Name: Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 배우세요 제브라피시 자생종양 모델을 활용한 흑색종 조절 유전자 고속 스크리닝 방법입니다. miniCoopR 벡터로 멜라닌세포에서 유전자 발현을 조절하여 종양 발생과 진행을 평가하는 기술을 익히세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

와 제임스 Neiswender, 순영 관이 작업에 사용 plasmids의 선물의 고 (故) 치 빈 치엔; 항체 염색법과 도움 제임스 리스터와 데이빗 Raible 우리는 그의 연구실이 기술이 처음 개발에서 박사 레너드 I. Zon 감사 microinjection 비디오. 이 작품은 CJC에 NIH 보조금 R00AR056899-03가 추진하는 사업

1. 흑종의 발병 조절을위한 검사 <ol><li> PCR 관심의 유전자의 전체 길이 열려있는 독서 프레임 (GOI)를 증폭하고 BP clonase II (Invitrogen)를 사용하여 pDONR 221에 ​​recombining에 의해 게이트웨이 중간 항목 클론을 만들 수 있습니다. miniCoopR 벡터 (그림 1A)에 mitfa 프로모터에서의 관심 유전자를 삽입 재조합 p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 miniCoopR 5 Multisite 게이트웨이 기술 (Invitrogen)를 사용합니다. </li><li> 이전 7에 설명 된대로 mitfa (LF) triply homozygous zebrafish의 배아, p53의 (만약에) : 한 셀 TG (BRAF V600E mitfa)에 25 picograms Tol2 transposase의 mRNA와 함께 각 클론의 25 picograms를 삽입. 28.5에서 주입 배아를 배양 ° C. 24 hpf에있는 죽은 태아를 제거합니다. </li><li> 해부 microscop에 주입 배아를 포함하는 페트리 접시를 배치하여 72 hpf에서 구출 melanocytes과 유전자 변형 동물을 선택흰색 배경 (그림 1A)에 대한 입사광에 따라 5. </li><li> 이전에 8에 설명 된대로 네 dpf에서 zebrafish 시설의 보육의 3 L 탱크에 동물을 전송합니다. </li><li> 2개월에서 4mm 2 (그림 1A)보다 큰 melanocyte 구조의 적어도 하나의 공간이있는 동물을 선택합니다. 72 hpf에서 melanocyte 구조의 정도, 2 개월 melanocyte 구조의 정도 사이에 강한 상관 관계가 있습니다. melanocyte 구조와 태아가 72 hpf로 선택하는 경우, 그들 중 대부분 (~ 80 %) 2 개월 4mm 2보다 큰 melanocyte 구조의 적어도 하나의 영역을 갖게됩니다. </li><li> 화면 종양의 존재 (그림 1B)에 대한 주간 선택한 동물. histopathologic와 morphologic 변경 사항을 사이에 강한 상관 관계가 있습니다. 양성에서 악성으로 전환이 병변은 동물의 표면을 제기 될 morphologic 변경으로 인정 받고 있습니다. 종양 베어링 애니 마을 분리연구 있나요. </li><li> 종좌표에 자리표와 %의 흑색 증이없는 생존의 주 나이가 흑색 증 - 무료 생존 곡선을 그립니다. 관심있는 유전자를 표현하는 melanocytes가있는 동물은 동물을 제어하는 비교됩니다 melanocytes에서 명시 적 EGFP (강화 된 녹색 형광 단백질) (그림 1C). miniCoopR-EGFP를 주입 동물에 대한 중간 종양의 증상은 약 18 주입니다. 두 곡선이 로그 순위 테스트를 사용하여 통계적으로 다른 있는지 여부를 확인합니다. </li></ol> 2. 종양 침략 분석 <ol><li> hindbrain과 등쪽 지느러미 (그림 2A)의 앞쪽에 경계의 뒤쪽 경계 사이의 지역에서, dorsally 종양을 개발하는 절연 zebrafish를 선택합니다. </li><li> 흑색 증의 증상은 메사추세츠 의과 대학 기능 대학에서 안락사에 대한 미국의 동물 의료 협회 패널에 의해 지정된 및 승인 지침에 따라 물고기를 안락사시켜야 2 주 후에titutional 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC). 아가미의 움직임이 멈출 때까지 특히, 생선은 0.6 MG / ML tricaine와 함께 그릇에 배치됩니다. </li><li> 메스 생선의 복막 캐비티에 절개를 확인하고 고정에 대해 4 ° C에서 밤새 4 % paraformaldehyde에있는 물고기 (PFA)를 넣습니다. </li><li> 4에서 하루 아침에 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 함께 치료 ° C가 decalcify합니다. </li><li> 밤 60시 2 시간 각 2 회 ° C.를 1 시간에 크실렌 3 회와 분명 1 시간에 탈수하고 파라핀으로 처리 카세트에 포르말린으로 고정 </li><li> 몰드에 파라핀의 조직을 삽입하고 30 분 ~ 1 시간을 위해 더욱 강화 할 수 있습니다. </li><li> 5 μm 섹션, 하나마다 50 μm하십시오. 섹션은 가로와 깊은 침략의 요점을 식별 할 수 있도록 전체 병변을 통해해야합니다. hematoxylin 및 eosin의 착색에 따릅니다. </li><li> 종양 세포가 collagenous 지층 compactum 밖에 남아 있는지 여부를 측정하여 종양 침략을 평가 등쪽에 침략근육은 나 척추 (그림 2B, C)에 더 침략. 샘플의 두 집합 사이의 통계적 차이를 확인합니다. </li></ol> 3. 규모 Melanocytes의 항체 염색법 <ol><li> 80 ML 0.1 M 오세영 2 HPO 4, 20 ML 0.1M 아니 2 PO 4 PO4 버퍼를 확인합니다. 산도는 7.3 있는지 확인하십시오. 8.0 g의 자당, 0.15 ML 0.2M CaCl 2, 90 ML 0.2M PO 4 버퍼, 산도 7.3을 포함하는 2 배 수정 버퍼를 확인합니다. 필요는 NaOH 또는 HCL과 7.3로 pH를 조정한다면 PO 4 버퍼 100 ML까지합니다. </li><li> 300 MG 고체 PFA까지 무게 microcentrifuge 튜브에 추가합니다. PFA 4.5 X 질량, MG에서 (예를 들면 450 UL 5 MM NaOH 100 MG PFA까지)와 같은 볼륨에 5 MM NaOH를 추가합니다. 60-70에서 열 ° C PFA가 해산 될 때까지 흔들림 가끔있는. 나머지 입자를 스핀 다운 20 % PFA 표면에 뜨는을 복구합니다. 