Name: 포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 학습하세요 포유류 세포에서 소포체 현지화 mRNA를 형광 원위교잡법으로 시각화하는 방법을. 세포막 선택적 투과와 고정 기법을 활용하여 유전자 발현 조절 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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1. 추출을위한 자료의 작성 <ol><li> 셀의 준비 <ol><li> 실험하기 전에 최소한 하나의 일에 대한 산 처리 coverslips에 씨 조직 문화 세포. 이 두 세포 라인이 분비 단백질의 강력한 생산을 전시하고 잘 정의 된 ER을 가지고 우리는 COS-7 또는 U2OS을 사용합니다. 높은 추출 효율을 달성하기 위해, 세포 실험 당일 coverslip에 confluency 80 %를 초과 할 수 없습니다합니다. </li><li> 특정 외인성 mRNA가 조사하는 경우, 전지가 표준 transfection 프로토콜을 사용하여 관심있는 유전자를 포함하는 plasmids과 퍼 뜨리고 마치면 하루 종일 transfected 수 있습니다. 세포 그런 다음 이전에 추출 최소 18 시간의 mRNA를 표현 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 번역 억제제로 세포 치료 <ol><li> ER과 mRNAs 협회의 유지 보수에 그대로 리보솜의 효과를 테스트하려면 전지 협회를 중단 번역 억제제로 치료 될 수있다mRNA 11 리보솜의. </li><li> (4 - 메틸-2, 6 dinitroanilino) - - 같은 homoharringtonin (HHT), pactamycin, 또는 2와 같은 번역 개시의 억제제를 동시에 약혼 리보솜을 허용하면서 N-methylpropionamide (MDMP)는 성적 증명서와 연결에서 새 리보솜을 방지 번역 12-14를 완료합니다. 포유류의 세포에서 대부분의 단백질에 대한 번역 속도에 관계없이 코돈 사용 또는 mRNA의 길이 15 초당 5 아미노산이기 때문에, 30 분의 치료 27000 세포핵 (단백질에 대한 코딩하는 한 열린 독서 프레임과 메시지의 리보솜을 삭제해야합니다 ) 9,000 아미노산 가능한 한 오래. </li><li> 같은 puromycin 등 억제제는 초기 체인의 조기 배출을 촉진하므로 polysomes 12 중단. 그러나 완전히 mRNA와 puromycin - 처리 리보솜의 연결을 방해하는 등 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 같은 마그네슘 chelators는 digitonin 추출 버퍼 11 추가해야합니다. </li> &lt;리&gt;이 실험에서 세포는 200 μM의 puromycin, 5 μM의 HHT 또는 추출하기 전에 30 분을위한 제어 매체 처리됩니다. </li></ol></li><li> Digitonin 추출 버퍼의 작성. 무료 (즉 세포질, 비 ER-관련) 성적 증명서의 방해없이 ER-지역화 mRNAs를 시각화하기 위해, 우리는 선택적으로 digitonin, 3β-hydroxysterols을 우선적으로 상호 작용 스테로이드 glycoside있는 셀을 permeabilize. 낮은 농도에서 digitonin 선택적으로 &#39;leakiness&#39;16 발생, 플라즈마 막의 일부를 permeabilizes. 대조적으로, 콜레스테롤의 가난한 ER 막과 핵 봉투, 16,17 그대로 남아 있습니다. <ol><li> Digitonin (시그마 알드리치) 분말 5 % 중량 / 부피에 증류수에 용해되며,이 주식 솔루션은 작은 볼륨으로 aliquoted되어 있으며 -20 ° C.에 저장 우리의 경험에서 여러 동결 - 해동주기는 해산 digitonin의 효율성을 낮 춥니 다. </li><li> 의 주식 솔루션10X CHO 버퍼는 (1X 작업 솔루션 농도 : 115 MM KAC, 25 MM HEPES 산도 7.4, 2.5 MM MgCl 2, 2 MM EGTA 150 밀리미터 자당) RNase 무료 시약을 준비 -20 ° C.에 저장됩니다 작업 솔루션은 (1X CHO 버퍼) RNase 무료 물과 주식 솔루션을 diluting에 의해 준비가되어 있습니다, 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol></li></ol> 2. Digitonin 추출 <ol><li> 추출 솔루션을 준비 <ol><li> 평평한 표면과 가열 블록은 사전 가열 40 ° C 및 추출에 동안이 온도에서 유지. </li><li> RNase 무료입니다 평면 작업 표면을 형성하기 위해 가열 블록 parafilm M (Bemis 회사, 주식회사)의 새로운 조각을 물과 겹쳐로 moistened 있습니다. parafilm 시트 및 난방 블록 사이의 기포는 RNase 무료 장갑과 kimwipes (VWR)를 사용하여 밖으로 부드럽게 있습니다. </li><li> 1X CHO 버퍼는 물 목욕에 잠복기가 37 ° C로 예열합니다. </li><li> 6 잘 플레이트는 씻어하는 데 사용됩니다그리고 세포를 해결할 수 있습니다. 세 우물의 각 행은 하나 커버 슬립에 사용됩니다. 행의 처음 두 우물까지 따뜻하게 CHO 버퍼의 2 ML이 추가됩니다. 마지막으로 잘까지 고정 솔루션 2 ML은 (PBS + 4 % paraformaldehyde (전자 현미경 과학))이 추가됩니다. 세포 추출을위한 준비가 될 때까지이 트레이는 37 ° C 배양기에 저장 할 수 있습니다. </li><li> Digitonin 추출 솔루션은 단지 사용 전에 따뜻한 CHO 버퍼와 0.025 %로 주식 digitonin 솔루션을 diluting에 의해 준비가되어 있습니다. 