Name: T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 학습하세요 고처리량 단일 세포 수준에서 T 세포 세포독성을 측정하는 방법을. 나노웰 어레이와 형광 현미경을 활용하여 종양 표적 세포에 대한 면역 반응을 정밀 분석하고 암 면역치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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연구 상 번호 R01CA174385에 따라 국립 보건원 국립 암 연구소에 의해 지원 된이 출판물에보고했다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 전망을 대표하지 않습니다.

1. 시약 준비 <ol><li> 500 ML RPMI-1640 5 ML을 혼합하여 RPMI-PLGH을 준비 페니실린 - 스트렙토 마이신, L-글루타민, 그리고 HEPES 솔루션의 각. </li><li> 10% 태아 소 혈청 (FBS)와 RPMI-PLGH을 혼합하여 R10 솔루션을 준비합니다. FBS는 또한 30 분에 대한 ° C 이전 56에서 열 inactivated입니다. </li><li> 37 번 프리 따뜻한 ° C RPMI-PLGH, 멸균 원추형 튜브의 R10 15 PBS의 ML, 15 ML 50 ML. </li><li> PDMS의 nanowells의 배열의 제조 : 실리콘 마스터는 석판 술 본질적으로 이전 10 설명을 사용하여 제조된다. 철저하게 플라스틱 칼을 사용하여 Sylgard 184 엘라스토머 키트베이스와 일회용 컵에 10시 1분 체중의 비율로 경화 에이전트를 섞는다. 1 시간의 진공 챔버에서 가스를 제거하다의 혼합물. , nanowell 배열에 혼합물을 부어 유리 슬라이드로 밀봉하고 30 분에 앉아 보자. ° C 2 시간 80로 설정 오븐에 어셈블리를 전송하고 1 시간 동안 실온에서 시원한 보자. 엘라스토머는 현재 것이다이 기간과 의지의 유리 슬라이드에 결합시 전자. PDMS nanowell 배열을 포함하는 유리 슬라이드는 신중하게 스카치 테이프로 덮여와 미래의 사용까지 저장, 실리콘 마스터를 해제됩니다. </li></ol> 2. 대상 셀 (T) 라벨링 <ol><li> 5 분에 340 XG에서 원심 분리하여 살균 15 ML 원뿔 튜브에 hemocytometer 및 펠렛 세포를 사용하여 세포 배양에서 5,000,000 대상 셀을 계산합니다. 세포 배양은 5 ML 총 볼륨 (밀도 = 1,000,000 / ML)에 전날 분할 및 T-25 플라스크 (VWR)에서 배양되어 있습니다. hemocytometer를 사용하여 셀 계산을위한 프로토콜은 이전에 11에 자세히 설명되어 </li><li> 미디어의 약 50 μl을 남기지 초과 미디어를 대기음. </li><li> (최종 농도 2.5 μM) 150 μl RPMI-PLGH에 0.5 μl CTR 재고 (1 MM)를 혼합하여 셀 추적 레드 (CTR)의 작업 솔루션을 준비합니다. 대상 셀에 작업 솔루션 150 μl를 추가하고 P200의 피펫을 사용하여 철저하게 섞는다.반면, PKH 26 (2 μm의 최종 농도) 제조업체의 지시에 따라 라벨을 대상 셀을 사용할 수 있습니다. </li><li> 20 분에 37 ° C / 5% CO 2 품다. </li></ol> 3. 효과기 (E) 셀 라벨링 <ol><li> 5 분에 340 XG에서 원심 분리하여 살균 15 ML 원뿔 튜브에 hemacytometer 및 펠렛 세포를 사용하여 세포 배양에서 5,000,000 효과기 세포를 계산합니다. </li><li> 초과 미디어를 대기음 </li><li> R10 미디어 1 ML (5 μm의 최종 농도)에 5 밀리미터 Vybrant 바이올렛 주식 1 μl를 추가하여 Vybrant DyeCycleViolet 얼룩 솔루션의 작동 솔루션을 준비합니다. 셀에 작업 솔루션을 추가하고 P200 피펫을 사용하여 resuspend. 반면, PKH 67 (2 μm의 최종 농도) 제조업체의 지시에 따라 라벨을 대상 셀을 사용할 수 있습니다. PKH 67를 사용하는 경우이 동일한 형광 채널에 있기 때문에 다음 SYTOX 그린은 사용할 수 없습니다. apoptotic 대상의 열거는 독점적를 사용하여 수행됩니다이 경우 nnexinV의 착색. 참고 : 시간 경과가 아닌 엔드 포인트 측정을 수행하는 경우, Vybrant 누나 같은 UV 염료는 피해야한다. </li><li> 20 분에 37 ° C / 5% CO 2 품다. </li></ol> 4. 