신선한 때마다 확인합니다. </li><li> 1X Fi 접속 설비를 포함하는 고정 솔루션을 준비X 버퍼와 4퍼센트 PFA. </li><li> 0.17 MG / ML tricaine에서 물고기를 마취. </li><li> 날카로운 미세 스쳐 집게를 사용하여 등쪽의 비늘은 꺽을 해부 현미경으로 입사 광을 사용하여 규모의 melanocyte 함유 절반 (그림 3A)를 손상하지 돌봐. 직접 한 ML의 고정 솔루션과 실온에서 알을 품다,에 포셉 곳에서의 비늘가 도는 동안, ≥ 2 시간에. 물고기 물에 물고기를 전송하고 성공적인 복구를 확인하기 위해 생선을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 표백 색소 melanocytes는 실온에서 5 분에 PBST (1X PBS 산도 7.4, 0.1 % 트리톤 X-100) 2 번에 고정 비늘을 씻어합니다. DH 2 O. 5 개 ML에 0.4 ML 10% 코와 0.15 ML 30% H 2 O 2를 포함 한 ML을 추가 갓 만든 표백 솔루션 튜브가 열려 파열에서 가스를 방지하기 위해 parafilm이나 모자를 자물쇠에 놔. 안료는 (그림 3B, C) ​​(10 분 전형적인) 사라질 때까지 표백 계속합니다. 온도는 실온에서 5 분 동안 PBST 네 번에 씻어erature. </li><li> 1X PBS 산도 7.4, 0.2 % 트리톤 X-100, 2 밀리그램 / ML BSA, 1 % DMSO, 0.02 % 할머니 3 2% 양 혈청으로 구성 블록 솔루션에 적어도 30 분을위한 블록. HRP 반응을 개발하면 할머니 3을 둡니다. </li><li> 실온에서 하룻밤 블록 솔루션에 기본 항체를 품다. 당신이 그들을 침수 유지하기 위해 샘플을 통해 솔루션의 적어도 400 μl이 필요합니다. </li><li> 상온에서 PBST에서 30 분의 비늘에게 3 번 씻으십시오. </li><li> 2 시간에서 실온에서 블록 솔루션 야간에 차 항체를 품다. </li><li> PBST + 0.1 μM의 DAPI로 10 분에 청바지. </li><li> PBST로 5 분에 3 번 씻으십시오. </li><li> 비늘의 오목면이 슬라이드 밑에 직면 있도록 vectashield 한 방울의 유리 슬라이드에 비늘를 장착하고 이상 유리 커버 전표를 놓습니다. 투명 매니큐어와 슬라이드의 가장자리를 밀봉하고 형광 현미경 (그림 3D, E, F, G에서 슬라이드를 관찰 </strong&gt;). </li></ol> 4. 이식 검정 <ol><li> 이식 10 이전 감마 방사선의 25 GY 일일를 irradiating에 의해받는 2~3개월 이전 캐스퍼 9 생선을 준비합니다. 물고기는 물고기 물에 복구 할 수 있습니다. </li><li> 이전에 설명 된대로 종양 - 베어링 생선 (2.2 절)을​​ 안락사시켜야. </li><li> 종양을 잘라 5 % FBS와 0.9x PBS를 소독 약 5 ML 필터를 페트리 접시에 넣어. 면도기 솔루션 중에있는 종양를 분석. </li><li> 실온에서 근무, 단일 세포를 얻을 수있는 P1000 피펫을 씹다. 5% FBS와 필터를 소독 0.9x PBS로 볼륨 25 ML로 구성합니다. </li><li> 40 μM 메쉬 필터를 통해 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 10 분에 1,500 RPM (453 rcf)에서 Eppendorf 5810R의 탁상 원심 분리기에 봐. </li><li> 표면에 뜨는를 제거하고 약 원하는 농도 (100mm 3 종양에 대한 10 7 세포를 가정)에 세포 현탁액을합니다. </li><li> t를 계산그는 정확한 휴대폰 번호는 hemocytometer를 사용하여 최종 사출 볼륨이 약 5 μl이되도록 세포 현탁액을 희석. 50000 세포 주입 할 경우 예를 들어, 세포 현탁액은 10,000 세포 / μl의 최종 농도로 희석해야합니다. 세포 현탁액에게 전지 거리며 걷게을 방지하기 위해 모든 몇 분을 포함하는 관을 긋기. </li><li> 2 ~ 3 배는 100 % 에탄올과 0.9x PBS와 26s 게이지 (베벨 팁) 701 N 10 μl 해밀턴 주사기를 씻으십시오. 세포 현탁액의 5 μl로 주사기를로드합니다. </li><li> 0.17 MG / ML tricaine에서 방사능받는 물고기를 마취. 젖은 Kimwipe에서의 편에 자리 물고기 (그림 4A). </li><li> 한 손으로 물고기를 안정화 약 반 hindbrain와 등쪽 지느러미 앞쪽 테두리의 뒤쪽 경계 사이의 복막 캐비티 위의 생선의 측면에 45 ° 각도로 일어나 직면하고있는 베벨로 바늘을 삽입합니다. 부드럽게 플런저를 (그림 4B) 우울. &lt;/ 리&gt; <li> 생선 신선한 생선 물에 복구하고 종양 engraftment (그림 4C)를 매일 물고기를 관찰 할 수 있습니다. engraftment가 발생했습니다 경우, 지속적인 성장과 질병 개발도 볼 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li>
<li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sets+of+genetic+alterations+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Distinct sets of genetic alterations in melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).</li>
<li>Lin, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+genomic+diversity+and+tumor+dependency+in+malignant+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma.</a> Cancer Res. 68, 664-673 (2008).</li>
<li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).</li>
<li>Ceol, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+SETDB1+is+recurrently+amplified+in+melanoma+and+accelerates+its+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset.</a> Nature. 471, 513-517 (2011).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+of+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

