혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금

이 절차의 전반적인 목표는 COMET 분석을 사용하여 뉴런의 DNA 손상량을 측정하고 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 뉴런을 다양한 DNA 손상 조건에 노출시키고 뉴런을 수집하고 낮은 융점 소스와 혼합함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 슬라이드의 뉴런을 고정시키는 것입니다.

다음으로, 뉴런을 용해시킨 다음 마지막 단계에서 전기영동을 실시합니다. DNA는 사이버 그린으로 염색되어 있습니다. 궁극적으로 형광 현미경 검사와 COMET 분석 소프트웨어는 개별 뉴런의 DNA 손상 수준을 시각화하고 정량화하는 데 사용됩니다.

안녕하세요, 제 이름은 에디 양(Eddie Yang)이고, 앨라배마 대학교 버밍엄 캠퍼스(University of Alabama at Birmingham)의 방사선 종양학과 조교수입니다. 오늘은 세포의 DNA 손상을 감지하는 간단한 방법인 COMET assay를 시연할 예정입니다. 펄스장 젤 전기 이동법 뿐만 아니라 감마 H 2 A X 초점 얼룩과 같은 다른 기존하는 방법에 이 기술의 주요 이점은 이 기술이 DNA 손상을 측정하는 직접 및 과민한 방법이다 입니다.

또한, 많은 암 치료법이 종양에서 DNA 손상을 유도하여 작용하고 종종 DNA 복구 능력을 변경함으로써 작용하기 때문에 이 기술을 약간 수정하면 DNA 손상 유형을 결정할 수 있습니다. 이 기술의 함의는 암 치료의 효능으로 확장될 수 있습니다. 오늘 시연할 것은 제 연구실의 연구 조교인 Samara Noshin 씨가 원하는 실험 환경에서 처리된 신경 세포를 15ml 튜브로 수확하는 것으로 시작합니다.

상층액 소생을 흡인시킨 후 G 1000회와 섭씨 4도에서 5분 동안 튜브를 회전시킵니다. 펠릿을 PBS에 현탁시킨 다음 두 번째 세척 후 셀을 다시 스핀다운합니다. Resus는 더 많은 PBS에 세포를 현탁시키고, 세포를 세고, 혜성 분석에 사용될 때까지 어둠 속에 보관합니다.

DNA 손상을 피하기 위하여 오기 분석실험은 모든 과립이 사라질 때까지 3 분 동안 마이크로파에 있는 1%aros를 녹입니다. 그런 다음 슬라이드를 용융된 아그로스에 담그고 Kim 물티슈로 한쪽 면을 깨끗이 닦습니다. 아그로스가 섭씨 4도에서 최소 1시간 동안 냉각 용해 용액을 건조하는 동안 아그로스를 투명 필름으로 자연 건조하고 더 많이 녹이도록 합니다.

1%낮은 융점 Agros. 시원하다. 이 아그로스 배치는 30 분 동안 수조에서 섭씨 37도까지 떨어집니다. 혜성 꼬리의 인공적인 감응작용을 피하기 위하여는, 지금 100 의 밀리리터 당 000의 세포가 있다 그래야 가을걷이된 신경 세포 현탁액을 묽게 하십시오.

세포 현탁액을 1 대 10 비율의 소용돌이에서 섭씨 37도의 낮은 융점 아그로스와 간단히 결합하고 즉시 피펫 팁의 측면을 사용하여 50마이크로리터의 세포 현탁액을 공기 건조된 혜성 슬라이드의 샘플 영역에 고르게 펴 놓습니다. 처리된 슬라이드를 슬라이드 주변에 원이 나타날 때까지 30분 동안 냉장고에 평평하게 놓습니다. 그런 다음 섭씨 4도의 어둠 속에서 미리 냉각된 용해 용액에 슬라이드를 담그십시오.

30분 후 용해 용액을 흡입합니다. 그런 다음 냉장고에서 30분 동안 하나의 x 중성 전기영동 버퍼에 슬라이드를 배양합니다. 다음으로, 사전 냉각된 1 x 중성 전기영동 버퍼를 전기영동 챔버에 추가한 다음 슬라이드를 전기영동 슬라이드 트레이에 놓고 전극에서 동일하게 떨어져 있도록 슬라이드를 정렬합니다.

