Name: 뮌헨의 Wistar 쥐에서 2 광자 현미경을 사용하여 형광 고분자의 사구체 투과율을 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 배우세요 뮌헨 Wistar 쥐에서 2광자 현미경을 이용한 형광 고분자의 사구체 투과율 정량화 방법을. 이 기술은 신장 여과 장벽의 투과 특성을 생체 내에서 직접 측정하여 신장 질환 연구에 활용됩니다.

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저자는 정맥 액세스 라인의 위치를​​ 포함하는 수술 절차를 완료 Drs에 실비아 B 캄포스 - Bilderback 조지 J 로즈에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한 시몬과 Frömter 균주 모두로 구성된 뮌헨의 Wistar 식민지를 유지하기 위해 사라 E 유아에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 설포-로다 민 101 포닐 염화물 (텍사스 레드) 알부민 쥐 혈청의 활용 <ol><li> 최종 농도 50 ML 원뿔 관에 15 밀리그램 / ML, 100 mM의 중조 산도 9.0의 쥐에서 (RSA) 혈청 알부민 6.667 ML 100 MG를 녹인다. </li><li> 장소 얼음 / 물 비커의 용액으로 0에서 11 ° C. 사이에 멋진 </li><li> 15 초 동안 중간에 소용돌이, 텍사스 레드 포닐 염화물 (TRSC)의 10 mg을 유리 병에 고품질의 무수 디메틸 포름 아미드 (DMF) 200 μl를 추가합니다. </li><li> 소용돌이 RSA 매체에 솔루션 용해 TRSC을 추가합니다. </li><li> 호일 랩 50 ML 원뿔 (형성 파라 필름이 단단히 밀봉을 보장하는 데 사용할 수 있습니다), 수평 W / 아이스 만과 장소 (거품 형성을 방지)을 천천히 솔루션을 선동하는 로커에 얼음 양동이에 장소는 반응이 0에서 계속할 수 4 ° C 1 시간 동안. </li><li> 0.9 % 생리 식염수 5 L를 확인하고 클립 하나) 투석 막을 수 있습니다 챔버 떨어져 컷 50 kDa의 분자량, B) 디 젖은플로트 - lyzer, 또는 c) 슬라이드 - lyzer 카세트 (접합 TRSC을 제거하기위한 모든 적절한)에서와 같이 투석 튜브. </li><li> 5 L 컨테이너 W / 0.9 % 생리 식염수에 투석 챔버와 장소에서 개최 반응 혼합물은, 교반 막대를 사용하여 부드러운 교반과 함께 4 ° C에서 하룻밤을 dialyze. </li><li> 사실상 색상 변화에 하룻밤 배양 결과 (이 일반적으로 최소 4 교류와 함께 ~ 48 시간 소요)까지 아침과 늦은 오후에 5 L 투석 솔루션을 변경합니다. 또한, 50 kDa의의 MWCO가 RSA, 66kDa의 분자량에 너무 가까이되고 함께, 그것은 명확한 솔루션을 생성하지 않을 수 있습니다,이 멤브레인의 기공 크기의 분포에 따라 달라집니다, 60 시간, 5 교환합니다 충분한 시간을보다. </li><li> 측정 볼륨 및 TR-RSA의 대략적인 농도를 제공하기 위해 부피 100 MG의 초기 무게를 분할, 일반적으로 농도 범위 10-13 MG / ML. 최종 염료 : 알부민 비율은 15.00 당 ~ 4:1 1 형광해야한다단백질 MW 0 달톤. 4에서 보관 ° C; 발생할 수있는 조각화가 발생하면 투자율 값을 변경하므로, TR-RSA 솔루션을 일시 정지하지 마십시오. </li></ol> 2. 이미지 / 현미경 설정 거꾸로 현미경 스테이지를 준비 <ol><li> 장소 ~ 오토 클레이브 테이프의 4-7 조각 (약 ¾ &quot;롱) 완벽 40mm의 coverslip을 바닥 (coverslip에 바닥 접시)와 50mm 접시 내부에 서로 위에 쌓아.이는 가장자리 중 하나에 가까이 위치해야하므로 테이프의 가장자리 신장의 곡률의 가장자리와 접촉을하지만, 목표 빛의 경로 (그림 1A와 1B) 차단하지 않습니다, 큰 쥐가 요리의 테이프와 가장자리 사이에 더 많은 공간이 필요합니다. </li><li> 50 밀리미터 접시 (그림 1A)와 함께 무대 옆에 위치 2 Repti - 칼로리 패드. 무대 위에 온난화 물 재킷 담요를 놓습니다. </li><li> 객관적인 포탑을 보장하여 이미지를 수집하는 배 공기 O가있을 때 효율성을 극대화R 20X (공기 또는 물 침지) 객관적이고 정량 이미지를 수집하기 위해 높은 전원 침수 목표. </li><li> 영상 중에 목표에 물을 추가하는 가장 효율적인 방법은 측면에 회전 및 목표의 상단에 도달 할 수 PE-200 튜브의 긴 조각 1 CC의 주사기를 사용하여 물을 추가하는 것입니다. </li><li> 소프트웨어에 대한 중립적 인 밀도 필터를 사용하여 ~ 15 % ~ 20 %로 10w 레이저 여기 강도를 설정합니다. 갈륨 비소 인화물 비 descanned 광 검출기는 빨간색으로 배출량을 수집하는 녹색 배기 가스 및 625를 수집하기 위해 750로 설정됩니다. 블루 배출 (예 : 핵 얼룩 훽스트 33342)를 750-800 사이의 설정으로 표준 nondescanned multialkaline 탐지기를 사용하여 수집하고 있습니다. </li><li> 보먼의 공간에 낮은 강도 배출의 적절한 컬렉션을 보장하기 위해 검출기의 낮은 한계가이 값을 제외하지 않는 정도로 설정되어 있는지 확인합니다. 