Name: 혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 학습하세요 혜성 분석을 사용하여 해마 뉴런의 DNA 손상을 측정하고 정량화하는 방법을. 전기 영동과 형광 현미경을 활용하여 개별 뉴런의 DNA 무결성을 평가할 수 있습니다.

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이 작품은 방사선 종양학, 앨라배마 - 버밍햄 대학 종합 암 센터, 파이팅 어린이 암 재단과 가브리엘의 엔젤 재단 (ESY 있습니다.)의 부에서 IMPACT 상에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양 <ol><li> 문화 neuronal 세포와이를 필요에 따라 취급합니다. </li><li> 15 ML 튜브에 수확 세포 : 기음 미디어, 인산염과 린스 (PBS, 칼슘, 마그네슘 무료) 생리 버퍼, 15 ML 튜브에 수집하고 적절한 혈청이 포함 된 미디어와 트립신을 중화, 트립신을 추가합니다. </li><li> 5 분 1,000 XG에서 봐. </li><li> 미디어를 대기음. </li><li> PBS에 세포를 Resuspend. </li><li> 5 분 1,000 XG에서 봐. </li><li> 신선한 PBS에서 미디어 및 resuspend 세포를 대기음. </li><li> hemacytometer이나 선호하는 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다. </li><li> 세포 샘플은 분석을 시작하기 바로 전에 준비해야합니다. </li><li> 모든 샘플은 자외선에서 DNA 손상을 방지하기 위해 어둡거나 노란 빛으로 처리해야합니다. </li></ol> 2. 혜성 분석 1. 슬라이드 준비 <ol><li> 1% 아가로 오스를 (1X 트리스베이스, 붕산, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), TB의 1g / 100 ML 녹음E) 3 분의 전자 레인지의 모든 과립가 사라 때까지. </li><li> 수영 용융 아가로 오스에 슬라이드과 측면을 닦아은 kimwipe으로 청소하십시오. 투명 필름에 공기 건조에 아가로 오스 할 수 있습니다. 이것은 저장할 수 있습니다 사전 및 슬라이드에 수행 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 중성 혜성 분석 <ol><li> 사용하기 전에 적어도 1 시간에 ° C 4에 얼음 용해 용액 (2.5 M NaCl, 100 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 10, 10 MM 트리스베이스, 1 %의 나트륨 라 우릴의 sarcosinate, 그리고 1퍼센트 튼 X-100, 산도 10). </li><li> 2.2.2. 모든 과립이 사라 때까지 전자 레인지에 1% 낮은 녹는 점 아가로 오스는 (1X 트리스 자료의 1g / 100ml, 붕소의 산성, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 3 분 동안 녹음. 아가로 오스는 혜성 꼬리의 인공 유도를 방지하기 위해 ° C 물 목욕에서 37로 냉각해야합니다. 이상적으로, 아가로 오스는 사용하기 전에 반 시간 동안 냉각해야합니다. </li><li> 2.2.3. ML 100,000 세포가되도록 세포 현탁액을 희석. 낮은 녹는 점 아가로 오스 (37시 ° C)에있는 세포 현탁액을 결합1시 10분 (V / V), 와류 짧게의 비율과 즉시 혜성 슬라이드에 50 μl를 피펫. 샘플 영역 골고루 세포 현탁액을 확산하기 위해 피펫 팁의 측면을 사용합니다. 각 치료 그룹은 적어도 세중의에 있어야합니다. </li><li> 원은 슬라이드의 주변에 나타날 때까지 장소 30 분에 냉장고에 평면 슬라이드. </li><li> Prechill 4에 어둠 속에서 30 분이 솔루션에 용해 솔루션과 잠수함 슬라이드 ° C (또는 냉장고에). </li><li> 오프 넣어 또는 용해 솔루션을 기음과 1X 중립적 인 전기 영동 버퍼 (트리스베이스, 붕산, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1X TBE)을 추가합니다. 냉장고에 30 분 동안이 버퍼에 슬라이드를 둡니다. </li><li> 전기 챔버에서 prechilled 1X 중성 전기 영동 버퍼 (TBE), 전기 슬라이드 트레이에 장소 슬라이드를 추가 할 수 있습니다. 사람들이 전극에서 등거리되도록 슬라이드를 맞 춥니 다. </li><li> 1X 중립 전기가 슬라이드 위에 0.2 인치까지 버퍼 네요. 초과 버퍼 간 것전기와 fere. </li><li> cm 당 1 V (전극에 전극을 측정)에 전원 공급 장치의 전압을 설정하고 어둠 속에서 4 ° C (또는 차가운 방)에서 30 분에 실행합니다. </li></ol> 3. 알칼리성 혜성 분석 <ol><li> 사용하기 전에 적어도 1 시간에 ° C 4에 얼음 용해 용액 (2.5 M NaCl, 100 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 10, 10 MM 트리스베이스, 1 %의 나트륨 라 우릴의 sarcosinate, 그리고 1퍼센트 튼 X-100, 산도 10). </li><li> 모든 과립이 사라 때까지 3 분을 위해 전자 레인지에 1% 낮은 녹는 점 아가로 오스를 (1X 트리스 자료의 1g / 100 ML, 붕소의 산성, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 녹음. 그럼 적어도 30 분에 37 ° C의 물을 욕조에 좋아. </li><li> 1시 10분 (V / V), 와류 잠시의 비율로 용융 낮은 녹는 점 아가로 오스와 1 개 105 / ML (37시 ° C)에서 세포를 결합하고 즉시 혜성 슬라이드에 50 μl를 피펫. 샘플 영역 골고루 세포 현탁액을 확산하기 위해 피펫 팁의 측면을 사용합니다. 각 치료 그룹은 적어도 세중의에 있어야합니다. </li><li> 장소는 미끄러에스 평면은 30 분에 냉장고에있는 원은 슬라이드의 주변에 나타납니다 때까지. </li><li> prechilled 용해 용액과 4에 남겨 ° C를 어둠 속에서 야간에 1 시간에 젖어 슬라이드. </li><li> 용해 용액에서 슬라이드를 제거 슬라이드를 배출하고 알칼리 긴장을 풀기 단계로 사전에 잔류 세제와 소금을 제거하는 5 분을위한 차가운 중화 버퍼로 한 번 씻어. </li><li> 겔 전기 영동 챔버의 장소 슬라이드 슬라이드 위에 0.5 cm를 초과하지 prechilled 갓 만든 전기 영동 버퍼 (300 MM NaOH, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산),&gt; 13 PH)로 가득. 사람들이 전극에서 등거리되도록 슬라이드를 맞 춥니 다. </li><li> 슬라이드가 DNA와 알칼리 - 책임 손상의 표현의 긴장을 풀기을 할 수 있도록 어둠 속에서 30 분 동안 알칼리 버퍼에 앉아 보자. </li><li> cm 당 1 V (전극에 전극을 측정)에 전원 공급 장치의 전압을 설정하고 4시 30 분에 실행 ° C (또는 추운 방). </li></ol> 4. 고정과 역ining 셀 <ol><li> 초과 전기 버퍼를 배수 </li><li> 젖어은 RT에서 5 분을 위해 사전에 차가운 증류수에 슬라이드. </li><li> RT에서 5 분을위한 사전 차가운 70 % 에탄올에 젖어 슬라이드. </li><li> 밤새 드라이 샘플. 밝은 빛에 슬라이드를 노출시키지 마십시오. 샘플은 이전 단계에서 골을 실온에서 몇 달 동안 저장 될 수 있습니다. </li><li> 냉장고에 20 분에 Sybr 녹색 (PBS에 희석 1X)에 immersing하여 슬라이드를 청바지. </li><li> 슬라이드를 제거하고 그 어둠 속으로 완전히 건조 할 수 있습니다. 때 완전히 건조 아가로 오스는 투명이 될 것입니다. </li></ol> 4. 