다시 puromycin - 처리 세포에 대해 추출 버퍼가 추가로 효율적으로 리보솜 11 방해하는 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 포함해야합니다. 추출 솔루션 100 μl의 방울 추출하기 전에 즉시 parafilm 덮인 가열 블록에 게재됩니다. </li></ol></li><li> Digitonin 추출 및 세포 고정 <ol><li> 37 ° C 배양기에서 세포를 제거합니다. </li><li> 추출 과정 coverslips는 jewler의 포셉의 도움으로 조작됩니다. 과포셉은 coverslip을 선택하고 성장 매체의 세탁 할 수있는 잘 포함 된 두 번째 한 후 첫 번째와 CHO 버퍼에 떨어 뜨릴. </li><li> 신속하게 kimwipe로 coverslip의 뒷면에서 초과 버퍼를 가릴 즉시 추출 솔루션을 아래로 직면하고있는 coverslip, 셀 측을 배치합니다. </li><li> 10 초 후, 포셉으로 coverslip을 수령 즉시 세포면이 잘 포함 된 4 % paraformaldehyde 고정 버퍼에 최대 직면하고, 그것을 전송할 수 있습니다. </li><li> 상온에서 최소 15 분 동안 정착액의 예제 길러 보자. </li></ol></li><li> Unextracted 제어 셀의 작성. 이 unextracted 제어 샘플을 준비하는 것이 좋습니다 세포질에서 mRNA의 총 양을 결정합니다. <ol><li> coverslips에 성장 세포는 digitonin 추출 단계 (2.2.3)이 생략되는 경우를 제외하고 (2.2 절 참조) 위와 같이 준비가되어 있습니다. </li><li> 고정 후 취소 - 압축을 푼 세포는 PBS에 permeabilized 할 필요가 + 0.1 % 튼을X-100 실온에서 15 분에. </li></ol></li></ol> 3. 생선 착색 <ol><li> 원위치 하이브리드 화에 형광을위한 프로브를 설계 <ol><li> 관심의 mRNA의 주요 순서는 해당 RNAstructure 5.0 18와 같은 RNA 차 구조 예측 소프트웨어를 사용하여 통합되어 있습니다. mRNA의 주름은 시각적으로 주요 이차 구조 무료입니다 약 50 세포핵의 영역을 식별하기 위해 평가됩니다. </li><li> 이 지역의 역 보완는 프로브의 5 &#39;끝 (통합 DNA 기술에서 구입)에 부착 Alexa546 형광으로 합성된다. </li><li> 프로브는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 100 μm의 주식 농도에 RNase 무료 물을 희석되어 </li></ol></li><li> 생선 프로브로 얼룩 <ol><li> digitonin - 압축을 푼 세포가 더 permeabilization을 필요로하지 않지만, 0.1 %의 2 ML과 함께 고정 된 샘플을 치료합니다 트리톤 X-100에 희석PBS는 생선 착색하기 전에 상온에서 15 분 동안 배경 신호를 감소하는 데 도움이됩니다. </li><li> 슬라이드 그런 다음 잔여 paraformaldehyde 또는 트라이 튼 X-100을 제거하는 PBS로 두 번 세척하고 있습니다. </li><li> 세포는 다음 1X 나트륨 구연산 버퍼 (150 MM NaCl, 15 MM 나트륨 시트르산) 25 % 60 % 포름 아미드로 두 번 세척하고 있습니다. 일반적으로, 길이 50​​-60 세포핵 구체적인 생선 프로브에 대해 60 %의 포름 아미드가 사용되지만, oligo (DT) 생선 프로브와 폴리 (A) mRNA의 착색을 위해 포름 아미드의 수준은 25 % 아래로 감소된다. </li><li> 착색 챔버를 준비하려면, 150mm 페트리 접시의 바닥이 물로 덮여 있으며, parafilm의 한 부분이 물에 떠내려 수 있습니다. 물은 따라서 parafilm는 접시​​의 바닥을 준수 할 수 있도록, 요리를 통해 돌려 제거됩니다. 기포를 수동으로 kimwipes으로 제거됩니다. </li><li> 각 coverslip을 물들 일하기 위해서는 파에 관심 물고기 프로브를 포함하는 하이브리드 솔루션의 100 μl 드롭 피펫착색 챔버에 afilm. 재고 생선 프로브의 작동 농도에 하이브 리다이 제이션 버퍼 25 % 60 % 포름 아미드 (1X SSC, 100 MG / ML dextran 황산염, 1 MG / ML 효모 tRNA, 5mM vanadyl riboside 단지, 25~60% 포름 아미드)로 희석합니다 0.2 μM. 포름 아미드의 양이 사용되는 특정 프로브에 대해 최적화되어 있으며 SSC 세척 버퍼에 같은 농도 (단계 3.3.3 참조)에 존재해야합니다. </li><li> coverslip이 같은 조직 문화 인큐베이터로 humidified 챔버에 37 ° C에서 착색 챔버에서 생선 솔루션에 셀 사이드 얼굴을 아래로 배치하고 5-24 시간에 대한 incubated 수 있습니다. </li></ol></li><li> 스테인드 샘플을 세정 장착 <ol><li> RNase 무료 세탁 영역을 준비하려면 이러한 실험실 벤치와 같은 수준의 평평한 표면에 parafilm의 스트립은 바칠 것이다. parafilm는 수준의 표면 서부 유럽 표준시, 평면인지 확인하려면, 상단에있는 parafilm을 배치하고 수동 kimwipes과 아무런 기포를 제거합니다. </li><li> 착색 챔버는보육에서 제거 및 평면 수준의 표면에 위치. coverslips는 다음 각 coverslip의 가장자리 근처에 물고기 세척 버퍼의 약 500 μl를 pipetting하여 떠내려 수 있습니다. 