시각적 인 경고 표지가 표시됩니다 경우 감도설정이 너무 낮으며이 값이 0의 강도 값을 부여하고있다. </li><li> 1 CC의 전체 볼륨을 가지고 0.9 % 멸균 식염수로 희석 형광 알부민 용액의 ~ 5-8 MG와 1 CC의 주사기를로드합니다. </li></ol> 3. Intravital 위해 뮌헨의 Wistar 쥐의 신장을 노출 2 광자 이미징 <ol><li> Pentabarbitol (50 MG / ML 솔루션 120 μl/100 G 체중), Inactin (130 밀리그램 / ML 솔루션 120 μ/100 G 체중) 또는 Isofluorane (5 % 유도 1.5을 사용하여 미리 마취 쥐의 시작 ) 2.5 % 유지 보수, 내주 정맥 액세스 회선 (중 경정맥이나 대퇴 정맥), 왼쪽 측면은 흉곽 아래의 바로 왼쪽 허벅지 위에서 면도. </li><li> 그래서 그 오른쪽에 평평 쥐를 놓고 그 왼쪽, 면도면이 위로 향하고, 그 자세 늘어 (그림 앞발이 서로 닿지 서로 뒤 발을 만지고, 웅크 리고하지로는, 테이블에 평평하게되어 있는지 확인 2A). </리&gt; <li> 아주 부드럽게 자연스럽게 복막 내 낳는 위치를 결정하고 빈틈을 사용하여 몸 (허벅지 흉곽부터) (그림 2A)에 평행 한 직선을 그릴 신장을 느끼고 만져. </li><li> 이빨 포셉 한 쌍의 피부를 선택하고, 조직을 분쇄하고 출혈을 방지하기 위해 hemostats의 쌍을 사용하여 그린 선을 따라 피부를 꼬집어. 외과 가위를 사용하여 절개를 따라 잘라. 절단하기 전에 바깥 쪽 피부와 근육 층을 분쇄 극적으로 절감하고 일반적으로 출혈을 제거합니다. </li><li> 얇은 바깥 쪽 근육 레이어에 대해이 절차를 반복합니다. </li><li> 복막을 노출 할 내부 근육 층에 절개를 들어, 크기를 추정하기 위해 신장을 다시 만져. 신장보다 작은 절개 라인이 끼지; 절개를 보장하는 것은 바로 신장 이상이다. 그것은이 절개가 너무 작하고 필요한 경우 그것을 더 크게 만들 것이 좋습니다. 이 너무 큰 한 경우 봉합이 필요합니다.이 마지막 절개 중요하다, 너무 멀리 어떤 방향에하면 무대에서의 안정성에 영향을 미칠 유도 호흡 (최상의 시나리오)에서 하나의 모션 아티팩트를하거나 신장 작은 꽃자루에 악영향 감소 신장 관류 (최악의 경우) 늘릴 것입니다 것입니다. </li><li> 손 패션을 통해 손에 신장의 아래쪽 극을 향해 노력하고, 신장 (그림 2B 참조) 그립 집게를 사용하여 주변의 지방을 찾습니다. </li><li> 신장의 하부 극에 도달하면 매우 부드럽게 외면하는 신장 아래로 압박하면서, 조심스럽게 절개를 통해 신장을 당깁니다. 절개가 너무 작은 경우, 근육 층을 분쇄하고 넓혀 절단, 신장을 외면하는 절차를 반복합니다. </li></ol> 4. 이미징을위한 스테이지에서 뮌헨의 Wistar 쥐를 배치 <ol><li> 신장에 coverslip을 접시의 가장자리쪽으로 신장을 놓고 약간 쥐의 등쪽 (뒷면)으로 회전 신장의 복부 측면 그래서s는 coverslip을 바닥 접시 (그림 1A)와 접촉을 만들기. 접시에 따뜻하게, 멸균 09. % 생리 식염수를 추가합니다. </li><li> 10 배 또는 20 배 목표를보고 동작을 확인합니다. 움직임이 감지되면 가슴이 멀리 coverslip을 바닥 접시에서 그래서 약간에 쥐 롤, 신장 등의 신 경 (그림 1B)를 스트레칭없이 접시의 가장자리에 가까이 있는지 확인합니다. </li></ol> 5. 알부민의 신장 침투성을 정량화하는 이미지 획득 <ol><li> 사구체 투과성 (Glomeruluar 체질 계수, GSC) 계산하는 고분자의 것은 이전에 형광 분자의 주입에 개별 사구체 참조 배경 이미지를 촬영해야합니다. 귀하의 현미경 마킹 위치 할 수있는 전동 무대가 장착되어있는 경우, 찾아 낮은 전원 공급 목표를 사용하여 센터 개인 사구체 각각의 위치를​​ 표시합니다. 듀얼 패스 형광 / 로다 민 epifluorescence에 FIL하나 방출 필터 (위상 대비 또는 조명의 다른 비 형광 소스가 작동하지 않습니다) 작동하지만 터이 절차에 이상적입니다. 사구체는 듀얼 패스 필터를 통해 볼 때 고유의 노란색 - 오렌지 autoflourescence을 가진 근위 세뇨관으로 둘러싸인 빈 원형​​ 구조로 표시됩니다. </li><li> 귀하의 현미경 자동화 단계가없는 경우, 저전력 목적으로 래스터 패턴 신장 스캔 및 개별 사구체의 위치의 기초지도를 만든다; 같은 신장 캡슐 위에있는 큰 표면 혈관 등의 자연 명소에 의존 또는 지방 패치. </li><li> 높은 전력 침수 목표로 포탑을 전환하고 모세관 루프와 보먼의 공간을 명확하게 볼 수 있습니다 확인하고 각 사구체의 3D 데이터 세트를 가지고. 사색 팔레트 (B / W 이외)를 사용하여 이러한 구조를 시각화하는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 표면의 혈관에있는 집중 천천히 t에 주입그는 형광 알부민 결정해야 시간이 전신 배포 할 수 있도록 제공됩니다. 