세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

다음 실험의 전반적인 목표는 본래 환경에서 대장균 세포 분열 단백질에 대한 정량적 구조 정보를 얻는 것입니다. 이는 살아있는 세포에서 photoactive 형광 융합 단백질을 발현하고 이러한 세포를 아크로 겔 패드에 고정시킴으로써 달성됩니다. 그런 다음 스트리밍 비디오를 통해 세포를 이미지화합니다.

여기 및 활성화 레이저가 단일 분자 위치를 시각화하기 위해 적용되는 동안, 결과 필름은 컴퓨터 분석을 통해 나노미터 정확도로 분자 위치를 추출하고 중첩하여 초고해상도 이미지를 생성합니다. 그런 다음 이 이미지는 치수 및 분자 밀도를 포함하여 관심 구조를 설명하는 다양한 정량적 측정으로 분석할 수 있습니다. 광으로 활성화된 국소화, 현미경 또는 손바닥은 쉽게 구현된 초고해상도 형광 현미경 기법입니다.

계측은 간단하지만 신뢰할 수 있는 결과를 생성하려면 데이터 수집 및 분석의 신중한 최적화가 필요합니다. 또 다른 중요한 단계는 융합 단백질의 특성화 범위와 발현 수준을 파악하여 결과가 생물학적으로 관련성이 있는지 확인하는 것입니다. 다음 프로토콜은 FTSZ 단백질 융합 Muse two에 최적화되었으며 관심 단백질에 맞게 조정되어야 합니다.

먼저, 서면 프로토콜에 기술된 바와 같이 준비된 형광 점착성 단백질을 포함하는 관심 균주의 단일 콜로니를 LB 배지에 접종합니다. 이 비디오와 함께 다음 날 섭씨 37도의 셰이커에서 밤새 자랍니다. 배양액을 1에서 1000까지 M nine과 최소 배지로 희석합니다.

실온에서 적절한 항생제가 있는 상태에서 중간 로그 단계까지 성장한 다음 배양이 20마이크로몰 IPTG로 단백질을 생성하도록 유도합니다. 한편, M nine 마이너스 미디어에 3% agro 용액을 만들어 이미징 챔버를 조립합니다. 섭씨 70도의 탁상용 열 블록에서 40분 동안 아그로스를 녹입니다.

녹은 아그로스를 섭씨 50도에서 최대 5시간 동안 보관하십시오. 전극이 아래를 향하도록 이미징 챔버의 위쪽 절반에 깨끗한 마이크로 수로 슬라이드를 놓습니다. 관류 채널을 덮을 수 있도록 마이크로 수로 슬라이드의 하단 개스킷을 정렬합니다.

약 50마이크로리터의 용융된 아로스를 유리 중앙에 바릅니다. 깨끗하고 건조한 커버 슬립으로 Agros 젤 방울 위를 즉시 밀어 넣습니다. 단백질 주입 후 최소 30분 동안 실온에서 겔이 응고되도록 합니다.

마이크로 원심분리기에서 배양물을 펠렛화합니다. 소생. 동일한 부피의 M nine과 반복 원심분리 및 두 번째 Resus 현탁액 후 Resus 현탁액을 현탁액으로 현탁시킵니다. 실온에서 2시간 동안 성장을 계속합니다.

다음으로, PBS에 파라폼 알데히드를 첨가하여 유도 배양을 수정하여 4%파라폼 알데히드의 최종 농도를 달성합니다. 이미징 라이브 셀이 절차의 변화에 대해 이 비디오와 함께 제공되는 서면 프로토콜을 보는 경우 배양액을 실온에서 40분 동안 배양합니다. 배양물을 펠렛화하고 동일한 부피의 PBS에 재현탁시킵니다.

다음으로, 50 나노 미터의 금 구슬을 1 대 10로 희석하여 Resuspended 배양액으로 만듭니다. 준비된 이미징 챔버에 샘플을 적용하려면 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 마이크로 수로 슬라이드에 젤 패드를 남겨 둡니다. 즉시 1마이크로리터의 세포 배양 샘플을 겔 패드 상단에 추가합니다.

용액이 젤 패드에 흡수될 때까지 약 2분 정도 기다렸다가 젤 패드 위에 깨끗하고 건조한 새 커버 슬립을 얹습니다. 이미지 획득을 위한 제조업체의 지침에 따라 전체 이미징 챔버를 계속 조립합니다. 현미경 카메라와 레이저를 켭니다.

분자 장치에 의한 개방형 변형 소프트웨어. 이 현미경 회로도에 표시된 대로 이미징 경로에 적절한 여기 및 방출 필터를 배치하며, 이는 이 비디오와 함께 제공되는 서면 절차에서 찾을 수 있습니다. 다음으로 레이저 출력 및 획득 설정을 지정합니다.

