퇴행성 관상 재관류에 의한 돼지 심장의 Decellularization 절차

이 절차의 전반적인 목표는 역행성 증식을 통해 온전한 돼지 심장에서 세포 성분을 빠르고 완전하게 제거하여 부위 특이적 심장 세포외 기질 골격을 생성하는 것입니다. 이것은 온전한 돼지 심장의 대동맥인 캐뉼러팅(cannulating)을 통해 이루어집니다. 다음으로 튜브를 연동 펌프에 부착하고 조직을 낮은 유속으로 물과 소금 용액으로 세척합니다.

그런 다음 심장에 일련의 세제와 효소 용액을 점차적으로 증가시키는 유속으로 관류하여 세포 성분을 제거합니다. 마지막 단계는 소독액을 관류하는 것입니다. 튜브를 제거하고 처리를 위해 심실 벽을 잘라냅니다.

최종적으로 심장을 분석하여 조직에서 세포 및 핵 물질이 완전히 제거되었는지 확인합니다. 튜브의 정확한 위치가 실험 성공의 열쇠이기 때문에 캐뉼레이션 및 초기 풍량 단계를 배우기가 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 돼지 장기는 안락사 직후 도살장이나 연구 시설에서 얻습니다.

먼저 과도한 피를 헹굽니다. 다음으로, 심방과 대동맥을 그대로 유지하면서 과도한 지방과 조직의 심장을 잘라냅니다. 추가적인 지방을 제거하여 폐동맥과 대동맥을 분리하십시오.

다듬은 후에는 각 심장을 냉동고로 개별적으로 싸서 영하 80도에서 최소 24시간 동안 보관하여 완전히 얼립니다. 사용할 준비가 되면 1형 물을 채운 4리터 비커에 심장을 담가 심장을 해동하고 밤새 섭씨 4도로 두십시오. 심장이 완전히 해동된 후 패드를 덧대어 말리고 무게를 기록합니다.

시판 체중 돼지의 심장 무게는 약 375-450g입니다. 심장이 준비되면 크기 18 마스터 플렉스 튜빙을 미늘 감속기의 1/4인치 끝에 연결합니다. 다음으로, 미늘 감속기와 튜브를 대동맥 내부에 삽입합니다.

두 개의 호스 cl을 놓습니다.amps 또는 상완두형성 몸통 바로 아래의 대동맥 주위에 지퍼 타이를 고정합니다. 감속기와 튜브는 관상동맥이 관류될 수 있도록 대동맥 판막 위에 있어야 합니다. 다음으로, 주사기를 사용하여 튜브에 1형 물을 채우고 대략적인 중간 지점에서 마스터 플렉스 롤러 펌프의 카트리지에 삽입합니다.

다음으로, 2.5리터의 물을 채운 비이커 바닥에 심장과 함께 튜브의 유입 끝을 담그고 고정합니다. 이 절차의 가장 어려운 측면은 심장의 적절한 캐뉼레이션과 절차 전반에 걸쳐 적절한 펌프 속도를 유지하는 것입니다. 우리는 시술 전반에 걸쳐 조직에 기포가 있는지 육안으로 검사하고 시술 전반에 걸쳐 심실에서 적절한 삼출액을 유지함으로써 실험의 성공을 보장합니다.

펌프를 프라이밍하여 튜브에서 기포를 제거하고, 기포가 관찰되면 대동맥과 튜브 주변의 추가 타이를 재배치하거나 고정합니다. 기밀 밀봉은 탈세포화 과정에서 적절한 압력을 유지하는 데 중요합니다. 이 시점에서 탈세포화 과정을 준비하기 위해 3리터의 소금 균형 트립신 용액이 들어 있는 4리터 비커를 데웁니다.

먼저 펌프를 분당 400밀리리터의 유속으로 설정하고 올바른 튜빙 크기가 선택되었는지 확인하십시오. 펌프를 시작하고 15-25분 동안 1형 물로 심장을 씻어내고, 심장이 부풀어 오르고 심실에서 혈액이 확산되어야 하며, 5-10분마다 또는 필요에 따라 신선한 용액으로 교체해야 합니다. 혈액을 제거한 후 펌프를 멈추고 두 개의 XPBS로 채워진 별도의 비커로 심장을 옮깁니다.