낮은 GSC와 분자의 경우는 플라즈마 강도 값을 최대화하는 것이 아니라 현미경 사진 탐지기를 포화 수준에 도달하지 필수적입니다. 이 필터링 분자의 검출을 증가시킵니다. 주 : (1 프레임 / 초 ~에서 전체 프레임을 취득) 화면에 나타나는 형광 알부민이 시간에 도입되는 시간 사이에 5-7 초 경과는 일반적으로있다. </li><li> 약 10 분은 잠재적 작은 분자량 조각이 알부민 GSC를 계산에 사용되는 1 ㎛ 간격으로 3 차원 볼륨을 취득하기 전에 취소 할 수 있도록 허용합니다. 일반적으로, 뮌헨의 Wistar 쥐의 시몬의 긴장이 훨씬 적은 표면 사구체를 가지고 시각화 할 수있는 모든 이미징 및 정량되도록. 우리는 ~ 10 정량화 수를 제한 할 수 있도록 Frömter 변형이 훨씬 더 큰 번호가 있습니다. </li><li> 연구의 끝에서 쥐가 anesthet의 과다 복용을 통해 안락사됩니다IC는 연구에 사용됩니다. 이중 pneumothoracotamy는 안락사를 보장하기 위해 수행됩니다. </li></ol> 6. 3D 볼륨에서 형광 알부민 GSC를 계산 <ol><li> Metamorph 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 배경 설정 모두 각각의 사구체에 대한 3D 데이터 세트를로드하고 형광 알부민 주입 후 촬영 설정합니다. </li><li> 정의 된 여백과 보먼의 캡슐의 가장자리 사이에 충분한 공간 빈 공간 표면 모세관 루프를 찾습니다 형광 알부민을 포함하는 볼륨. </li><li> 배경 볼륨에서 알부민 함유 이미지의 시각적 단서를 포함해야 동일한 초점 비행기를 찾습니다. 관심 모세관 루프 내에서 영역을 선택하고 평균 강도 수치를 기록합니다. 다음 보먼의 공간 내에서 영역을 선택하고 평균 강도 판독 값을 기록합니다. 이러한 배경 값으로 사용됩니다. </li><li> 정량, 알부민 C에서 보먼의 공간에 유사한 지역을 선택이미지를 ontaining. 보먼의 공간 내에서의 평균 강도에 대한 평균 값을 적어도 두 개의 다른 지역에 대해이 작업을 수행합니다. </li><li> 밝은 플라즈마 강도 모세관 루프를 선택하고 주변 지역을 그립니다. 임계 값 기능을 사용하여 다음 RBC의 순환하는 어두운 줄무늬를 피하고, 순환 혈장 내에서 밝은 값을 강조 표시합니다. 선택한 플라즈마 공간의 평균 강도 값을 기록합니다. 혈액 내 요소는 원인이 플라즈마 형광 수준을 과소 평가하는 역할을하기 때문에 그것은 우선적으로 플라즈마의 밝은 영역을 선택하는 것이 중요합니다. </li><li> Microsoft Excel 스프레드 시트 어디 GSC를 계산하는 값을 입력하여 : </li></ol><img alt="그림 1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells%3B+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504(2007).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489(2009).</li>
<li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447(2012).</li>
<li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601(1992).</li>
<li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides%2C+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat%3A+Effects+of+molecular+size+and+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237(2007).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389(2008).</li>
<li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9(2007).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에서 강조하는 단계는 우리가들은 다음과 같은 함정을 피할 수 있기 때문에 일관되고 정확한 투자율 값을 생성 할 것 느끼는 것을 나타냅니다 : <ol><li> 산란 : 긴 파장의 광자가 산란 적은 경향이 있기 때문에 적색 발광 형광체의 사용은 빛을보다 효율적으로 수집을 할 수 있습니다. 하나 녹색 또는 청색 발광 형광체를 사용하기 때문에 모세관 루프와 보먼의 공간 3에서 강도 값의 변동성이 증가의 GSC의 더 큰 변화를 소개합니다. </li><li> 이미지 깊이 : 깊은 3D 데이터 세트는 일반적으로 (종종 총 깊이 30 ~ 45 미크론 사이)에 수집되어 있지만, 상위 15 미크론 GSC 값을 결정하는 가장 적절한 초점 깊이를 나타냅니다. 다시 깊은 깊이 감도의 감소 및 방출 광자의 산란으로 인해 변동성이 증가된다. 더 중요한 것은 그러나 D를 발생 모세관 루프의 군집이다사구체 내 키퍼. 여기에, 모세관 루프 보먼의 공간을 둘러싼 보먼의 캡슐의 가장자리에 바싹 푸시됩니다. 이 실수로 직접 모세관 루...

