 치료 그룹의 직접 비교를 위한 독특한 기회를 나타냅니다.

Neurodegeneration Ex Vivo 쥐 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 기본 이벤트를 공부 하는 양자 택일 접근

Microglia, 두뇌의 거주 면역 세포 그들의 환경의 수정에 형태학 변화 신속 하 게 응답. 이 프로토콜 2 광자 현미경을 사용 하 여 쥐의 급성 뇌 조각에서 세로토닌 또는 ATP microglial 프로세스의 매력을 공부 하는 방법을 설명 합니다.

Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상

이 문서는 니코틴 uncaging에 의해 마우스 뇌 조각에서 nicotinic 아 세 틸 콜린 수용 체 (nAChRs) 공부에 대 한 메서드를 제공 합니다. 동시 패치 클램프 기록 및 2 광자 레이저 스캐닝 현미경 검사 법으로 사용할 경우 해 신경 생물학의 깊은 이해를 제공 하는 세포 형태학 nicotinic 수용 체 기능을 연결 니코틴 uncaging 합니다.

Photoactivatable 니코틴의 레이저 플래시 Photolysis를 통해 마우스 뇌 조각에서 Nicotinic 아 세 틸 콜린 수용 체 기능을 프로 빙

우리는 성인 마우스에서 급성 조각에 단일 코르티코스트 리아 탈 글루타마티터지시냅스에서 글루타메이트 방출과 클리어런스 사이의 균형을 평가하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 글루타메이트 검출을 위해 형광 센서 iGluu, 신호 수집을 위한 sCMOS 카메라 및 초점 레이저 조명장치를 사용합니다.

정상 및 헌팅턴 마우스의 급성 뇌 슬라이스에서 글루타메이트 방출 및 섭취량의 단일 시냅스 지표

이 방법은 급성 뇌 슬라이스를 사용하여 내인성 모아민 방출의 검출을위한 간단한 기술을 소개합니다. 설정은 모노아민 방출을 위한 조직 홀더를 포함하는 48웰 플레이트를 사용합니다. 방출된 모노아민은 HPLC에 의해 전기화학적 검출과 결합하여 분석된다. 또한,이 기술은 약물 발견을위한 스크리닝 방법을 제공합니다.

급성 뇌 슬라이스에서 내인성 모아민 방출 측정을 위한 판 기반 분석

이 프로토콜은 포유류 Neuro-2a 세포주를 이용한 뉴런 니코틴계 아세틸콜린 수용체 소단위의 발현 및 정량을 설명합니다. pH 민감성 형광 태그와 공초점 현미경은 수용체의 위치가 형질막과 pH 중립 세포 내 구획에서 발현된 수용체를 정밀하게 평가할 수 있게 하여 nAChR 수송과 약리학적 조절 연구를 용이하게 합니다.

포유류 세포에서 정량적 영상을 이용한 세포내 니코틴 아세틸콜린 수용체의 원형 및 세포내 원형질막 위치

배우세요 성인 마우스 뇌 슬라이스에서 patch clamp 기법과 국소 약물 적용을 이용한 ligand-gated ion channel 기능 연구 방법을. 이 기법은 신경 과학 연구에서 생체 뉴런의 수용체 특성을 정밀 분석하는 데 활용됩니다.

마우스 뇌 슬라이스의 Nicotinic 아 세티 콜린 수용체 기능을 공부하는 약물의 로컬 응용 프로그램

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