이미지 수집 및 분석 <ol><li> 녹색 필터 (Zeiss AxioVision)와 혜성 분석 소프트웨어 (지각 악기)를 사용하여 분석으로 설정 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득. </li><li> &quot;혜성의 머리&quot;(핵)를 클릭하고 소프트웨어에서 평균 꼬리 순간 DNA의 양을 포함하여 매개 변수를 계산핵. </li><li> 치료 당 최소한 200 세포를 분석합니다. </li><li> Microsoft Excel로 데이터를 내보낼 수도 있습니다. </li><li> 각 치료 그룹과 적절한 플롯 데이터 꼬리 순간을 의미 계산합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 neuronal 세포에 혜성 분석 분석의 예는 그림 2와 그림 3에 표시됩니다. 이 경우 neuronal 세포의 방사선은 DNA 손상을 유도한다. 세포는 전기 분야의 대상이됨에 따라, DNA는 이후 혜성 분석 소프트웨어를 사용하여 분석 크기의 차이로 인해 서로 다른 속도로 마이그레이션합니다. 더 DNA 손상은 멀리 DNA는 핵에서 마이그레이션합니다. 이 이후 높은 꼬리 순간의 소프트웨어와 결과에 의해 포착 된 핵의 형광 강도를 낮 춥니 다. 표 1은 혜성 분석 분석 및 그림 4에서 대표 표를 묘사 represen를 보여줍니다tative 그래프는 혜성 분석에 의해 측정으로 방사선에 따라 neuronal 세포의 DNA 손상을 비교. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 혜성 분석의 흐름 차트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. neuronal 세포의 대표 이미지 (A)없이와 (B) 혜성 꼬리. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig3.jpg" alt="그림 3"/> 혜성 분석 소프트웨어를 사용하여 그림 3. 혜성 분석 분석. (A) 이미지의 대표 스크린 샷은 칼 Zeiss 형광 현미경을 사용하여 획득과 혜성을 사용하여 분석분석 소프트웨어. (B) 핵 또는 &quot;혜성의 머리&quot;(녹색 동그라미)을 클릭하면 형광지도와 그래프 (노란색 동그라미)와 (C) 데이터 테이블을 (빨간색 원)으로 생성합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 중립적 인 혜성 분석을 사용하여 방사능과 비 방사능 neuronal 세포의 DNA 손상을 분석하여 얻은 평균 꼬리 순간을 음모하여 얻은 대표 그래프. 예상대로 방사능 neuronal 세포에서 높은 평균 꼬리의 순간에 의해 묘사로 3Gy 방사선 (x-선)은 DNA 손상을 유도한다. , ** P &lt;0.01 - 평균 꼬리 순간 (표준 오류 + /)입니다 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049table1.jpg" alt="표 1"/> 표 1. </STRONG&gt; 방사능과 비 방사능 neuronal 세포에 혜성 분석 분석 얻은 대표 표. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049table1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li>
<li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay.+An+overview+of+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay. An overview of techniques.</a> Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+damage+in+individual+cells+by+analysis+of+histone+H2AX+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation.</a> Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+comet+assay+in+radiobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of the comet assay in radiobiology.</a> Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+H2AX+phosphorylation+after+exposure+to+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin.</a> Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+DNA+damage+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in DNA damage using the comet assay.</a> Cytometry A. 66, 1-8 (2005).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair.</a> Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).</li>
<li>Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Genetic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a comprehensive review.</a> Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).</li>
<li>Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase+3B+inhibition+enhances+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+irradiated+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons.</a> Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).</li>
<li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li>
<li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li>
<li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li>
<li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+hOGG1%2C+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li>
<li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4(2010).</li>
<li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+sensitivity%2C+H2AX+phosphorylation%2C+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li>
<li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5DH2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li>
<li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li>
<li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElectrophoresis%2C+FI+%22Pulsed-field+gel+electrophoresis%22">Pulsed-field gel electrophoresis</a>. , (2000).</li>
<li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

