Name: 유전자 규정의 단일 분자 이미징 생체에 절단하여 Cotranslational 인증 (CoTrAC)를 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 배우세요 CoTrAC 방법을 사용하여 살아있는 E. coli 세포에서 단일 분자 수준으로 단백질 생산을 시각화하는 기술을. 이 비침습적 형광 현미경법은 전사 인자 동역학을 관찰하여 세포 과정을 방해하지 않고 단백질 기능을 연구할 수 있습니다.

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Ubp1을 표현 플라스미드 pCG001께서는 의학 연구의 존 커틴 대학에서 로한은 베이커에 의해 제공되었다. 이 작품은 천 연구 기금 1 FY2011 년 3 월, 천​​ 바질 오코너 초보자 학술 연구 상 # 5 - FY20 및 NSF 경력 상 0,746,796 3 월에 자금을 지원했다.

1. 스트레인 엔지니어링 워크 플로우 <ol><li> 시퀀스 인코딩 (A) 막 현지화 순서, (b)는 빠른 속도로 성장하고 형광 단백질과와 관심 단백질 (예를 들어 전사 인자)와 프레임 (C) 단백 분해 효소 인식 서열 N-터미널.를 삽입 우리는 TSR-비너스 기자 대상 멤브레인을 사용하고 표현 박테리오파지 λ 억제 CI 단백질 분자의 수를 계산하기 위해 Ubiquitin 단백 분해 효소 인식 서열 (UB)에 융합. 우리가 지역을 코딩 CI 야생 형을 대체하고 E.에 구조를 통합, 융합 단백질 TSR-비너스-UB-CI를 구축 방법에 대한 자세한 내용은 λ 레드 재조합 3을 사용 대장균의 염색체가, 심판에 자세히 설명되어 있습니다. 1. </li><li> 시퀀싱하여 모든 수정 사항을 확인합니다. </li><li> 플라스미드 인코딩 할 관심의 형광 기자와 단백질을 표현 변종에 위의 사용 된 인식 순서에 맞는 프로테아제를 변환병진 융합 인치 우리는 C-터미널 Ubiquitin 잔류 네 직후 cleaves 단백 분해 효소 Ubp1을 사용 하였다. </li></ol> 2. 문화 셀 및 샘플 준비 <ol><li> 한 E. 선택 갓 줄무늬 한천 플레이트에서 관심 대장균 식민지 하나 ML M9 최소한의 미디어 5로는 1X 가상 아미노산과 적절한 항생제로 보충. 원하는 온도로 흔드는에 품다는 충분히 달성 할 수 OD 600&gt; 1.0 (600 nm의에서 광학 밀도).에게 </li><li> OD 600 = 0.02에 해당 항생제로 1 ML 신선한 M9 매체에 문화를 희석. 적절한 온도에서 흔드는에 품다. 저온 성장에 필요한 경우 초기 세포 밀도 증가 될 수있다. </li><li> OD 600 = 0.2-0.3 (37에서 OD 600에서 초기 세포 배양과 ° C = 0.02, 이건 3-4 시간을 소요됩니다), 아가로 오스 겔 패드를 (3 단계) 준비를 시작합니다. </li><li> 때 OD 셀 이미징을위한 준비 <sub&gt;을 600 = 0.3-0.4. </li><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브, benchtop microcentrifuge에서 1 분 10,000 XG에서 원심 분리기로 한 ML incubated 문화를 전송합니다. </li><li> 표면에 뜨는을 취소하고 1 ML 신선한 M9 매체를 추가하고 펠렛을 부드럽게 resuspend. </li><li> 1 분에 10,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 1.6 1.7 단계를 반복합니다. 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 부드럽게 한 ML M9 미디어에 resuspend. timelapse 영상에 대한 낮은 세포 밀도를 보장하기 위해 100 배에 - 세포를 직접 현미경 이미징 또는 희석 10 사용할 수 있습니다. 낮은 세포 밀도가 확장 timelapse 영상을 위해 중요합니다. 이미징 챔버 (4 단계)은 실험이 진행되는 동안 봉인되어 있습니다. 세포의 기하 급수적 인 성장으로 인해, 높은 초기 세포 농도는 크게 형광 단백질 성숙을 줄이고 세포의 성장에 영향을 미치는, 젤 패드의 장기 성장 후 챔버 내에 산소를 고갈 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 아가로 오스 솔루션을 준비 <ol><li> 10-20 MG를 달다1.5 ML의 microcentrifuge 관에 낮은 녹는 온도 아가로 오스. </li><li> 3 % 아가로 오스 솔루션을 만들기 위해 항생제없이 적절한 볼륨 M9 최소한의 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 70시 30 분의 아가로 오스 솔루션을 가열 ° C, 솔루션은 완전히 녹아 균일 성을 확보하기 위해 반전 튜브를 용해 할 수 있습니다. 