밀도 기울기를 사용하여 라이브와 죽은 세포의 분리 <ol><li> 각각 대상과 효과기 세포에 6.8 ML 및 RPMI-PLGH의 6.0 ML를 추가하고 부드럽게 등을 아래로 pipetting하여 섞는다. </li><li> FICOLL - Paque 플러스 목표와 효과기 세포를 포함하는 각 원뿔 튜브의 하단까지의 레이어 3.5 ML. 레이어 FICOLL 천천히 FICOLL와 미디어 사이의 층을 잘 형성을 보장합니다. </li><li> 30 분에 340 XG에 두 튜브를 원심 분리기. 노 브레이크 및 가속을 갖추고 있습니다. </li><li> 원심 분리하는 동안 4도 판에 사전 예열 PBS 7 ML을 전송하기 만하면됩니다. nanowell 배열 (PDMS에 가공) 준비 : 에탄올과 유리 슬라이드의 깨끗한 바닥을 1 분 동안 플라즈마 산회 제를 사용하여 높은 R​​F 설정에서 PDMS를 산화. 이 단계는 아닌지 것또한 친수성 ​​PDMS를 렌더링하는 동안 nanowell 배열을 rilize. 즉시 PBS를 포함하는 판에 nanowell 배열을 이동합니다. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛에 판을 송금 초과 PBS를 대기음. 30-45 초 다음은 10 ML DI 물과 전자 레인지가 그에 100 MG 한천 가루를 추가로 10 ML 1% 고귀한 한천을 만듭니다. 배열을 고정하고 더욱 강화하기 위해 한천 10 분을 기다려야하는 nanowell 배열을 포함하고 유리 슬라이드의 상단과 하단 가장자리에서 1 % 귀족 한천을 따뜻하게 적용합니다. 3 ML PBS 및 기음 초과 한천을 추가합니다. </li><li> nanowell 배열의 상단에 R10의 3 ML을 추가하고 ~ 10 분 동안 평형을 보자. </li><li> 원심 분리를 FICOLL 이후에, 각 튜브의 상단 층에서 5 ML 미디어를 대기음. 세포를 포함하는 레이어를 대기음하지 않도록주의하십시오. </li><li> P1, 000 피펫과 새로운 멸균 원뿔 튜브로 이동이있는 FICOLL과 미디어 사이의 레이어 1-2 ML을 복구하여 세포를 (흰색 레이어) 수확. 그게 당신 맥심 확인하는 동안 세포의 두 세트에 대해이 단계를 반복복구 세포를이지는. </li><li> 전체 가속 및 브레이크를 5 분에 340 XG에서 원심 분리하여 pipetting과 펠릿의 각 튜브, 혼합에 사전 예열 RPMI-PLGH 3 ML을 추가합니다. </li><li> 초과 미디어를 대기음, 각 튜브에 사전 예열 RPMI-PLGH 5 ML을 추가하고 5 분에 340 XG에서 원심 분리를 반복합니다. </li><li> 초과 미디어를 기음과 R10 500 μl의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> hemacytometer에 Trypan 파랑 제외 방법을 사용하여 라이브 셀을 계산합니다. </li></ol> 5. Nanowell 배열로 셀 로딩 <ol><li> nanowell 배열에서 초과 미디어를 기음과 배열에 걸쳐 신선한 R10의 2 ML를 추가합니다. nanowell 배열의 맨 그것이 세포의 분포에 영향을 미칠 것이기 때문에 너무 무리 / 건조되지 않았는지 확인하는 동안 다시 대기음. </li><li> nanowell 어레이 표면에 R10 200 μl에 보증금 1 개 10 5 효과기 세포 (밀도 = 5 × 10 5 세포 / ML). </li><li> 세포가 5 분에 정착, 실내에 표준 조직 문화 현미경 검사를 사용하자세포의 분포가 바람직하다 있는지 확인합니다. 필요한 경우 더 많은 셀을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 보증금 1 개 10 nanowell 어레이 표면에 200 μl R10 5 대상 세포 (밀도 = 5 × 10 5 세포 / ML). </li><li> 세포가 5 분 및 세포의 분포가 바람직하다 수 있도록 표준 조직 문화 현미경 검사를 사용하기위한 해결하자. 필요한 경우 더 많은 셀을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 2 ML R10 및 기음 초과 미디어와주의 깊게 nanowell 배열을 씻어. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브를 멸균에서 3 ML 미리 예열 R10를 준비합니다. 얼룩 0.5mM SYTOX 그린 핵산 3 μl (최종 농도 0.5 μM) 및 작업 솔루션을 준비하는 Annexin V-알렉사 형석 647의 60 μl를 추가합니다. 세포가 우물에서 변위되지 않도록하는 동안주의 깊게 4도 판로 작업 솔루션을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 15 분에 37 ° C / 5% CO 2 품다. </li></ol> 6. 