솔루션은 모세관 작용을 통해 coverslip과 parafilm 인 사이에 그려집니다. </li><li> 각 coverslip를 들어, 세탁 버퍼 1 ML (1X SCC 25-60%의 포름 아미드로, 3.3.3 단계를 참조하십시오)은 세탁기 지역 parafilm (단계 3.4.1 참조)에 pipetted 있습니다. </li><li> 집게를 사용하여 coverslips는 착색 챔버에서 제거됩니다 및 각 세척 버퍼의 드롭에 위치하며 5 분 동안 실온에서 incubated. 세척 과정은 3 번 반복됩니다. </li><li> 유리 슬라이드는 70 % 에탄올로 세척하고, kimwipes로 건조됩니다. </li><li> 각 coverslip를 들어, 마운트 솔루션 (DAPI Fluoromount G, 남부 생명 공학)의 25 μl은 슬라이드에 pipetted 있습니다. 이 솔루션 4 &#39;, 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI), 얼룩의 DNA를 포함하고 핵의 시각화를 허용합니다. </li><li> UsiNG 포셉 및 kimwipes는 coverslip의 뒷면은 건조하고 초과 물고기 세척 버퍼는 샘플을 건조하지 않고 해제 blotted 있습니다. 각 coverslip 그런 다음 설치 솔루션의 드롭에, 아래에 직면 세포 측에 저장됩니다. </li><li> 마운트 샘플 그런 다음 표시되며, 4시에 저장 할 수 있습니다 ° C. </li></ol></li></ol> 4. 이미징 및 정량화 <ol><li> 영상 <ol><li> epifluorescence 현미경은 이미지 생선 착색 따라 셀을하는 데 사용됩니다. transfected 세포는 적절한 채널에 밝은 형광 신호로 untransfected 세포에서 차별화 할 수 있습니다. 이상적으로, 각 인수 필드는 또한 정량화의 배경 형광을 결정하는 데 사용되는 untransfected 셀을 포함합니다. </li><li> 를 들어 생선과 DAPI 채널의 각 필드 이미지가 획득됩니다. 세포 단백질 마커와 공동 묻은 경우 또한, immunofluorescence 채널의 이미지도 취득하고 있습니다. digitonin 추출도 사용할 수 있습니다ER-바운드 리보솜과 단백질 11 시각화합니다. </li><li> 분야 사이의 형광 강도를 비교할 수 있도록하려면 각 채널에 대한 노출 시간은 실험의 각 집합에 대해 일정하게 유지해야합니다. </li><li> 다시 다른 coverslips에 세포 사이의 형광 강도를 비교할 수 있도록, 물고기 신호의 epiluminescence 강도 나 부식에 매일 변경 이미징 하나의 좌석에 coverslips의 모든이 최소화되어야합니다. </li></ol></li><li> 정량화. ER에 지역화 mRNA의 양을 정량화하기 위해, 우리는 니콘 NIS 요소 소프트웨어를 사용합니다. 그러나 이러한 ImageJ와 같은 다른 이미지 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. <ol><li> 니콘 NIS 요소 이미지 분석 도구 사용, 셀 주변 및 핵은 관심 분야 (ROIs)의 별도의 지역으로 설명되어 있습니다. </li><li> 각 투자 수익 (ROI), 형광 강도 (I T 전체 셀 강도 및 내 용 N에 대한핵 강도)과 지역 (A T 및 A N) 기록하고 Excel 스프레드 시트에 수출하고 있습니다. </li><li> 각 이미지를 들어, 배경 형광 강도 (I B)가 아닌 transfected 세포의 강도를 기록에 의해 결정됩니다. 폴리 (A) mRNA 수준을 분석하는 경우, 셀 - 무료 지역이 선택됩니다. </li><li> 총 ER의 양 (추출 셀) 또는 세포질은 (unextracted 세포에서) 형광이 공식에 의해 계산됩니다 : [A T] [I T - I B] - [A N] [I N - I B] </li><li> 핵 염색 강도도 계산 및 다양한 트리트먼트를 사이에 내부 통제으로 사용할 수 있습니다. 핵이 digitonin 치료 17 ribosome 파괴 11에 의해 영향을받지 않기 때문에 핵 mRNA의 양이 트리트먼트를 각각의 사이에 일정하게 유지해야합니다. 다음 수식을 사용 핵 형광을 계​​산하려면 : [A N] [I N - IB] </li><li> ER 타겟이 세포질 mRNA의 비율은 30-40 unextracted 세포 (다시 4.2.4 참조)의 평균 세포질 형광으로 나눈 30-40 추출한 세포의 평균 ER의 형광을 (4.2.4 참조) 복용에 의해 계산 될 수있다 . 이 추출 unextracted 세포가 준비 묻은와 병렬로 이미징하는 것이 중요합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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다양한 subcellular 사이트에 mRNAs의 현지화는 mRNA의 현지화 단백질과 성적의 상호 작용을 통해 subcellular의 로컬 요구 사항에 대한 그들의 최종 목적지 단백질의 적절한 정렬을위한, 그리고 유전자 표현의 미세 조정에 중요한 널리 현상입니다 지역 19,20. 검정을 사용하면 여기에 설명 된, 우리는 분비 단백질을 인코딩 mRNAs는 리보솜 또는 번역의 유무에 ER에서 유지 될 수 있는지 여부의 질문을 revisited. 사실, 우리는 이러한 mRNAs의 하위 집합이 활동 11이 것으로 나타났습니다. 예를 들어,이 추출 프로토콜을 사용하여, 우리는 ALPP과 CYP8B1 mRNAs 모두 컨트롤에서 ER의 표면 처리 COS-7 세포 (그림 1-2)에 지역화 된 것으로 나타났습니다. 그러나, 번역 억제제 puromycin 또는 HHT 만 ALPP하지만, CYP8B1</...