혜성 분석은 개별 세포를 분석의 고유 한 능력이 있습니다. 이 세포 독성 요원에게 차등 응답을 보여 세포의 subpopulations의 식별에 유리한 것입니다. 몇 실제적인 제한이 고려되어야한다. 개별적으로 평가 될 수있는 세포의 수는 개인에 따라 다를 수 있습니다. 인구 내에서 DNA 손상에 차이가있을 경우 표본의 크기가 증가해야합니다. 괴사 또는 apoptotic 세포의 주된 존재가 에러가 추가되므로 가능한 단일 셀 정지이 분석에 중요합니다. 용해와 전기 단계는 apoptotic 세포, 작은 DNA 조각 (50킬로바이트보다 작)과 mitochondrial DNA의 제거됩니다. 따라서, 그들은 혜성 분석 1,3-11에 의해 감지되지 않습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 혜성 분석은 알칼리 불안정한 사이트에 DNA-DNA/DNA-protein 상호 링크 등 단일 및 이중 가닥 휴식을 검출 효율적인 방법입니다DNA. 중립 혜성 분석은 두 번 스트랜드 나누기...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 1.5 ML 튜브 </td><td> 산타 크루즈 (Santa Cruz) 생명 공학, Inc의 </td><td> SC-200271 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBE (트리스베이스, 붕소의 산성, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 튜브 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> 시그마 </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> 알루미늄 호일 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> 굽​​ 달린 큰 컵 </td><td> 피셔 과학 </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> 열 과학 </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> 혜성 분석 소프트웨어 </td><td> 혜성 분석 IV 이미지 분석 시스템 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 실린더 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> GIBCO </td><td> 15,575 </td><td></td></tr><tr><td> 전기 챔버 </td><td> 열 과학 </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> Zeiss Axio 비전 </td><td></td><td> 그린 필터 가진 형광 현미경은 충분 </td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> 피셔 과학 </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> 낮은 녹는 점 아가로 오스 </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로파 </td><td> 시어스 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 무료 생리, 칼슘 무료, 마그네슘 버퍼 </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> 전원 공급 장치 </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> 냉장고 </td><td> 시어스 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 지배자 </td><td> 스테이플 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 시그마 </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 </td><td> 시그마 </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 라 우릴 sarcosinate </td><td> 피셔 과학 </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> Sybr 녹색 </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> 쟁반 </td><td> FIS그녀 과학 </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> 트리스베이스 </td><td> 시그마 </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 - X 100 </td><td> 시그마 </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> 소용돌이 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> 열탕 목욕 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