miniCoopR 방법은 zebrafish melanocytes에 대한 관심의 유전자의 표현이 가능합니다. 이 방법은 zebrafish mitfa 유전자가 세포 자율적으로 역할을한다는 사실을 활용합니다. 이러한 이유로, miniCoopR 벡터에 의해 구출 melanocytes는 minigene이 있고 물리적으로 연결된다에 관심이있는 유전자를 포함 할 확신합니다. 구출 melanocytes는 명확하게 볼 수 있으며, 단일 셀 배아로 주입 된 동물에서 얻을 수 있습니다. chimerism의 지정된 수준이 선택되어,이 컷오프를 능가 동물은 종양 발병 또는 기타 특성을 채점 할 수 있습니다. miniCoopR 방법의 가장 큰 장점은 충분한 chimerism과 동물 쉽게 식별하고 테스트 관심의 모든 유전자에 해당 안정적으로 유전자 변형 라인을 취득 할 필요없이 득점 할 수 있다는 것입니다. 시간과 노력, 비용을 조사 할 관심 유전자의 수에 비례에 저장됩니다. 이전 <s...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 게이트웨이 재결합 시약 </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> miniCoopR </td><td></td><td></td><td> 인용 발명 5 </td></tr><tr><td> Mitfa 항체 </td><td></td><td></td><td> 인용 발명 5 </td></tr><tr><td> FITC 염소 안티 - 토끼 IgG 항체 </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> 벡터 연구소 </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 캐스퍼 Zebrafish </td><td></td><td></td><td> 참조 9 </td></tr><tr><td> 701N 10 μl 주사기 </td><td> 해밀턴 / 피셔 </td><td> 14-824 </td><td> 및nbsp; </td></tr><tr><td> 40 μM 필터 </td><td> BD 팔콘 / 피셔 </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

