Name: 심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 배우세요 심장 조직 공학을 위한 모세관 력 리소그래피 기법을 활용하여 생체모방 세포 배양 기질을 제작하는 방법입니다. 이 기술은 심근세포 구조 정렬과 기능 분석에 효과적입니다.

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D. H. Kim은 워싱턴 대학교 생명공학과에 새로운 교수진 창업 기금을 제공한 것에 대해 감사를 표합니다. D. H. Kim은 또한 Perkins Coie Award for Discovery, Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, Washington State Life Science Discovery Fund 및 American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076)의 지원을 받고 있습니다. J. Macadangdang과 A. Jiao는 NIH Bioengineering의 지원에 감사드립니다. 심혈관 훈련 보조금 펠로우십. 이 작업에 대한 추가 지원은 M. Regnier에 대한 NIH(National Institutes of Health) 보조금 R01HL111197에서 제공됩니다.

별도의 표시가없는 한, 모든 절차는 실온 (~ 23 ° C)에서 실시하고 있습니다. 실리콘 마스터 1. 제작 <ol><li> O 2 / N 2 가스에서 100 % 에탄올, 자일 렌 및 건조와 깨끗한 실리콘 웨이퍼. </li><li> 0.3 ~ 0.5 μm의 두께 필름을 생산하기 위해 2,000-4,000 RPM의 회전 속도로 스핀 코터 실리콘 웨이퍼를 놓습니다. </li><li> 포토 리소그래피 시스템을 사용하여 패턴 정확한 치수를 갖는 포토 레지스트 막을 </li><li> 완전 포토 레지스트 개발 솔루션의 적절한 볼륨의 패턴 화 된 포토 레지스트 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 체험. </li><li> 탈 이온수로 개발 된 포토 레지스트 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 씻어. </li><li> 근처 수직 측벽, 깊은 반응성 이온 식각 에칭 시스템을 사용하여 노출 된 실리콘과 함께 서브 마이크론 치수 능선 어레이를 형성한다. </li><li> 플라즈마 애셔 시스템에서 실리콘 웨이퍼를 배치하여 남은 포토 레지스트를 제거한다. </li><li> 승 실리콘을 잘라이후의 복제 성형에 대한 적절한 크기의 실리콘 마스터에 다이아몬드 팁 커터 AFERS. </li></ol> 실리콘 마스터에서 PUA 몰드 2. 제작 주 : 나노 제조를위한 실리콘 마스터에 추가 할 양이 우레탄 아크릴 레이트 (PUA) 용액의 점도뿐만 아니라 복제 될 나노 패턴 마스터의 면적에 따라 달라질 것이다. <ol><li> 100 % 에탄올 또는 O 2 / N 2 가스에서 자일 렌 및 건조와 깨끗한 실리콘 마스터면. </li><li> 페트리 접시에 실리콘 마스터 패턴 측면을 놓습니다. </li><li> 2cm X 2cm 표면 패턴, 패턴의 표면에 PUA의 피펫 40 μL와 실리콘 마스터하십시오. </li><li> 4cm 분배 PUA에 대한 X 4cm 투명한 폴리 에스테르 (PET) 필름의 시트를 놓습니다. </li><li> 아래로 PET 시트에 눌러 수 있도록 (예 : 카드 등) 롤러 또는 평면 가장자리가 표면을 사용하여 패턴면에서 시트 아래에 PUA 확산 전체패턴 PUA 프리폴리머에 의해 덮여있다. </li><li> 50 초 동안 약 10cm 20 와트 (115 V) 자외선 (λ = 365 nm의) 아래의 실리콘 마스터, 예비 및 PET를 놓습니다. 