혜성 분석을 사용하여 hippocampal 뉴런의 dna 손상을 시금

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

약물의 수는 DNA 복구 경로를 타겟으로하고 세포가 DNA 손상을 만들어 죽 유도. 따라서, 직접 D​​NA 손상을 측정하기위한 프로세스를 광범위하게 평가되었습니다. 전통적인 방법은 시간이 소요, 비용, 리소스를 집중하고 세포가 복제를 필요로합니다. 반면, 혜성 분석, 단일 세포 겔 전기 영동 분석은 DNA 손상 및 수리를 빠르고 비 침습적, 저렴한, 직접 민감한 측정하기위한 한 방법입니다. DNA 손상뿐만 아니라 DNA 수리의 모든 양식이 강력한 기술을 사용하여 단일 세포 수준에서 시각화 할 수 있습니다. 혜성 분석의 기초 원리는 DNA 손상이 조직을 방해 반면에 그대로 DNA가 높은 주문이다. 손상된 DNA의 아가로 오스 매트릭스에 새어 나온 및 전기 분야의 대상이 때, 부정적인 청구 DNA가 긍정적으로 청구됩니다 음극으로 마이그레이션합니다. 큰 피해 DNA의 가닥 훨씬 핵에서 마이그레이션 할 수 없습니다. DNA 손상더 손상 DNA보다 여행 작은 DNA 조각을 만듭니다. 혜성 분석, 이미지 분석 소프트웨어, 조치하고 핵에서 마이그레이션 DNA와 핵에서 DNA의 전체 형광 강도를 비교합니다. 마이그레이션 DNA의 형광 신호가 DNA 손상에 비례합니다. 긴 밝은 DNA 꼬리 증가 DNA 손상을 의미합니다. 측정 매개 변수 중 일부는 꼬리에있는 DNA의 금액과 꼬리, 꼬리 길이 DNA의 유통 및 DNA의 비율 모두의 척도입니다 꼬리 순간입니다. 이 분석은 DNA 손상의 해상도가 복구가 자리를 차지하게 때문에뿐만 아니라 DNA 복구를 측정 할 수 있습니다. 감도의 제한 diploid 포유류의 세포 1,2 당 약 50 스트랜드 나누기입니다. 같은 etoposide와 같은 DNA 손상 대리인과 치료 세포는 긍정적 인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 따라서 혜성 분석은 DNA 손상을 측정 할 수있는 신속하고 효과적인 절차입니다.

혜성 분석은 알칼리 불안정한 사이트와 hippocampal 뉴런을 포함한 모든 세포의 DNA에 DNA-DNA/DNA-protein 상호 링크 등 단일 및 이중 가닥 휴식을 검출 효율적인 방법입니다. 방법은 DNA 손상의 양의 차이로 인해 전기 분야에서 DNA의 차동 마이그레이션을 활용합니다.

혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

이 절차의 전반적인 목표는 COMET 분석을 사용하여 뉴런의 DNA 손상량을 측정하고 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 뉴런을 다양한 DNA 손상 조건에 노출시키고 뉴런을 수집하고 낮은 융점 소스와 혼합함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 슬라이드의 뉴런을 고정시키는 것입니다.다음으로, 뉴런을 용해시킨 다음 마지막 단계에서 전기영동을 실시합니다. DNA는 사이버 그린으로 염색되어 있습니다. 궁극적으로 형광 현미경 검사와 COMET 분석 소프트웨어는 개별 뉴런의 DNA 손상 수준을 시각화하고 정량화하는 데 사용됩니다.안녕하세요, 제 이름은 에디 양(Eddie Yang)이고, 앨라배마 대학교 버밍엄 캠퍼스(University of Alabama at Birmingham)의 방사선 종양학과 조교수입니다. 오늘은 세포의 DNA 손상을 감지하는 간단한 방법인 COMET assay를 시연할 예정입니다. 펄스장 젤 전기 이동법 뿐만 아니라 감마 H 2 A X 초점 얼룩과 같은 다른 기존하는 방법에 이 기술의 주요 이점은 이 기술이 DNA 손상을 측정하는 직접 및 과민한 방법이다 입니다.또한, 많은 암 치료법이 종양에서 DNA 손상을 유도하여 작용하고 종종 DNA 복구 능력을 변경함으로써 작용하기 때문에 이 기술을 약간 수정하면 DNA 손상 유형을 결정할 수 있습니다. 이 기술의 함의는 암 치료의 효능으로 확장될 수 있습니다. 오늘 시연할 것은 제 연구실의 연구 조교인 Samara Noshin 씨가 원하는 실험 환경에서 처리된 신경 세포를 15ml 튜브로 수확하는 것으로 시작합니다.상층액 소생을 흡인시킨 후 G 1000회와 섭씨 4도에서 5분 동안 튜브를 회전시킵니다. 펠릿을 PBS에 현탁시킨 다음 두 번째 세척 후 셀을 다시 스핀다운합니다. Resus는 더 많은 PBS에 세포를 현탁시키고, 세포를 세고, 혜성 분석에 사용될 때까지 어둠 속에 보관합니다.DNA 손상을 피하기 위하여 오기 분석실험은 모든 과립이 사라질 때까지 3 분 동안 마이크로파에 있는 1%aros를 녹입니다. 그런 다음 슬라이드를 용융된 아그로스에 담그고 Kim 물티슈로 한쪽 면을 깨끗이 닦습니다. 아그로스가 섭씨 4도에서 최소 1시간 동안 냉각 용해 용액을 건조하는 동안 아그로스를 투명 필름으로 자연 건조하고 더 많이 녹이도록 합니다.1%낮은 융점 Agros. 시원하다. 이 아그로스 배치는 30 분 동안 수조에서 섭씨 37도까지 떨어집니다. 혜성 꼬리의 인공적인 감응작용을 피하기 위하여는, 지금 100 의 밀리리터 당 000의 세포가 있다 그래야 가을걷이된 신경 세포 현탁액을 묽게 하십시오.세포 현탁액을 1 대 10 비율의 소용돌이에서 섭씨 37도의 낮은 융점 아그로스와 간단히 결합하고 즉시 피펫 팁의 측면을 사용하여 50마이크로리터의 세포 현탁액을 공기 건조된 혜성 슬라이드의 샘플 영역에 고르게 펴 놓습니다. 처리된 슬라이드를 슬라이드 주변에 원이 나타날 때까지 30분 동안 냉장고에 평평하게 놓습니다. 그런 다음 섭씨 4도의 어둠 속에서 미리 냉각된 용해 용액에 슬라이드를 담그십시오.30분 후 용해 용액을 흡입합니다. 그런 다음 냉장고에서 30분 동안 하나의 x 중성 전기영동 버퍼에 슬라이드를 배양합니다. 다음으로, 사전 냉각된 1 x 중성 전기영동 버퍼를 전기영동 챔버에 추가한 다음 슬라이드를 전기영동 슬라이드 트레이에 놓고 전극에서 동일하게 떨어져 있도록 슬라이드를 정렬합니다.1 x 중성 전기 영동 버퍼의 0.2 인치로 슬라이드를 덮을 수있을만큼 챔버를 채운 후 전원 공급 장치 전압을 센티미터당 1 볼트로 설정하고 섭씨 4도에서 30 분 동안 어둠 속에서 분석을 실행합니다. 먼저 새로운 아그로스 및 신경 세포 처리 슬라이드를 신선하고 미리 냉각된 용해 용액에 담근 다음 섭씨 4도의 어둠 속에서 1시간에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, 용해 용액에서 슬라이드를 제거하고 배수 한 다음 알칼리 감기 단계 전에 잔류 물을 제거하기 위해 5 분 동안 차가운 중화 버퍼로 한 번 헹굽니다.