Name: T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 배우세요 T 세포 활성화 중 단백질 역학을 실시간 라이브 영상으로 연구하는 방법을. 공초점 현미경과 영상 분석을 결합하여 신호 복합체 형성을 정량적으로 분석하고 면역학 및 세포 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 기술 지원 소피아 튀김 감사합니다. 보조금 no.1659/08, 971 / 08, 1503년부터 1508년까지 및 10분의 491, 아니 보조금 보건 및 과학의 사역에 대한 이스라엘 과학 재단 : MBS는 자신의 연구 지원을 위해 다음과 같은 기관을 감사드립니다. 3-4114과 3-6540, 후반 알렉산더 Smidoda의 부동산을 통해 이스라엘 암 협회와 바이오 의약품의 우수성 부여에 대한 Taubenblatt 패밀리 재단.

1. T-세포의 형질 <ol><li> Nucleofector 솔루션 키트의 &quot;보충&quot;솔루션을 혼합하여 활성화 Amaxa Nucleofector 솔루션을 준비합니다. 활성화 된 솔루션은 3 개월까지에 대해 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 문화 매체 인 Jurkat T 세포를 증가 【10 % 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션, 2 RPMI에서 mM의 L-글루타민]. 최적의 세포는 1-2주 해동 후 사용한다. 로그 성장 세포 배양을 사용하여 높은 형질 전환 효율과 세포의 생존을 위해 매우 중요합니다. 또는 약간의 수정과 함께,이 프로토콜은 기본 T 세포와 함께 사용할 수 있습니다, 앞에서 8을 설명했다. 그것은 기본 T 세포의 활성화 과정의 기간 더 긴 인 Jurkat T 세포 (~ 30 분)보다 것을 강조되어야한다, 현미경 단계 배양 시스템은 CO 2, 전역 습도와 온도를 유지하는 데 사용해야 장착 활성화 프로세스입니다. </li><li> 5 수집15 ML 튜브에 형질 전환 당 × 10 6 로그 상 T 세포. </li><li> 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리하는 동안 6 잘 플레이트를 준비합니다. 37 5 ML 문화 매체 및 사전 부화 각 형질에 대해 잘 하나를 채울 ° C. </li><li> 원심 분리기에서 튜브를 수집하고 상층 액을 버린다. 1 ML RPMI에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리하는 동안 형질 솔루션을 준비합니다. 96 - 웰 플레이트 잘 하나, 찬란 태그 단백질을 코딩 관심 플라스미드의 5 μg의 DNA와 1 단계에서 제조 된 활성화 100 μl의 Amaxa Nucleofector 솔루션을 섞는다. 최적의 DNA 농도는 형질 솔루션을 희석 방지하기 위해 1 ㎍ / ㎖보다 커야합니다. </li><li> 부드러운 피펫으로 잘 섞는다. </li><li> 세포 원심 분리 한 후,주의 깊게 상층 액을 제거 D되지 동안펠렛을 isturbing. </li><li> DNA / 형질 전환 솔루션 두번을 피펫. </li><li> 펠렛의 DNA / 형질 전환 솔루션을 추가합니다. </li><li> Amaxa 큐벳에 세포를 전송합니다. </li><li> Amaxa Nucleofector 장치에 큐벳을 삽입합니다. </li><li> electroporation을위한 H-10 Amaxa의 형질 설정 (인 Jurkat) 또는 T-23 (기본 T 세포)를 사용합니다. </li><li> 인큐베이터에서 6 잘 플레이트를 제거합니다. </li><li> electroporation에 따라주의 깊게 파스퇴르 피펫을 사용하여 6 잘 플레이트에 세포 현탁액에 뜨는을 전송합니다. 세포 파편으로 구성된 펠렛이 형성 될 수 있습니다. 펠렛을 전송하지 마십시오. </li><li> 37 24 시간 동안 세포를 품어 ° C. </li><li> 새로운 우물에 각 우물에서 세포 현탁액의 2.5 ML을 전송합니다. 각 well에 2.5 ML 따뜻한 문화 매체 (2 단계에서 설명)를 추가합니다. </li><li> 72 시간 후 400 7 분 × g, 실온에서 대한 멸균 튜브와 원심 분리기에 세포를 전송합니다. 뜨는을 취소하고이를 위스콘신 교체사용되는 플라스미드에 적합한 포유류 세포 선택 항생제 (, 우리는 각각 1.3 밀리그램 / ML 및 / 또는 0.2 밀리그램 / ML의 농도 G418 및 / 또는 그로 마이신을 사용하는 데 사용되는 항생제에 적합한 농도를 적용) 보충 번째 배지. 신선한 잘있는 문화 세포 현탁액. 또한, 세포는 일시적으로 형질 전환 및 형질 전환 후 48 시간을 이미지 할 수 있습니다. 일시적으로 형질 전환 된 세포를 준비하려면 20 단계로 일반적으로 계속 8 단계에서 동시에 두 개의 플라스미드와 세포를 공동 형질하고 23 단계로 없습니다. 이 시나리오에서, 세포가 즉시 사용되어야합니다, 일반적으로 자신의 형광 강도는 이기종 반드시 높지 않다. </li><li> 적절한 선택 항생제가 첨가 배지로 세포를 성장. 세포를 분리하고 필요에 따라 항생제 첨가 배지와 함께 그들을 보충합니다. </li><li> 이주 후 FACS의 사용 (독감 성공적으로 형질을 확인로 orescence - 활성화 된 셀 정렬은) 다음 : </li><li> 10 6 형질 전환 세포 10 6 모의 형질 세포 (대조군), 그리고 안정적으로 찬란 태그 단백질을 표현하는 것으로 알려져있다 10 6 세포를 수집합니다. 