효과가, 자외선 파장은 310-400 nm의 사이에 어디 에나있을 수 있습니다. 빛의 세기는 상기 기판의 표면에서 10 ~ 15 mW의 / cm 2이다. </li><li> 경화 후, 집게 천천히 PET 필름을 제거합니다. PUA는 실리콘 마스터 나노 패턴의 음과 PET 필름에 부착해야한다. </li><li> 사용하기 전에 최소 12 시간 동안 UV에서 PUA / PET의 나노 패턴을 치료. 과다 노출은 문제가되지 않습니다. </li><li> 실리콘 마스터를 청소하려면, PUA의 추가없이 마스터 위에 PET의 또 다른 필름을 배치하고 50 초 동안 자외선 (λ = 365 nm의)에 노출 및 PET 필름을 제거합니다. 이것은 미 반응 모노머를 제거합니다. </li><li> O 2 / N 2 가스에서 100 % 에탄올, 자일 렌 및 건조와 실리콘 마스터를 씻어. </li></ol> 3A. 나노 패터닝 폴리 우레탄 폴리머 </P&gt; <ol><li> 10 분간 오존 처리 챔버 내에 배치하여 25mm 지름의 원형 유리 슬라이드를 준비한다. </li><li> 쉬운 취급을위한 작은 PDMS 블록에 오존 처리 된 유리 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 유리 슬라이드에 페인트 브러시와 표면 접착 촉진제의 얇은 층을 적용하십시오. 30 분 동안 공기 건조 유리 슬라이드. </li><li> 프린터 종이에 유리 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 유리 슬라이드의 중심에 사전 폴리머 (NOA 76) 폴리 우레탄 10 μL (PU)을 분배 삭제합니다. 기포가 첨가 한 후 존재하지 않는 확인하십시오. </li><li> 장소 PUA 금형, 패턴 유리 슬라이드에, 얼굴을 아래로. 균일 PUA 몰드 따라 실린더 고무 롤러를 회전함에 따라 유리 슬라이드의 표면에 걸쳐 PU를 분산. 프린터 용지 폴리머 오버 플로우를 흡수 할 것이다. </li><li> 와트 UV 램프. PU의 중합 시간은 UV 소스의 힘에 의존한다. </li><li> UV 광원으로부터 샘플을 제거하고주의 깊게 PU 코팅 된 유리 슬라이드에서 PUA 몰드 껍질. PU의 중합 C로 간주됩니다omplete 완전히 떨어져 샘플에서 PUA 몰드 껍질과 PU 유리 슬라이드 무지개 빛깔의 외관이 때. </li><li> 한 달에 스토리지를위한 데시 케이 터에서 완성 샘플을 놓습니다. </li></ol> (b). 나노 패터닝 폴리 (락 타이드 - 코 - 글리콜 라이드) 히드로 겔 <ol><li> 적극적으로 10:1의 비율로 실리콘 엘라스토머 기지와 실리콘 엘라스토머 경화제를 혼합하여 평면 PDMS 몰드를 만듭니다. </li><li> (PDMS 5 ㎜ 두께가되도록, 즉) PDMS 전구체 접시의 가장자리를 5mm까지 도달하도록 혼합 PDMS가 페트리 디쉬에 액을 전구체 붓는다. </li><li> 가스를 제거하는 1 시간 동안 건조기에 페트리 접시와 PDMS 전구체를 놓습니다. </li><li> 치료하기 위해 적어도 2 시간 동안 65 ° C의 오븐에 페트리 접시와 PDMS 전구체를 이동합니다. </li><li> PDMS는 치료 후 3cm × 3 인치의 정사각형 섹션으로 평면 PDMS를 잘라 면도기를 사용합니다. 