T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

이 실험 시스템은 단일 세포 수준에서 T 세포 매개 세포 독성을 모니터링하기 위한 고처리량 방법론을 제공합니다. 먼저, effector T 세포와 종양 표적 세포를 형광 염료 사멸로 표시합니다. 두 세포 유형을 모두 나노 웰 어레이에 로드하고 전체 칩을 cyt green 및 형광 표지된 nexin을 포함하는 배지에 담그십시오. 5.

괴사성 세포와 세포사멸 세포를 모두 식별하기 위해 이제 초기 사전 이미지를 기록하여 분석 시작 시 유정 점유율과 세포 생존율을 결정합니다. 6시간의 배양 후 두 번째 이미지를 기록합니다. 그런 다음 자동 이미지 분석을 사용하여 자동차 양성 T 세포에 의한 EL 4 CD 19 양성의 항원 특이적 용해를 정량화합니다.

이 고처리량 분석법에서 얻은 결과는 사이톡신(cytoxin)을 사용한 양성 염색을 기반으로 효과기 세포에 의한 표적의 항원 특이적 용해를 스크리닝할 수 있습니다. 5. 크롬 51 방출 분석과 같은 기존 방법에 비해이 기술의 주요 장점은 진정한 일대일 효과적인 표적 상호 작용을 달성 할 수 있고 위성 주파수를 측정 할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 자가 세포 치료에서 효능의 상관 관계를 연구 할 수 있기 때문에 암 치료법으로 확장됩니다 실리콘 마스터를 사용하여 나노 웰을 제조하려면 먼저 시가 180 4 엘라스토머 키트베이스와 경화제를 철저히 혼합합니다. 플라스틱 칼을 사용하여 일회용 컵에 10:1 무게 비율. 진공 챔버에서 혼합물을 1시간 동안 가스를 제거합니다.

그런 다음 혼합물을 실리콘 마스터에 붓고 30분 동안 그대로 두십시오. 이제 엘라스토머를 경화시키기 위해 실온에서 한 시간 동안 냉각한 후 섭씨 80도의 오븐에서 어셈블리를 2시간 동안 가열합니다. 실리콘 마스터에서 PDMS 나노 웰 어레이를 조심스럽게 제거합니다.

실험 통과 하루 전까지 스카치 테이프로 덮으십시오.5 밀리리터에 500 만 개의 표적 세포를 사용하십시오. 실험 당일. 멸균 15ml 원뿔형 튜브에 500만 개의 세포를 340Gs에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿

세포를 라벨링하기 위해 약 50마이크로리터의 배지를 남기고 과도한 배지를 흡입합니다. 150마이크로리터의 fresh cell tracker red working solution을 추가하고 P 200 피펫을 사용하여 섭씨 37도에서 20분 동안 5%이산화탄소와 함께 완전히 혼합합니다. 혈구 분석기를 사용하여 배양에서 수확한 effector 세포를 열거합니다.

그런 다음 원심분리를 통해 멸균 15ml 원뿔형 튜브에 500만 개의 세포를 펠릿화합니다. 초과 매체를 흡입합니다. 그런 다음 P 200 피펫을 사용하여 5마이크로몰의 새로운 작업 용액, 생생한 D 사이클, 바이올렛 염색 및 서스펜션 복원을 추가합니다.

세포를 배양하고 섭씨 37도에서 20분 동안 6.8ml의 5%이산화탄소와 6.0mL의 R-P-M-I-P-L-G-H를 각각 표적 세포와 효과기 세포에 넣고 피펫팅으로 혼합합니다. 다음 천천히 각 관의 바닥에 플러스 fial 팩의 3.5 밀리리터를 층을 이루고, 원심분리 도중 틈 그리고 가속도 없이 30 분 동안 340 GS에 두 관 다 원심분리하고, 4개의 좋은 판으로 나노 우물 배열 첫번째 이동 전 PBS의 7 밀리리터를 준비합니다. 플라즈마 산화제를 사용하여 유리 슬라이드의 바닥을 에탄올로 청소합니다.

PDMS를 높은 RF 설정에서 30-45초 동안 처리합니다. 그런 다음 어레이를 PBS에 배치합니다. 플레이트를 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 초과 PBS를 흡인하고 유리 슬라이드의 상단 및 하단 가장자리에 따뜻한 1% 고귀한 한천을 적용하여 어레이를 고정합니다.

PBS 3밀리리터에서 10분 후에 PDMS를 건조시키지 말고 과도한 한천을 흡인하십시오. 그런 다음 나노 웰 어레이 상단에 R 10 3 밀리리터를 추가하고 약 10 분 동안 평형을 이룹니다. Fial 원심분리 후 각 튜브의 최상층에서 5ml의 매체를 흡입합니다.