세포가 하나 이상의 형광 단백질 (27 단계 참조) 형질 전환되는 경우에, 긍정적 인 컨트롤 등 여러 단독 태그 세포 라인을 사용합니다. </li><li> 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버린다. 500 μL FACS 버퍼 (PBS W / O 칼슘 2 +와 마그네슘 2 + 5 % FCS, 0.05 % 나트륨 아 지드)에있는 세포를 resuspend. </li><li> 세포의 형광을 확인 분석 FACS를 사용합니다. 부정과 긍정적 인 컨트롤의로 형질 전환 된 세포의 형광을 비교합니다. </li><li> 형질 전환 된 세포를 사용하여 추가, 찬란 태그 단백질의 단계를 반복 3-26과 세포를 형질합니다. </li><li> 형광의 높은 수준을 표시하는 셀이 사용되어야한다. 의 최적, 최소 50 %문화의 세포가 높은 형광해야한다. 세포의 형광 FACS를 통해 세포 분류에 의해 증가 될 수있다. </li></ol> 모든 추가 태그 단백질은 서로 다른 형광 물질에 융합되어야하며, 다른 선택의 항생제 인코딩 플라스미드에 인코딩. 하나 이상의 플라스미드로 형질 전환 된 세포를 선택하는 매체는 모든 적절한 항생제로 보충해야한다. 2. T 세포 확산 분석 준비 <ol><li> 실험실 테크 II 독일어 커버 글라스 시스템 4 챔버 슬라이드를 사용합니다. 실수로 준비 또는 사용 중 피펫 팁 예를 들어 챔버의 내부 표면, 스크래치하지 않도록합니다. </li><li> 50-ML 슬라이드 준비 솔루션을 준비 : 12 M (37 %), 염산 4.6 mL를 취하여, 38.5 ML 100 % 에탄올 6.9 ML 이중 증류수를 추가합니다. </li><li> 500 μL 슬라이드 준비 솔루션 슬라이드의 각 챔버를 채우십시오. </li><li> 10 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 챔버 흡입의, 완전히 건조. </li><li> ° C까지 완전히 건조 45 1 시간 동안 폭로 슬라이드를 품어. </li><li> 이중 증류수에 0.1 % 폴리-L-라이신 (시그마 - 알드리치)을 희석하여 0.01 % 폴리-L-라이신 솔루션을 준비합니다. </li><li> 각 챔버에 500 μl를 적용합니다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 슬라이드를 품어. </li><li> 그들을 완전히 건조 챔버를 대기음. </li><li> ° C까지 완전히 건조 45 3 시간 동안 품어. </li><li> 코팅 된 슬라이드는 실온에서 몇 달 동안 건조 저장할 수 있습니다. </li><li> 활성화 항체 솔루션을 준비합니다. HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) 또는 UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 챔버 당 400 ㎕의 PBS에서 10 ㎍ / ㎖ 하나 : 항 CD3 항체를 사용합니다. 이 솔루션은 곧 슬라이드 준비하기 전에 준비를해야합니다. </li><li> 활성화 항체 용액 400 μL 각 챔버를 채우십시오. </li><li> 4에서 하룻밤, 바람직하게는 37 ° C 또는에서 2 시간 동안 슬라이드를 품어 ° C. </li><li> 활성화 항체 졸 제거ution 즉시 300 μL PBS로 두 번 실을 씻는다. 이 시점에서, 실이 버퍼로 가득 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 4 ℃에서 PBS - 채워진 슬라이드를 저장 우리는 1 주 안에 준비된 슬라이드 챔버를 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. T 세포 활성화 및 이미징 <ol><li> [1.25 ML의 HEPES (1 M) 10 ㎖ FCS, 38.75 ML RPMI 페놀 레드없이] 이미지 버퍼를 준비합니다. 이미지 버퍼는 4 ° C 후 여과에 저장할 수 있습니다. </li><li> 자이스 혈구 LSM 510 메타 현미경을 활성화합니다. 37 현미경 가열이 장착 프레임을 따뜻하게 ° C. &quot;전문가 모드&quot;를 선택합니다. </li><li> &quot;취득&quot;탭을 클릭하고 다음 탭을 엽니 레이저, 현미경, 구성, 검사, 시간 시리즈. </li><li> 필요한 레이저를 활성화합니다. MCFP 및 mYFP의 자극에 대한 다음 &quot;의&quot;5 분 &quot;대기&quot;로 아르곤 / 2 레이저가 설정합니다. </li><li> 당신은 같은 형광체를 사용하기 전에이 라이브 세포 이미징 분석을 수행 한 경우, 결과 LSM 파일을 열고, 나는 &quot;재사용&quot;을 클릭사기꾼, 9 단계에서 계속합니다. 그렇지 않으면 6 단계에서 계속합니다. </li><li> 사용 된 형광 단백질의 여기 및 방출에 대한 적절한 필터를 사용하여 채널을 정의합니다. </li><li> &quot;스캔 제어&quot;창에서, Z 스택 옵션을 선택합니다. </li><li> 0.5 μm의, 현재 조각 : 3; 슬라이스 번호 : 간격 5 다음 검색 매개 변수를 입력합니다. </li><li> 현미경 근처에 37 Accublock 디지털 건조한 목욕 (Labnet) ° C를 준비합니다. </li><li> 37 ° C.