eukaryotes에서 mRNA 인코딩 번역 3,4 동안 리보솜과 translocons 사이의 직접 상호 작용을 통해 분비와 막 단백질은 공동 translationally 신호 인식 입자 1,2에 의해 응급실로 타겟팅 할 수 있으며, ER에서 유지 관리 할 수 있습니다. 그러나, mRNAs가 타겟팅하고 리보솜 또는 번역 중의 ER 독립을 유지 할 수 있는지 여부 것은 매우 최근까지 불분명했다. 이전 연구는 세포 분획 기법을 사용하여 ER로 번역 독립적 인 mRNA 협회가 있는지 해결하기 위해 시도했습니다. 거친 화학 조건이 잠재적으로 민감한 mRNA-ER 협회가 바뀐다 ER 파생 소포에서 리보솜을 해제해야 되었기 때문에,이 연구는 5-8에 대한 증거를 제공하고, 결정적이었고 9,10에 대한 ribosomal 독립적 인 mRNA의 응급실로 고정 . 이러한 문제를 회피하기 위해 우리는 proto을 개발했습니다콜 분리 및 이미지 ER-바운드 mRNAs를합니다. 이 절차를 동시에 ER 형태와 관련 분자의 모든을 유지하면서 효과적으로 세포 (비 ER-바운드 mRNAs 포함)의 모든 세포질 내용을 제거 가벼운 추출 치료를하는 것입니다. 이 프로토콜 사용 우리는 mRNAs의 일부 타겟팅하고 독립적으로 리보솜 또는 번역 (11)의 ER에 유지하는 증명하고있다.

