Name: 항원은 컴팩트 Hyperbranched Polyglycerols 중 이식 막으로 기능 적혈구를 보호 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 학습하세요 적혈구 표면 항원을 하이퍼브랜치드 폴리글리세롤(HPG)로 보호하는 세포막 변형 기법을 배우세요. 유세포 분석을 통해 항원 위장 효과를 검증하고 수혈 호환성을 향상시키는 방법을 탐색하세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 캐나다 혈액 서비스 (CBS)과 보건 과학 (CIHR) 연구 파트너십 기금의 캐나다 연구소에 의해 자금을 지원했다. 저자는 자신의 연구 시설의 사용에 대한 혈액 연구 UBC 센터에서 LMB Macromolecule 허브 감사드립니다. 인프라 시설 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI)과 건강 연구에 대한 마이클 스미스 재단 (MSFHR)에 의해 지원됩니다. R. Chapanian은 (CIHR / CBS) 박사 수혈 과학 장학금 및 MSFHR 연구 연수 후 박사 교제의 수신자의 수상자이다. JN Kizhakkedathu는 MSFHR 경력 탐정 학술 상 수상자이다.

A. Hyperbranched Polyglycerol의 변경 (SS-HPG) <ol><li> 장소 둥근 바닥 플라스크에 60 kDa (0.5 g, 0.0083 mmol)을 HPG 동결 건조 및 90 진공 박을 건조 ° C. </li><li> 실내 온도에 휴대용 술병을 냉장하고, 무수 피리딘 (3 ML)에서 건조 HPG를 해산. </li><li> 카르 복실 그룹과 HPG에 약 여덟 수산기 그룹을 functionalize하려면 HPG 솔루션으로 dimethylaminopyridine의 촉매 금액 (피리딘 5 MG / ML 솔루션의 한 방울)을 추가합니다. 이 혼합물에 10 분 이상 현명한 0.5 ML 피리딘 드롭에 용해 (0.0067 g, 0.0664 mmol), succinic 무수물을 추가합니다. 아르곤에 따라 실온에서 하루 아침에 혼합물을 저어. </li><li> 50 ML의 원심 분리기 튜브의 차가운 아세톤 (4 ° C)의 40 ML에있는 혼합물을 침전, 15 분 동안 27,000 XG에서 Beckman J2-MC의 원심 분리기를 사용하여 원심 분리기. 표면에 뜨는을 가만히 따르다하고, 실온에서 아르곤과 함께 플러싱에 의해 잔류 아세톤을 제거합니다. </li><li> 카르복시을 활성화하려면succinimidyl 신산 (SS) 단체와 난 그룹은, 무수 DMF 3 ML에있는 카르 복실-작용 HPG를 해산. HPG 솔루션에 N-hydroxysuccinimide (0.0077 g, 0.0664 mmol) 및 N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide을 (0.0084 g, 0.0664 mmol)을 추가 및 아르곤 이하 실온에서 하루 아침에 혼합물을 저어. </li><li> 차가운 아세톤의 강수량에 의해 SS-HPG를 정화. </li><li> 아르곤과 함께 플러싱에 의해 잔류 아세톤을 제거합니다. </li><li> NMR 분석 - 수정 HPG의 순도와 양자 (1 H)의 카르 복실와 SS 작용의 정도를 결정합니다. </li></ol> B. 전체 혈액 수집 및 적혈구의 분리 (적혈구) <ol><li> 구연산의 vacutainer 관으로 건강한 인간 기증자를 동의에서 전체 혈액 (40 % 혈소판, 3 ML)를 수집합니다. </li><li> 4 분 1,000 XG에 시트르산 튜브를 원심 분리기. </li><li> 플라즈마와 혈소판을 포함하는 표면에 뜨는을 제거하고, 백혈구와 platele를 포함하는 중간 버피 코트파스퇴르 피펫을 사용하여 TS. </li><li> 12 ML 팔콘의 원심 분리기 튜브에 포장 적혈구 (80 % 혈소판, 1.2 ML)를 전송하고, 적혈구를 씻어 PBS 버퍼를 (8 ML, 산도 = 8.0)를 추가합니다. </li><li> 균일 한 세포 분포를 얻기 위해 반전하여 적혈구를 섞는다. </li><li> 4 분 1,000 XG에서 매 튜브를 원심 분리기하고, 표면에 뜨는을 제거합니다. </li><li> 단계 5와 6을 반복하여 PBS 두 번으로 적혈구를 씻으십시오. </li><li> 장소 1.6 ML Eppendorf 튜브에 (100 μl) 적혈구를 포장, 20 % 혈소판의 적혈구를 얻기 위해 PBS 버퍼 (300 μl, 산도는 = 8.0)을 추가합니다. </li></ol> C. HPG는 적혈구로 이식 <ol><li> 즉시 단계 A6의 아세톤에 수정 HPG, 장소의 강수량 후 유리관 (1 DRAM) 및 PBS 버퍼 (300 μl, 산도는 = 8.0)에 용해에 SS-HPG (150 MG). </li><li> 20 % 혈소판에 SS-HPG 폴리머 솔루션을 추가하면 400 μl와 0.5 mm까지에서 3 mm까지 범위 SS-HPG 농도의 최종 볼륨을 얻기 위해 적혈구을 빨기도 했죠. 예를 들어 0.5 밀리미터로 치료 적혈구를 준비하는 SS-HPG, 세탁 RBC에서 PBS의 36 μl를 제거하고 SS-HPG 폴리머 솔루션 36 μl를 놓습니다. </li><li> 소용돌이 부드럽게 정지 1 시간 동안 실온에서 궤도 셰이커에 Eppendorf 튜브에 넣습니다. </li><li> 4 분 1,000 XG에서 Eppendorf 튜브 원심 분리기하고 표면에 뜨는을 피펫. </li><li> , 적혈구을 씻고 원심 분리기하고 표면에 뜨는을 제거하는 PBS 1 ML을 추가합니다. </li><li> 한 ML의 생리를 추가하고 배 5 단계에서 적혈구을 씻는다. </li><li> 20 % 혈소판의 최종 농도로 가득 적혈구의 100 μl (80 % 혈소판)에 생리 300 μl를 추가합니다. </li></ol> 수정일 적혈구를 HPG의 D. 특성 I.의 보수 매개의 용해 <ol><li> 건강한 사람의 기증자로부터 BD vacutainer 유리 혈청 관에 전체 혈액의 8 주변 ML를 수집하고, 30 분 동안 실온에서 응고에 혈액을 수 있습니다. </li><li> 10 분에 2,000 XG에서 튜브를 원심 분리기와 혈청 3 약 ML를 수집합니다. </li><li> seru 중 하나 밀리리터m은 열 inactivated 혈청를 준비하는 30 분에 60 ° C에서 물을 욕조에 배치되었습니다. </li><li> 20 % 혈소판 HPG 수정 적혈구 나 수정되지 않은 적혈구의 60 μl를 포함 Eppendorf 튜브에 신선한 혈청 또는 열 inactivated 혈청 60 μl를 추가합니다. </li><li> 37 1 시간에 적혈구를 품다 ° C. </li><li> 세포 현탁액에서 헤모글로빈의 양, 장소 96 잘 플레이트에 세중의에서 수정 적혈구 나 수정되지 않은 세포를 HPG의 20 % 혈소판의 5.9 μl을 수량화 할 수 있습니다. Drabkin의 시약 (spectrophotomerically 헤모글로빈의 양을 정량화하는 데 사용되는 시약)의 294 μl를 추가합니다. 