이러한 패터닝 공정에서 나중에 사용 평 PDMS 몰드 것이다. </li><li> PL 청결한 지름 25mm 원형 유리 슬라이드물을 초음파 처리기에 30 분 동안 이소 프로필 알콜로 acing. </li><li> O 2 / N 2 가스 하에서 드라이 세정 된 유리 슬라이드. </li><li> 드롭 PLGA 용액 100 μl를 분배 유리 슬라이드에 (15 % w 클로로포름 PLGA V /). </li><li> 용매를 흡수하고 평평한 PLGA 표면을 얻기 위해 분배 된 PLGA 위에 평평한 PDMS 몰드를 놓습니다. 5 분 동안 PDMS 위에 200g의 중량을 배치하여 가벼운 압력 (~ 10 kPa의)을 적용한다. </li><li> 서서히 평 PDMS 몰드를 박리하고 잔류 용매를 제거하고 PLGA와 커버 글라스 사이의 밀착성을 증가시키기 위해 5 분 동안 예열 플레이트 (120 ℃)​​에 커버 글라스를 배치. </li><li> 플랫 PLGA 위에 NP PUA 몰드를 놓고 PUA 몰드의 상단에 1 kg 무게를 배치하여 일정한 압력 (~ 100 kPa의)과 열 (120 ° C)를 적용 15 분 동안 가열 접시에있다. </li><li> PLGA 커버 슬라이드에서 무게를 제거하고 하층은 실온으로 냉각시킨다. 하층이 될 때까지 PUA 몰드를 제거하지 마십시오냉각. </li><li> 하층가 충분히 냉각 한 후, 조심스럽게 NP PLGA의 기질을 드러내는, NP PUA 몰드를 벗겨. NP PLGA의 토대는 무지개 빛깔의 모습이 있어야합니다. </li><li> 한 달에 스토리지를위한 데시 케이 터에서 완성 샘플을 놓습니다. </li></ol> 4. 셀 시드와 문화 참고 :이 프로토콜은 신생아 쥐의 심실 근육 세포 (NRVMs)과 H7 인간 배아 줄기 세포 유래 심근 (hESC의-CMS)하지만 다른 세포 소스의 문화를 설명 사용할 수있다. <ol><li> 35mm 조직 문화 폴리스티렌 접시에 ANFS의 커버 슬립 (PU 또는 PLGA)를 연결합니다. 접시의 바닥에 조심스럽게 놀 랜드 광학 접착제 (NOA83H)의 피펫 20 μL는 NOA의 상단에 ANFS coverslip에 배치합니다. 접착제가 퍼져 전체 coverslip에 바닥을 커버 할 수 있습니다. 10 분 동안 UV에 요리를 노출하여 NOA 치료. </li><li> 회, 5 분 동안 70 % 에탄올 수용액 2 ㎖로 세정하여 ANFS 살균. 전자를 제거흡인 thanol. 허용 ANFS 생물 안전 캐비닛의 UV 살균 램프 (λ = 200-290 nm의)에서 ~ 1 시간 동안 완전히 건조 공기. </li><li> 세포 접착 밤새 피브로넥틴에 ANFS 코팅에 의해 강화된다. 5 ㎍ / ml로 DI 물에 피브로넥틴을 희석. 접시에 피브로넥틴 솔루션의 피펫 2 ㎖. 37 ° C에서 인큐베이터에 배치하고 5 % CO 2 밤새 (최소 6 시간). </li><li> 이전 프로토콜 22에 따라 NRVMs, hESC의 CMS가, 또는 관심의 다른 심장 세포를 얻습니다. </li><li> 펠릿 세포에 3 분 동안 1,000 rpm으로 원심 분리기 세포 샘플. </li><li> 흡인에 의해 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 방해하지 않도록하십시오. </li><li> 4.6 × 106 세포 / ml의 농도로 적절한 배양 배지에서 세포를 재현 탁. </li><li> 조심스럽게 살균 ANFS에 세포 현탁액 200 μl를 피펫. 확인 세포 현탁액은 커버 슬립에 남아합니다. </li><li> 37 ° C와 5 % 배양기에서 세포를 배치CO 세포가 ANFS에 부착 할 수 있도록 4 시간 2. </li><li> 동일한 조건에서 배양기에서 세포를 접시 및 교체 따뜻한 배지 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 24 시간 후, 미디어를 제거하고 여분의 세포를 제거하기 위해 두 번 DPBS 2 ㎖로 씻는다. </li><li> 동일한 조건에서 배양기에서 세포를 접시 및 교체 따뜻한 배지 2 ㎖를 추가합니다. 문화 세포가 합류합니다. 매일 미디어를 교체합니다. </li></ol>

