June 10th, 2014
이 프로토콜에서는 모세관 힘 리소그래피를 사용하여 두 개의 별개의 고분자 재료로 만든 생체 모방 심장 세포 배양 하층의 제작을 보여줍니다. 설명된 방법은 in vitro 및 in vivo 응용 프로그램을 위해 거시적 심장 조직의 구조와 기능을 엔지니어링할 수 있는 확장 가능하고 비용 효율적인 기술을 제공합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 거시적 심장 조직의 구조와 기능을 엔지니어링하기 위해 생체 모방 세포 배양 하위층을 생산하는 것입니다. 이는 먼저 심층 반응성 이온 에칭을 통해 원하는 지형 아키텍처를 가진 실리콘 마스터를 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 UV 보조 모세관 힘 리소그래피를 사용하여 실리콘 마스터에서 PUA 금형으로 원하는 지형 패턴을 전송하는 것입니다.
다음으로, PUA 몰드는 UV 보조 또는 용매 매개 모세혈관 리소그래피를 통해 원하는 응용 분야에 따라 다양한 고분자 재료로 세포 배양 하층을 제작하기 위한 템플릿으로 사용됩니다. 마지막 단계는 후속 분석을 위해 1차 또는 줄기세포 유래 심근세포를 나노 패턴 세포 배양 하층(substrata)에 플레이트링하는 것입니다. 궁극적으로, 명시야와 면역형광 현미경 검사는 심근세포 내 세포 형태 및 수축 단백질 배열의 변화를 보여주는 데 사용됩니다.
마이크로 컨택트 프린팅과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 모세관 힘 리소그래피가 세포 증식 또는 이동에 의존하지 않고 심장 조직 단층의 구조적 정렬을 유도할 수 있는 나노 패턴 세포 배양 하층을 생성한다는 것입니다. 이 방법은 심장 조직의 구조 기능 관계에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있지만 암 기계생물학과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 세포 이동 Be에 대한 매트릭스 지형의 영향을 연구하려면 실리콘 마스터 표면을 100% 에탄올 또는 자일렌으로 세척하고 산소 질소 가스에서 건조하여 이 절차를 시작합니다.
다음으로, 실리콘 마스터 패턴이 위로 향하게 하여 2cm x 2cm 표면 패턴 피펫 40마이크로리터의 PUA가 있는 실리콘 마스터용 페트리 접시에 놓습니다. 그런 다음 분배된 PUA 위에 4cm x 4cm 투명 폴리에스터 필름 시트를 놓고 PET 시트를 누른 다음 롤러 또는 평평한 가장자리 표면을 사용하여 패턴 면을 가로질러 시트 아래에 PUA를 펴서 전체 패턴이 PUA 프리 폴리머로 덮이도록 합니다. 그런 다음 실리콘 마스터 프리 폴리머와 PET를 10와트 자외선 아래 약 20cm 아래에 50초 동안 놓습니다.
경화 후 겸자로 PET 필름을 천천히 제거합니다. PUA는 Silicon Master 나노 패턴의 네거티브가 있는 PET 필름에 부착해야 합니다. 그런 다음 사용하기 전에 최소 12시간 동안 UV에서 P-U-A-P-E-T 나노 패턴을 경화시킵니다.
실리콘 마스터를 청소하려면 PUA를 추가하지 않고 마스터 위에 다른 PET 필름을 놓습니다. 자외선에 50초 동안 노출시키고 PET 필름을 제거합니다. 그런 다음 실리콘 마스터를 100% 에탄올 또는 자일렌으로 헹구고 산소 질소 가스에서 건조시킵니다.
이 절차에서는 18mm 직경의 원형 유리 슬라이드를 10분 동안 오존 챔버에 넣어 처리합니다. 그런 다음 슬라이드를 PDMS 블록에 놓고 쉽게 다룰 수 있도록 임시로 고정합니다. 다음으로, 유리 슬라이드의 표면에 유리 프라이머 층을 바릅니다.
프라이머를 30분 동안 자연 건조시킵니다. 이제 유리 슬라이드를 프린터 용지 조각에 놓습니다. 10마이크로리터의 폴리우레탄 프리 폴리머를 각 유리 슬라이드의 중앙에 떨어뜨리고 기포가 발생하지 않는지 확인합니다.
그런 다음 PUA 금형 패턴을 뒤집어 유리 슬라이드에 놓고 PUA 금형을 따라 고무 실린더 롤러를 굴려 유리 슬라이드 표면에 균일하게 pu 프리 폴리머를 분산시킵니다. 프린터 용지는 나중에 폴리머 오버플로를 흡수하여 20와트 UV 램프에서 60초 동안 UV 경화시킵니다. 그런 다음 UV 광원에서 샘플을 제거하고 PU 코팅 유리 슬라이드 중합에서 PUA 금형을 조심스럽게 벗겨내면 PU의 중합이 완료된 것으로 간주됩니다.