및 아웃 pipetting하여 Drabkin의 시약으로 세포를 섞는다. 스펙트럼 MAX 190 판 리더를 사용하여 540 nm 정도의 헤모글로빈 cyanoderivati​​ve의 흡광도를 측정합니다. </li><li> 표면에 뜨는에서 헤모글로빈의 양을 정량화하기 위해 1 분에 13,000 XG에서 세포를 원심 분리기. 96 잘 플레이트에 세중의에 표면에 뜨는 장소 50 μl. Drabkin의 시약 250 μl를 추가합니다. Drabkin의 시약과 혼합 세포및 아웃 pipetting하여. 스펙트럼 MAX 190 판 리더를 사용하여 540 nm 정도의 헤모글로빈 cyanoderivati​​ve의 흡광도를 측정합니다. </li><li> 샘플의 표면에 뜨는에서 헤모글로빈의 비율 (7 단계) 및 총 헤모글로빈 (단계 6) 8, 11, 12에서 lysed 세포의 양을 정량화. </li></ol> II. MTS 카드를 사용하여 전공 및 부전공 항원의 위장 <ol><li> 장소 50 Eppendorf 튜브에 HPG 수정 RBC (10 % 혈소판), 1 분 1,000 XG에서 원심 분리기의 μl, 그리고 표면에 뜨는을 제거합니다. </li><li> 세포 펠렛에 MTS 희석제의 110 μl를 추가하고 및 아웃 pipetting하여 세포 현탁액을 균질화. </li><li> 각 미니 겔 항목에 세포 현탁액 11 μl를 추가합니다. 또한 동안 젤을 터치하지 마십시오. </li><li> 원심 분리기 카드 소지자에 MTS 카드를 찾아 6 분에 156 XG에 원심 분리기. </li><li> 표면 항원의 보호는 제조에 따라, 미니 젤 열에서 RBC의 위치에서 결정된다R 설명입니다. </li></ol> III. 수성 2 상 파티션 측정 <ol><li> Dextran 500 kDa 13에 따라 (5 % dextran 50 만, 4% PEG 8K, 150 MM NaCl, 10 MM 인산) 구성 / PEG 8 kDa 2 상 분리 시스템을 준비합니다. </li><li> 두 단계 시스템 (아래의 dextran)을 얻기 위해 실온에서 10 분에 433 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 두 단계를 분리합니다. </li><li> 표시 관 (오목 하단에 있음)에 상부 PEG 단계의 나누어지는 1.0 ML은 flicking하여 부드럽게 20 20% 혈소판 HPG 수정 RBC의 μl와 혼합 셀을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 낮은 단계의 0.5 ML로 세포를 포함하고, flicking에 의해 부드럽게 시스템을 혼합 상단 단계의 0.5 ML를 추가합니다. </li><li> 분리하고 시스템에서 셀의 위치를​​ 결정하는 시스템 ~ 2 분 동안 벤치에 튜브를 놓습니다. 적혈구의 국산화은 (상단 PEG 단계에서, 낮은 dextran 단계에서 또는 두 가지 모두)을 수정 및 분자의 정도 기능입니다HPG의 무게. </li></ol> IV. 삼투 취약성 측정 <ol><li> 0에서 0.9 (w / V) %로 다양 농도와 NaCl 솔루션을 준비합니다. </li><li> 1.5 ML Eppendorf 튜브에 NaCl 솔루션의 장소 0.4은 ML. </li><li> NaCl 솔루션으로 적혈구 (20 % 혈소판)의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 반전 30 분 동안 37 ° C에서 물이 욕조에 넣어하여 신중하게 믹스 세포. </li><li> 반전으로 조심스럽게 세포를 일시 중지합니다. RBC 서스펜션의 50 μl를 타고 큐벳에 배치 한 ML Drabkin의 시약,에 추가 할 수 있습니다. 및 아웃 pipetting하여 Drabkin의 시약으로 세포를 섞는다. BECKMAN 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 DU 730 UV / VIS 리더를 사용하여 540 nm 정도의 헤모글로빈 cyanoderivati​​ve의 흡광도를 측정합니다. </li><li> 표면에 뜨는에서 헤모글로빈의 양을 정량화하기 위해 1 분 1,000 XG에서 세포를 원심 분리기. 큐벳에서 Drabkin의 시약 1 ML에 표면에 뜨는 200 μl를 추가합니다. 및 아웃 pipetting하여 Drabkin의 시약으로 세포를 섞는다. hemogl의 흡광도를 측정BECKMAN 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 DU 730 UV / VIS 리더를 사용하여 540 nm의에서 obin cyanoderivati​​ve. </li><li> 세포 현탁액 (5 단계)에서 헤모글로빈의 총 금액에 표면에 뜨는에있는 금액 헤모글로빈의 비율 (6 단계)에서 다른 NaCl 용액에 lysed 세포의 양을 계산할 수 있습니다. </li></ol> V. 흐름 세포 계측법 측정 - 리 서스-D의 보호 (RhD)는 항원 <ol><li> 5 제어 μl 25 μl의 총 볼륨에 0.5 % BSA와 보충 PBS 버퍼로 세중의에 HPG 수정 적혈구 (20 % 혈소판)을 추가합니다. </li><li> 지수 Biodiagnostics (PA, USA)에서 구입 한 FITC 단클론 항 리 서스 D (RhD)의 25 μl를 추가합니다. </li><li> 물 욕조에 37 ° C에서 30 분의 혼합물을 품다. </li><li> 1.5 ML PBS 버퍼를 두 번으로 혼합물을 씻으십시오. 표면에 뜨는을 제거하려면 1 분 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 한 ML의 생리에 적혈구를 일시 중지, 4 ML 흐름 BD의 유동 세포 계측법 관에 정지를 전송합니다. </li><li> FACSCanto II FLO를 사용하여 분석w cytometer는 RBC 제어 게이트에 5000 이벤트를 수집하고, 분석을 위해 전체 이벤트를 사용합니다. </li></ol> VI. 유동 세포 계측법 측정 - CD47의 표현 <ol><li> 1.54 제어 μl 또는 44 μl의 총 볼륨에 0.5 % BSA와 보충 PBS 버퍼로 세중의에 HPG 수정 적혈구 (20 % 혈소판)을 추가합니다. </li><li> BD Biosciences (NJ, USA)에서 구입 한 마우스 반 인간 CD47이라는 phycoerythrin (PE) 6 μl를 추가합니다. </li><li> 물 욕조에 37 ° C에서 30 분의 혼합물을 품다. </li><li> 두 배에 1.5 ML PBS 버퍼로 혼합물을 씻으십시오. 표면에 뜨는을 제거하려면 1 분 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 한 ML의 생리에 적혈구를 일시 중지하고, 세포 거리며 걷게을 최소화하기 위해 26 G 8분의 5 바늘을 통과. </li><li> 4 ML 흐름 BD의 유동 세포 계측법 관에 정지를 전송합니다. </li><li> RBC 제어 게이트 만 이벤트를 인수, FACSCanto II 흐름 cytometer를 사용하여 분석합니다. </li></ol>