인간의 암의 게놈 연구는 종양 하나, 둘, 셋에서 변경 아르 유전자에 대한 풍부한 정보를 굴복했습니다. 이 연구에서 발생하는 문제는 많은 유전자가 변경된다는 것입니다, 그것은 모든 사람들이 변화하는 동안 부수적으로 발생한 그에서 tumorigenesis를 몰고 유전자 변경을 구분하기 어려울 수 있습니다. 이 구별을 그리려면이 양적 종양 계속하고 배포 할 수 있도록 종양 개시 및 기타 프로세스에 변경된 유전자의 효과를 측정 할 수 있습니다 검정을 가지고 유용합니다. 여기 흑색 증의 개시 및 유지 보수에 필요한 단계를 포함 autochthonous 종양 모델 (4)를 사용하여 zebrafish에 후보 흑색 증 조절 다수의 화면에 빠른 방법을 제시한다. 이 분석의 주요 시약 어떤 게이트웨이 재결합 카세트에 커플 mitfa melanocyte 사양 계수의 야생 형 사본을 miniCoopR 벡터, 어느 후보 멜로anoma 유전자는 5 재결합 할 수 있습니다. miniCoopR 벡터는 발기인, 오픈 읽기 프레임과 야생 형 mitfa 유전자의 3&#39;-번역되지 않은 지역을 포함하는 mitfa의 구조를 minigene 있습니다. 우리는 후보 흑색 증 조절의 전체 길이 열려있는 독서 프레임을 사용하여 구조를 할 수 있습니다. p53의 (만약에); mitfa (LF) zebrafish의 배아 :이 각각의 클론 그런 다음 단일 셀 TG (BRAF V600E mitfa)에 주입 될 수있다. miniCoopR 벡터는 Tol2로 인한 transgenesis 6 통합 melanocytes를 구출됩니다. 그들이 실제로 mitfa 구출 minigene에 연결되기 때문에, 후보 유전자는 변화와 종양으로 발전 할 일부의 구출 melanocytes에 표현됩니다. 흑색 증의 개시 및 흑색 증 세포의 특성에 후보 유전자의 효과가 흑색 증없는 생존 곡선, 침략의 assays, 항체 염색법과 이식 assays를 사용하여 측정 할 수 있습니다.

하나의 셀 TG (mitfa : BRAF V600E), p53의 (만약에), mitfa (LF) zebrafish의 배아는 흑색 증의 종양 유전자 mitfa 프로모터의 조절하에 SETDB1 5 EGFP 각을 포함하는 miniCoopR 벡터를 주입했다. melanocyte 구조와 태아가 선택되고 성숙 할 수 있었다. melanocyte 구조와 세 동물 2 개월에 4mm 2보다 더 큰이 선택되었습니다. 동물 melanomas 주 단위로 상영되었다. 성인을위한 종양 발생률 곡선은 SETDB1 종양 유전자는 크게 EGFP 제어 (그림 1)에 비해 흑색 증의 onsetas을 가속화 것으로 나타났다. hindbrain의 뒤쪽 경계와 등쪽 지느러미 (그림 2A)의 앞 국경 사이에 종양을 개발 동물 격리되었다. 두 주 흑색 증의 발병 후에는 hem...

zebrafish autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑색 증 조절을위한 화면으로 빠른 방법은 제공됩니다. 그것은 melanocytes에서 후보 흑색 증의 유전자의 표현을 허용 miniCoopR 벡터의 이점을 걸립니다. 흑색 증 - 무료 생존 곡선, 침략 분석, 규모 melanocytes의 항체 염색법을위한 프로토콜과 흑색 증 이식 분석을 구하는 방법이 설명되어 있습니다.