젤 패드는이 점 (4 단계)에서 부어 할 수 있습니다 또는 온도는 ° C 50 감소하고 나중에 사용하기 위해 몇 시간 동안 실시 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 상공 회의소에 젤 패드를 준비합니다 <ol><li> 이미징 전에 약 50 분, 물과 Microaqueduct 슬라이드를 씻어. </li><li> 하나는 커버 유리를 청소 (6에 설명 등 여러 엄격한 청소 방법을 사용하여)와 압축 공기로 불어하여 멸균 물과 건조로 슬라이드를 Microaqueduct 씻어. </li><li> 이렇게이의 응용 프로그램을 수정할 수 있습니다 Microaqueduct 슬라이드 (의 유리면에 유입구 및 유출구를 포함하도록 Microaqueduct 슬라이드에 고무 개스킷을 삽입합니다어떤 미디어)은 샘플을 통해 perfused 있습니다. Microaqueduct 슬라이드의 중심 50 μl 아가로 오스 솔루션 (3 단계)을 적용합니다. </li><li> 청소, 드라이 커버 유리와 아가로 오스 솔루션을 맨. </li><li> 아가로 오스 솔루션은 30 분 동안 실온에서 서 보자. </li><li> 한편, (제 2 단계) 세포 샘플을 준비합니다. </li><li> 조심스럽게 젤 패드의 상단에서 덮개 유리에서 껍질. 젤 패드의 상단에 1.0 μl 한물 세포 배양을 추가합니다. 젤 패드에 의해 흡수 될 수있는 문화 ~ 2 분 기다리십시오. 그건 너무 오래 기다리지 않고 중요하다 젤 패드 overdries하지만, 충분히 전지가 올바르게 젤 패드을 준수되었는지 확인합니다.주세요 이상적인 대기 시간은 온도와 습도에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 기다리는 동안 다른 precleaned 커버 유리를 건조. </li><li> 커버 유리와 Microaqueduct 슬라이드가 잘 정렬되어 있도록 새로운 커버 유리로 샘플을 커버. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 온도 제어 성장 챔버를 조립.그것은 지금 현미경 (단계 5)에서 영상을 위해 사용될 수 있습니다. </li></ol> 5. 이미징 및 Timelapse 영화의 취득 <ol><li> 제조업체의 지시 사항 (예 : 레이저 실험 전에 ~ 0.5 시간에 예열해야 할 수도 있습니다) 다음과 같은 레이저와 현미경을 사용합니다. </li><li> 현미경의 무대 삽입에 조립 챔버를 잠급니다. 성장 챔버의 온도와 37 ° C 나 기타 원하는 성장 온도에서 목표 히터를 설정합니다. </li><li> 실온 위 이미징 경우, 초점이나 젤 패드는 일반적으로 초기 온도 변화 후 ~ 15 분 동안 크게 표류합니다. 실제로, 관심 지역을 찾아 실험을 위해 필요에 따라 이미징 스크립트를 수정할 시간을 사용합니다. </li><li> 현미경에서 세포를 찾아 미리 정의와 정렬 이미징 지역 내에서 중심 한 후 각 셀의 위치를​​ 저장합니다. 하나 이상의 셀은 각 이미지 획득 시간 창에서 이미징 할 수 있습니다. m 이상 timelapse 영상에 대한모든 세대가 다른 식민지 성장하는 동안 이미징 지역을 입력하지 않도록 이미징 세포가 처음 백 회에 몇 μm하여 다른 세포로부터 분리되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 그래서 레이저 여기 강도를 조정은 6 노출 내의 거의 모든 형광 분자의 photobleach (그림 5). </li><li> 자동 이미지 스크립트 / 잡지, 그림 3의 실험 워크 플로우에 설명 된 알고리즘을 사용하여 timelapse 데이터를 가져올을 사용합니다. </li></ol>

<ol><li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells%2C+One+Protein+Molecule+at+a+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li>
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</ol>

우리는 공개가 없습니다.