<ol><li>Bradley, A. J., Murad, K. L., Regan, K. L., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+consequences+of+linker+chemistry+and+polymer+size+on+stealth+erythrocytes%3A+size+does+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Biophysical consequences of linker chemistry and polymer size on stealth erythrocytes: size does matter.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1561 (2), 147-158 (2002).</li>
<li>Murad, K. T., Mahany, K. L., Brugnara, C., Kuypers, F. A., Eaton, J. W., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+consequences+of+antigenic+modulation+of+red+blood+cells+with+methoxypoly%28ethylene+glycol%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Structural and functional consequences of antigenic modulation of red blood cells with methoxypoly(ethylene glycol.</a> Blood. 93 (6), 2121-2127 (1999).</li>
<li>Scott, M. D., Murad, K. L., Koumpouras, F., Talbot, M., Eaton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+camouflage+of+antigenic+determinants%3A+Stealth+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Chemical camouflage of antigenic determinants: Stealth erythrocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (14), 7566-7571 (1997).</li>
<li>Daniels, G., Reid, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+groups%3A+the+past+50+years%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Blood groups: the past 50 years.</a> Transfusion. 50 (2), 281-289 (2010).</li>
<li>Murad, K. L., Gosselin, E. J., Eaton, J. W., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stealth+cells%3A+Prevention+of+major+histocompatibility+complex+class+II-mediated+T-cell+activation+by+cell+surface+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stealth cells: Prevention of major histocompatibility complex class II-mediated T-cell activation by cell surface modification.</a> Blood. 94 (6), 2135-2141 (1999).</li>
<li>Kainthan, R. K., Hester, S. R., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biological+evaluation+of+high+molecular+weight+hyperbranched+polyglycerols%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro biological evaluation of high molecular weight hyperbranched polyglycerols.</a> Biomaterials. 28 (31), 4581-4590 (2007).</li>
<li>Kainthan, R. K., Janzen, J., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+testing+of+branched+and+linear+polyglycidol%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility testing of branched and linear polyglycidol.</a> Biomacromolecules. 7 (3), 703-709 (2006).</li>
<li>Chapanian, R., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+circulation%2C+clearance%2C+and+biodistribution+of+polyglycerol+grafted+functional+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo circulation, clearance, and biodistribution of polyglycerol grafted functional red blood cells.</a> Biomaterials. 33 (10), 3047-3057 (2012).</li>
<li>Chapanian, R., Constantinescu, I., Rossi, N. A. A., Medvedev, N., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+polymer+architecture+on+antigens+Camouflage%2C+CD47+protection+and+complement+mediated+lysis+of+surface+grafted+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Influence of polymer architecture on antigens Camouflage, CD47 protection and complement mediated lysis of surface grafted red blood cells.</a> Biomaterials. 33 (31), 7871-7883 (2012).</li>
<li>Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+cell+surface+polymer+grafting+in+concentrated+and+nonreactive+aqueous+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Enhanced cell surface polymer grafting in concentrated and nonreactive aqueous polymer solutions.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (10), 3423-3430 (2010).</li>
<li>Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Kainthan, R. K., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+membrane+grafting+of+multi-functional+hyperbranched+polyglycerols%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Red blood cell membrane grafting of multi-functional hyperbranched polyglycerols.</a> Biomaterials. 31 (14), 4167-4178 (2010).</li>
<li>Muzykantov, V. R., Smirnov, M. D., Domogatsky, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+complement+activity+assay+in+microtitration+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+App.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Hemolytic complement activity assay in microtitration plates.</a> J. App. Biochem. 7 (3), 223-227 (1985).</li>
<li>Walter, H., Brooks, D. E., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalter%2C+H+%22Partitioning+in+aqueous+two-phase+systems%3A+theory%2C+methods%2C+uses%2C+and+applications+to+biotechnology%22">Partitioning in aqueous two-phase systems: theory, methods, uses, and applications to biotechnology</a>. , Academic Press Inc. London. (1985).</li>
<li>Rossi, L., Serafini, S., Pierige, F., Antonelli, A., Cerasi, A., Franternale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte-based+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte-based drug delivery.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 2 (2), 311-322 (2005).</li>
<li>Walter, H., Krob, E. J., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+surface+properties+other+than+charge+involved+in+cell+separation+by+partition+in+polymer%2C+aqueous+2-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane surface properties other than charge involved in cell separation by partition in polymer, aqueous 2-phase systems.</a> Biochemistry. 15 (14), 2959-2964 (1976).</li>
<li>Muzykantov, V. R., Murciano, J. C., Taylor, R. P., Atochina, E. N., Herraez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+complement-mediated+elimination+of+red+blood+cells+modified+with+biotin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the complement-mediated elimination of red blood cells modified with biotin and streptavidin.</a> Anal Biochem. 241 (1), 109-119 (1996).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