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

다음 실험의 전반적인 목표는 제브라피시 자가 종양 모델을 사용하여 흑색종 변형자를 스크리닝하는 것입니다. 이것은 멜라닌 세포가 관심 유전자를 발현하고 물고기가 흑색종에 걸리기 쉬운 형질전환 동물을 만들어 달성됩니다. 다음으로, 관심 유전자가 종양 시작을 변경하는지 여부를 평가하기 위해 흑색종 발병을 점수화합니다.그런 다음 종양 침입 및 세포 특이적 분석을 수행하여 흑색종 및 전악성 멜라닌 세포에 대한 관심 유전자의 추가 영향을 확인합니다. 마지막으로, 관심 유전자가 확립된 종양에서 흑색종 시작 세포의 빈도에 어떤 영향을 미치는지 측정하기 위해 흑색종 세포를 이식합니다. 결과는 후보 유전자가 발병 침입 및 이식 능력을 포함하여 멜라닌 세포와 흑색종의 다양한 특성에 어떻게 영향을 미치는지를 보여줍니다.후보 암 유전자 조사를 위한 생식계열 형질전환과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 시간, 노력 및 비용이 절약되고 분석을 통해 처리량이 증가한다는 것입니다. 차임 형질전환 동물에서 종양 발생의 다양한 측면 이 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 대학원생인 셰라니아 한천이 주사를 위한 구조체를 생성하는 것입니다. PCR에 의해 게이트웨이 중간 진입 클론을 생성하고, 관심 유전자의 전체 길이 개방 판독 프레임을 증폭하고, P don R 2 21로 재조합하는 것으로 시작합니다.그런 다음 다중 사이트 게이트웨이 기술을 사용하여 관심 멜라닌 세포 특이적 mifa 프로모터 유전자 및 폴리아데닐화 신호를 미니 Cooper 벡터에 재조합하여 관심 유전자를 MIFA 프로모터의 제어 하에 배치하고, 각 클론의 25 피코그램을 TOL 2의 25 피코그램과 함께 주입합니다. 미파 브래프 FP 53. 돌연변이 동물은 멜라닌 세포가 결핍되어 변형과 흑색종이 형성되기 쉽습니다.관심 유전자와 함께. mini Cooper 벡터는 recuring MVA mini gene을 포함하고 있습니다. 따라서 성공적으로 주입된 동물은 관심 유전자를 발현하는 구조된 멜라닌 세포를 발달시킬 것입니다.주입된 배아를 수정 후 24시간 동안 섭씨 28.5도에서 배양 또는 HPF를 배양합니다. 수정 후 72시간이 지나면 흰색 배경의 입사광 아래에서 해부 현미경을 사용하여 죽은 배아를 제거합니다. 구조된 멜라닌 세포가 있는 형질전환 동물을 선택합니다.동물이 수정 후 4일이 되면 제브라피시 시설의 보육원에 있는 3리터 탱크로 옮깁니다. 생후 2개월이 되면, 멜라닌 세포 구조 영역이 4mm 제곱 이상 되는 동물을 선택합니다. 매주 선택한 동물을 검사하여 종양의 존재 여부를 확인합니다.연구를 위해 종양이 있는 동물을 분리하십시오. absa에서 연령(주)에 따른 흑색종 무함유 생존 곡선을 그리고 세로좌표에 흑색종 무함유 생존율을 그립니다. EGFP와 멜라닌 세포를 발현하는 대조 동물을 대조하기 위해 관심 유전자를 발현하는 멜라닌 세포와 비교합니다.로그 순위 검정을 사용하여 두 곡선이 통계적으로 다른지 여부를 확인할 수 있습니다. 종양 침습 분석을 수행합니다. 뒷뇌의 후방 경계와 등지느러미의 전방 경계 사이의 영역에서 등쪽에 종양이 발생하는 고립된 얼룩말 물고기를 선택하는 것으로 시작합니다.흑색종 발병 2주 후, 트리카를 사용하여 생선을 파라핀에 고정하고 삽입한 후 물고기를 안락사시킵니다. 병변을 통해 5마이크로미터 횡단면을 만듭니다. 1. 50마이크로미터마다 전체 병변을 절단하여 가장 깊은 침범 지점을 식별할 수 있습니다.hematin과 eoin을 사용하여 섹션을 염색하십시오. 종양 세포가 콜라겐 층 밖에 남아 있는지, 등쪽 근육 조직으로 침범하는지, 척추 내로 더 깊이 침범하는지 여부를 측정하여 종양 침습을 평가합니다. 면역 염색을 수행하기 위해 두 샘플 세트 간의 통계적 차이를 측정합니다.해부 현미경으로 입사광으로 트리카 밀리리터당 0.17mg으로 물고기를 마취합니다. 날카롭고 가느다란 끝이 있는 집게를 사용하여 등쪽 비늘을 뽑습니다. 스케일의 절반을 포함하는 멜라닌 세포가 손상되지 않도록 주의하십시오.집게에서 직접 스케일을 1ml의 고정제에 넣고 실온에서 2시간 이상 뒤집으면서 배양합니다. 물고기를 물고기 물에 옮기고 물고기를 모니터링하여 색소 침착 멜라닌 세포의 성공적인 회복을 확인합니다. 