에 이미지 버퍼를 따뜻하게 </li><li> 따뜻한 이미지 버퍼 600 μL로 대체, PBS를 흡입하여 저장된 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 37 슬라이드를 품어 ° C. 13 단계까지 적어도 15 분 동안 인큐베이터에서 슬라이드를 유지합니다. </li><li> 5를 수집 × 10 5 형질 전환 된 T 세포를. </li><li> 400 × g에서 2 분간 세포를 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버린다. </li><li> 1 ML 따뜻한 이미지 버퍼에있는 세포를 resuspend하고, 1.5 ML 에펜 도르프 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> t를 놓고Accublock 디지털 건조한 목욕에 동부 표준시 관. </li><li> 인큐베이터에서 따뜻하게 슬라이드를 가지고, 예열 현미경 장착 프레임에 마운트합니다. </li><li> &quot;VIS&quot;아이콘을 클릭합니다. </li><li> 세포 현탁액을 혼합하고 1-2 μl를 제거합니다. </li><li> 슬라이드의 하단에 위의 이미지 버퍼에 피펫의 팁을 삽입합니다. 슬라이드가 긁히지 않도록. </li><li> 목표의 구멍에 씨앗 세포를. </li><li> 그들이 내려 가면 즉시 시각적으로 형광 세포를 추적을 시작합니다. 두 채널에서 높은 형광을 표시하는 셀을 선택합니다. </li><li> 셀이 슬라이드의 표면에 도달하기 전에, LSM 모드를 활성화합니다. </li><li> 단 하나의 여기 레이저를 전환합니다. 당신은 DIC 채널을 가지고있는 레이저를 선택합니다. </li><li> 1로 줌을 설정합니다. &quot;빠른 XY&quot;아이콘을 클릭합니다. &quot;정지&quot;아이콘을 클릭합니다. 자르기 도구를 사용하여 셀을 중심으로 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. </li><li> 3 줌을 설정합니다. &quot;빠른 XY&quot;아이콘을 클릭 한 다음 수동으로 최적의 셀을 볼 포커스를 설정합니다. &quot;정지&quot;ICO을 클릭N. </li><li> 모든 필요한 여기 레이저를 전환합니다. </li><li> &quot;StartT&quot;아이콘을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 이미지 확산 과정 (일반적으로 5 분)의 전체 셀을. 완료되면, &quot;정지&quot;아이콘을 클릭합니다. </li><li> 파일을 저장합니다. </li><li> 추가 세포를 획득하려면 &quot;VIS&quot;아이콘을 클릭합니다. 아직 슬라이드의 바닥에 접촉하지 않은 세포가있는 경우, 23 단계에서 계속합니다. 이미 확산 과정을 시작했습니다 이미징 세포를 피할 수 있습니다. 그렇지 않으면 32 단계로 진행합니다. </li><li> 관찰 슬라이드 영역이 세포의 대부분이없는 경우, 셀 (20 단계부터 계속합니다)의 또 다른 나누어지는을 추가합니다. 그렇지 않으면 33 단계로 진행합니다. </li><li> 추가 세포를 얻으려면 목적의 구멍 위의 영역이 세포의 결여되도록 슬라이드를 이동합니다. </li><li> 세포 (및 20 단계에서 계속) 다른 나누어지는을 추가합니다. </li><li> 원하는 모든 이미지를 수행 한 후, 저장된 LSM 파일을 엽니 다. </li><li> &quot;갤러리&quot;, &quot;시간 + Z&quot;와 &quot;부분&quot;을 클릭합니다. </li><li> relevan을 선택t 시간 범위와 Z 스택. </li><li> 새 파일을 저장합니다. </li><li> 모든 이미지 파일에 대한 단계 35-38를 수행합니다. </li></ol> 4. 영상 데이터 분석 <ol><li> Imaris 소프트웨어 (비트 플레인 AG, 취리히 스위스)를 사용하여 LSM 파일을 엽니 다. </li><li> &quot;능가&quot;을 클릭합니다. &quot;이미지 프로세싱&quot;메뉴를 클릭하고 &quot;시간과 Z 스왑&quot;를 선택합니다. 이 이미지의 정확한 자르기에 도움이 될 것입니다. </li><li> &quot;편집&quot;도구 모음을 클릭하고 드롭 메뉴에서 &quot;자르기 3D&quot;옵션을 선택합니다. 세포를 둘러싸고있는 영역 만 포함하도록 이미지를 자르. 우리는 셀을 중심으로 300 × 300 픽셀의 사각형을 자르기 좋습니다. 세포의 모양과 위치가 시간이 지남에 따라 변경 될 수 있습니다. t 축을 관찰하면 세포가 모든 시간 지점에서 자른 영역 내에 있는지 확인합니다. </li><li> &quot;이미지 프로세싱&quot;메뉴를 클릭하고 이미지의 원래 시간적 분리를 복원하는 &quot;시간과 Z 스왑&quot;를 선택합니다. </li><li> 기본 도구 모음에서 &quot;Coloc&quot;버튼을 누르십시오. &quot;데 시간 빌드를 선택P. Coloc. &quot;Imaris는 각 시점에서 각 채널에 대한 강도 임계 값을 계산합니다. </li><li> &quot;채널 통계&quot;를 선택하여 colocalization을 분석의 결과를 볼 수 있습니다. &quot;내보내기&quot;를 클릭하여 데이터를 내 보냅니다. </li><li> 각 군데 셀에 대해 6 단계를 반복합니다. 우리는 적어도 50 세포가 이러한 방식으로 분석하는 것이 좋습니다. </li><li> 평균 피어슨의 colocalization을 계수 및 표준 오류 또는 편차를 계산합니다. </li></ol>