유니버설 기증 적혈구는 수혈 치료를위한 강화 혈액 가용성 및 안전에 큰 잠재력을 지니고 있습니다. 적혈구는 오랜 순환 고유 biocompatibility 14, 15로 인해 유망 약물 투여 차량을 간주됩니다. 본 논문에서 제시 실험이 수정 적혈구를 HPG의 체외 특성에를 평가합니다. 체외의 속성과 HPG 수정 적혈구의 생체 유통은 최근 8, 11의 그룹에 조사되었습니다. NaCl과 인산 나트륨을 보충 Dextran500K/PEG8K의 수성 2 상 시스템에서 적혈구의 파티션은 적혈구 표면 전하와 표면 당 단백질 성분 16 따라 달라집니다. HPGs과 RBC glycocalyx 수정의 범위에 따라 수정 된 적혈구는 상단 PEG 단계로 낮은 dextran에서 파티션 경향이 있습니다. 두 단계 시스템은 RBC 표면 수정의 범위 손쉬운 평가를 제공합니다. 용해 Oautologous 혈청에서 F의 적혈구는 세포 및 생물학적 표면에 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Glycidol </td><td> 시그마 알드리치 </td><td></td><td> (캐나다, ON) </td></tr><tr><td> Trimethylolpropane </td><td> Fluka </td><td></td><td> (캐나다, ON) </td></tr><tr><td> 칼륨 methylate </td><td> 시그마 알드리치 </td><td></td><td> (캐나다, ON) </td></tr><tr><td> 무수 피리딘 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td></td><td> (캐나다, ON) </td></tr><tr><td> 4 Dimethylaminopyridine </td><td> 시그마 알드리치 </td><td></td><td> (캐나다, ON) </td></tr><tr><td> Succinic 무수물 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td></td><td> (캐나다, ON) </td></tr><tr><td> 아세톤 </td><td> 피셔 과학 </td><td></td><td> (캐나다, ON) </td></tr><tr><td> 무수 디메틸 포름 아미드 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td></td><td> (캐나다, ON) </td></tr><tr><td> N-Hydroxysuccinimide </td><td> 시그마 알드리치 </td><td></td><td> (캐나다, ON) </td></tr><tr><td> N, N&#39;-Diisopropylcarbodiimide </td><td> 시그마 알드리치 </td><td></td><td> (캐나다, ON) </td></tr><tr><td> MTS 카드 </td><td></td><td></td><td> 마이크로 입력하면 시스템 (MTS) 카드 (FL, USA) </td></tr><tr><td> Dextran 500 kDa </td><td> Pharmacia 정밀 화학 </td><td></td><td> (스웨덴) </td></tr><tr><td> PEG 8 kDa </td><td> 시그마 알드리치 </td><td></td><td> (캐나다, ON) </td></tr><tr><td> FITC 단클론 항 리 서스 D (RhD) </td><td> 지수 Biodiagnostics </td><td></td><td> (PA, USA) </td></tr><tr><td> PE 단클론 항 CD47 </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td> (NJ, USA) </td></tr><tr><td> Drabkin의 시약 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td></td><td> (캐나다, ON) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표. RBC 막과 분석 중합체를 HPG의 접목에 사용되는 화학 물질, 시약. </td></tr></tbody></table>