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기능적으로 성숙한 심장 조직은 생체 내에서와 심장 조직 공학 생체 응용 프로그램에서 모두 부족하다. 여기에 설명 CFL의 나노 제조 방법은 셀룰러 정렬을 달성 인해 시스템의 확장 성으로 거시적 조직 기능을 좌우위한 견고한 기술이다. 큰 영역은 쉽게 패턴과 세포 배양에 사용할 수 있습니다. 매크로 셀 정렬은 생체 모방, 그것은 심근 (38)의 기계 및 전기 두 속성에 영향을 미치는 등 기능적인 조직을 만들기 위해 심장 조직 공학에서 필수적이다. 여기의 방법은 심장 조직 공학 내의 다양한 애플리케이션에 적용될 수있다. 그것은 이전에 나노 큐가 심장 줄기 세포 틈새 시장을 생성하고 재생 (14)를 홍보하는 데 도움이 시연되었다. 이와 같은 PLGA와 같은 생분해 성 고분자를 이용하여 나노 패턴 &quot;패치&quot;촉진 할 수 있었다심장 모욕 후 치유. 대안 적으로, 네이티브 심장 유사한 탄성률과 하이드로 ...

심혈관 질환은 세계에서 사망률 및 사망의 주요 원인이며, 이미 변형 된 세계 보건 시스템 1,17에 무거운 사회 경제적 부담을 제시한다. (1) 허혈성 질환이나 심근 병증 후 손상된 심근을 재생하거나 (2) 생체 외 약물 검사 또는 질병 모델링을위한 마음의 고 충실도 모델을 만드는 : 심장 조직 공학은 두 가지 목표를 가지고 있습니다. 심장은 몸에 혈액을 공급하기 위해 지속적으로 작동해야합니다 복잡한 기관이다. 심근 및 지원 조직의 밀집 층 구조는 심장 벽 (18, 19)에 걸쳐 나선형 패턴으로 배치되어있다. 심장은 전기 기계적 효율적으로 본체 (21)에 혈액을 배출 할 수있는 고도의 조정 방식으로 20에 연결된다. 자연의 아야 신뢰성 시험 관내에서 효과적으로 요약 될 수 있기 전에 여러 주요 장애물은, 그러나, 해결되어야 남아있다.강력한 심근 분화 방법 (22)을 개발하기 위해 계속하지만, 첫째, hPSC-CMS는 여전히 다소 미숙 표현형을 나타낸다. 자신의 전기 특성과 형태에 가장 가까운 태아의 수준 23 일치. 전통 문화의 조건에서 보관하는 경우 둘째, 줄기 세포 유래 및 기본 심근 모두 기본, 조직과 같은 구조로 조립하는 데 실패합니다. 오히려 세포가 무작위로 지향되고 성숙한 심근 (24)의 줄무늬 막대 모양의 외관을 지원하지 않는 경우가 있습니다. 세포가 상호 작용과 세포 외 기질 (ECM) 환경은 많은 세포 과정 11,13,25에 중요한 역할을한다. ECM은 크게 6,26 세포의 구조 및 기능에 영향을 미치는 복합, 잘 정의 된 분자 및 지형 큐들로 구성된다. 심장 내에서 세포 정렬 밀접 기본 나노 미터 규모의 ECM 섬유 2를 다음과 같습니다. 이러한 nanotopograph의 영향세포와 조직의 기능에 iCal의 단서는, 그러나, 지금까지 완전히 이해에 있습니다. 나노 미터 크기의 세포 - 생체 적합 물질의 상호 작용의 예비 연구 (27) 세포 신호 전달, 접착 28-30, 성장 31, 32, 33 및 차별화를위한 서브 마이크론 지형 신호의 잠재적 인 중요성과 효과를 나타냅니다. 그러나, 재현과 확장 성 나노 제조 기판 개발에 어려움에, 이러한 연구는 생체 내 ECM 환경에서 복잡한 멀티 스케일 휴대 효과를 재현 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 네이티브 심장 ECM 섬유 배향을 흉내 낸 세포 배양 지지체를 생성하는 간단하고 비용 효과적인 나노 제조 기술은 심근 세포 - 생체 물질의 상호 작용의 신규 한 조사 광범위한 있도록 설명한다. 심근은 나노 ECM 환경과 상호 작용하는 방식을 이해하는 것은 더 가깝게 모방 기본 조직의 기능에 휴대 동작을 제어 할 수있는 능력을 허용 할 수기. 또한, 세포 단일 층은 3 차원 구조에 비해 단순화 된 실험 시스템입니다 만, 여전히 통찰력 조사와 기능 검사 2,34-36 복잡한 다세포 동작을 나타냅니다. 마지막으로, 지지체 (37)는 재생 목적을 위해 심장에 이식 할 때 셀룰러 그래프트 기능을 향상시키기 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Fibronectin</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>NOA 76</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>7606B</td><td></td></tr><tr><td>표면 접착 프로모터(유리 프라이머)</td><td>Minuta Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PUA</td><td>Minuta Tech</td><td>MINS-311RM</td><td></td></tr><tr><td>연질 고무 롤러</td><td>스피드볼</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>NOVA Electronic Materials</td><td>FA01-9900</td><td></td></tr><tr><td>포토레지</td>스트 <td>Shipley</td><td>SPRT510</td><td></td></tr><tr><td>포토레지스트 개발자</td><td>Shipley</td><td>MF320</td><td></td></tr><tr><td>전자빔 리소그래피 시스템</td><td>JEOL</td><td>JBX-9300FS</td><td></td></tr><tr><td>에칭 시스템</td><td>표면 기술 시스템</td><td>NP10 8UJ</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 Asher 시스템</td><td>BMR Technology Co.</td><td>DSF-200</td><td></td></tr><tr><td>오존 경화 시스템</td><td>Minuta Tech</td><td>MT-UV-O-08</td><td></td></tr><tr><td>융합 경화 시스템</td><td>Minuta Tech</td><td>MT-UV-A 11</td><td></td></tr><tr><td>NOA 83H</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>8301</td><td></td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>월계관 기술</td><td>WS-400-6NPP</td><td></td></tr><tr><td>Skyrol PET 필름</td><td>SKC Co., Ltd.</td><td>23038-59-9</td><td></td></tr><tr><td>25mm 유리 슬라이드</td><td>Corning</td><td>2948</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>6/5/2553</td><td></td></tr><tr><td>폴리(D,L-락타이드-코글리콜라이드)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P2191-1G</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>372978-1L</td><td></td></tr><tr><td>500g 무게</td><td>글로벌 산업용</td><td>T9FB503120</td><td></td></tr><tr><td>이소 프로필 알코올</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1835-2</td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>B2510MTH</td><td></td></tr></tbody></table>