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</ol>

우리는 공개 할 관심 없음 충돌이 없습니다.

여러 세포 프로세스의 규제 기능은 단백질 - 단백질 상호 작용의 형성 및 종료에 따라 달라집니다. 현미경 영상은 살아있는 세포에서 찬란 태그 단백질의 실시간 추적을 할 수 있습니다. 태그 단백질의 colocalization을이 단백질 사이의 직접 또는 간접적으로 상호 작용을 제안 할 수 있습니다, 그리고 면역 침전 등의 생화학 적 방법에 의해 얻어진 결과를 강화하는 데 사용할 수 있습니다. 생화학 적 방법과는 달리, 살아있는 세포 이미징이 간 단백질의 상호 작용이 발생할 때 생리적 인 과정의 모니터링을 촉진하고 단백질의 세포 분포의 검출, 공간적 및 시간에 관찰 할 수 있습니다. colocalization을의 정량 분석을위한 다양한 도구가 개발되었다; 피어슨의 상관 계수는 두 개의 단백질 12 사이 colocalization을 정도의 정량화를위한 ​​아주 매력적이고 널리 사용되는 방법 남아 있습니다. 반면 형광 공명 전자에너 전송 (무서워) 실험 가까이 (10 NM)을 특징으로 간 단백질 상호 작용의 검출을...