항원은 컴팩트 hyperbranched polyglycerols 중 이식 막으로 기능 적혈구를 보호

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

적혈구 (RBC) 수혈은 thalassemia 전공 및 낫 세포 빈혈 1-3으로 급성과 만성 의료 문제의 숫자의 치료를 위해 중요합니다. RBC 표면 (~ 308 항원 4) 만성 수혈 요법에 환자 transfused 적혈구 4, 5에 약간의 항원의 양을 일치로 인해 alloantibodies을 개발에 대한 항원의 다양한의 존재로 인해. 이러한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)와 hyperbranched polyglycerol (HPG)와 같은 친수성 고분자로 이식하는 등 산소, 포도당 및 이온 세와 같은 작은 분자의 흐름에 영향을주지 않고 표면 항원과 항체의 상호 작용을 방지 RBC 막에 제외 층을 형성한다. 현재 어떤 방법 때문에 적혈구 표면 및 D에 대한 항원 큰 수 (기반 단백질과 탄수화물)의 존재에 의해 제시 발굴 과제의 일환으로 보편적 적혈구 기증자 세포의 생성에 사용할 수 없습니다이러한 방법 evelopment이 크게 수혈의 안전을 향상시키고, 극적 적혈구의 가용성 및 사용을 향상시킬 수 있습니다. 이 보고서에서 HPG 및 특성의 접목 막에 의해 항원 보호 기능 적혈구를 개발하는 데 사용되는 실험이 제공됩니다. HPGs은 매우 컴팩트 한 폴리머 6, 7 biocompatible되며, 지질 막 8, 9 및 마스크 적혈구 표면 항원 10, 11을 둘러싸는 세포 glycocalyx 내에 위치 될 것으로 예상된다.

리 서스 D 항원과 CD47 RBC 표면 단백질의 위장복은 형광 표시 단클론 항체를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 정량화했고, 대표 결과는 그림 1에 있습니다. HPG - 이식 적혈구의 경우 (회색), 신호의 강도는 표면 단백질의 마스킹을 나타내는 세포 표면에 항체에 바인딩의 감소를 나타내는 컨트롤 적혈구 (적색 및 녹색)에 비해 (왼쪽으로 이동 피크) 감소 . <img src="/files/ftp_upload/50075/50075fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50075/50075fig1highres.jpg" /> 그림 1. 유동 세포 계측법을 사용하여 표면 항원과 단백질의 위장에 대한 평가. )는 붉은 털 원숭이 D (RhD) 보호 : 검...

hyperbranched polyglycerol (HPG)와 적혈구의 세포막 수정 (적혈구)가 제공됩니다. 수정 적혈구는 수성 2 상 분할, 삼투 취약성과 보완 매개 용해에 의해 특징되었습니다. 표면 단백질과 항원의 위장은 유동 세포 계측법 및 마이크로 타이핑 시스템 (MTS) 혈액 phenotyping 카드를 사용 평가되었습니다.

