포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화

이 절차의 목적은 소포체 또는 er과 관련된 메신저 RNA를 시각화하는 것입니다. 이는 커버 슬립에 포유류 조직 배양 세포를 먼저 도금하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 er에 결합되지 않은 세포질 mRNA를 제거하기 위해 추출 버퍼로 세포를 처리하는 것입니다.

다음 단계는 세포를 빠르게 고정하고 형광 in situ hybridization으로 mRNA를 염색하는 것입니다. 마지막 단계는 er과 관련된 형광의 양을 이미지화한 다음 정량화하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 mRNA가 다양한 조건에서 이 소기관의 표면과 어떻게 연관되어 있는지 보여줄 수 있습니다.

이 방법은 분비 단백질을 암호화하는 mRNA가 리보솜 또는 단백질 합성과 독립적으로 er 표면에서 유지될 수 있는지 여부와 같은 주요 세포 생물학적 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 몇 가지 까다로운 세포 조작 단계를 포함하기 때문에 매우 중요합니다. 실험 비용 7 및 OS 세포로 인해 산성 처리 된 커버 슬립에 최소 하루 동안 조직 배양 세포를 시드하십시오.

외인성 Mr NA를 조사하고 있는 경우, 파종(seeding) 하루 후에 세포를 형질주입한 다음 MR을 허용하기 위해 추가로 18시간 동안 세포를 배양합니다. NA 표현식을 사용합니다. 실험 당일. 높은 추출 효율을 달성하기 위해 세포는 mRNA가 ER과 상호 작용하는지 여부를 감지하기 위해 커버 슬립에서 80%co fluency를 초과해서는 안 되며, 번역 세포는 이러한 제제에서 리보솜과 mRNA 간의 상호 작용을 방해하는 제제로 처리될 수 있거나 추출 30분 전에 세포에 대한 배지를 제어할 수 있습니다.

이 경우 번역 억제제, 순수 Mycin 및 Homo Harrington in 또는 HHT가 사용됩니다. dig tonin과 1xcho의 작업 완충액을 포함하는 갓 준비된 추출 용액을 섭씨 37도까지 가열하는 것으로 시작합니다. 가열 블록을 섭씨 40도로 설정하고 반전된 금속 블록을 삽입하여 평평한 작업 표면을 형성합니다.

금속 블록을 물로 적신 다음 새로운 파라폼 조각으로 오버레이하고 RNA가 없는 장갑과 보푸라기가 없는 조직을 사용하여 거품을 매끄럽게 만듭니다. 다음으로, 각 커버 슬립 쌍에 대해 셀을 세척하고 4 개의 웰에 고정하기 위해 6 개의 웰 플레이트를 준비합니다. 마지막 두 개의 웰에 2ml의 따뜻해진 CHO 완충액을 추가합니다.

정착 용액 2ml를 추가합니다. 그런 다음 필요할 때까지 접시를 섭씨 37도에서 보관하십시오. 가열 블록에 처리할 셀의 각 커버 슬립에 대해 추출 용액 100마이크로리터 방울을 놓습니다.

이제 보석상의 집게를 사용하여 셀로 코팅된 커버 슬립을 집어 CHO 완충액이 들어 있는 첫 번째 및 두 번째 웰에 담급니다. 이것은 성장 매체를 씻어냅니다. 그런 다음 커버 슬립 뒷면에서 여분의 버퍼를 빠르게 치솥으로 제거합니다.

그리고 커버 슬립 셀 쪽을 아래로 향하게 하여 추출 용액 위에 간단히 놓습니다. 10초 후, 커버 슬립 셀 쪽을 최소 15분 동안 유지해야 하는 고정 버퍼까지 옮깁니다. 세포 추출 단계는 ER 결합이 아닌 모든 cyop plasticky mRNA를 제거하는 데 필수적입니다.

또한, 추출하지 않고 세포가 고정되는 제어 커버 슬립을 준비합니다. 고정 후 단계. 이러한 unex에서 추출한 대조 세포를 PBS로 두 번 세척한 다음 PBS와 TRITTON X 100에 퍼페이즈합니다.

필수는 아니지만, 세포가 투과된 후 배경 형광을 줄이기 위해 추출된 세포를 파는 경우에도 동일한 PBS 및 Triton 용액으로 세척해야 합니다. PBS로 슬라이드를 두 번 세척하여 정착제와 세제를 제거합니다. 다음으로, 1회 구연산나트륨 완충액 또는 SSC에서 60%fide로 슬라이드를 두 번 세척합니다.