영상 1 <ol><li> 형광 micr를 사용하여 nanowell 배열의 이미지를 취득oscope :이 예제에서, 우리는 동력 무대와 람다-DG4을 갖추고 Z-1 현미경 ZEISS의 옵저버를 사용합니다. </li><li> 소프트웨어 및 현미경을 초기화하고 전송 빛과 다른 형광 채널에 신호 강도를 확인합니다. 전반적으로,에 대응하는 다섯 채널을있을 것입니다 : 전송 빛, Annexin V-647 (Cy5 필터), CTR (DsRed 필터), SYTOX 녹색 (FITC 필터) 및 Vybrant 바이올렛 (DAPI 필터). 이 채도를 피하는 동안 소음에 최대 신호를 보장하기 위해 설정 현미경 있는지 확인합니다. </li><li> X와 nanowell 배열에 대한 Y 위치를 설정합니다. 제로 위치를 설정하고 nanowell 배열 스탬프의 왼쪽 상단 모서리에 7 X 7 nanowell 배열 블록의 중심에 초점을 초기화하여 과정을 시작합니다. 정확하게 각 블록에 포커스를 반영하기 위해 각 블록의 센터와 Z-값으로 일치 할 수있는 X, Y 위치를 설정합니다. </li><li> 위치 및 초점 준비되면, 선형 모드에서 이미지 획득을 설정하고 이미지를 획득해야합니다. <s&gt; 참고 trong : 현미경의 보육과 CO 2에 필요한 회전 적어도 30 분 실험 전에합니다. </li></ol> 7. 후 영상 6 시간을위한 인큐베이터 (37 ° C / 5퍼센트 CO 2)로 nanowell 배열을 포함하는 4 잘 판을 전송합니다. 8. 영상이 6 단계에서 설명한대로 시간이 지점 두 번째에서 이미지를 획득. 9. 이미지 분석 <ol><li> nanowells 내에서 세포의 수용 인원은 적절한 이미지 분할 프로그램 사용 (예 : ImageJ에 의해 결정됩니다 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) 기본적으로 이전에 9,12 설명했다. </li><li> 현미경 이미지 (t = 0 시간, t 0)의 초기 집합의 분석은 정확히 하나의 라이브 대상 셀을 (식별이 포함 된 개인 nanowells의 데이터베이스를 생성하는 데 사용됩니다로 레드 CellTracker, 빨간색)없이 죽은 세포 (Annexin V의 착색에 의해 식별, 녹색) [T1t 0 nanowells]. </li><li> 현미경 이미지 (t = 6 시간, t 6)의 두 번째 세트의 분석. 독립적 한 대상 셀 (빨간색) [T1t 6 nanowells]를 포함하는 nanowells의 두 번째 데이터베이스를 결정하는 데 사용됩니다 무결성 검사 (데이터베이스 쿼리)는 t 0의 모든 라이브 타겟이 일치하는 타겟의 최종 세트를 (T1t 0 T1match로 지정 = T1t 6 있습니다 nanowells로 구현) 생산 t 6에서 목표에 일치되는 것을 보장하기 위해 구현됩니다 </li><li> nanowells의 이펙터 세포의 수는 t 0 [E1 nanowells]에 Vybrant 보라 착색을 사용하여 결정됩니다 </li><li> 데이터베이스 쿼리는 (E1T1로 지정된 E1 및 T1 경기를 nanowells으로 정의), 하나의 목표로 공동 incubated 하나 effectors를 포함하는 nanowells를 식별하는 구현 </li><li> 이펙터 유도 apoptosis는 내가이 점수는<html> t 0과 긍정적 인 Annexin V t 4에 (t 6에서 Annexin V 대상 착색과 E1T1)에서 제외 Annexin V 아르 목표를 dentifying. </li></ol> 10. 니콘의 BioStation IM을 사용하여 살인의 선택 시간 경과 영상 <ol><li> coverslip 바닥과 페트리 접시를 타고 정확히 coverslip에 맞게됩니다 nanowell 배열 칩의 작은 조각을 (5 단계에서 작성) 잘라. 깍 칩이 젖었 유지 있는지 확인하십시오. </li><li> 믹스 1 개 10 6 목표 및 100 μl 미디어 1 개 10 6 T 세포, 그리고 coverslip에 그것을 피펫. </li><li> 15-30 분 정도의 세포가 정착하게 할 수 있습니다. </li><li> 신속 작은 nanowell 어레이 칩을 반전하고 coverslip에 배치. </li><li> 칩이 칩의 상단에 이미지, 장소 중에 하나 또는 두 개의 20mm X 20mm coverslips을 이동할 수 없습니다되도록하기 위해. 요리의 맨 아래에있는 칩을 밀어 부드럽게 압력을 적용합니다. </li></ol>십t &quot;&gt; 참고 : nanowell 어레이 칩의 바닥 고해상도 영상에 비해 너무 두꺼운이므로 뒤집어졌다되어야이 동안, 세포의 많은 쓸려있는이 단계 9.2에서 쉽게 제어, 세포 숫자가 될 수 없기 때문에.. 및 단계 9.3에서 부화 시간은 최적화해야합니다.