항원은 컴팩트 Hyperbranched Polyglycerols 중 이식 막으로 기능 적혈구를 보호

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

이 절차의 목적은 항원으로 보호되는 기능성 적혈구를 준비하는 것입니다. 이는 두 번째 단계에서 HPG 폴리머를 먼저 준비함으로써 달성됩니다. HPG는 숙시닐 숙시네이트 기의 첨가를 통해 기능화됩니다.다음으로, 건강한 헌혈자의 전혈을 식염수로 씻어 적혈구를 분리합니다. 마지막 단계에서는 분리된 적혈구를 기능화된 HPG로 처리합니다. 궁극적으로, 기능화된 HPG에 의한 변형된 세포의 표면 항원 보호는 유세포 분석에 의해 분석됩니다.기존 방법과 비교했을 때 우리 기술의 주요 장점은 HPG 접합이 정상적으로 순환하는 기능성 적혈구를 생성한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 만성 수혈에까지 확장됩니다. HPG로 인해 적혈구가 변형되어 생체 내에서 항원성과 정상적인 혈액 순환이 감소했습니다.이 절차를 시연하는 것은 박사후 연구원이자 동료이자 내 실험실의 기술자인 Dr.Ian이 동의한 건강한 기증자로부터 전혈을 채취하기 3일 전에 둥근 바닥 플라스크에서 하룻밤 동안 동결건조된 HPG를 건조하고 섭씨 90도의 진공에서 진공 상태로 만듭니다. 다음날 아침, 오일 수조에서 플라스크를 제거하고 실온에 도달하도록 한 다음 건조된 HPG를 무수 피리딘 2ml에 용해시킵니다. 다음으로, HPG 용액에 촉매량의 디메틸 아미노 파리딘을 첨가하여 HPG의 약 8개의 하이드록실기를 카르복실기로 기능화합니다.다음 10 분 동안 0.5 밀리리터에 용해 된 Sica 수 소화물을 용액에 페린을 적가시킨 다음 혼합물을 아르곤 아래 실온에서 밤새 저어 주며 다음날 HPG 혼합물을 섭씨 40 밀리리터로 침전시킵니다. 50 밀리리터에서 아세톤을 원심 분리 튜브에 15 분 동안 27, 000 번 섭씨 4도에서 G. 그런 다음 supinate를 디캔팅하고 실온에서 아르곤으로 침전물을 세척하여 잔류 아세톤을 제거합니다.Saxon 및 Mial 숙시네이트 그룹을 가진 carboxyl 그룹을 활성화하기 위하여. 그룹은 카르복실 기능화 HPG를 2ml의 무수 DMF에 용해시킵니다. 그런 다음 NHS 및 Diop profile CARBINIDE를 HPG 용액에 첨가하고 혼합물을 아르곤 아래 실온에서 밤새 저어줍니다.다음날 아침에는 차가운 아세톤에 침전하여 S-S-H-P-G를 정제하는 작업을 진행한다. 그 후 아르곤으로 세척하여 잔류 아세톤을 제거합니다. 그런 다음 양성자 NMR 분석을 통해 변형된 HPG의 순도와 카르복실 및 숙시닐 숙시네이트 기능화 정도를 결정합니다.정보에 입각한 동의를 얻은 후 S-S-H-P-G의 순도를 평가하는 동안 건강한 헌혈자로부터 혈액을 채취합니다. 원심 분리기는 기증자가 1000 회 G와 실온에서 4 분 동안 전혈을해야합니다. 페이스트르 피펫을 사용하여 supinate와 buffy coat를 제거한 다음 포장된 적혈구를 15ml 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다.PBS를 세포에 추가한 다음 반전으로 혼합하여 균일한 세포 분포를 얻습니다. 그런 다음 PB S3의 세포를 원심분리하여 SUP natant를 제거합니다. 세척 후, pact RBC 펠릿을 1.6 ml의 eend orph tube에 옮기고 300 μl의 PBS를 첨가하여 변형된 HPG의 순도를 확인한 직후 400 μl까지 용량을 늘리고, 150 mg의 S-S-H-P-G를 Dr.Glass 바이알 1개에 전달합니다.폴리머의 무게를 잰 후 S-S-H-P-G에 PBS 300마이크로리터를 첨가하고 볼텍스하여 폴리머를 용해시킵니다. 그런 다음 S-S-H-P-G 폴리머 용액을 20% 헤미드 세척된 적혈구에 첨가합니다. 다음으로, 현탁액을 부드럽게 와류로 돌린 다음 적혈구 HPG 혼합물을 실온의 안와 셰이커에 놓습니다.한 시간 후, PBS와 식염수로 용액을 4회 씻어내고 매번 supinate를 제거합니다. 그런 다음 300마이크로리터의 식염수를 포장된 적혈구의 최종 100마이크로리터 팔트에 추가하여 최종 20% 헤마토크릿 농도를 만듭니다. 이제 8ml의 기증자 전혈 세포가 실온에서 30분 동안 응고되도록 합니다.