심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

심혈관 질환은 전세계 사망 1의 주요 원인이 남아있다. 심장 조직 공학 심장 재생뿐만 아니라 체외 심사 분석을위한 기능적인 조직 개발의 목표와 혁신적인 의료 발견을 제공하기 위해 많은 약속을 보유하고 있습니다. 그러나, 심장 조직의 충실도가 높은 모델을 만들 수있는 능력이 어려운 입증했다. 심장의 세포 외 기질 (ECM)는에서 나노 미터 규모의 2 마이크로에 이르기까지 모두 생화학 및 생 역학적 인 신호로 구성된 복잡한 구조입니다. 기계적 하중 조건과 세포 - ECM 상호 작용 지역은 최근 심장 조직 공학 3-5의 중요한 구성 요소로 인식되고있다. 심장 ECM의 많은 부분이 크게 조직 구조 및 전기 기계 결합이 영향을 나노 스케일 직경 정렬 콜라겐 섬유로 구성된다. 불행하게도, 몇 가지 방법이 근래전자 나노 미터 크기까지 ECM 섬유의 조직을 모방 할 수있게되었습니다. 나노 제조 기술의 최근 발전은, 그러나, 심장 6-9에서 ECM의 생체 구조 및 기판 강성 큐들을 모방 확장 발판의 설계 및 제조를 사용할 수있다. 여기에서 우리는의 발전을 제시이 재현성, 경제적, 및 생체 적합성 중합체, 폴리 (락 티드 - 코 - 글리콜 라이드) (PLGA) (8) 및 폴리 우레탄 (PU) 계 중합체를 사용하여 심장 세포의 기능적 정렬을위한 확장 가능한 나노 패터닝 공정. 이러한 이방를 nanofabricated 하층 (ANFS는) 잘 조직 된, 정렬 조직의 기본 ECM을 모방하고 세포 형태 및 기능을 10 ~ 14에 나노 형상의 역할을 조사 할 수 있습니다. 주형으로 나노 패턴 (NP) 실리콘 마스터를 사용하여, 폴리 우레탄 아크릴 레이트 (PUA) 금형을 제작한다. 이 PUA 몰드는 다음 파에 사용된다각각 UV-지원 또는 용매 매개 모세관 력 리소그래피 (CFL), 15, 16을 통해 PU 또는 PLGA 하이드로 겔을 ttern. 간단히, PU 또는 PLGA 예비 중합체는 유리 커버 슬립하고 PUA 금형이 상부에 배치되어 상으로 분배 된 드롭이다. UV 보조 CFL 들어, PU는 후 경화 UV 방사선 (λ = 250-400 NM)에 노출된다. 용매 매개 CFL의 경우, PLGA는 열 (120 ° C) 및 압력 (100 kPa의)를 사용하여 양각되어있다. 경화 후, PUA 몰드는 세포 배양을위한 ANFS 남기고 박리된다. 이러한 신생아 래트 심실 근세포뿐만 아니라 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 같은 일차 전지는, ANFS 2에 유지 될 수있다.

도 1은이 제조 방법에 대한 제조 공정의 개략도이다. 때문에 나노 지형에 의한 빛의 회절, 나노 패터닝은 ANFS에 무지개 빛깔의 표면에 발생한다. 2는 800 nm의 능선과 홈에 잘 패턴 25mm NP-PU coverslip에 (그림 2A)에서이 무지개 빛깔의 표면을 묘사 그림 폭 (그림 2B). ANF​​S의 무지개 빛깔의 외관은 능선과 홈의 폭에 따라 다소 차이가 있습니다. ANF​​S에 세포를 파종 한 후, 셀은 기판의 홈에 평행 한 방향으로 정렬되기 시작한다. 정렬은 파종 후 첫 24 시간 내에 명확하게해야합니다. (3) 문화의 48 시간 후 문화의 hESC-CM을 7 일 이후에 NRVMs 대표 시야의 이미지를 보여줍니다 배양 기간의 전체에 대한 유지해야한다...

이 프로토콜에서는 모세관 힘 리소그래피를 사용하여 두 개의 별개의 고분자 재료로 만든 생체 모방 심장 세포 배양 하층의 제작을 보여줍니다. 설명된 방법은 in vitro 및 in vivo 응용 프로그램을 위해 거시적 심장 조직의 구조와 기능을 엔지니어링할 수 있는 확장 가능하고 비용 효율적인 기술을 제공합니다.