<table><tbody><tr><td>Olympus Floview 1000 컨포칼/다광자 현미경</td><td>Olympus America</td><td></td><td>검출기용 필터: 파란색 430/100, 녹색 525/50, 빨간색 605/90</td></tr><tr><td>모드 잠금 Ti:Sapphire Mai Tai 레이저</td><td>스펙트럼 물리학</td><td></td><td>조정 가능한 여기 파장: ~750-1150nm</td></tr><tr><td>갈륨 비소 인화물 광검출기</td><td>Hamamatsu Corp</td><td></td><td>참고: 전면 또는 측면 장착 구성 사용 가능.</td></tr><tr><td>메타모프 이미지 처리 소프트웨어</td><td>분자 역학</td><td></td><td>참고: 버전 6.1r1</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corportation</td><td></td><td>2007 버전</td></tr><tr><td>핸들링 겸</td>자 <td>전자 현미경 과학</td><td>Cat# 78266-04</td><td></td></tr><tr><td>Mayo 해부 가위</td><td>전자 현미경 과학</td><td>Cat# 72962</td><td></td></tr><tr><td>CA 마이크로 가위 모델 1C300</td><td>전자 현미경 과학</td><td>Cat# 78180-1C3</td><td></td></tr><tr><td>켈리 지혈 집게 (직선)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>Cat# 72930</td><td></td></tr><tr><td>워터 재킷 담요 + 가열 패드</td><td>Gaymar</td><td></td><td>T/Pump PN 11184-000 담요-66N111CC</td></tr><tr><td>Repti-Therm 언더 탱크 히터</td><td>ZooMed</td><td></td><td>RH-4</td></tr><tr><td>텍사스 레드 설포닐 클로라이드</td><td>바이러스/분자 프로브</td><td>Cat# T-353</td><td></td></tr><tr><td>쥐 혈청 알부민</td><td>시그마 알드리치</td><td>Cat# A-6272</td><td></td></tr><tr><td>고품질 무수 DMF</td><td>시그마 알드리치</td><td>Cat# 270547</td><td></td></tr><tr><td>Strate-Line 오토클레이브 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 11-889-1</td><td></td></tr><tr><td>Willco-dish 커버슬립 바닥 접시(50mm/40mm 커버슬립)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>Cat# 70665-07</td><td></td></tr></tbody></table>