그런 다음 세포를 회전시킨 후 약 3ml의 혈청을 모아 1ml의 혈청을 섭씨 60도의 수조로 옮깁니다. 열 불활성화 세럼을 준비합니다. 30분 후, 60마이크로리터의 새 세럼과 60마이크로리터의 열 비활성화 세럼을 별도의 에프 튜브에 추가합니다.각각 60마이크로리터의 20% 헤마토크릿 HPG 변형 적혈구를 함유하고 있습니다. 그런 다음 동일한 부피의 변형되지 않은 적혈구가 들어 있는 튜브에 동일한 60마이크로리터를 추가하고 모든 적혈구 샘플을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 세포 현탁액의 헤모글로빈의 양을 정량화하기 위해 먼저 각 샘플의 5.9마이크로리터를 96웰 플레이트에 3배로 넣습니다.그런 다음 각 샘플을 294 마이크로 리터의 칙칙한 킨스 시약과 혼합하고 540 나노 미터에서 분광 광도계로 헤모글로빈 사노 유도체의 흡광도를 판독하여 supinate 원심 분리기의 헤모글로빈의 양을 정량화하고 나머지 세포 샘플을 정량 화 한 다음 96 웰 플레이트에서 각 supinate의 50 마이크로 리터를 3 배로 도금합니다. 세포를 250마이크로리터의 칙칙한 킨스 시약과 혼합한 후 이 단계에서 설명한 대로 헤모글로빈 아노 유도체의 흡광도를 측정합니다. eend orph tube에서 10% hematocrit가 포함된 50마이크로리터의 HPG 변형 RBC를 원심분리하는 것으로 시작합니다.110마이크로리터의 MTS에서 S 상등액을 버린 후 세포 펠렛과 피펫으로 용액을 몇 번 위아래로 피펫화하여 세포 현탁액을 균질화합니다. 이제 11마이크로리터의 세포 현탁액을 미니 젤의 각 컬럼에 로드합니다. 그런 다음 MTS 카드를 원심 분리기 카드 홀더에 넣고 156회 G.표면 항원의 보호로 6분 동안 카드를 회전시킵니다. 제조업체의 설명에 따라 미니 젤 컬럼의 적혈구 위치에서 확인할 수 있습니다.이 단계에서는 dextran PEG 2상 분리 시스템을 설정한 후 dextran PEG 솔루션을 스핀하여 2상 시스템을 얻습니다. 그런 다음 상부 PEG 상 1ml를 바닥이 오목한 라벨이 붙은 튜브에 조심스럽게 분취합니다. 20-30%hemog crypt HPG 변형 RBC를 20마이크로리터의 튜브에 넣고 부드럽게 튕겨 세포 현탁액을 혼합합니다.다음으로, 상부상을 포함하는 세포의 0.5 밀리리터를 하부 덱스트란 면의 0.5 밀리리터에 첨가 한 다음 시스템을 더 부드러운 플릭으로 다시 혼합합니다. 이제 2분 후에 시스템이 분리될 수 있도록 튜브를 벤치에 놓습니다. 적혈구는 상부 PEG 단계, 하부 dextra 단계 또는 두 적혈구 모두에 국한되어야 합니다.높은 수준의 HPG로 유도체화는 유세포 분석을 통해 적혈구 표면 항원의 보호를 평가하기 위해 상부 PEG 단계에 위치합니다. 먼저, 각 샘플에 대해 3개의 facts 튜브에 20마이크로리터의 식염수를 추가합니다. 그런 다음 대조군 비변형 및 HPG 변형 적혈구를 각각 5마이크로리터씩 튜브에 3배로 추가합니다.다음으로, 각 튜브에 25마이크로리터의 fit C monoclonal anti reus D를 추가하고 수조에서 섭씨 37도의 샘플을 배양합니다. 30 분 후, 샘플을 1.5 밀리리터 식염수로 세척하고, 두 번째 세척 후 매번 supinate를 두 번 제거하고, Reese는 1 ml의 식염수로 적혈구를 구부립니다. 마지막으로, 적혈구 조절 게이트에서 최소 5, 000개의 이벤트를 획득하여 표면 항원의 보호를 분석합니다.이 히스토그램에서 건강한 인간 기증자의 변형되지 않은 적혈구에서 녹색 피크로 표시되는 Resus e-Antigen의 정상적인 발현은 적혈구를 HPG에 이식할 때 Reese의 e-항원 신호의 강도가 감소하는 것으로 나타나며, 이는 회색 피크로 표시된 왼쪽으로의 발현 이동으로 입증됩니다. HPG에 의한 적혈구의 변형은 또한 CD 47의 발현을 위장하는데, 이는 이 히스토그램에서 관찰된 회색 피크의 왼쪽 이동에 의해 입증되었는데, 이는 표면 단백질의 마스킹이 HPG의 존재 하에서 발생함을 나타냅니다. 이 절차에 따라 HPG 조절제, 혈액 세포는 수혈 및 치료제의 세포 매개 전달에 적용될 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 폴리머를 적혈구에 접합하여 항원성을 수정하고 약물 전달을 위한 기반을 구성하는 방법을 더 잘 이해할 수 있을 것입니다.