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약/재료</td></tr><tr><td>Amaxa 인간 T 세포 핵 펙터 키트</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD3 (UCHT1 클론) </td><td>BioLegend</td><td>300432</td><td></td></tr><tr><td>Falcon FACS 튜브</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Calbiochem</td><td>345810</td><td></td></tr><tr><td>독일 커버 글라스 시스템 4 챔버 슬라이드 </td><td>Lab-Tek II</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Bio Lab</td><td>8410501</td><td></td></tr><tr><td>Hepes </td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hygomycin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-306</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 </td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td> <td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 </td><td>시그마</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 0.1 % (w/v) in H2O</td><td>시그마</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>시그마</td><td>R87589</td><td></td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>시그마</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment </td></tr><tr><td>Accublock 디지털 드라이 배스</td><td>Labnet</td><td>D1105A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>가열식 장착 프레임 - 가열 인서트 P S </td><td>PeCon</td><td>130-800-031</td><td></td></tr><tr><td>TempModule S (가열식 장착 프레임에 필요)</td><td>Zeiss</td><td>411860-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>전기천공법 장치</td><td>Amaxa</td><td>Nucleofector I</td><td></td></tr><tr><td>형광 활성 세포 분류기</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACSVantage SE</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>Bitplane</td><td>7.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

t 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

전염성 질병에 대한 보호는 면역 시스템 1,2에 의해 중재된다. T 림프구는 여러 면역 세포 3,4의 활성화와 반응을 조절, 면역 시스템의 마스터 코디네이터입니다. T-세포의 활성화는 항원 제시 세포 (APC를)에 의해 표시되는 특정 항원의 인식에 따라 달라집니다. T 세포 항원 수용체 (TCR)는 각 T 세포 클론에 특정한 항원 특이성 5를 결정합니다. 항원에 TCR의 바인딩은 TCR 복합 구성 요소의 인산화를 유도합니다. T 세포 활성화를 촉진하기 위해이 신호는 같은 TCR에 신호 단백질의 모집 등 다양한 중요한 응답을 시작, 막의 세포질과 핵 형질해야하며 APC 사이트 (면역 시냅스), 자신의 분자 활성화, 골격 재 배열, 세포 내 칼슘 농도의 상승, 유전자 발현 6,7의 변화. 에서 올바른활성화 신호의 itiation 및 종료 적절한 T 세포 반응을 위해 매우 중요합니다. 신호 단백질의 활동은 단백질 - 단백질 상호 작용의 형성과 종료에 따라 달라집니다, 이러한 단백질 인산화 단백질 복합체, 단백질의 ubiquitylation 다양한 휴대 사이트 8 단백질의 모집 형성으로 번역 수정을 게시 할 수 있습니다. T-세포 활성화 과정의 내부 동작을 이해하는 것은 면역 학적 연구와 임상 응용 프로그램 모두에 매우 중요합니다. 다양한 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하기 위해 개발되었습니다, 그러나, 널리 사용되는 공동 immunoprecipitation의 방법으로 생화학 적 분석은, 따라서 세포의 역학에 대한 귀중한 통찰력의 관찰을 배제, 단백질의 위치가 식별 될 수 없습니다 메커니즘. 또한 이러한 대량 분석은 일반적으로 t의 다른 단계에있을 수있는 많은 다른 세포에서 단백질을 결합그는 세포 프로세스를 조사 하였다. 이 시간 해상도에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 살아있는 세포의 실시간 영상의 사용은 따라서 공정 9,10의 역학에 빛을 흘리는, 단백질의 공간적 추적 및 시간적 신호 이벤트를 구별 할 수있는 능력을 모두 할 수 있습니다. 우리는 T 세포 활성화 중에 신호 복잡한 형성의 실시간 영상의 방법을 제시한다. 기본 T 세포 또는 인 Jurkat 같은 T - 세포 라인, 비 생리적 인 올리고머 11을 방지 단량체 형광 단백질에 융합 관심의 단백질에 대한 인코딩 플라스미드 형질 전환됩니다. 라이브 T 세포는 특정 활성화 항원에 대한 필요성을 극복하면서 T 세포의 활성화를 유도 CD3/TCR 복합체에 결합 T-세포 활성화 항체 8,9와 coverslip을 미리 코팅을 통해 삭제됩니다. 활성화 된 세포는 지속적으로 공 촛점 현미경의 사용으로 몇 군데 있습니다. 영상 데이터는 COL과 같은 정량적 인 결과를 산출하기 위해 분석신호 단백질의 ocalization 계수.