CoTrAC 방법은 기존 N 또는 C-터미널 형광 단백질 fusions 단백질의 활동을 방해하는 다른 단백질의 생산을 측정하는 일반화 할 수 있습니다. CoTrAC 전략은 현재의 방법으로 세 독특한 장점이 있습니다. 첫째, 공동 병진 융합 형광 기자 분자가 실시간으로 단백질 생산의 정확한 계산을 허용, 관심있는 단백질의 각 분자에 대한 생산 될 수 있도록합니다. 둘째, 막 타겟 기자는 TSR-금성은 매우 낮은 수준에서 표현 단백질의 검출을 사용, 형광 기자의 단일 분자 검출 할 수 있습니다. 가장 중요한 세 번째와 네, 형광 기자의 공동 병진 절단 관심의 단백질은 E.의 단백 분해 효소 인식 순서로 Ubiquitin 일반적으로 - 사용하여 가까운 야생 형 시퀀스와 기능을 유지 할 수 있습니다 대장균은 대상 단백질은 그 첫 번째 N-터미널 N에서 자신의 야생 형 펩타이드 시퀀스 다를 &lt;/ EM&gt; - 포르 밀 메티오닌 - 메티오닌은으로 변경됩니다. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 아가로 오스 (낮은 녹는 온도) </td><td> Lonza </td><td> 50,100 </td><td></td></tr><tr><td> 밀리 Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × M9 소금 </td><td></td><td></td><td> 다음 제조법은 9에 설명 </td></tr><tr><td> 20 % 포도당 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 × 가상 아미노산 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> 온도 조절 성장방 무대 어댑터 </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> 목표 히터 </td><td> Bioptechs </td><td> 모델 현미경 대물에 따라 달라집니다 </td><td></td></tr><tr><td> 슬라이드 Microaqueduct </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 커버 유리 </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> 소스에 어려울 수 있습니다, Bioptechs의 이용도 가능합니다 </td></tr><tr><td> 유리 / 슬라이드 근육 커버 </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0.75 mm </td><td></td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> 여러 </td><td> 예를 들어 설정 : 코 히어 런트 Innova 308C 아르곤 이온 레이저, 올림푸스 IX-81 현미경, 올림푸스 PlanApo 100X NA 1.45 목적, Metamorph 소프트웨어 </td><td> 레이저 여기, 자동화 XYZ 단계, 스크립트 이미징 및 자동 초점이 가능 자동화 소프트웨어 resolvin 할 수있는 광학이 있어야합니다g 단일 형광 단백질 </td></tr><tr><td> EM-CCD 카메라 </td><td> 여러 </td><td> 예를 들어 설정 : ANDOR Ixon DU-898 </td><td> 배경 위의 하나의 형광 단백질을 감지 충분히 낮은 소음을 가지고 있어야 </td></tr></tbody></table>