PUA 금형이 샘플에서 깨끗하게 벗겨지고 PU 유리 슬라이드가 무지개 빛깔의 외관을 띠면 샘플을 건조제에 넣어 한 달 동안 보관합니다. 이제 NFS 덮개 슬립을 35mm 조직 배양 폴리스티렌 접시 피펫에 부착하고 20 마이크로 리터의 NOA를 접시 바닥에 부착합니다. NPPU 커버 슬립을 NOA 위에 부드럽게 놓고 접착제가 퍼지고 커버 슬립 바닥 전체를 덮은 후 접시를 10분 동안 UV에 노출시켜 NOA를 치료합니다.
다음으로, NP SUBSTRATA를 70% 수성 에탄올 용액 2ml로 각각 5분씩 2회 헹궈 살균합니다. 흡인에 의해 에탄올을 제거하십시오. A NFS가 생물 안전 캐비닛의 UV 살균 램프 아래에서 약 1시간 동안 완전히 자연 건조되도록 합니다.
세포 접착력을 향상시키려면 먼저 디워터의 피브로넥틴을 밀리리터당 5마이크로그램으로 희석하여 하룻밤 사이에 A NFS를 피브로넥틴으로 코팅합니다. 다음으로, 2ml의 피브로넥틴 용액을 접시에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 A NFS를 섭씨 37도, 5%CO2의 인큐베이터에 하룻밤 동안 넣습니다.
NR VM, HESC CMS 또는 기타 관심 심장 세포를 얻고 세포 샘플을 1000RPM에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 흡인에 의해 상등액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 방해하지 않도록 하십시오. 그 후, 배양 배지의 세포를 밀리리터당 6 개의 세포에 대해 4.6 곱하기 10의 농도로 재현 탁시킵니다.
200마이크로리터의 세포 현탁액을 멸균된 A NFS에 조심스럽게 피펫팅하고 세포 현탁액이 커버 슬립에 남아 있는지 확인합니다. 다음으로, 세포를 섭씨 37도, 5%CO2의 인큐베이터에 4시간 동안 넣어 세포가 A NFS에 부착되도록 합니다. 그런 다음 접시에 2ml의 추가 온열 배양 배지를 추가하고 동일한 조건에서 세포를 인큐베이터에 다시 놓습니다.
24시간 후 배지를 제거하고 2ml의 DPBS로 두 번 세척하여 과도한 세포를 제거합니다. 그 후, 접시에 2ml의 따뜻한 배양 배지를 추가합니다. 세포를 동일한 조건과 배양으로 인큐베이터에 넣습니다.
합류하는 세포는 격일로 배지를 교체합니다. 이 그림은 7일간의 배양 및 HESC cms 후 NR VM의 대표적인 명시야 이미지를 보여줍니다. 48시간의 배양 후 NP 표면의 NR VM 및 HESC CMS는 명백한 구조적 이방성 및 정렬을 보여주는 반면, UN 패턴 표면의 심근세포는 무작위 배향을 보입니다.
면역조직화학 분석은 세포 세포골격 정렬에 대한 나노 지형의 영향을 강조하며, A NFS에서 배양된 세포의 액틴 마이크로 필라멘트 및 알파 육종 액틴은 나노 능선을 따라 정렬되지만 패턴이 없는 하층의 세포에 무작위로 분포되어 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 감염이 발생한 후 큰 문제가 될 수 있으므로 세포가 앉기 전에 하층을 살균하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 심혈관 생물학 연구자들이 심장 성숙 및 줄기세포 유래 심근세포를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
이 동영상을 시청한 후에는 심장 조직 공학 응용 분야를 위한 모세관 힘 리소그래피를 통해 생체 모방 세포 배양 하층을 생산하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 프로토콜은 모세관력 리소그래피를 사용한 생체모방 심장 세포 배양 기질의 제작을 설명합니다. 설명된 방법은 다양한 응용을 위해 매크로 심장 조직을 엔지니어링하는 확장 가능하고 비용 효율적인 접근 방식을 제공합니다.
Capillary force lithography enables scalable fabrication of biomimetic substrata that replicate nanoscale extracellular matrix cues critical for cardiac tissue maturation. This approach supports predictive modeling of cardiomyocyte structure-function relationships, reducing reliance on empirical screening in early discovery. By providing reproducible, alignment-inducing platforms, the method enhances target validation confidence and translational continuity in cardiovascular R&D pipelines.
The method integrates into discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of matrix topography effects prior to lead optimization stages.