1 x 중성 전기 영동 버퍼의 0.2 인치로 슬라이드를 덮을 수있을만큼 챔버를 채운 후 전원 공급 장치 전압을 센티미터당 1 볼트로 설정하고 섭씨 4도에서 30 분 동안 어둠 속에서 분석을 실행합니다. 먼저 새로운 아그로스 및 신경 세포 처리 슬라이드를 신선하고 미리 냉각된 용해 용액에 담근 다음 섭씨 4도의 어둠 속에서 1시간에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, 용해 용액에서 슬라이드를 제거하고 배수 한 다음 알칼리 감기 단계 전에 잔류 물을 제거하기 위해 5 분 동안 차가운 중화 버퍼로 한 번 헹굽니다.

다음 활주의 위 0.5 센티미터를 초과하지 않기 위하여 전 냉각한, 갓 한 전기 이동법 완충기로 채워진 젤 전기 이동법 약실에 있는 활주를 두십시오. 어두운 곳에서 30분 동안 알칼리성 완충액에 슬라이드를 배양하여 DNA가 풀리고 알칼리 손상 원인이 발현될 수 있도록 합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 30분 동안 1볼트/센티미터로 분석을 실행합니다.

혜성 분석을 실행한 후 과도한 전기영동 완충액을 배출한 다음 슬라이드를 실온에서 미리 냉각된 증류수에 담그십시오. 5 분 후, 슬라이드를 실온에서 사전 냉각, 70 % 에탄올에 담그십시오. 5분 더 후 샘플을 밤새 건조시켜 밝은 빛을 피하십시오.

그런 다음 냉장고에서 30 분 동안 슬라이드를 사이버 그린으로 염색하십시오. 이제 슬라이드를 제거하고 어둠 속에서 완전히 건조시키십시오. 아로스는 완전히 건조되면 투명해집니다.

분석에서 이미지를 획득하려면 녹색 필터로 설정된 형광 현미경을 사용합니다. 그런 다음 COMET 분석 프로그램을 열어 획득한 이미지를 분석합니다. 혜성 머리 버튼을 클릭하면 소프트웨어가 평균 꼬리 모멘트와 핵 내 DNA의 양을 포함한 매개변수를 계산합니다.

처리당 최소 200개의 세포를 분석한 후 평균 꼬리 모멘트 및 데이터 플로팅을 계산하기 위해 데이터를 Microsoft Excel로 내보냅니다. 이 첫 번째 그림은 혜성 꼬리가 있거나 없는 신경 세포에 대한 COMET 분석 분석의 예를 보여줍니다. COMET 분석 소프트웨어를 사용하여 분석된 이 두 번째 혜성 분석에서 신경 세포에 대한 방사선 조사는 세포가 전기장을 받을 때 DNA 손상을 유도하는 것으로 확인되었습니다.

DNA는 크기의 차이로 인해 다른 속도로 이동했으며, 이후에 일반적인 분석 소프트웨어로 분석했습니다. 이 첫 번째 스크린샷은 COMET 분석 프로그램을 사용하여 형광 현미경을 사용하여 얻은 대표 이미지를 보여줍니다. 한 이미지의 핵 또는 혜성 머리를 클릭하면 형광 지도 그래프와 데이터 테이블이 생성되었습니다.

DNA에 대한 손상이 심할수록 DNA가 핵 밖으로 더 멀리 이동했습니다. 그 결과 녹색으로 표시된 것처럼 핵의 형광 강도가 감소했으며, 이후에 소프트웨어에 의해 감지되어 더 높은 꼬리 모멘트를 생성합니다. 이 최종 그림에서, 중성 혜성 분석을 사용하여 조사된 신경 세포와 조사되지 않은 신경 세포의 DNA 손상을 분석하여 얻은 평균 꼬리 모멘트의 대표적인 그래프는 조사된 신경 세포에서 더 높은 평균 꼬리 모멘트에 의해 표시된 바와 같이 3개의 회색 방사선 유도 DNA 손상이 예상된 대로 표시됩니다.

이 절차를 시도하는 동안 세포를 조심스럽게 다루고 직사광선에 노출되지 않도록 하고 pH 단위의 온도를 제어하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이는 세포가 추가 스트레스를 받지 않도록 하기 위한 것이며, 이로 인해 결과가 변경될 수 있습니다. 이 절차를 따르십시오. DNA 분석과 같은 다른 방법, 면역형광 염색을 통한 복구 병소를 수행하여 DNA 복구 경로가 변경되는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

예를 들어, RAD 51 foci 또는 phospho, DNA PK Foci에 대한 면역형광 염색을 수행하여 상동 재조합 복구 또는 비상동 및 결합 복구를 각각 측정할 수 있습니다.