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 nanowells의 배열 (그림 1) effectors 및 대상의 공동 배양을 통해 활성화 높은 처리량 단일 셀 cytolytic 분석을위한 프로토콜을 설명하고 있습니다. 처리량뿐만 아니라 기술의 주요 장점은 결과적으로 대상 셀과 autologous 또는 기본 / 검색 종양 세포의 사용을 허용 대상 세포 공학 필요없이 원하는 대상 세포에 대한 이펙터로 인한 세포 독성을 모니터링 할 수있는 기능입니다. 공간 제한은 검정 9 끝의 검색 및 기능 T 세포의 후속 복제 할 수 있습니다. 분석의 한계는 자동화 단계와 빠른 스위칭 광학있는 전문 현미경이 필요합니다. 이 그러나이 기계는 지금​​ 연구 핵심 시설의 일환으로 널리 사용할 수 있습니다 점을 감안할 때 심각한 제한이 없습니다. 높은 처리량을 제공합니다 흐름 세포 계측법 기반 assays의 다양한 방법이 있지만 preservi단일 셀 해상도 것이다. 이러한 effectors...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> RPMI-1천6백40와트 / O L-글루타민 </td><td> Cellgro </td><td> 15-040 - CV </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Cellgro </td><td> 30-002 - CI </td><td> 10,000 IU 페니실린 10,000 μg / ML 스트렙토 마이신 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Cellgro </td><td> 25-005 - CI </td><td> 200 MM 솔루션 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> H3537 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11150 </td><td> 롯 테스트 </td></tr><tr><td> 셀 추적기 레드 청바지 </td><td> Invitrogen </td><td> C34552 </td><td> 50 μg </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle이 있었던 청바지 </td><td> Invitrogen </td><td> V35003 </td><td> 5 MM </td></tr><tr><td> SYTOX 녹색 핵산의 산 얼룩 </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td> 5 MM </td></tr><tr><td> Annexin V-알렉사 형석 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A23204 </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td> Dulbecco의 PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 - CV </td><td> 500 ML </td></tr><tr><td> 귀족 한천 </td><td> DIFCO </td><td> 2M220 </td><td> 100g </td></tr><tr><td> Trypan 블루 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> T8154 </td><td> 0.4 % 액체, 무균 여과 </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser Scientifics </td><td> 1492 </td><td> 밝은 라인 </td></tr><tr><td> 4 잘 판 </td><td> 온도 피셔 </td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrick 플라즈마 클리너 </td><td> Harrick 플라즈마 </td><td> PDC-32G </td><td> 기본 플라즈마 청소기 </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><tD&gt; </td><td> 형광 현미경 (아래의 세 부분으로 작동) </td></tr><tr><td> 람다 10-3 </td><td> 셔터 악기 </td><td></td><td> 필터 컨트롤러 </td></tr><tr><td> 람다 DG-4 </td><td> 셔터 악기 </td><td></td><td> 초 고속 파장 스위처 </td></tr><tr><td> 하마 마츠 EM-CCD 카메라 </td><td> 하마 마츠 </td><td> C9100-13 </td><td> CCD - 현미경 카메라 </td></tr><tr><td> 15 ML 원뿔 관 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML 원뿔 관 </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> 니콘 Biostation </td><td> 니콘 인스트루먼트 주식회사 </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> 유리 바닥 문화 요리 </td><td> MatTek 공사 </td><td> P35G-0 </td><td> 35mm 페트리 접시, 10mm microwell </td></tr></tbody></table>