유전자 규정의 단일 분자 이미징<em&gt; 생체에</em&gt; 절단하여 cotranslational 인증 (cotrac)를 사용

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

우리는 이미지 절단하여 형광 현미경 방법, 공동 병진 인증 (CoTrAC) 단백질의 기능을 perturbing없이 단일 분자 정밀도 라이브 세포의 단백질 분자의 생산을 설명합니다. 이 방법은 가능한 연속 다섯 분 시간 창 동안 한 셀에서 생산되는 단백질 분자의 숫자를 계산 할 수 있습니다. 이 라이브 셀에 하나의 형광 단백질 분자를 감지 할 충분히 문자를 구분합니다 ~ 0.5-1 kW 급 / cm 2,의 레이저 여기 전력 밀도와 형광 현미경이 필요합니다. 막 타겟팅 순서, 빠른 속도로 성장하고, 노란색 형광 단백질과 단백 분해 효소 인식 순서 :이 방법에 사용되는 형광 기자는 세 부분으로 구성되어 있습니다. 기자는 translationally 관심 단백질의 N-말단에 융합되어 있습니다. 셀은 온도 조절 현미경 무대에서 성장하고 있습니다. 5 분마다, 세포 내 형광 분자 (이상 공동 이미징 아르) 형광 이미지를 분석하여 unted 만 새로 번역 된 단백질이 다음 측정에 포함됩니다 있도록 이후 photobleached. 이 방법에 의한 형광 이미지는 각 이미지의 형광 명소를 감지 개별 셀에 지정하고 세포 lineages에 셀을 지정하여 분석 할 수 있습니다. 주어진 셀에 시간 창 내에서 생산되는 단백질의 수는 단일 형광 분자의 평균 강도에 의해 장소의 통합 형광 강도를 나누어 계산됩니다. 우리는 하나의 5 분 시간 창에서 0-45 분자의 범위에서 표현 수준을 측정 할 수이 방법을 사용했습니다. 이 방법은 우리가 λ 억제 CI의 표현에 소음을 측정 할 수있게하고, 시스템 생물학에 많은 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다.

λ 억제 CI의 생산을 추적 CoTrAC 실험에서 전형적인 결과는 그림 4와 5에 표시됩니다. 이 실험에서, 12 콜로니는 5 분 간격으로 이미징했다. 때마다 시점에서, 식민지 먼저 autofocused되었고 이미징 영역 내에 중앙. 다음으로 중심 / 중심의 위치가 저장되었고 brightfield 이미지가 인수되었습니다. 무대는 다음 세포를 (위상 대비 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 광학없이 bisecting 비행기에 brightfield 초점 평면에서 이동하려면 Z-축을 따라 ~ 0.5 μm에 의해 translocated되었습니다 반투명 개체는 약간의 이미징 할 수 있습니다 밖에서 초점 비행기 8). 마지막으로, 여섯, 이미지는 100 밀리 초 노출 (그림 5는 하나의 시점을 보여줍니다)을 1 초 간격, 각에 인수되었다. 이것은 각각의 시점에서 모든 셀에 대해 반복되었다. 거의 모든 비너스 분자는 각 timepoint, fluores에서 pho...

우리는 이미지 절단하여 형광 현미경 방법, 공동 병진 인증 (CoTrAC), 단백질의 기능을 perturbing없이 단일 분자 정밀도 라이브 세포의 단백질 분자의 생산을 설명합니다. 이 메소드는 전사 인자, λ 억제 CI의 확률 표현 역학을 수행하는 데 사용되었습니다<sup&gt; 1</sup&gt;.