뮌헨의 wistar 쥐에서 2 광자 현미경을 사용하여 형광 고분자의 사구체 투과율을 정량화

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

같은 혈청 알부민, 긴 침투성 족으로 구성된 장벽, 혈관 내피 세포, 그리고 한마음으로 작업 기저막의 변화에​​ 의한 것으로 생각되어 같은 대형 필수 고분자의 소변 손실을 포함하는 신장 질환. intravital 2 광자 현미경을 사용하여 우리 연구소의 데이터는 근위 세뇨관 세포 (PTC)는 1,2 불리는 세포의 초기 집합에서 발생하는 필터링 알부민 검색과 이전에 생리 학적 조건에서 생각했던 것보다 더 투과성 사구체 여과 장벽 (GFB)를, 밝혀 3. 이전 기술은 신장 여과를 연구하는 데 사용 유체 콘텐츠 및 분석 4 샘플링이 초기 관 세그먼트의 루멘의 micropuncture을 포함 여과 장벽의 특성을 설정. 해당 밀접하게, 이러한 연구는 거의 존재하지 않는 것으로 내강 액에 알부민 농도를 결정일반적으로 소변에서 검출되는 것과. 그러나,이 기술에 의해 정의 된 크기의 덱스 트란 폴리머의 특성은 혈청 알부민과 비슷한 크기의 사람들을 밝혀 관 루멘과 소변에서 높은 수준을했다; 증가 투자율 5 제안. 여기에 직접 시각화하고 생체 내에서 사구체 형광 알부민 투과성을 계량하는 데 사용되는 기술에 대한 자세한 개요입니다. 이 방법은 보먼의 공간 (소변 여과의 초기 챔버)로 여과 장벽을 통해 여과 된 알부민을 검출 할 수 있고, 또한 근위 세뇨관과 이후 알부민 transcytosis 6 시각화하여 알부민 재 흡수의 정량화 할 수 있습니다. 방광 도중에 이상 관 세그먼트에 따라 형광 알부민의 부재는 이전 근위 세뇨관 세그먼트에있는 검색 경로의 효율성을 강조 표시합니다. 또한,이 기술을 적용 할 때 투자율을 결정하기의 알부민 거의 동일 투자율 값으로 유사한 크기를 갖는 덱스 트란은 2보고되었다. 이러한 관찰은 직접 근위 세뇨관 세포 재생에 포함 된 변경에 많은 단백뇨 신장 질환의 초점을 확장 할 필요성을 지원합니다.