t 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

암 immunotherapy는 종양을 타겟팅하고 제거하는 면역 반응의 특이성을 활용 할 수 있습니다. 유전자 키메라 항원 수용체 (자동차)을 표현하도록 수정 T 세포의 입양 전송을 기반으로 입양 세포 치료 (ACT)는 임상 실험 1-4에서 상당한 약속을 보여 주었다. 이 자동차를 사용하여 + T 세포 비 MHC 제한 항원을 타겟팅하고 호스트에서 추적 및 지속성 최적의 생존을위한 T 세포를 functionalize 할 수있는 능력을 포함 암의 치료를 위해 다음과 같은 여러 장점이 있습니다, 그리고 마지막으로 자동차의 apoptosis를 유도하기 + 호스트 독성 (5)의 경우에 T 세포. 자동차의 최적의 기능을 Delineating + 임상 이익과 관련된 T 세포가 임상 시험의 다음 세대를 디자인하는 것이 필수적입니다. multiphoton 현미경 같은 라이브 동물 이미징의 최근 발전 면역 세포 기능의 연구를 혁신 한 전N 생체 6,7. 이 연구 생체, 임상 실험에서 T-세포 기반 ACT에서 T-세포 기능의 우리의 이해를 전진했지만에 활용하여, 사전에 주입 임상 효능 후 주입와 T-세포 준비의 분자 및 기능 기능을 연결 할 필요가 필요합니다 세포 독성 및 시토 킨 분비, 같은 T-세포 기능을 모니터링 체외 assays. 표준 흐름 세포 계측법 기반 assays은 단일 셀 수준의 T 세포 인구의 전반적인 기능을 결정하지만, 이러한 공액 형성과 수명 또는 여러 대상에게 8 죽일 같은 세포의 기능을 모니터링에 적합하지 않다고 개발되었습니다. polydimethylsiloxane (PDMS) 등의 biocompatible 폴리머로 설계 Microfabricated 배열 spatially effectors 작은 볼륨 9 대상을 한정 할 수있는 특히 매력적인 방법입니다. 자동 시간 경과 형광 현미경, tho와 함께효과기 - 대상의 상호 작용 usands은 nanowell 배열의 이미징 개인 우물에서 동시에 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 여기서 크게 T 세포의 cytolytic 기능을 공부에 적용 할 수있는 단일 셀 레벨에서 T-세포 매개의 세포 독성을 모니터링하기위한 높은 처리량 방법론을 제시한다.

