유전자 규정의 단일 분자 이미징 생체에 절단하여 Cotranslational 인증 (CoTrAC)를 사용

이 절차의 목적은 성장하는 대장균 군집의 타임 랩스 형광 이미지를 획득하여 새로 생성된 단백질 분자의 수를 식별하기 위해 공동 추적 구조를 발현하는 것입니다. 이는 먼저 세포 샘플을 준비하고, 형광 Cora 리포터에 융합된 관심 단백질을 발현하는 coex, 그리고 Cora 리포터와 관심 단백질 사이를 특이적으로 절단하는 프로테아제를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 M nine 최소 배지로 만든 저용융 온도 Aris의 겔을 준비하는 것입니다.

다음으로, 온도 제어 시료 챔버와 함께 사용할 수 있도록 AROS 겔 패드를 준비합니다. 대장균 세포를 겔 위에 놓고 챔버를 조립합니다. 마지막 단계는 챔버를 형광 현미경에 놓고 여러 세대에 걸쳐 일정한 간격으로 성장하는 여러 세포 군체를 이미지화하는 것입니다.

광표백은 궁극적으로 모든 re의 각 간격에 새로 생성된 TRE 보고 분자를 사용하여 단일 분자 및 단일 세포 분해능을 가진 생명 세포에서 단백질 생산의 시간 흔적을 획득하는 데 사용됩니다. 형광 단백질 융합을 사용한 ex 단일 세포 측정에 비해 이 기술의 장점은 단백질 분자의 모든 암을 생산할 때 단일 분자 절차와 그 분자 기능에 영향을 미치는 결과를 따를 수 있다는 것입니다. 균주 삽입 염기서열을 엔지니어링하기 위해, 막 국소화 서열, 빠르게 성숙하는 형광 단백질, 프로테아제 인식 서열 및 말단을 이 특정 사례에서 관심 단백질인 전사 인자 또는 tf와 함께 프레임에 인코딩합니다.

이 절차에서는 멤브레인 표적 TSR 정맥 리포터를 사용했습니다. 리포터는 프로테아제 인식 서열 유비퀴틴에 융합하여 발현된 박테리아 파지 람다 억제제, C 1 단백질 분자의 수를 계수하였다. 구조체를 대장균 염색체에 통합한 후, 인식 서열에 특이적인 프로테아제의 플라스미드 인코딩은 번역 융합에서 관심 형광 리포터 및 단백질을 발현하는 균주로 형질전환됩니다.

이 프로토콜에서는 C 말단 유비퀴틴 잔기 직후 절단되는 프로테아제 유비퀴틴 카르복시 Hydro one이 사용되었습니다. 이 프로토콜을 시작하려면 갓 줄무늬 한천 플레이트에서 대장균 콜로니 하나를 선택하여 최소 필수 배지 아미노산 1개와 적절한 항생제가 보충된 최소 배지 1ml의 M nine으로 만듭니다. 600 나노미터 또는 1.0 이상의 OD 600에서 광학 밀도에 도달할 수 있을 만큼 충분히 긴 원하는 온도에서 셰이커를 배양합니다.

그런 다음 배양액을 적절한 항생제를 사용하여 1ml의 신선한 M nine 배지로 OD 600 0.02로 희석합니다. 적절한 온도에서 shaker를 배양하면 저온 성장에 필요한 경우 초기 세포 밀도를 높일 수 있습니다. OD 600이 0.2에서 0.3과 같을 때 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 10-20 밀리그램의 낮은 용융 온도 aros의 무게를 측정하여 ARO 젤 패드 준비를 시작합니다.

적절한 부피 M 9, 항생제가 없는 최소 배지를 추가하여 3% 용액을 만듭니다. 그런 다음 발생한 용액을 섭씨 70도에서 30분 동안 가열하여 녹입니다. 용액이 완전히 녹고 균질한지 확인하기 위해 튜브를 뒤집습니다.

젤 패드 조립의 경우, 미리 세척된 커버 유리 1개와 마이크로 수로 슬라이드 1개를 멸균수로 헹굽니다. 커버 유리를 건조시키고 압축 공기를 불어 슬라이드합니다. 고무 개스킷을 마이크로 수로 슬라이드에 놓아 입구와 출구를 덮도록 합니다.

슬라이드의 유리 쪽에서 마이크로 수로 중앙에 50 마이크로 리터의 ARO 용액을 바릅니다. ARO 용액 위에 세척된 드라이 커버 유리로 밀어 넣습니다. 농업 용액을 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오.

세포가 0.3에서 0.4의 OD 600에 도달하면 이미징 준비가 된 것입니다. 배양된 배양액 1ml를 벤치탑 마이크로 원심분리기에서 1분 동안 10, 000회 G로 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브 원심분리기로 옮깁니다. SUP 에이전트를 버린 후 신선한 M nine medium 1ml를 넣고 소생시킵니다.