유전자 규정의 단일 분자 이미징<em&gt; 생체에</em&gt; 절단하여 Cotranslational 인증 (CoTrAC)를 사용

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

이 절차의 목적은 성장하는 대장균 군집의 타임 랩스 형광 이미지를 획득하여 새로 생성된 단백질 분자의 수를 식별하기 위해 공동 추적 구조를 발현하는 것입니다. 이는 먼저 세포 샘플을 준비하고, 형광 Cora 리포터에 융합된 관심 단백질을 발현하는 coex, 그리고 Cora 리포터와 관심 단백질 사이를 특이적으로 절단하는 프로테아제를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 M nine 최소 배지로 만든 저용융 온도 Aris의 겔을 준비하는 것입니다.다음으로, 온도 제어 시료 챔버와 함께 사용할 수 있도록 AROS 겔 패드를 준비합니다. 대장균 세포를 겔 위에 놓고 챔버를 조립합니다. 마지막 단계는 챔버를 형광 현미경에 놓고 여러 세대에 걸쳐 일정한 간격으로 성장하는 여러 세포 군체를 이미지화하는 것입니다.광표백은 궁극적으로 모든 re의 각 간격에 새로 생성된 TRE 보고 분자를 사용하여 단일 분자 및 단일 세포 분해능을 가진 생명 세포에서 단백질 생산의 시간 흔적을 획득하는 데 사용됩니다. 형광 단백질 융합을 사용한 ex 단일 세포 측정에 비해 이 기술의 장점은 단백질 분자의 모든 암을 생산할 때 단일 분자 절차와 그 분자 기능에 영향을 미치는 결과를 따를 수 있다는 것입니다. 균주 삽입 염기서열을 엔지니어링하기 위해, 막 국소화 서열, 빠르게 성숙하는 형광 단백질, 프로테아제 인식 서열 및 말단을 이 특정 사례에서 관심 단백질인 전사 인자 또는 tf와 함께 프레임에 인코딩합니다.이 절차에서는 멤브레인 표적 TSR 정맥 리포터를 사용했습니다. 리포터는 프로테아제 인식 서열 유비퀴틴에 융합하여 발현된 박테리아 파지 람다 억제제, C 1 단백질 분자의 수를 계수하였다. 구조체를 대장균 염색체에 통합한 후, 인식 서열에 특이적인 프로테아제의 플라스미드 인코딩은 번역 융합에서 관심 형광 리포터 및 단백질을 발현하는 균주로 형질전환됩니다.이 프로토콜에서는 C 말단 유비퀴틴 잔기 직후 절단되는 프로테아제 유비퀴틴 카르복시 Hydro one이 사용되었습니다. 이 프로토콜을 시작하려면 갓 줄무늬 한천 플레이트에서 대장균 콜로니 하나를 선택하여 최소 필수 배지 아미노산 1개와 적절한 항생제가 보충된 최소 배지 1ml의 M nine으로 만듭니다. 600 나노미터 또는 1.0 이상의 OD 600에서 광학 밀도에 도달할 수 있을 만큼 충분히 긴 원하는 온도에서 셰이커를 배양합니다.그런 다음 배양액을 적절한 항생제를 사용하여 1ml의 신선한 M nine 배지로 OD 600 0.02로 희석합니다. 적절한 온도에서 shaker를 배양하면 저온 성장에 필요한 경우 초기 세포 밀도를 높일 수 있습니다. OD 600이 0.2에서 0.3과 같을 때 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 10-20 밀리그램의 낮은 용융 온도 aros의 무게를 측정하여 ARO 젤 패드 준비를 시작합니다.적절한 부피 M 9, 항생제가 없는 최소 배지를 추가하여 3% 용액을 만듭니다. 그런 다음 발생한 용액을 섭씨 70도에서 30분 동안 가열하여 녹입니다. 용액이 완전히 녹고 균질한지 확인하기 위해 튜브를 뒤집습니다.젤 패드 조립의 경우, 미리 세척된 커버 유리 1개와 마이크로 수로 슬라이드 1개를 멸균수로 헹굽니다. 커버 유리를 건조시키고 압축 공기를 불어 슬라이드합니다. 고무 개스킷을 마이크로 수로 슬라이드에 놓아 입구와 출구를 덮도록 합니다.슬라이드의 유리 쪽에서 마이크로 수로 중앙에 50 마이크로 리터의 ARO 용액을 바릅니다. ARO 용액 위에 세척된 드라이 커버 유리로 밀어 넣습니다. 농업 용액을 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오.세포가 0.3에서 0.4의 OD 600에 도달하면 이미징 준비가 된 것입니다. 배양된 배양액 1ml를 벤치탑 마이크로 원심분리기에서 1분 동안 10, 000회 G로 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브 원심분리기로 옮깁니다. SUP 에이전트를 버린 후 신선한 M nine medium 1ml를 넣고 소생시킵니다.