antigens-protected-functional-red-blood-cells-membrane-grafting

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

본 논문은 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포의 alloantigen 특정 anergy를 유도하는 간단한 기술을 설명합니다. 기술은 아닌 alloreactive 기증자의 세포를 생성하는 임상 적용할 수 있습니다. 이러한 세포의 주입은 면역 reconstitution를 개선하고 all​​ogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 독성을 줄일 수 있습니다.

공동 stimulatory 신호 봉쇄와 Alloantigen 자극에 의​​해 사람 말초혈 Mononuclear 세포 Alloantigen 특정 Anergy의 유도

유도 및 항원에 특정한 T 세포의 확장을위한 새로운 DC 독립적인 방법을 설명합니다. HLA A2 - IG 기반의 인공 항원 제시 세포 (aAPC)을 효율적으로 다양한 항원 특이성의 CTL 확장 HLA - A2 제한 펩티드와 함께로드됩니다. 이 기술은 CTL 기반 입양 immunotherapy에 대한 잠재력을 보유하고 있습니다.

효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내</em인간 CTL의> 확장

기능 - 스페이서 - 지질 (FSL) 구조는 살아있는 세포와 virions의 표면 특성은 활력의 손실없이 수정할 수 있도록. 방법은 세포 / virion 및 자발하고 안정적​​인 표면 설립 발생과 FSL 구조 솔루션의 단순한 접촉을 필요로합니다.

FSL은 구조 : 생물 학적 마커의 범위와 셀 / Virion 표면을 수정하기위한 간단한 방법을 자신의 생존에 영향을주지 않고

고분자 혈액 도관에 대한 혈액 노출은 임상 합병증과 관련된 이물질 반응을 시작합니다. 여기에서는 이러한 도관을 통한 혈액 관류를 모방하는 실험 도구인 Chandler Loop Apparatus에 대해 설명합니다. 재조합 CD47의 부속물은 이러한 도관에서 이물질 반응의 증거를 감소시킵니다.

사용 전의 VIVO 챈들러 루프 장치 수정 된 고분자 혈액 도관의 생체 적합성을 평가하기 위해

이 논문은 정의된 동종항원에 특이적으로 반응하는 인간 T 세포 클론의 생성 및 증식 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 펩타이드-MHC 리간드에 특이적인 인간 T 세포를 클로닝하는 데 적용할 수 있습니다.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

대 식세포는 방어 면역과 항상성에 결정적인 역할을하는 조혈 시스템의 플라스틱 세포입니다. 이 보고서에서 우리는 관용적 조건 하에서 이식 장기에 축적되는 이식편 침윤 조절 macrophage를 표현형 및 기능적으로 특성화하기 위해 최적화 된 시험 관내 기술을 설명합니다.

이식 반응 면역을 억제하는 조절 성 마크로파지의 기능적 특성 규명

여기, 선물이 프로토콜을 이식, 허용 오차를 유발 하 고 생체 외에서 그리고 vivo에서 평가 받는에서 고유한 셀 하위 집합의 진압 용량 및 기증자 또는 외 인 항 원 받는 사람의 면역 상태.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 T, B 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가

기증자에서 파생 된 셀의 정량화는 engraftment hemoglobinopathies 환자에 줄기 세포 이식 후 모니터링 해야 합니다. 교류 cytometry 기반 셀 정렬, 식민지 대형 분석 결과, 및 짧은 탠덤 반복 확산을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다의 후속 분석 및 erythroid 구획에 창시자의 차별화의 조합입니다.

Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출

이 프로토콜에 설명 합니다 제거 하 고 그들은 바로 심장 도관 법 동안에 폐 동맥 쐐기는 하는 동안 남아 백조 Ganz 카 테 터의 풍선 도움말에는 폐 동맥 내 피 세포 (PAECs)의 정화 부착 하는 deflated 풍선 환자의 몸에서 제거 다음.

오른쪽 심장 도관 법 후 백조 Ganz 카 테 터의 풍선 팁에서 내 피 세포의 수확

이식편 대 숙주 질병은 동종 골수 이식 후에 중요한 합병증입니다. 수지상 세포는 이식편 대 숙주 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. 현재 논문은 이식편 대 숙주 질환및 이식편 대 백혈병 효과의 발달에 있는 수지상 세포의 역할을 조사하기 위하여 새로운 골수 이식 플랫폼을 기술합니다.

이식대 숙주 질환에서 수지상 세포의 역할을 조사하는 골수 이식 플랫폼

우리는 쥐에 있는 이종 성 복부 심혼 이식의 모형을 기술합니다, 현재 전략의 수정을 암시하는, 이는 단순화한 외과 접근으로 이끌어 내는. 추가적으로, 우리는 쥐에 있는 추가 이식 면역학 분석을 허용하는 중요한 심장 근육 세포의 귀 주입에 의하여 새로운 거부 모델을 기술합니다.

쥐에 있는 이종 심혼 및 심장 근육 세포 이식을 위한 면역학 모형

학습하세요 적혈구 표면 항원을 하이퍼브랜치드 폴리글리세롤(HPG)로 보호하는 세포막 변형 기법을 배우세요. 유세포 분석을 통해 항원 위장 효과를 검증하고 수혈 호환성을 향상시키는 방법을 탐색하세요.

항원은 컴팩트 Hyperbranched Polyglycerols 중 이식 막으로 기능 적혈구를 보호

더 많은 동영상 탐색