펠릿을 온화하게 10, 1 분 동안 000 시간 G에 현탁액을 다시 원심 분리하십시오. 그런 다음 Resus 원심분리 단계를 한 번 더 반복하고 펠릿을 M nine 배지 1ml에 부드럽게 재현탁합니다. 이 시점에서 세포는 현미경 이미징에 사용되거나 타임 랩스 이미징을 위한 낮은 세포 밀도를 보장하기 위해 10-100배 희석될 수 있습니다.

이미징을 위한 샘플을 준비하려면 젤 패드 상단에서 커버 유리를 조심스럽게 떼어냅니다. 세척된 세포 배양액 1마이크로리터를 겔 패드 상단에 추가합니다. 배양액이 젤 패드에 흡수될 때까지 약 2분 동안 기다립니다.

젤 패드가 너무 오래 마르지 않도록 너무 오래 기다리지 않는 것이 중요합니다. 이상적인 시간은 건조를 기다리는 동안 온도와 습도에 따라 달라집니다. 미리 청소된 또 다른 커버 유리.

샘플이 건조되면 새 커버 유리로 샘플을 덮고 커버 유리와 마이크로 수로 슬라이드가 잘 정렬되었는지 확인합니다. 제조업체의 지침에 따라 온도 조절식 성장 챔버를 조립합니다. 이제 현미경에서 이미징하는 데 사용할 수 있습니다.

이미징을 시작하려면 제조업체의 지침에 따라 레이저와 현미경을 켜십시오. 조립된 챔버를 스테이지에 잠급니다.tage 현미경의 삽입물. 성장실과 대물렌즈 히터의 온도를 섭씨 37도 또는 기타 원하는 성장 온도로 설정합니다.

실온 이상으로 이미징하는 경우 초점 또는 젤 패딩은 일반적으로 초기 온도 변화 후 약 15분 동안 크게 드리프트됩니다. 실제로. 이 시간을 사용하여 관심 영역을 찾고 필요에 따라 이미징 스크립트를 수정합니다.

실험을 위해. 레이저 여기 강도를 조정하여 거의 모든 형광 분자가 6회 노출 이내에 광표백제를 투하하도록 합니다. 현미경에서 세포를 찾아 사전 정의되고 정렬된 이미징 영역 내의 중앙에 배치합니다.

그런 다음 각 세포의 위치를 저장하고 각 이미지에서 하나 이상의 세포를 이미지화할 수 있습니다. 여러 세대에 걸친 타임 랩스 이미징을 위한 획득 시간 창은 이미지 세포가 초기에 다른 세포와 분리되지만 성장 중에 다른 콜로니가 이미징 영역으로 들어오지 않도록 최소 수백 미크론 이상 분리되도록 합니다. 자동화된 이미징 스크립트를 사용하여 이 실험 워크플로우에 설명된 알고리즘을 사용하여 타임랩스 데이터를 획득하며, 이는 이 비디오와 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있습니다.

이 이미지는 코드 트랙 실험의 일반적인 타임랩스 데이터를 보여줍니다. 단일 군체의 이미지는 25분 간격으로 표시됩니다. 이 실험에서는 12개의 서로 다른 군체에서 5분마다 데이터를 수집했습니다.

이 이미지는 명시야 이미지와 Venus YFP 형광 이미지를 나타내며, 전체 이미징 필드의 배경 변화를 설명하기 위해 평균 배경을 뺀 이미지입니다. 시간이 지남에 따라 이미지가 중첩되면 TSR 정맥 UB 리포터 분자의 극 국소화와 다른 세포에서 5분 시간 창에서 생성된 분자 수의 이질성을 나타냅니다. 여기에 표시된 것은 코드 트랙 실험에서 단일 시점의 일반적인 데이터로, 각 5분 시간 간격이 시작될 때 획득된 6개의 100밀리초 노출에 대한 정맥 형광 이미지가 표시됩니다.

6번의 노출은 각각 900밀리초씩 분리되어 일시적으로 어두운 정맥 분자가 분석을 위해 형광이 될 시간을 허용했습니다. 이미지 6은 표백되지 않은 분자와 자가형광을 보정하기 위해 이미지 1에서 뺀 것입니다. 이 이미지의 배경 반점은 특정 세포 계통에 국한되어 있으며 통합된 형광 강도에 의해 정량화됩니다.

그런 다음 군체의 평균 통합 형광을 이 선에 맞는 6개의 이미지에 걸쳐 표시합니다. 또한 상수 오프셋은 약 1초의 감쇠 하프타임을 제공합니다. 이 실험에서 정맥 분자는 세포 자가형광보다 훨씬 더 빠르게 광표백합니다.

따라서 총 정맥 분자 수의 약 절반이 각 프레임에서 광표백됩니다. 이 절차를 위해 전도도 이미징 분석을 다른 곳에서 수행하여 단일 세포에서 생성되는 단백질 분자 수의 trics를 생성할 수 있습니다.