우리는 살아있는 T 세포 이미징 및 분석의 예를 제시한다. 영상 실험에 앞서, SLP76 결핍 T 세포 (J14)는 형광 단백질 (그림 1)의 발현을 결정하는 FACS의 사용으로 분석 하였다. 태그 신호 단백질 MCFP - NCK와 SLP76-mYFP로 형질 전환 된 T 세포는 활성화 슬라이드를 통해 입금 및 T 세포의 확산 (그림 2) 중 몇 군데 있었다. 수집 된 이미지 활성화 및 (그림 3) 확산을 통해 단백질 지방화의 역 동성을 보여줍니다. 인간의 편견을 최소화하면서 컴퓨터 이미지 처리, 새로운 통찰력과 시각 세포의 정량적 정보를 제공합니다. 세포의 활성화 과정을 통해 두 단백질의 colocalization을 검토하기 위해, 우리는 Imaris 소프트웨어 (비트 플레인 AG, 취리히 스위스)의 colocalization을 도구를 활용. 몇 군데 세포에 걸쳐 서로 다른 시간 지점 사이 colocalization을 계수를 비교하여, ...

우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

이 비디오는 일차 인간 T 세포와 지지된 지질 이중층(SLB) 사이의 면역 시냅스 형성을 연구하는 시험관 내 기술을 보여줍니다. T 세포 표면 단백질은 SLB에 고정된 각 리간드와 상호 작용하여 면역 시냅스를 형성한 다음, lytic granule이 시냅스를 향해 이동하며, 이는 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

지원되는 평면 지질 이중층과의 T 세포 상호 작용을 연구하기 위한 In Vitro 기술

이 비디오는 T 림프구와 형광 항원을 운반하는 상피 세포 간의 상호 작용을 조사하여 면역학적 시냅스 토폴로지의 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 형광 현미경 검사는 내피 세포에서 적색 세포질 변위와 노란색 막 고리를 보여주어 면역학적 시냅스의 형성을 나타냅니다.

Live-Cell Imaging을 통한 면역학적 Synapse 토폴로지 평가

적응 면역은 T 세포와 항원 제시 세포 사이에 형성된 역동적인 '면역학적 시냅스'에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜은 연구가 부족한 생리학적 APC이자 새로운 유형의 '평면 세포 APC 모델'로서 내피 세포를 조사하는 방법을 설명합니다.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

T 세포 면역학적 시냅스에서 필라멘트 액틴의 유속과 방향성을 조사하기 위해 라이브 셀 초해상도 이미징을 내부 전반사 형광과 결합하고 시공간 이미지 상관 분광법으로 정량화합니다.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.

Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

프로토콜 평면 지질 bilayers를 사용 하 여 시 냅 스 인터페이스를 형성 하는 기본 polyclonal 인간 T 세포의 기능을 연구 하는 기법을 설명 합니다. 우리 림프절과 주변 혈액에서 파생 하는 인간의 기본 T 세포의 차별 시 냅 스 형성 기능을이 기법을 사용 합니다.

말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

이 프로토콜의 목표는 살아있는 세포에 있는 표면 수용체 역학을 4 차원으로 가시화하기 위하여 격자 빛 시트 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 여기서CD4+ 원발성 T 세포상에 T 세포 수용체가 도시된다.

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

이러한 프로토콜은 면역학적 시냅스 형성및 면역학적 시냅스를 향한 후속 편광 분비 트래픽을 모두 이미지화한다. 세포 접합체는 초항원 펄스 라지 세포 (항원 제시 세포역할을 함)와 Jurkat 클론 (이펙터 도우미 T 림프구로 작용)사이에 형성되었습니다.

인간 면역학적 시냅스 이미징

여기에서는 형광 현미경을 사용하여 원발성 쥐 및 인간 T 세포에서 Ca2+ 마이크로도메인으로 알려진 초기 국소 Ca2+ 신호를 분석하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 면역 세포 내의 Ca2+ 신호 경로를 조사하고 그 기능을 더 자세히 밝히는 데 귀중한 리소스 역할을 합니다.

일차 T 세포에서 초기 Ca2+ 마이크로도메인 이미징

배우세요 T 세포 활성화 중 단백질 역학을 실시간 라이브 영상으로 연구하는 방법을. 공초점 현미경과 영상 분석을 결합하여 신호 복합체 형성을 정량적으로 분석하고 면역학 및 세포 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

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