그림 3은 뮌헨의 Wistar Frömter 쥐와 형광 알부민 투과성을 결정하기 위해 수행하는 단계의 표면 사구체에서 촬영 한 이미지의 예를 보여줍니다. 0.0111의 알부민 GSC 값은 뮌헨의 Wistar 쥐 때 공급 조건 3이 변형에서 볼 수있는 범위 내에서이 개별 사구체 가을을위한 것. 이 이미지에서 볼 수있는 안정성은 신중한 계획과 그림 1과 2에 묘사 된 명령어의 실행 때문이다. 앞에서 언급 한 바와 같이, 신장 exteriorizing에 사용되는 절개의 위치는 모션 아티팩트 무료로 안정된 이미지를 생산에서 가장 중요한 단계입니다. <img src="/files/ftp_upload/50052/50052Figure1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_u...

2 광자 현미경 높은 해상도 intavital을 활용하는 기술을 직접 시각화 및 표면 사구체에서 gloemrular 여과를 정량화한다. 이 방법은 정상과 질병 상태 모두에서 거대 분자의 투과 특성을 직접 측정 할 수 있습니다.

뮌헨의 Wistar 쥐에서 2 광자 현미경을 사용하여 형광 고분자의 사구체 투과율을 정량화

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

이 절차의 전반적인 목표는 네프론의 여과 단위를 성공적으로 시각화하고 생체 내 여과 장벽을 통해 비뇨기 공간으로의 형광 거대분자의 여과를 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 살아있는 동물을 위한 현미경 스테이지를 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로 신장을 노출시키고 쥐를 무대에 놓습니다.그런 다음 개별 사구체를 식별하고 매핑하고 배경 3D 이미지를 획득합니다. 마지막으로 형광 알부민이 주입됩니다. 개별 사구체의 3D 부피를 획득하고 투과성을 정량화합니다.궁극적으로, 바이알 내 2광자 현미경을 사용하여 신장의 사구체를 가로지르는 거대분자의 여과 계수를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. Two Photon Microscopy의 주요 장점은 동물에서 사구체 여과와 근위 세뇨관 재흡수 및 transcytosis를 동시에 정량화할 수 있다는 것입니다. 동시에, 이 기술의 함의는 기계론적인 것을 넘어 진단 및 치료로 확장되며, 사구체 여과와 근위 세뇨관의 역할을 모두 이해하는 것의 중요성이 있습니다.알부민의 재흡수는 치료의 표적을 결정하는 데 중요합니다. 쥐를 마취한 후 경정맥 또는 대퇴 정맥을 통해 내주 정맥 접근선을 삽입하고 흉곽 바로 아래에서 왼쪽 허벅지 바로 위까지 왼쪽 옆구리를 면도합니다. 이것은 생존이 불가능한 수술입니다.면도한 왼쪽이 위를 향하도록 쥐를 오른쪽에 평평하게 놓습니다. 앞발이 서로 닿고 뒷발이 서로 매우 부드럽게 닿도록 자세가 길쭉하고 웅크리지 않고 벤치에 평평하게 놓여 있는지 확인하십시오. 신장을 만져 보면서 신장이 후복막 내에서 자연적으로 어디에 놓여 있는지 확인하고 샤피를 사용하여 한 쌍의 치아 집게로 몸과 평행한 직선을 그립니다.피부를 집어 올리고 한 쌍의 지혈기를 사용하여 그려진 선을 따라 피부를 꼬집어 조직을 부수고 수술 용 가위를 사용하여 출혈을 방지합니다. 절개 부위를 따라 자릅니다. 필요에 따라 얇은 바깥쪽 근육층을 절단하는 것과 동일한 절차를 사용하십시오.복막을 노출시키는 내부 근육층을 절개하기 위해 출혈을 방지하기 위해 지혈제를 사용합니다. 크기를 추정하기 위해 신장을 다시 촉진합니다. 신장보다 작은 절개 라인을 꼬집어 절개가 신장 바로 위에 있는지 확인합니다.이 절개 부위는 너무 작게 만들고 필요한 경우 크게 만드는 것이 가장 좋습니다. 신장을 찾아 집게를 사용하여 손과 손을 맞대고 신장의 아래쪽 극을 향해 움직이는 주변 지방을 잡습니다. 신장의 아래쪽 극에 도달하면 절개 부위를 통해 신장을 부드럽게 당기면서 신장 아래를 아주 부드럽게 눌러 외부로 배출합니다.절개 부위가 너무 작으면 근육층을 부수고 절개하여 넓힙니다. 쥐의 신장을 외부화하고 이미징을 위해 쥐를 현미경 스테이지에 올려 놓은 후 신장을 외부화하는 절차를 반복합니다. 현미경에 이중 통과 플루오레세인 로드, 도민 필터 및 저전력 대물렌즈를 사용하여 위치를 표시할 수 있는 전동 스테이지가 장착되어 있는 경우 근위세뇨관으로 둘러싸인 빈 원형 구조로 나타나는 개별 사구체를 찾아 중앙에 배치합니다.