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

이 절차의 전반적인 목표는 거시적 심장 조직의 구조와 기능을 공학적으로 구현하기 위해 생체 모방 세포 배양 기질을 제작하는 것입니다. 이는 먼저 심부 반응성 이온 식각법을 통해 원하는 지형적 구조를 가진 실리콘 마스터를 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 UV 보조 모세관력 리소그래피를 사용하여 실리콘 마스터의 원하는 지형적 패턴을 PUA 몰드로 전사하는 것입니다.다음으로, UV 보조 또는 용매 매개 모세관력 리소그래피를 통해 원하는 응용 분야에 따라 다양한 고분자 재료로 세포 배양 기판을 제작하기 위한 템플릿으로 PUA 몰드를 사용합니다. 마지막 단계는 후속 분석을 위해 일차 세포 또는 줄기세포 유래 심근세포를 나노 패턴 세포 배양 기판 위에 도말하는 것입니다. 최종적으로, 명시야 및 면역형광 현미경을 사용하여 심근세포 내의 세포 형태 및 수축 단백질 배열의 변화를 관찰합니다.마이크로 접촉 인쇄와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 모세관력 리소그래피가 세포 증식이나 이동에 의존하지 않고도 심장 조직 단일층의 구조적 정렬을 유도할 수 있는 나노 패턴 세포 배양 기질을 생성한다는 점입니다. 이 방법은 심장 조직의 구조-기능 관계에 대한 통찰을 제공하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 암 기계생물학(mechanobiology)과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 매트릭스 지형이 세포 이동에 미치는 영향을 연구하려면, 먼저 100% ethanol 또는 xylene으로 실리콘 마스터 표면을 세척하고 산소 질소 가스로 건조하여 이 절차를 시작하십시오.다음으로, 실리콘 마스터의 패턴 면이 위로 향하게 페트리 접시에 놓습니다. 표면 패턴 크기가 2 cm x 2 cm인 실리콘 마스터의 경우, PUA 40 µL를 분주합니다. 그다음, 분주된 PUA 위에 4 cm x 4 cm 크기의 투명 폴리에스터 필름 시트를 덮습니다. PET 시트를 누른 후 롤러나 평평한 표면을 사용하여 시트 아래의 PUA를 패턴 면 전체에 펼쳐, 모든 패턴이 PUA 프리폴리머로 덮이게 합니다. 그 후, 프리폴리머와 PET가 덮인 실리콘 마스터를 20 W UV 램프 아래 약 10 cm 거리에 두고 50초 동안 노출시킵니다.경화 후, 핀셋을 사용하여 PET 필름을 천천히 제거합니다. PUA는 실리콘 마스터 나노 패턴의 음각 형태로 PET 필름에 부착되어야 합니다. 이후 사용 전 UV 하에서 P-U-A-P-E-T 나노 패턴을 최소 12시간 동안 경화시킵니다.실리콘 마스터를 세척하려면 PUA를 추가하지 않은 상태에서 마스터 위에 PET 필름을 한 겹 더 덮습니다. 이를 UV 광원에 50초 동안 노출시킨 후 PET 필름을 제거합니다. 그다음 100% ethanol 또는 xylene으로 실리콘 마스터를 헹구고 산소 질소 가스로 건조시킵니다.본 절차에서는 18 millimeter 직경의 원형 유리 슬라이드를 오존 챔버에 10분 동안 넣어 처리합니다. 다음으로, 취급이 용이하도록 슬라이드를 PDMS 블록 위에 올려 일시적으로 고정합니다. 그다음, 유리 슬라이드 표면에 유리 프라이머 층을 도포합니다.프라이머를 30분 동안 자연 건조시킵니다. 이제 유리 슬라이드를 프린터 용지 위에 놓습니다. 각 유리 슬라이드의 중앙에 폴리우레탄 프리폴리머 10 µL를 떨어뜨리고 기포가 생성되지 않았는지 확인합니다.그런 다음 PUA 몰드의 패턴 면을 유리 슬라이드 위에 아래로 향하게 놓은 뒤, 고무 실린더 롤러로 PUA 몰드를 밀어 PU 프리폴리머를 유리 슬라이드 표면에 균일하게 분산시킵니다. 이때 프린터 용지가 과잉 분출된 폴리머를 흡수합니다. 이후 20W UV 램프 아래에서 60초 동안 UV 경화시킵니다. 