튜브를 담그십시오. 유속을 분당 700밀리리터로 높이고 펌프를 시동합니다. 심장을 용액에 15분 동안 그대로 두고, 5분마다 용액을 교체합니다.

준비가 되면 심장을 1형 물로 10분 동안 옮기고 유속을 분당 750밀리리터로 높입니다. 탈세포화 과정을 시작하려면 따뜻한 소금 균형 트리인 용액이 들어 있는 비커로 심장을 옮깁니다. 속도를 분당 1200밀리리터로 높이고 펌프를 시동하십시오.

혈액 순환을 위해 비커 바닥에 교반 막대를 놓고 심장을 이 용액에 3시간 동안 그대로 두십시오. 관류 속도를 천천히 증가시켜 조직을 컨디셔닝하고 혈관의 파열을 방지합니다. 1시간 후 펌프 속도를 분당 1500밀리리터로 높입니다.

한 시간이 더 지나면 펌프 속도가 분당 1800밀리리터로 증가합니다. 심장이 부풀어 오르고 크기가 거의 두 배로 커져야 합니다. 조직은 심방에서 정점으로 진행하면서 자연스러운 색을 잃어야 합니다.

각 용액 관류 후 세포 파편, 화학 잔류물을 제거하고 세포 용해를 돕기 위해 2단계 헹굼을 수행합니다.염 균형 트립 및 용액 후 분당 1900밀리리터로 물을 관류한 다음 각각 10분 동안 분당 1950밀리리터로 두 번의 XPBS를 관류합니다. 다음으로, 심장을 Triton X 100의 실온 소금 밸런스 용액으로 옮깁니다. 펌프 속도를 분당 2000밀리리터로 높이고 1시간 동안 관류합니다.

새 용액으로 다시 채운 후 펌프 속도를 분당 2100밀리리터로 높이고 추가로 1시간 30분 동안 관류합니다. 다음으로, 앞에서 설명한 대로 조직을 헹굽되 펌프 속도를 높입니다. 다음 관류는 실온 4% 나트륨 데옥시 코팅을 사용하는 것입니다.

펌프 속도를 분당 2200밀리리터로 높이고 3시간 동안 관류합니다. 3시간 후 헹굼 단계를 반복하고 각 용액에 대해 5분에서 10분 후에 용액을 변경합니다. 최종 관류 후 심장을 0.1% 파라세트산, 4% 에탄올 용액으로 옮기고 동일한 펌프 속도로 분당 2200밀리리터로 1.5시간 동안 관류하고 15분 동안 1개의 XPBS로 조직을 관류한 다음 1형 물에서 5분 동안 두 번 세척합니다.

용액 관류 절차를 완료하기 위해 한 번 더 반복하고 펌프를 끄고 용액에서 심장을 제거합니다. 대동맥에서 끈을 끊습니다. 모든 튜브를 제거하고 빈 비커에 심장을 넣어 1시간 동안 물을 빼냅니다.

1시간 후에 주기적으로 과도한 액체를 제거하십시오. 더 멀리 배출하기 위해 흡수 패드에 심장을 놓습니다. 수분을 대부분 제거한 후 심장의 최종 무게를 기록합니다.

심장은 탈세포화 과정에서 초기 체중의 약 20-25%를 감량할 수 있습니다. 이 과정이 끝나면 심장이 하얗거나 반투명하게 보여야 하는데, 이는 세포 물질이 손실되었음을 나타냅니다. 다음으로, 심실 중격과 좌심실을 분리하여 DNA를 위해 예약합니다.

정량화 및 조직학적 처리는 동결 건조 전에 최소 2시간 동안 섭씨 영하 80도에서 샘플을 동결합니다. 성공적인 탈세포화는 본래 심실과 비교할 때 DNA 함량이 현저히 감소한 것으로 여기에서 입증됩니다. 이 겔은 소변 방광 기질 또는 UBM과 비교할 때 탈세포화된 심실에 남아 있는 DNA가 거의 없음을 보여줍니다.

이 예에서 hemat toin 및 eosin 염색은 심실에서 핵 물질이 완전히 제거되었음을 보여줍니다. Masson의 염색은 이 절차를 시도하는 동안 심장 근육 다발의 손실과 콜라겐 네트워크의 유지를 추가로 확인합니다. 조직과 관상 동맥을 자주 육안으로 검사하는 것이 중요합니다.