포유류의 세포에서 endoplasmic 소포체 현지화 mrnas의 시각화

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

eukaryotes에서 분비와 막 단백질이 소포체 endoplasmic (ER)의 표면에 지역화 아르 인코딩 메신저 RNAs (mRNAs)의 대부분. 그러나 이러한 mRNAs의 시각화가 도전 할 수 있습니다. 이것은 mRNA의 일부만이 ER-관련 될 때 특히 사실이다이 세포 기관과의 배포가 아닌 타겟 (예 : &quot;무료&quot;) 성적 증명서에 의해 가려합니다. 동시에 ER의 무결성을 유지하면서 ER-관련 mRNAs을 모니터링하기 위해, 우리는 세포가 선택적으로 플라즈마 멤브레인을 permeabilizes digitonin 추출 솔루션에 대한 짧은 노출로 치료되는 방법을 개발하고, 따라서 세포질 내용을 제거했습니다 . 이 방법은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광와 결합 될 때, 하나는 분명 형광 현미경으로 ER-바운드 mRNAs를 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 대량 폴리 (A) 성적 증명서 또는 특정 mRNAs 중 하나에 ER-협회의 정도를 평가 할 수 있습니다심지어 정량. 이 과정에서, 하나는 mRNA-ER 상호 작용의 특성을 조사하기 위해이 분석을 사용할 수 있습니다.

ER-연결되어있는 mRNA의 비율, 태반 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (ALPP) 또는 시토크롬 P450-8B1이 (CYP8B1) 또는 digitonin로 추출 후 수정, 또는 직접 수정되었습니다를 포함 plasmids와 transfected 된 COS-7 세포를 확인하려면 (그림 1 참조, 비교 &quot;Ctrl 키를 추출&quot;을 &quot;Ctrl 키를 Unextracted&quot;). 비 핵 형광은 샘플 및 ER-관련 mRNA의 분율은 (그림 2) 계산에 모두 정량화되었다. 우리의 데이터는 명확하게 ALPP과 CYP8B1 모두, 세포질 mRNA의 약 60 %가 응급실에 연결되어 표시됩니다. 이 mRNAs이 모두 ER-루멘으로 처리됩니다 단백질을 인코딩 때문에, 결과는 mRNAs는 ER의 표면에 번역하는 생각과 일치합니다. COS-7 세포 transfec...

여기 포유류의 조직 배양 세포에서 endoplasmic 소포체 - 관련 mRNAs을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 형광등에 이어 세포질 내용을 제거 할 digitonin과 플라즈마 막의 선택적 permeabilization을 포함<em&gt; 현장에서</em어느 대량 폴리 (A) mRNA 또는 특정 기록을 검색 할 수&gt; 하이브리드.