이어서 샘플을 UV 광원에서 제거하고 PU가 코팅된 유리 슬라이드에서 PUA 몰드를 조심스럽게 떼어내면 PU의 중합이 완료된 것으로 간주합니다.PUA 몰드가 샘플에서 깨끗하게 벗겨지고 PU 유리 슬라이드가 무지개 빛을 띠면, 샘플을 데시케이터에 넣어 최대 한 달 동안 보관하십시오. 이제 NFS 커버슬립을 35 millimeter 조직 배양용 폴리스티렌 디쉬에 부착하기 위해, 디쉬 바닥에 NOA 20 microliters를 피펫으로 분주합니다. NPPU 커버슬립을 NOA 위에 조심스럽게 올리고 접착제가 퍼져 커버슬립 바닥 전체를 덮도록 둡니다. 그 후, 디쉬를 UV에 10 minutes 동안 노출시켜 NOA를 경화시킵니다.다음으로, 70% 에탄올 수용액 2 mL로 NP SUBSTRATA를 각각 5분씩 두 번 헹구어 멸균합니다. 흡입법으로 에탄올을 제거합니다. 생물안전작업대(biological safety cabinet) 내의 UV 멸균 램프 아래에서 A NFS를 약 1시간 동안 완전히 자연 건조시킵니다.세포 부착력을 높이기 위해, 먼저 피브로넥틴(fibronectin)을 초순수(di water)로 5 µg/mL가 되도록 희석하여 A NFS를 하룻밤 동안 코팅합니다. 그다음, 피브로넥틴 용액 2 mL를 디쉬에 분주합니다. 이후 A NFS를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다.NR VM, HESC CM 또는 기타 관심 심장 세포를 준비하고, 세포 샘플을 1000 RPM에서 3분 동안 원심 분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 흡입법을 통해 상층액을 조심스럽게 제거하며, 이때 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의합니다. 그 후, 세포를 배양 배지에 재현탁하여 4.6 × 10⁶ cells/mL 농도로 맞춥니다.세포 현탁액 200 µL를 멸균된 A NFS 위에 조심스럽게 피펫팅하고, 세포 현탁액이 커버슬립 위에 그대로 유지되도록 합니다. 다음으로, 세포가 A NFS에 부착될 수 있도록 세포를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다. 그 후, 디시에 따뜻한 배양액 2 mL를 추가로 넣고 동일한 조건의 인큐베이터에 세포를 다시 넣습니다.24시간 후, 배지를 제거하고 2 mL의 DPBS로 두 번 세척하여 과잉 세포를 제거합니다. 그 다음, 디쉬에 2 mL의 따뜻한 배양 배지를 첨가합니다. 세포를 동일한 조건의 인큐베이터에 넣고 배양합니다.세포가 컨플루언스(confluence) 상태가 될 때까지 이틀마다 배지를 교체합니다. 이 그림은 7일간 배양한 NR VM과 HESC cm의 대표적인 명시야(brightfield) 이미지를 보여줍니다. 48시간 배양 후, NP 표면의 NR VM과 HESC CMS는 뚜렷한 구조적 이방성과 정렬을 보이는 반면, UN 패턴 표면의 심근세포는 무작위로 배열되어 있습니다.면역조직화학 분석은 나노 지형이 세포 세포골격 정렬에 미치는 영향을 강조하며, A NFS에서 배양된 세포의 actin 미세섬유와 alpha sarcomeric actin은 나노 리지(nano ridges)를 따라 정렬되지만, 패턴이 없는 기질 위의 세포에서는 무작위로 분포된 상태로 유지됩니다. 이 절차를 수행할 때, 배양 후 오염이 큰 문제가 될 수 있으므로 세포를 안착시키기 전에 기질을 멸균하는 것이 중요함을 기억하십시오. 이 기술은 심혈관 생물학 연구자들이 심장 성숙과 줄기세포 유래 심근세포를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청하신 후에는 심장 조직 공학 응용을 위해 모세관력 리소그래피(capillary force lithography)를 통해 생체 모방 세포 배양 기질을 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

