2013년 4월 27일
정량의 화학 주성 반응을 평가하는 방법 Caenorhabditis의 엘레이 설명되어 있습니다. 화성 지수 (CI)가 정확하게 특정 대상에 웜의 반응을 평가하고, 균주 및 그 화합물의 비교의 플랫폼으로 제공하는 방법으로 사용 하였다.
다음 실험의 전반적인 목표는 간단하고 저렴한 분석을 사용하여 C Elegance의 화학 택 반응을 정량화하는 것입니다. 이는 단계별로 분리된 벌레를 마크가 달린 접시의 중앙에 배치하여 이루어집니다. 각 사이트에 증거 및 대조 지점에서 동일한 거리에 관심 화합물 또는 대조 화합물이 증착되어 있으며, 이는 벌레가 접근할 때 마취제와 함께 벌레를 정지시키는 데 사용됩니다.
60분 후, 접시 위의 벌레의 최종 분포가 집계되고, 벌레 위치의 비율이 분석 지수를 제공하는 데 사용됩니다. 궁극적으로 해 Elegance가 특정 화합물에 대한 매력을 정량화하는 것은 기본 실험 조작의 행동 결과를 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 이점은 이전의 많은 유익한 측면을 포함하면서 더 큰 사용 편의성을 허용한다는 것입니다.
이 분석은 해 Elegance의 행동에 대한 통찰력을 제공하고 신경 유전자 조작 및 기타 신경 생물학적 분석과 함께 특히 유용합니다. 화학 택 아가르 또는 NGM으로 채워진 5센티미터 접시로 시작하십시오. 접시의 바닥을 4개의 동등한 사분면으로 표시하십시오.
테스트된 각 유전자 주 및 조건에 대해 최소 세 개의 접시를 최소 세 번의 시도에 대해 준비하십시오. 다음으로 원점 주위에 0.5센티미터 반경의 원을 표시하십시오. 그런 다음 반대편 사분면에 T(테스트) 또는 C(대조)로 지점을 표시하여 해당 지점이 원점과 서로 동일한 거리에 있고 서로 동일한 거리에 있는지 확인하십시오.
이 분석을 위해 지점은 원점에서 최소 2센티미터 떨어져 있어야 합니다. 5센티미터 화학 택 접시에서 동기화된 발달 상태의 젊은 성인 벌레를 준비하십시오. 개발 단계가 다른 벌레는 분석물에 다르게 반응할 수 있습니다.
따라서 분석에 사용된 모든 벌레가 동일한 발달 단계에 있는 것이 매우 중요합니다. 벌레가 OP 50 e coli의 층을 제거한 후 2밀리리터의 S 기초 완충액을 접시에 파이펫팅합니다. 벌레를 모두 완충액으로 옮겨 벌레를 씻기 위해 접시를 조작합니다.
버퍼에 있는 벌레 1밀리리터를 마이크로 원심분리기 튜브에 파이펫팅하고 10초 동안 원심분리합니다. 6,600 RPM의 피코 퓨지를 사용하여 아스 바질을 흡입하여 벌레 펠릿을 방해하지 않고 남겨둡니다. 이제 동일한 방법을 사용하여 이 벌레를 세 번 더 세척합니다.
S 바질 버퍼를 튜브에 추가하고 튜브를 뒤집어 벌레를 용액으로 다시 넣습니다. 최종 세척 후 벌레를 다시 10초 동안 원심분리하고 초과분을 최종 부피 100마이크로리터로 흡입합니다. 다음으로 NGM 플레이트에 펠릿에서 2마이크로리터의 세척된 벌레를 파이펫팅하여 충분한 벌레 밀도를 확인합니다.
최소 50마리, 그러나 250마리 이상의 벌레는 없어야 합니다. 벌레가 너무 많은 경우 ESP 바질 용액의 부피를 늘리고, 벌레가 너무 적은 경우 벌레를 다시 처리하여 더 낮은 부피로 현탁시킵니다.
벌레 튜브를 퓨지 후드에 놓습니다. 준비되면 벌레는 화학 택 분석에 최대 한 시간 동안 사용할 수 있습니다. 먼저 용액을 준비합니다.
테스트 용액을 테스트 화합물의 동일한 부피를 마취제 0.5 몰 아지드와 결합하여 혼합합니다. 다음으로 테스트 화합물을 희석하는 데 사용된 용매와 0.5 몰 나트륨 아지드를 혼합하여 대조 용액을 준비합니다. 이제 테스트 플레이트를 준비합니다.
먼저 펠릿에서 2마이크로리터의 ��
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본 논문은 간단하고 비용 효율적인 분석법을 사용하여 Caenorhabditis elegans의 화학성 유인 반응을 정량적으로 평가하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 다양한 화합물에 반응하는 벌레의 분포를 측정하여 비교를 위한 화학성 유인 지수를 제공합니다.
모델 생물에서 화학주성 반응을 정량화하면 유전적 또는 약리학적 조작을 측정 가능한 행동 출력과 연결함으로써 초기 단계의 타겟 검증이 가능해집니다. 이 분석법은 감각 경로 기능에 대한 정량적이고 재현 가능한 판독값을 제공하여 신경과학 발견 단계에서 기전적 리스크 감소(de-risking)를 지원합니다. 또한, 그 단순성과 확장성 덕분에 리드 화합물 발굴 이전의 타겟 결합 연구에서 예측 신뢰도를 높일 수 있습니다.
이 분석법은 타겟 신뢰도를 알려주는 기능적 행동 판독값(readout)을 제공함으로써, 타겟 가설 검증부터 리드 최적화에 이르는 신약 발굴 연속 과정에 적합하게 적용됩니다.