그러나 oligo DT 어류 프로브를 사용하여 모든 세포를 염색하는 경우 poly mRNA는 fide 수준을 25%로 감소시킵니다.다음으로, 어류 프로브로 혼성화 완충액을 준비합니다. 혼성화 완충액에서 동일한 농도의 fide로 스톡 어류 프로브를 0.2 마이크로몰로 희석합니다. 이제 염색 챔버를 준비합니다.

150mm 페트리 접시 바닥에 물을 채웁니다. 그런 다음 파라폼 조각을 물에 띄우고 접시를 거꾸로 뒤집습니다. 파라 필름은 물이 빠져나갈 때 접시 바닥에 부착됩니다.

기포가 있는 경우 장갑과 보푸라기가 없는 티슈로 피쉬 프로브를 포함하는 혼성화 용액 100마이크로리터를 파라 필름에 끼우십시오. 이제 커버 슬립 셀 쪽을 아래로 향하게 하여 용액에 놓습니다. 마지막으로, 따뜻한 가습 챔버에서 5-24시간 동안 챔버를 배양합니다.

물고기 염색 시간이 끝나기 전에 RNA가 없는 세척 영역, 더 젖은 수준의 평평한 표면을 물로 준비하고 매개변수 스트립으로 오버레이합니다. 장갑과 린이 없는 티슈로 기포를 제거합니다. 염색이 완료되면 챔버를 각 커버의 작업 영역으로 옮기고 세척 영역에 1ml의 세척 완충액을 피펫으로

커버 슬립을 전사하기 위한 파라 필름: 첫 번째 피펫, 각 커버 슬립의 가장자리 근처에 반 밀리리터의 생선 세척 버퍼. 액체는 모세관 작용에 의해 커버 슬립 아래로 당겨집니다. 다음으로, 집게를 사용하여 챔버에서 커버 슬립을 제거하고 세척 버퍼 방울에 놓습니다.

그리고 5분 정도 기다립니다. 이 세척 방법을 세 번 더 반복합니다. 세척 부위에 신선한 1 밀리리터 세척 완충액 방울을 사용합니다.

한편, 70% 에탄올로 유리 슬라이드를 청소하고 보푸라기가 없는 티슈로 말리십시오. 그런 다음 각 커버 슬립에 대해 슬라이드에 25마이크로리터의 DPI 장착 솔루션을 적용합니다.집게를 사용하여 커버 슬립을 집어 올리고 보푸라기가 없는 티슈로 뒷면을 건조시켜 과도한 세탁 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 커버 슬립 셀 면이 아래를 향하도록 하여 장착 용액 방울 위로 옮깁니다.

완성 된 슬라이드는 이미지화 될 때까지 섭씨 4도에서 저장할 수 있습니다. 태반 알칼리 포스파타제 또는 시토크롬 P4 58 B 1을 함유하는 플라스미드로 형질주입된 7개의 세포를 토닌으로 추출한 다음 고정하거나 직접 고정하여 ER과 관련된 이러한 mRNA의 비율을 측정했습니다. 비핵 형광은 두 샘플 모두에서 정량화되었으며 두 mRNA에 대해 ER 관련 mRNA의 분율을 계산했습니다.

세포질 분획의 약 60%가 ER과 연관되어 이러한 전사체의 ER 연관성을 모니터링했습니다. 리보솜 해리 비용 transfection 후 7개의 세포를 대조 배지, pur MYCIN 또는 HHT로 처리한 다음 tonin 및 고정 mRNA를 추출했습니다. 염색 결과 A LPP는 리보솜 파괴 후 ER과 연관되어 있었지만 CYP 8 P 1 mRNA는

mRNA 정량화는 이러한 관찰을 뒷받침했으며 중요한 것은 핵 mRNA의 수준이 모든 샘플에서 일관된다는 것을 보여주었습니다. 이러한 데이터는 A LPP 전사체와 같은 ER 표적 mRNA의 하위 집합이 리보솜 분해 후 ER 표면에서 유지됨을 보여줍니다. 이 프로토콜을 사용하여 다양한 mRNA가 mRNA 핵 수출을 분석하는 데 사용되는 다른 분석법과 결합할 때 소포체와 같은 별개의 세포 내 구획에 어떻게 국한되는지 조사할 수 있습니다.

이 절차는 새로 합성된 mRNA의 er 표면에 대한 초기 표적화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.