다음 활주의 위 0.5 센티미터를 초과하지 않기 위하여 전 냉각한, 갓 한 전기 이동법 완충기로 채워진 젤 전기 이동법 약실에 있는 활주를 두십시오. 어두운 곳에서 30분 동안 알칼리성 완충액에 슬라이드를 배양하여 DNA가 풀리고 알칼리 손상 원인이 발현될 수 있도록 합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 30분 동안 1볼트/센티미터로 분석을 실행합니다.혜성 분석을 실행한 후 과도한 전기영동 완충액을 배출한 다음 슬라이드를 실온에서 미리 냉각된 증류수에 담그십시오. 5 분 후, 슬라이드를 실온에서 사전 냉각, 70 % 에탄올에 담그십시오. 5분 더 후 샘플을 밤새 건조시켜 밝은 빛을 피하십시오.그런 다음 냉장고에서 30 분 동안 슬라이드를 사이버 그린으로 염색하십시오. 이제 슬라이드를 제거하고 어둠 속에서 완전히 건조시키십시오. 아로스는 완전히 건조되면 투명해집니다.분석에서 이미지를 획득하려면 녹색 필터로 설정된 형광 현미경을 사용합니다. 그런 다음 COMET 분석 프로그램을 열어 획득한 이미지를 분석합니다. 혜성 머리 버튼을 클릭하면 소프트웨어가 평균 꼬리 모멘트와 핵 내 DNA의 양을 포함한 매개변수를 계산합니다.처리당 최소 200개의 세포를 분석한 후 평균 꼬리 모멘트 및 데이터 플로팅을 계산하기 위해 데이터를 Microsoft Excel로 내보냅니다. 이 첫 번째 그림은 혜성 꼬리가 있거나 없는 신경 세포에 대한 COMET 분석 분석의 예를 보여줍니다. COMET 분석 소프트웨어를 사용하여 분석된 이 두 번째 혜성 분석에서 신경 세포에 대한 방사선 조사는 세포가 전기장을 받을 때 DNA 손상을 유도하는 것으로 확인되었습니다.DNA는 크기의 차이로 인해 다른 속도로 이동했으며, 이후에 일반적인 분석 소프트웨어로 분석했습니다. 이 첫 번째 스크린샷은 COMET 분석 프로그램을 사용하여 형광 현미경을 사용하여 얻은 대표 이미지를 보여줍니다. 한 이미지의 핵 또는 혜성 머리를 클릭하면 형광 지도 그래프와 데이터 테이블이 생성되었습니다.DNA에 대한 손상이 심할수록 DNA가 핵 밖으로 더 멀리 이동했습니다. 그 결과 녹색으로 표시된 것처럼 핵의 형광 강도가 감소했으며, 이후에 소프트웨어에 의해 감지되어 더 높은 꼬리 모멘트를 생성합니다. 이 최종 그림에서, 중성 혜성 분석을 사용하여 조사된 신경 세포와 조사되지 않은 신경 세포의 DNA 손상을 분석하여 얻은 평균 꼬리 모멘트의 대표적인 그래프는 조사된 신경 세포에서 더 높은 평균 꼬리 모멘트에 의해 표시된 바와 같이 3개의 회색 방사선 유도 DNA 손상이 예상된 대로 표시됩니다.이 절차를 시도하는 동안 세포를 조심스럽게 다루고 직사광선에 노출되지 않도록 하고 pH 단위의 온도를 제어하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이는 세포가 추가 스트레스를 받지 않도록 하기 위한 것이며, 이로 인해 결과가 변경될 수 있습니다. 이 절차를 따르십시오. DNA 분석과 같은 다른 방법, 면역형광 염색을 통한 복구 병소를 수행하여 DNA 복구 경로가 변경되는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.예를 들어, RAD 51 foci 또는 phospho, DNA PK Foci에 대한 면역형광 염색을 수행하여 상동 재조합 복구 또는 비상동 및 결합 복구를 각각 측정할 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 유해 물질에 노출된 후 DNA 손상을 감지하기 위한 혜성 분석을 보여줍니다. 알칼리성 조건에서는 DNA가 풀리고 변성되며, 전기영동에 따라 손상되지 않은 DNA와 손상된 DNA가 아가로스 겔에서 다르게 이동하여 혜성 모양의 구조를 형성합니다. 천천히 이동하는 손상되지 않은 DNA는 원형 혜성 머리를 형성하고, 빠르게 이동하는 손상된 DNA 조각은 길쭉한 혜성 꼬리를 형성합니다.