먼저 PBST의 고정 저울을 실온에서 5분 동안 두 번 세척합니다.다음으로, 갓 만든 표백제 용액 1ml를 넣고 퍼퓸 또는 캡 잠금 장치로 덮어 가스가 튜브가 터지는 것을 방지합니다. 색소가 사라질 때까지 표백을 계속하십시오. 그런 다음 실온에서 5분에 4회 PBST로 세척합니다.블록 용액에서 최소 30분 동안 배양한 다음 약 400마이크로리터의 1차 항체 및 블록 용액으로 하룻밤 동안 실온에서 배양하고 실온에서 PBS에서 30분 동안 저울을 3회 세척하고 실온에서 2시간에서 하룻밤 동안 2차 항체로 배양합니다. dpi로 서 있는 후 유리 슬라이드에 벡터 쉴드 한 방울을 바르고 비늘의 오목한 면이 슬라이드에 대해 아래를 향하도록 비늘을 장착합니다. 샘플 위에 유리 커버 슬립을 놓습니다.투명 매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉하고 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다. 방사선 투여를 받은 후, 생후 2-3개월 된 캐스퍼 피쉬는 이식 하루 전에 25개의 회색 감마선을 조사합니다. 물고기가 물고기 물에서 회복할 수 있도록 합니다.트리카를 사용하여 종양이 있는 물고기를 안락사시키고, 종양을 잘라낸 다음 약 5밀리리터의 페트리 접시에 0.9 XPBS(5% FBS로 멸균)를 넣은 후 용액에서 실온에서 작업하고 P 1000 피펫으로 반복하여 단일 세포를 생성하는 동안 종양을 면도칼로 깍둑썰기합니다. 볼륨을 25밀리리터로 올립니다. 40마이크로미터 메쉬 필터를 통해 용액을 여과하고 453RCF의 탁상용 원심분리기에서 10분 동안 회전합니다.펠릿을 0.9%PBS, 5%FBS에서 원하는 농도로 다시 현탁시킵니다. 혈액 세포분석기를 사용하여 정확한 세포 수를 계산하고 최종 주입 부피가 약 5마이크로리터가 되도록 세포 현탁액을 희석합니다. 예를 들면, 50의 000의 세포가 주사될 것인 경우에, 세포 현탁액은 10의 마지막 농도, 마이크로리터 당 000의 세포에 묽게 되어야 한다.세포 현탁액이 들어 있는 튜브를 몇 분마다 튕겨 100% 에탄올과 0.9 XPBS로 세포가 뭉치는 것을 방지합니다. 26 s 게이지 베벨 팁 7, 0, 1 및 10 마이크로 리터 Hamilton 주사기를 2-3 회 세척 한 후 주사기에 5 마이크로 리터의 세포 현탁액을 장전합니다. 방사선 조사된 수혈 피쉬를 트리카에 마취한 후, 젖은 킴 물티슈에 옆으로 눕힌다.한 손으로 물고기를 안정시키고 베벨이 45도 각도를 향하도록 바늘을 복막강 위의 물고기 측면에 삽입합니다. 뒷뇌의 후방 경계와 등지느러미의 전방 경계 사이의 약 중간. 플런저를 부드럽게 누릅니다.물고기가 민물고기 물에서 회복되도록 하고 종양 생착을 위해 매일 물고기를 관찰하십시오. 생착이 발생한 경우 지속적인 성장과 질병 발생도 관찰할 수 있습니다. 1개의 세포 BRAF FP 53 MIFA 제브라피쉬 배아에 흑색종 발암유전자 세트 DB 1 또는 EGFP를 각각 포함하는 미니 쿠퍼 벡터를 본 명세서와 같이 MFA 프로모터의 제어하에 주입하였다.성인의 종양 발생률 곡선은 여기에서 볼 수 있듯이 SET DB one이 EGFP 대조군에 비해 흑색종 발병을 현저히 가속화하는 것으로 나타났으며, 헤마틴 및 EOSIN 염색은 SET DB one을 발현하는 흑색종이 EGFP 대조군 흑색종보다 국소 침습성이 더 높았음을 보여줍니다. 이 그림은 종양의 이식 능력을 평가하기 위해 핵 국소 mifa 전사 인자를 인식하는 항체로 염색된 표백되거나 표백되지 않은 제브라피시 등쪽 비늘을 보여줍니다. 흑색종 세포는 BRAF FP 53 미파 피쉬에서 분리하여 미니 컵 R-E-G-F-P 50을 주입하고, 000 세포를 전날 방사선 조사한 수용자 캐스퍼 돌연변이체에 피하 주사하여 25 개의 회색을 여기에서 볼 수 있듯이 여기에서 볼 수 있습니다.색소화된 공여체 유래 세포는 쉽게 인식되었습니다. 따라서 개발 후 이 기술은 암 생물학 분야의 연구자들이 제브라피시를 사용하여 흑색종과 관련된 유전적 변화의 기능적 결과를 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시 자동 종양 모델을 사용하여 분석을 통해 흑색종 조절자를 스크리닝하는 방법, 종양 발병 침습, 유전자 발현 및 이식 능력의 차이를 잘 이해할 수 있을 것입니다.