높은 처리량 cytolytic 분석의 응용의 예는 그림 2에 보여 있습니다. 간단히, CD19 별 CAR 표시 + T 세포는 nanowell 배열의 각 우물 (제 1-5)에 표시된 마우스 EL4 대상 세포와 공동 incubated되었습니다. 초기 이미지는 배열 (제 6 항)에 하나 하나 nanowell의 수용 인원을 (effectors 및 / 또는 타겟) 식별하기 위해 자동 형광 현미경에 기록되었습니다. 이미지 처리는 정확히 하나의 대상과 하나의 이펙터를 포함하는 모든 nanowells을 확인하고 죽은 대상 (제 9) 포함 nanowells를 제외하는 데 사용되었다. 이 칩은 6h에 대한 보육에 전송 된 후 칩의 두 번째 이미지는 (제 7-8) 기록되었다. 대상 셀의 apoptosis를 유도하는 이펙터의 기능은 정확히 하나의 이펙터 한 목표를 포함 nanowells에서 Annexin V와 얼룩에 의해 측정되었다. 두 개의 평행 한 실험은 같은 effectors와 두 세트의 O를...

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

이 실험 시스템은 단일 세포 수준에서 T 세포 매개 세포 독성을 모니터링하기 위한 고처리량 방법론을 제공합니다. 먼저, effector T 세포와 종양 표적 세포를 형광 염료 사멸로 표시합니다. 두 세포 유형을 모두 나노 웰 어레이에 로드하고 전체 칩을 cyt green 및 형광 표지된 nexin을 포함하는 배지에 담그십시오. 5.괴사성 세포와 세포사멸 세포를 모두 식별하기 위해 이제 초기 사전 이미지를 기록하여 분석 시작 시 유정 점유율과 세포 생존율을 결정합니다. 6시간의 배양 후 두 번째 이미지를 기록합니다. 그런 다음 자동 이미지 분석을 사용하여 자동차 양성 T 세포에 의한 EL 4 CD 19 양성의 항원 특이적 용해를 정량화합니다.이 고처리량 분석법에서 얻은 결과는 사이톡신(cytoxin)을 사용한 양성 염색을 기반으로 효과기 세포에 의한 표적의 항원 특이적 용해를 스크리닝할 수 있습니다. 5. 크롬 51 방출 분석과 같은 기존 방법에 비해이 기술의 주요 장점은 진정한 일대일 효과적인 표적 상호 작용을 달성 할 수 있고 위성 주파수를 측정 할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 자가 세포 치료에서 효능의 상관 관계를 연구 할 수 있기 때문에 암 치료법으로 확장됩니다 실리콘 마스터를 사용하여 나노 웰을 제조하려면 먼저 시가 180 4 엘라스토머 키트베이스와 경화제를 철저히 혼합합니다. 플라스틱 칼을 사용하여 일회용 컵에 10:1 무게 비율. 진공 챔버에서 혼합물을 1시간 동안 가스를 제거합니다.그런 다음 혼합물을 실리콘 마스터에 붓고 30분 동안 그대로 두십시오. 이제 엘라스토머를 경화시키기 위해 실온에서 한 시간 동안 냉각한 후 섭씨 80도의 오븐에서 어셈블리를 2시간 동안 가열합니다. 실리콘 마스터에서 PDMS 나노 웰 어레이를 조심스럽게 제거합니다.실험 통과 하루 전까지 스카치 테이프로 덮으십시오.5 밀리리터에 500 만 개의 표적 세포를 사용하십시오. 실험 당일. 멸균 15ml 원뿔형 튜브에 500만 개의 세포를 340Gs에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다.세포를 라벨링하기 위해 약 50마이크로리터의 배지를 남기고 과도한 배지를 흡입합니다. 150마이크로리터의 fresh cell tracker red working solution을 추가하고 P 200 피펫을 사용하여 섭씨 37도에서 20분 동안 5%이산화탄소와 함께 완전히 혼합합니다. 혈구 분석기를 사용하여 배양에서 수확한 effector 세포를 열거합니다.그런 다음 원심분리를 통해 멸균 15ml 원뿔형 튜브에 500만 개의 세포를 펠릿화합니다. 초과 매체를 흡입합니다. 그런 다음 P 200 피펫을 사용하여 5마이크로몰의 새로운 작업 용액, 생생한 D 사이클, 바이올렛 염색 및 서스펜션 복원을 추가합니다.세포를 배양하고 섭씨 37도에서 20분 동안 6.8ml의 5%이산화탄소와 6.0mL의 R-P-M-I-P-L-G-H를 각각 표적 세포와 효과기 세포에 넣고 피펫팅으로 혼합합니다. 다음 천천히 각 관의 바닥에 플러스 fial 팩의 3.5 밀리리터를 층을 이루고, 원심분리 도중 틈 그리고 가속도 없이 30 분 동안 340 GS에 두 관 다 원심분리하고, 4개의 좋은 판으로 나노 우물 배열 첫번째 이동 전 PBS의 7 밀리리터를 준비합니다. 플라즈마 산화제를 사용하여 유리 슬라이드의 바닥을 에탄올로 청소합니다.PDMS를 높은 RF 설정에서 30-45초 동안 처리합니다. 그런 다음 어레이를 PBS에 배치합니다. 