세포의 DNA 손상 감지를 위한 Comet Assay

여기서 전례 처리량 DNA 손상 혜성 분석 검출 할 수있는 플랫폼을 설명한다. 장치 패턴 마이크로 어레이에 포유 동물 세포와는 96 샘플의 병렬 처리를 할 수 있습니다. 접근법은 기본 레벨 DNA 손상, 노출 유도 DNA 손상 및 DNA 수선의 동력학 분석을 용이하게한다.

CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

혜성 분석은 다른 요인에 의해 유도 된 DNA 나누기를 측정한다. DNA 손상을 유발 (산화 스트레스를 제외한) 모든 요인들이 일정하게 유지되는 경우, DNA 손상의 양이 산화 스트레스 좋은 간접 파라미터이다. 이 프로토콜의 목적은 산화 적 스트레스의 간접적 인 측정에 혜성 분석을 사용하는 것이다.

전신 산화 스트레스의 간접 측정으로 혜성 분석

알칼리 혜성 분석은 진핵 세포에서 DNA 가닥 절단을 측정합니다. Endonuclease III 또는 human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step을 추가함으로써 이 분석은 산화적 DNA 손상을 효율적으로 검출할 수 있습니다. 우리는 쥐 간에서 DNA 손상을 검출하기 위하여 이 분석을 사용하는 방법을 기술한다.

쥐 간에서 DNA 가닥 나누기 및 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 생체 알카라인 혜성 분석 및 효소 수정 알카라인 혜성 분석에서

혜성 분석 결과 단일과 이중 가닥 DNA를 포함 하 여 DNA 손상 나누기를 검색 하는 효율적인 방법입니다. 알칼리와 중립 혜성 분석 실험 화학 요법의 치료 효과 평가 하기 위해 암 세포의 DNA 손상을 측정을 설명 합니다.

DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

이 프로토콜은 DNA 손상을 평가하기 위해 혜성 분석실험에 사용하기 위해 부검 시 고품질 냉동 조직 샘플을 준비하기 위한 몇 가지 절차를 설명합니다: 1) 다진 조직, 2) 위장관에서 긁힌 상피 세포, 3) 큐브 조직 조직 다진 장치를 사용하여 균질화를 요구하는 샘플.

DNA 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용

혜성 분석은 DNA 손상을 감지하는 널리 사용되는 수단입니다. 이 연구는 혜성 분석의 대표적인 변형에서 슬라이드를 실행하는 접근 방식을 설명합니다. 이 접근 방식은 샘플 수를 크게 늘리는 동시에 분석 실행 시간, 슬라이드 조작 횟수 및 젤 손상 위험을 줄였습니다.

세포 DNA 손상 평가를 위한 고처리량 혜성 분석 접근법

이 프로토콜은 혜성 분석의 적용을 통해 FLT3 돌연변이 세포에서 유형 I 및 유형 II 억제제에 의해 유도된 DNA 손상의 차이를 정량화하는 효과적인 방법을 설명합니다.

유형 I 및 유형 II FLT3 억제제에 노출된 후 FLT3 돌연변이 발현 32D 세포에서 DNA 손상을 정량화하기 위한 혜성 분석

유전자 변형을 사용하여 시금 β - 아밀로이드 독성 C. 엘레간스 모델

우리는 오랜 기간이 이상의 형광 현미경을 통해 뉴런을 생활에서 mitochondria의 이미징 수있는 프로토콜을 설명합니다. 연장 기간 동안 이미지가 mitochondrially 대상으로 형광 단백질과 설계 및 우리 연구실에 지어진 저렴한 무대 위로 보육의 이용 lentivirus - 중재 표현을 통해 수행됩니다.

Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

학습하세요 혜성 분석을 사용하여 해마 뉴런의 DNA 손상을 측정하고 정량화하는 방법을. 전기 영동과 형광 현미경을 활용하여 개별 뉴런의 DNA 무결성을 평가할 수 있습니다.

혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금

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