펠릿을 온화하게 10, 1 분 동안 000 시간 G에 현탁액을 다시 원심 분리하십시오. 그런 다음 Resus 원심분리 단계를 한 번 더 반복하고 펠릿을 M nine 배지 1ml에 부드럽게 재현탁합니다. 이 시점에서 세포는 현미경 이미징에 사용되거나 타임 랩스 이미징을 위한 낮은 세포 밀도를 보장하기 위해 10-100배 희석될 수 있습니다.이미징을 위한 샘플을 준비하려면 젤 패드 상단에서 커버 유리를 조심스럽게 떼어냅니다. 세척된 세포 배양액 1마이크로리터를 겔 패드 상단에 추가합니다. 배양액이 젤 패드에 흡수될 때까지 약 2분 동안 기다립니다.젤 패드가 너무 오래 마르지 않도록 너무 오래 기다리지 않는 것이 중요합니다. 이상적인 시간은 건조를 기다리는 동안 온도와 습도에 따라 달라집니다. 미리 청소된 또 다른 커버 유리.샘플이 건조되면 새 커버 유리로 샘플을 덮고 커버 유리와 마이크로 수로 슬라이드가 잘 정렬되었는지 확인합니다. 제조업체의 지침에 따라 온도 조절식 성장 챔버를 조립합니다. 이제 현미경에서 이미징하는 데 사용할 수 있습니다.이미징을 시작하려면 제조업체의 지침에 따라 레이저와 현미경을 켜십시오. 조립된 챔버를 스테이지에 잠급니다.tage 현미경의 삽입물. 성장실과 대물렌즈 히터의 온도를 섭씨 37도 또는 기타 원하는 성장 온도로 설정합니다.실온 이상으로 이미징하는 경우 초점 또는 젤 패딩은 일반적으로 초기 온도 변화 후 약 15분 동안 크게 드리프트됩니다. 실제로. 이 시간을 사용하여 관심 영역을 찾고 필요에 따라 이미징 스크립트를 수정합니다.실험을 위해. 레이저 여기 강도를 조정하여 거의 모든 형광 분자가 6회 노출 이내에 광표백제를 투하하도록 합니다. 현미경에서 세포를 찾아 사전 정의되고 정렬된 이미징 영역 내의 중앙에 배치합니다.그런 다음 각 세포의 위치를 저장하고 각 이미지에서 하나 이상의 세포를 이미지화할 수 있습니다. 여러 세대에 걸친 타임 랩스 이미징을 위한 획득 시간 창은 이미지 세포가 초기에 다른 세포와 분리되지만 성장 중에 다른 콜로니가 이미징 영역으로 들어오지 않도록 최소 수백 미크론 이상 분리되도록 합니다. 자동화된 이미징 스크립트를 사용하여 이 실험 워크플로우에 설명된 알고리즘을 사용하여 타임랩스 데이터를 획득하며, 이는 이 비디오와 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있습니다.이 이미지는 코드 트랙 실험의 일반적인 타임랩스 데이터를 보여줍니다. 단일 군체의 이미지는 25분 간격으로 표시됩니다. 이 실험에서는 12개의 서로 다른 군체에서 5분마다 데이터를 수집했습니다.이 이미지는 명시야 이미지와 Venus YFP 형광 이미지를 나타내며, 전체 이미징 필드의 배경 변화를 설명하기 위해 평균 배경을 뺀 이미지입니다. 시간이 지남에 따라 이미지가 중첩되면 TSR 정맥 UB 리포터 분자의 극 국소화와 다른 세포에서 5분 시간 창에서 생성된 분자 수의 이질성을 나타냅니다. 여기에 표시된 것은 코드 트랙 실험에서 단일 시점의 일반적인 데이터로, 각 5분 시간 간격이 시작될 때 획득된 6개의 100밀리초 노출에 대한 정맥 형광 이미지가 표시됩니다.6번의 노출은 각각 900밀리초씩 분리되어 일시적으로 어두운 정맥 분자가 분석을 위해 형광이 될 시간을 허용했습니다. 이미지 6은 표백되지 않은 분자와 자가형광을 보정하기 위해 이미지 1에서 뺀 것입니다. 이 이미지의 배경 반점은 특정 세포 계통에 국한되어 있으며 통합된 형광 강도에 의해 정량화됩니다.그런 다음 군체의 평균 통합 형광을 이 선에 맞는 6개의 이미지에 걸쳐 표시합니다. 또한 상수 오프셋은 약 1초의 감쇠 하프타임을 제공합니다. 이 실험에서 정맥 분자는 세포 자가형광보다 훨씬 더 빠르게 광표백합니다.따라서 총 정맥 분자 수의 약 절반이 각 프레임에서 광표백됩니다. 이 절차를 위해 전도도 이미징 분석을 다른 곳에서 수행하여 단일 세포에서 생성되는 단백질 분자 수의 trics를 생성할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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유전자 규정의 단일 분자 이미징

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