P 1000 피펫으로 세포가 포함된 층을 흡인하지 않도록 주의하십시오. fial과 배지 사이의 흰색 세포층을 수확합니다. 세포를 새로운 멸균 원추형 튜브로 옮깁니다.

이제 수확된 효과기와 표적 세포를 전쟁 전 R-P-M-I-P-L-G-H 3밀리리터로 두 번 세척합니다. 최종 원심분리 후 과잉 배지를 흡입하고 세포 펠릿을 재현탁합니다. 500 마이크로리터의 R 10에서 혈구 분석기에서 trian blue exclusion 방법을 사용하여 생존 가능한 세포를 계수하고 나노 의지 배열의 초과 배지를 흡입합니다.

그런 다음 새 R 10 흡입 2ml를 추가합니다. 다시 말하지만, 나노 의지 어레이의 상단이 너무 젖거나 너무 건조하지 않은지 확인하는 것은 세포의 분포에 영향을 미치기 때문입니다. 이제 200 마이크로 리터의 R 10에 5 분의 1을 증착하여 나노 배열 표면에 세포가 5 분 동안 정착 할 수 있도록합니다.

그런 다음 표준 조직 배양 현미경을 사용하여 세포의 원하는 분포를 확인합니다. 다음으로, 200 마이크로리터의 R 10 중의 다섯 번째 표적 세포에 10배를 1배씩 증착하고, 효과기 세포를 포함하는 나노 웰 어레이 표면 상에 증착한다. 5분 후, 현미경으로 세포 분포를 평가합니다.

그런 다음 나노 웰 어레이를 2ml의 R 10으로 조심스럽게 헹구고 별도의 멸균 15ml 원추형 튜브에서 초과 매체를 흡입합니다. 3 마이크로리터의 0.5 밀리몰 시트, 녹색 핵산 염색 및 60 마이크로리터의 X를 피펫팅으로 철저히 혼합하여 예열 R 10 3 밀리리터를 피펫팅합니다. 지금 4개의 우물 판에 얼룩 해결책을 온화하게 피펫으로 쌈다, 세포가 37 섭씨 온도에 15 분 동안 배양하는 우물에서 전치되지 않다는 것을 확인하거든, 5%carbon 취득한다 자동화한 단계 및 Lambda DG 4 장비된 zes 관찰자 Z 1 현미경 같이 형광 현미경을 사용하여 nano 우물 배열의 심상을 취득한다.

소프트웨어와 현미경을 초기화합니다. 투과광과 다른 형광 채널의 신호 강도를 확인하십시오. 포화를 피하면서 최대 신호 대 잡음을 보장하도록 현미경 설정을 조정합니다.

이제 nelle 배열의 x 및 Y 위치 목록을 엽니다. XY 0 위치를 설정하고 nelle 배열 스탬프의 왼쪽 상단 모서리에 있는 7 x 7 nelle 배열 블록의 중심에 초점을 0으로 설정합니다. 각 블록의 중심과 일치하도록 XY 위치를 설정하고 각 블록의 초점을 정확하게 반영하도록 Z 값을 설정합니다.

이제 이미지 획득을 선형 모드로 설정하고 이미지를 획득합니다. 첫 번째 이미징 시리즈 후 나노 웰 어레이를 6시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 교반을 잘 관리하면 세포 이동으로 이어질 수 있습니다.

그런 다음 두 번째 시점에서 이미지 획득을 반복합니다. 이 고처리량 세포 용해 분석법은 항원 특이적 용해로 표지된 CD 19 특정 CAR 양성 T 세포의 빈도를 나노 L 어레이의 개별 웰에서 표지된 마우스 EL 4개의 표적 세포와 함께 공동 배양했습니다. 타겟 세포 히스토그램 플롯은 단일 effector cell과 단일 target cell을 포함하는 well을 나타냅니다.

6시간의 공동 배양 후, 효과기가 없는 표적 세포의 일치하는 히스토그램을 음성 대조군으로 사용하여 배경 세포 사멸 빈도를 보고했습니다. 2 내지 4% 범위의 비특이적 용해의 저주파를 달성하는 것이 바람직합니다.나노 웰 어레이는 효과기, 표적 접합 및 후속 세포 사멸을 관찰할 수 있도록 타임 랩스 이미징에 적용할 수 있습니다. 여기서, 표지되지 않은 자동차 양성 T 세포를 NOL에서 NA LM 6 GFP 타겟 세포와 함께 공동 배양하고 동적 모니터링을 수행했습니다.

Xin five가 배양 배지에 추가되었을 때, apoptotic cells는 Once mastered라는 빨간색 라벨을 붙였습니다. 이 기술은 이 절차에 따라 10-12시간 내에 적절하게 수행할 수 있습니다. 마이크로 그래빙(micro grabbing)과 같은 다른 방법은 세포의 사이토카인 분비 프로파일을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.