플레이트를 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 초과 PBS를 흡인하고 유리 슬라이드의 상단 및 하단 가장자리에 따뜻한 1% 고귀한 한천을 적용하여 어레이를 고정합니다.PBS 3밀리리터에서 10분 후에 PDMS를 건조시키지 말고 과도한 한천을 흡인하십시오. 그런 다음 나노 웰 어레이 상단에 R 10 3 밀리리터를 추가하고 약 10 분 동안 평형을 이룹니다. Fial 원심분리 후 각 튜브의 최상층에서 5ml의 매체를 흡입합니다.P 1000 피펫으로 세포가 포함된 층을 흡인하지 않도록 주의하십시오. fial과 배지 사이의 흰색 세포층을 수확합니다. 세포를 새로운 멸균 원추형 튜브로 옮깁니다.이제 수확된 효과기와 표적 세포를 전쟁 전 R-P-M-I-P-L-G-H 3밀리리터로 두 번 세척합니다. 최종 원심분리 후 과잉 배지를 흡입하고 세포 펠릿을 재현탁합니다. 500 마이크로리터의 R 10에서 혈구 분석기에서 trian blue exclusion 방법을 사용하여 생존 가능한 세포를 계수하고 나노 의지 배열의 초과 배지를 흡입합니다.그런 다음 새 R 10 흡입 2ml를 추가합니다. 다시 말하지만, 나노 의지 어레이의 상단이 너무 젖거나 너무 건조하지 않은지 확인하는 것은 세포의 분포에 영향을 미치기 때문입니다. 이제 200 마이크로 리터의 R 10에 5 분의 1을 증착하여 나노 배열 표면에 세포가 5 분 동안 정착 할 수 있도록합니다.그런 다음 표준 조직 배양 현미경을 사용하여 세포의 원하는 분포를 확인합니다. 다음으로, 200 마이크로리터의 R 10 중의 다섯 번째 표적 세포에 10배를 1배씩 증착하고, 효과기 세포를 포함하는 나노 웰 어레이 표면 상에 증착한다. 5분 후, 현미경으로 세포 분포를 평가합니다.그런 다음 나노 웰 어레이를 2ml의 R 10으로 조심스럽게 헹구고 별도의 멸균 15ml 원추형 튜브에서 초과 매체를 흡입합니다. 3 마이크로리터의 0.5 밀리몰 시트, 녹색 핵산 염색 및 60 마이크로리터의 X를 피펫팅으로 철저히 혼합하여 예열 R 10 3 밀리리터를 피펫팅합니다. 지금 4개의 우물 판에 얼룩 해결책을 온화하게 피펫으로 쌈다, 세포가 37 섭씨 온도에 15 분 동안 배양하는 우물에서 전치되지 않다는 것을 확인하거든, 5%carbon 취득한다 자동화한 단계 및 Lambda DG 4 장비된 zes 관찰자 Z 1 현미경 같이 형광 현미경을 사용하여 nano 우물 배열의 심상을 취득한다.소프트웨어와 현미경을 초기화합니다. 투과광과 다른 형광 채널의 신호 강도를 확인하십시오. 포화를 피하면서 최대 신호 대 잡음을 보장하도록 현미경 설정을 조정합니다.이제 nelle 배열의 x 및 Y 위치 목록을 엽니다. XY 0 위치를 설정하고 nelle 배열 스탬프의 왼쪽 상단 모서리에 있는 7 x 7 nelle 배열 블록의 중심에 초점을 0으로 설정합니다. 각 블록의 중심과 일치하도록 XY 위치를 설정하고 각 블록의 초점을 정확하게 반영하도록 Z 값을 설정합니다.이제 이미지 획득을 선형 모드로 설정하고 이미지를 획득합니다. 첫 번째 이미징 시리즈 후 나노 웰 어레이를 6시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 교반을 잘 관리하면 세포 이동으로 이어질 수 있습니다.그런 다음 두 번째 시점에서 이미지 획득을 반복합니다. 이 고처리량 세포 용해 분석법은 항원 특이적 용해로 표지된 CD 19 특정 CAR 양성 T 세포의 빈도를 나노 L 어레이의 개별 웰에서 표지된 마우스 EL 4개의 표적 세포와 함께 공동 배양했습니다. 타겟 세포 히스토그램 플롯은 단일 effector cell과 단일 target cell을 포함하는 well을 나타냅니다.6시간의 공동 배양 후, 효과기가 없는 표적 세포의 일치하는 히스토그램을 음성 대조군으로 사용하여 배경 세포 사멸 빈도를 보고했습니다. 2 내지 4% 범위의 비특이적 용해의 저주파를 달성하는 것이 바람직합니다.나노 웰 어레이는 효과기, 표적 접합 및 후속 세포 사멸을 관찰할 수 있도록 타임 랩스 이미징에 적용할 수 있습니다. 여기서, 표지되지 않은 자동차 양성 T 세포를 NOL에서 NA LM 6 GFP 타겟 세포와 함께 공동 배양하고 동적 모니터링을 수행했습니다.Xin five가 배양 배지에 추가되었을 때, apoptotic cells는 Once mastered라는 빨간색 라벨을 붙였습니다. 이 기술은 이 절차에 따라 10-12시간 내에 적절하게 수행할 수 있습니다. 마이크로 그래빙(micro grabbing)과 같은 다른 방법은 세포의 사이토카인 분비 프로파일을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