정렬 심근 조직의 생성 임상 유용한 목적에 줄기 세포 생물학의 최근 발전을 조절하기위한 중요한 요구 사항입니다. 여기에 우리는 세포의 형태와 기능의 정확한 제어를위한 microcontact 인쇄 방법을 설명합니다. 심장 progenitors을 파생 배아 줄기 세포의 높은 정화 인구 사용하여, 우리는 비 등방성 기능 심근 조직을 생성합니다.

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

우리는 PDMS 기질에 패턴화된 제니핀과 피브로넥틴을 미세유체 증착하는 방법을 제시하여 혈관 평활근 세포 밀집형 조직의 생존력을 연장할 수 있습니다. 이 조직 제조 방법은 이전의 혈관 근육 박막 기술과 결합되어 질병 관련 시간 경과에 대한 혈관 수축성을 측정합니다.

미세 패턴 혈관 근육 박막의 확장 문화 미세 유체 Genipin 증착 기술

이 원고는 표면 마커 발현과 세포 분류를 사용하여 정의된 공학적 심장 조직의 생성을 설명합니다. 그런 다음 정의된 조직을 다중 조직 생물반응기에서 사용하여 심장 세포 치료의 메커니즘을 조사하여 기능적이면서도 제어된 인간 심장 모델 시스템을 제공할 수 있습니다.

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

이 프로토콜은 생체 재료를 사용하지 않고 심장 ​​조직의 3D bioprinting을 설명합니다. 3D bioprinted 심장 패치는 구성 요소 spheroids의 기계적 통합을 나타내며 심장 조직 재생 및 심장병의 3D 모델로서 매우 유망합니다.

3D Bioprinting을 이용한 Spheroids의 기계적 통합을 보여주는 심장 조직의 생성

우리 어디 보조 세포 유형 수 더 시드할 수이 microfibrous 구조 vascularized 조직 및 organoids를 생성 하는 틈새 공간으로 microfibrous 혈관 침대 엔지니어링에 대 한 미세 bioprinting 전략에 따라 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다.

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

여기 우리는 복잡 한 형상의 설계 조직 히드로-기반 생산에 사용할 수 있는 사용자 지정입니다 금형 날조를 위한 신속 하 고, 손쉬운, 고 저가 방법 제시. 우리는 또한이 기술을 사용 하 여 생산 조작된 심장 조직에서 실시 하는 기계 및 조직학 평가 결과 설명 합니다.

사용자 지정 레이저 에칭 마스터스에서 조직 문화 금형 설계

이 프로토콜은 생물 공학 적 배경이 제한된 사람들이 간단하고 접근 할 수있는 리소 그래피프리 마이크로 패터닝 방법을 소개합니다. 이 방법은 세포 형태를 변조하기 위한 관심있는 모양의 마이크로 패턴 세포 외 매트릭스 단백질에 맞춤형 레이저 컷 스텐실을 활용합니다. 미세 패터킹에 대한 절차는 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 입증된다.

레이저 컷 스텐실을 사용한 간단한 리소그래피 없는 단일 셀 마이크로패터닝

엔지니어링 된 조직은 중요한 영양소와 가스를 제공하고 신진 대사 폐기물을 제거하기 위해 적절한 혈관 네트워크에 크게 의존합니다. 이 작업에서는 내피 세포 및 지지 세포의 단계별 파종 프로토콜이 제어된 3D 환경에서 혈관 거동을 연구하기 위한 고도로 조직된 혈관 네트워크를 생성합니다.

스테셀레이트 비계에 단계별 세포 파종하여 발아 혈관을 연구합니다.

줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 생체 공학적으로 설계된 3차원 심장 조직은 건강한 심근과 병든 인간 심근 을 체외 에서 연구하는 동시에 천연 심장 틈새 시장의 주요 측면을 요약하기 위한 유망한 모델로 부상했습니다. 이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포에서 생성된 high-content engineered 심장 조직을 제작하고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

공학적 심장 조직의 데이터 수집 및 모델 처리량을 개선하기 위한 바이오리액터 설계

빛을 사용하여 심장 세포와 조직을 제어하면 비접촉 자극이 가능하여 세포의 자연 상태와 기능을 보존할 수 있으므로 기본 연구와 치료 응용 분야 모두에 유용한 접근 방식이 됩니다.

비유전적 광학 자극을 통한 Ca2+ 전파를 연구하기 위한 심장 미세생리학적 시스템

용융 전기방사 쓰기(MEW), 폴리카프로락톤(PCL) 스캐폴드 및 피브린 하이드로겔을 hiPSC 유래 심근세포 및 섬유아세포와 결합한 3D 심근 조직을 생성하기 위해 재현 가능한 방법이 제시됩니다. 이 기술은 스캐폴드 아키텍처를 정밀하게 제어하며 전임상 약물 테스트 및 심장 질환 모델링에 적용할 수 있습니다.

폴리카프로락톤 골격 및 hiPSC 유래 심장 세포의 용융 전기방사 쓰기를 사용한 3D 인간 심근 조직 생성

배우세요 심장 조직 공학을 위한 모세관 력 리소그래피 기법을 활용하여 생체모방 세포 배양 기질을 제작하는 방법입니다. 이 기술은 심근세포 구조 정렬과 기능 분석에 효과적입니다.

심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

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