포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

이 절차의 목적은 소포체 또는 er과 관련된 메신저 RNA를 시각화하는 것입니다. 이는 커버 슬립에 포유류 조직 배양 세포를 먼저 도금하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 er에 결합되지 않은 세포질 mRNA를 제거하기 위해 추출 버퍼로 세포를 처리하는 것입니다.다음 단계는 세포를 빠르게 고정하고 형광 in situ hybridization으로 mRNA를 염색하는 것입니다. 마지막 단계는 er과 관련된 형광의 양을 이미지화한 다음 정량화하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 mRNA가 다양한 조건에서 이 소기관의 표면과 어떻게 연관되어 있는지 보여줄 수 있습니다.이 방법은 분비 단백질을 암호화하는 mRNA가 리보솜 또는 단백질 합성과 독립적으로 er 표면에서 유지될 수 있는지 여부와 같은 주요 세포 생물학적 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 몇 가지 까다로운 세포 조작 단계를 포함하기 때문에 매우 중요합니다. 실험 비용 7 및 OS 세포로 인해 산성 처리 된 커버 슬립에 최소 하루 동안 조직 배양 세포를 시드하십시오.외인성 Mr NA를 조사하고 있는 경우, 파종(seeding) 하루 후에 세포를 형질주입한 다음 MR을 허용하기 위해 추가로 18시간 동안 세포를 배양합니다. NA 표현식을 사용합니다. 실험 당일. 높은 추출 효율을 달성하기 위해 세포는 mRNA가 ER과 상호 작용하는지 여부를 감지하기 위해 커버 슬립에서 80%co fluency를 초과해서는 안 되며, 번역 세포는 이러한 제제에서 리보솜과 mRNA 간의 상호 작용을 방해하는 제제로 처리될 수 있거나 추출 30분 전에 세포에 대한 배지를 제어할 수 있습니다.이 경우 번역 억제제, 순수 Mycin 및 Homo Harrington in 또는 HHT가 사용됩니다. dig tonin과 1xcho의 작업 완충액을 포함하는 갓 준비된 추출 용액을 섭씨 37도까지 가열하는 것으로 시작합니다. 가열 블록을 섭씨 40도로 설정하고 반전된 금속 블록을 삽입하여 평평한 작업 표면을 형성합니다.금속 블록을 물로 적신 다음 새로운 파라폼 조각으로 오버레이하고 RNA가 없는 장갑과 보푸라기가 없는 조직을 사용하여 거품을 매끄럽게 만듭니다. 다음으로, 각 커버 슬립 쌍에 대해 셀을 세척하고 4 개의 웰에 고정하기 위해 6 개의 웰 플레이트를 준비합니다. 마지막 두 개의 웰에 2ml의 따뜻해진 CHO 완충액을 추가합니다.정착 용액 2

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

현미경 coverslips에서 포유 동물 세포의 현장 subcellular 분별 (분리)에서 단백질 지방화의 시각이 있습니다.

자기편 및 비 점착 성의 포유 동물 세포의 현장 Subcellular 분별 (분리)에서

여기 형광와 결합 microinjection의 전원을 고용 분석을...

Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

미토콘드리아 단백질을 코딩하는 대부분의 mRNA는 미토콘드리아 외부 막과 연결되어 있습니다. 우리는 관련의 mRNA와 리보솜과 효모 미토콘드리아의 고립을 목표로 세포 내 분획 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 mRNA의 지방화의 메커니즘과 미토콘드리아 근처 현지화 번역을 표시하기 위해 다양한 조건에서 자란 세포에 적용 할 수 있습니다.

현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

여기, 우리는 고정 된 세포에서 소포체와 미토콘드리아의 내생 적 상호 작용을 시각화하고 고감도로 정량화 할 수있는 절차를 설명합니다. 프로토콜은이 미토콘드리아 관련 막 계면에서 이노시톨에게 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 / 혈당 조절 단백질 75 / 전압 가변 음이온 채널 / 시클로 필린의 D 복합체 타겟팅 시츄 근접 결찰 분석법 최적화 기능.

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

여기에서, 우리는 분자 비콘, 회전 디스크 공초점 현미경 및 오픈 소스 분석을 사용하여 살아있는 Drosophila melanogaster 계란 챔버에서 내인성 mRNA 인신 매매의 시각화, 탐지, 분석 및 추적을위한 프로토콜을 제시합니다. 소프트웨어.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

막 접촉 부위(MCS)를 연구하기 위한 새로운 접근법의 필요성은 이러한 세포 구조와 그 구성 요소 연구에 대한 관심이 증가함에 따라 증가했습니다. 여기에서는 MCS에 상주하는 세포 소기관 내 및 세포 기관 간 단백질 복합체를 식별하고 정량화하기 위해 이전에 사용 가능한 현미경 기술을 통합하는 프로토콜을 제시합니다.

근접 결찰 분석에 의한 ER-미토콘드리아 접촉 부위에서 내인성 세포 기관 내 단백질 상호 작용의 시각화 및 정량화

학습하세요 포유류 세포에서 소포체 현지화 mRNA를 형광 원위교잡법으로 시각화하는 방법을. 세포막 선택적 투과와 고정 기법을 활용하여 유전자 발현 조절 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화

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