크롬 출시 분석, 세포 독성 T 세포의 활동을 검출하기위한 일반적인 분석은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 본 문서에서, 항원 특이 CD8 T 세포와 인간의 유방암 종양 라인 SKBR3를 사용하여 임피던스 기반의 접근 방식은 세포의 살해를 감지하는 기능에 대해 조사 하였다.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

이 비디오는 실시간 전기 임피던스 측정을 통해 암세포에 대한 CAR T 세포 활성을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 임피던스의 변화를 추적하면 암세포 세포 용해를 유도하는 CAR T 세포의 효과를 평가하여 세포 독성 능력에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

CAR T 세포의 효능을 평가하기 위한 실시간 체외 세포분해 분석

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 형광 현미경 및 자동화 된 화상 처리와 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발 된 세포 독성 분석이다. 여기서, 우리는 항 CD20 항체로 처리 림프종 세포가 세포 독성 정량적 분석을 제공하는 인간 전혈에서 실시간 분석 할 수있는 방법을 설명한다.

인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

우리는 액체 및 고체 종양 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포의 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포분석 시스템을 정량적으로 실시간으로 기술한다. 이 프로토콜은 다른 면역 이펙터 세포뿐만 아니라 조합 치료를 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

단일 종양 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 Jurkat 세포에 의한 정량적 종양 세포 사멸을 평가하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 말초 혈액 유래 T 세포에서 확인하기 전에 CAR hinge 구조를 신속하게 최적화하기 위한 스크리닝 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

형광 이미징을 사용한 Jurkat 발현 키메라 항원 수용체의 신속한 체외 세포 독성 평가

이 프로토콜은 암 면역 요법을 위한 비통합 mRNA를 사용하여 일시적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 자세한 절차를 설명하고 CAR-T 세포 및 세포 독성 기능을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

암 면역 요법을 위해 mRNA를 사용하여 일시적인 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하는 비바이러스 접근법

여기에서는 단일 세포 수준에서 세포 사멸을 조사하기 위해 하나의 T 세포와 암 표적 세포를 캡슐화하는 이중 에멀젼 방울을 만드는 방법을 설명합니다. 이 방법은 많은 T 세포 집단 내에서 세포독성 분자와 표적 세포 사멸을 모두 이중 정량화할 수 있습니다.

단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 T 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석

학습하세요 고처리량 단일 세포 수준에서 T 세포 세포독성을 측정하는 방법을. 나노웰 어레이와 형광 현미경을 활용하여 종양 표적 세포에 대한 면역 반응을 정밀 분석하고 암 면역치료 연구에 활용할 수 있습니다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

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