고유한 노란색 주황색 자가형광으로 각 위치를 표시하고, 포탑을 더 높은 출력의 침수 대물렌즈로 전환하고, 각 사구체의 3D 데이터 세트를 가져옵니다. 모세관 루프와 Bowman 공간이 명확하게 보이는지 확인합니다. 의사 색상 팔레트를 사용하면 이러한 구조를 시각화하는 데 도움이 됩니다.다음으로, 표재성 혈관에 초점을 맞추고 형광 알부민을 천천히 주입하고, 사구체 cing 계수 또는 GSC가 낮은 분자에 대한 전신 분포를 허용하는 시간이 주어지도록 하고, 플라즈마의 강도 값을 최대화하는 것이 필수적이지만 현미경의 광 검출기를 포화시키는 수준에 도달하지 않아야 합니다. 이것은 걸러진 분자의 검출 가능성을 증가합니다.잠재적인 작은 분자량 파편이 제거될 때까지 약 10분을 기다린 후 변형 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 알부민을 계산하는 데 사용할 1미크론 간격으로 3D 부피를 획득합니다. 형광 알부민이 포함된 볼륨의 각 사구체에 대한 배경 이미지와 함께 3D 데이터 세트를 불러옵니다.정의된 여백과 Bowman의 캡슐 가장자리 사이에 충분한 빈 공간이 있는 표면 모세관 루프를 찾습니다. 배경 볼륨에서. 이미지를 포함하는 알부민의 모든 시각적 신호를 포함해야 하는 동일한 초점면을 찾습니다.관심 있는 모세관 루프 내의 영역을 선택하고 평균 intensity 판독값을 기록하십시오. 다음으로, Bowman 공간 내의 영역을 선택하고 평균 강도 판독값을 기록합니다. 이는 정량화를 위한 배경 값으로 사용됩니다.이미지가 포함된 알부민의 Bowman 공간 내에서 유사한 영역을 선택합니다. Bowman의 공간 내에서 평균 강도에 대한 값을 얻기 위해 적어도 두 개의 다른 영역에 대해 이 작업을 수행합니다. 플라즈마 강도가 가장 밝은 모세관 루프를 선택하고 그 주위에 영역을 그립니다.다음으로, threshold 기능을 사용하여 순환 혈장 내의 밝은 값을 강조 표시하여 순환하는 적혈구를 나타내는 어두운 줄무늬를 피합니다. 선택한 플라즈마 공간의 평균 intensity 값을 확인합니다. 혈장의 밝은 영역을 우선적으로 선택하는 것이 중요한데, 혈액 내 요인은 혈장 형광 수치를 과소평가하는 역할만 하기 때문입니다.Excel 스프레드시트에 값을 입력하여 GSC를 계산하며, 여기서 GSC는 원시 활자 공간의 차이와 같습니다. 강도에서 배경 Bowman 공간 강도를 뺀 값을 원시 모세관 루프 강도에서 배경 모세관 루프 강도를 뺀 값으로 나눈 값입니다. 여과된 형광 알부민의 흡수는 주로 근위세뇨관의 초기 분절에서 발생합니다.S one, 이 패널은 사구체의 단면과 뮌헨 Wistar 프롬프터 쥐에서 가져온 S one 세그먼트를 보여주며, 초기 텍사스 레드 RSA 볼루스 주입 후 약 20분 후에 나타납니다. Bowman 공간의 개방과 빨간색의 알부민의 열렬한 흡수는 S 한 세그먼트에서 볼 수 있습니다. 이 패널은 동일한 데이터 세트의 얕은 20미크론 3D 프로젝션을 보여주며, 여기에 표시된 것은 주입 후 약 60분 후에 수행된 저출력 프로젝션입니다.이러한 이미지는 인트라바이탈 현미경 검사법을 통해 여과 후 주입된 물질의 운명을 시각화할 수 있음을 보여주며, 여기에 표시된 여과 계수는 표면 사구체에서 가져온 이미지입니다. 이 패널은 배경 이미지이며 이 이미지는 텍사스 레드 랫트 세럼 알부민 주입 후 약 12분 후에 촬영되었습니다. 이 두 패널은 의사 색상으로 그려집니다.Bowman의 공간에 그려진 세 개의 작은 관심 영역은 여과 장벽을 가로질러 이동한 형광 알부민의 평균 강도를 계산하는 데 사용됩니다. 개별 지역에 대한 평균 강도 값은 show region Statistics(지역 통계 표시) 대화 상자 내에서 강조 표시된 영역에 보고되었습니다. 이 개별 사구체에 대해 파생된 0.0111의 알부민에 대한 GSC 값은 먹이를 먹인 상태일 때 뮌헨 별쥐의 이 균주에서 범위 장면 내에 속합니다.이 절차에 따라, 다른 신장 구조에 대해 정량적 및 정성적 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 거대분자가 발달 후 요로 공간으로 여과된 후 거대분자의 최종 이동과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술을 통해 신장 생리학 연구자들은 역동적인 생리학적 및 병태생리학적 과정을 한 번이 아니라 종단적으로 탐구할 수 있었습니다. 시간이 지나면서 그랬습니다.