보완 스테이지 어댑터를 통해 이미징 챔버를 스테이지에 적절하게 잠급니다. 커버 슬립 립에 가장 가까운 세포의 표면에 초점을 맞춥니다. 세 가지 레이저 모두에 의해 균일하게 조명되는 적절한 이미징 영역을 지정합니다.

세포와 기준 마커를 모두 포함하는 샘플 영역을 식별하며, 이는 근접하지만 겹치지 않는 금색 구슬입니다. 50밀리초의 통합 시간으로 하나의 명시야 이미지를 획득하고 초점을 샘플로 0.5마이크로미터 이동합니다. 그런 다음 50밀리초의 통합 시간을 사용하여 488 나노미터 레이저의 여기와 함께 앙상블 그린 형광 이미지를 획득합니다.

다음으로, 405 나노미터 및 561 나노미터 레이저에서 연속 조명으로 스트리밍 비디오를 획득합니다. 조정 세포를 위해, 50 밀리초 프레임 속도는 20, 000의 구조 합계를 위해 이용된다. 405나노미터 레이저 출력이 1,000프레임마다 약 10%씩 증가하면 처음 500프레임이 표시됩니다.

획득된 프레임의 수는 이 시스템에 최적화되었으며 특정 세포 구조에 따라 달라집니다. 라벨링, 밀도, 활성화율 및 바닥 바닥의 전체 풀을 소진하는지 여부가 분석에 중요한지 여부 이미지 구성을 수행합니다. 먼저, 이미지 스트림에서 유망 스폿을 경험적으로 결정된 임계값 이상의 농도를 가진 3개의 인접한 픽셀이 각 예상 스폿의 강도를 2차원 가우스 함수에 적합하도록 식별합니다.

분자 위치와 방출된 광자의 총 수를 식별하려면 검출된 총 광자 수를 사용하여 각 스폿의 국소화 위치를 계산합니다. 다음으로, 국소화 정밀도의 임계값을 적용하여 잘 맞지 않는 스폿을 버리고, 샘플 드리프트에 대해 정확한 진행 스폿의 45나노미터 및 6프레임 내에 있는 스폿을 무시하여 동일한 분자의 반복 관찰을 제거합니다. 각 분자 위치에서 금 구슬의 프레임 종속 변위를 빼서 15 x 15 나노미터 픽셀로 구성된 단일 이미지에 보정된 모든 분자 위치를 겹쳐 놓고 각 고유 분자를 국소화 정밀도와 동일한 표준 편차를 가진 단위 영역, 2차원 가우스 프로파일로 플로팅합니다.

결과 이미지는 픽셀의 강도가 분자를 찾을 가능성에 비례하는 확률 밀도 맵입니다. 저것에서 픽셀 설명. 다음은 Palm Imaging Method에서 생성된 ZR의 2차원 초해상도 렌더링입니다.

질적으로, Z 고리는 기존의 형광 이미지에서 구별할 수 없는 단일 밴드 또는 나선형 호와 같은 여러 구성을 채택하는 불규칙한 구조임을 관찰했습니다. 이와 같은 관찰은 특정 구조적 구성을 나타내는 세포 집단의 백분율을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. ZR의 차원도 이 플롯에서 측정할 수 있습니다.

고리 너비는 113나노미터로 결정되었습니다. 이 값은 시험관 전자 현미경을 기반으로 한 5-10나노미터인 단일 FDSC 프로토 필라멘트의 예상 너비보다 넓습니다. 여기서, 고리 직경은 1050 나노미터로 측정된다.

이 직경은 세포 분열 중 수축 정도를 정량적으로 설명하는 데 사용할 수 있습니다. 또 다른 정량적 접근법은 정의된 영역 내에 국한된 분자의 수를 계산하여 분자 밀도를 계산하는 것입니다. 손바닥 이미지는 3D 물체의 2D 투영이기 때문에 감지 평면을 Z 링의 한 면으로 제한하기 위해 전체 내부 반사 또는 TIR 손바닥을 사용해야 합니다.

플롯된 분자는 전체 FDSC 모집단의 하위 집합을 나타내기 때문에 결정된 밀도는 실제 밀도의 하한입니다. Z 고리의 TIR 이미지에서 관찰된 최대 밀도는 일부 섹션에 겹치는 프로토 필라멘트가 포함되어 있음을 시사합니다. 이 절차를 수행하는 동안 융합 단백질의 발현이 세포 생존율에 영향을 미치지 않는지 확인하기 위해 세포 형태와 성장 속도를 모니터링하는 것이 중요합니다.

관심 단백질에 대해 이 절차가 확립되면 세포주기 진행과 관련된 구조적 변화를 테스트하거나 여러 단백질의 얼굴 분포를 비교하기 위해 두 가지 색상 이미징으로 더 확장할 수 있습니다.