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Medicine

의학

이 비디오는 이광자 매개 미세천자 기법을 사용하여 쥐 사구체의 유체 흡인을 보여줍니다. 이 기술은 살아있는 쥐의 사구체에 대한 접근을 제공하여 신장 생리학에 대한 통찰력을 얻는 데 도움이 됩니다.

Fluid Aspiration from Mouse Glomeruli: A Method to Aspirate from Mouse Glomerular Fluid Using Two-Photon Mediated Micropuncture(생쥐 사구체의 유체 흡인: 이광자 매개 미세천자를 사용하여 마우스의 사구체 유체를 흡인하는 방법)

사구체 여과율 (GFR)의 측정은 신장 기능 평가를위한 황금 표준입니다. 여기서 우리는 두 단계 지수 붕괴 모델 플라즈마 GFR의 계산에 하나의 알약 주입, 형광 이소 티오 시아 네이트의 결정 (FITC) 이눌린을 사용하여 의식 쥐 GFR의 결정을 허용하는 높은 처리량 방법을 설명합니다.

의식 쥐의 사구체 여과율의 측정을위한 높은 처리량 방법

고립 된 혈액 관류 폐 준비는 폐 표면에 미세 혈관의 네트워크를 시각화하는 것이 가능합니다. 여기에서 우리는 실시간 형광 이미징을 사용하여 격리 된 폐의 단일 미세 혈관의 투과성을 정량화하는 방법을 설명합니다.

고립 된 혈액 관류 쥐 폐 준비에 단일 미세 혈관 투과성의 양을

특정 대상 프로브 질병 (예를 들어, 염증, 감염, 및 tumorigenesis)의 다양 한 종류의 단백질 표정 등의 분자 메커니즘을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 연구에서 우리는 murine 모델 f 4/80 전용 형광 중재 단층 촬영을 사용 하 여 대 장 염의 장 대 식 세포 침투의 양적 차원 단층 평가 설명 합니다.

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Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

이 프로토콜에는 전체 신장 작업 업 사 질병 마우스 모델에서을 수행 하는 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

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보 먼의 공간 2 광자 현미경에 의해 촉진 생쥐에서의 Micropuncture

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여기에서, 우리는 고과민성, 비방사성 추적자를 사용하여 마우스에 있는 사구체 투과성을 시험하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 작은 소변 볼륨을 가진 반복적인 소변 분석을 허용합니다.

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이 연구는 CUBIC이 제거된 마우스 신장의 사구체를 표지하고 분석하기 위한 사용하기 쉽고 완전하며 간단한 방법 세트를 제시합니다. 사구체 수 및 부피와 같은 데이터는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란, 광시트 형광 현미경(LSFM) 또는 일반적인 컨포칼 현미경 및 Imaris와 같은 소프트웨어를 사용하여 쉽고 안정적으로 얻을 수 있습니다.

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배우세요 뮌헨 Wistar 쥐에서 2광자 현미경을 이용한 형광 고분자의 사구체 투과율 정량화 방법을. 이 기술은 신장 여과 장벽의 투과 특성을 생체 내에서 직접 측정하여 신장 질환 연구에 활용됩니다.

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