screening-for-melanoma-modifiers-using-zebrafish-autochthonous-tumor

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 형질전환 제브라피시 종양 모델을 사용하여 흑색종 변형 유전자를 스크리닝하는 방법을 설명합니다. 제브라피쉬는 흑색종을 유발하는 miniCoopR 벡터를 주입하면 흑색종이 발생하므로 제브라피시의 종양 발달에 영향을 미치는 유전적 요인을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

miniCoopR 벡터 기반 형질전환: 제브라피시 종양 모델에서 흑색종 유발 유전자를 스크리닝하는 기술

이 비디오는 제브라피시 모델의 등쪽 비늘 관련 멜라닌 세포에서 전사 인자 발현을 감지하는 항체 염색 방법을 설명합니다. 이 면역염색 기법은 형질전환 제브라피시에서 멜라닌세포 유도 형질주입 인자-A를 특이적으로 식별하는 데 도움이 됩니다.

비늘 멜라닌 세포의 항체 염색 : 제브라 피시 모델의 등쪽 비늘 관련 멜라닌 세포에서 발현 된 전사 인자를 검출하는 기술

이 비디오는 흑색종 보유 기증자 제브라피시 모델에서 면역이 저하된 수혜자 캐스퍼 제브라피시로 종양 세포를 이식하는 방법을 설명합니다. 수용 물고기의 종양 생착 및 증식을 시각화하는 데 도움이 됩니다.

피하 이식 분석: 기증자에서 수혜자에게 흑색종 세포를 이식하는 방법 제브라피시 모델

이 연구의 목표는 제브라피시에서 모자이크 형질전환 전략을 사용하여 종양 시작 및 생체 내 진행에서 여러 종양 유전자의 상대적 기여도를 빠르고 효율적으로 평가하는 방법을 보여주는 것입니다.

종양의 병인에 후보 협동 유전자의 기능 게놈 분석을위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

암 세포의 이식은 암 기전과 치료 반응의 확인에 중요한 도구입니다. 현재의 기술은 면역 기능이없는 동물에 달려 있습니다. 여기, 우리는 종양 세포 행동과 생체 내 약물 반응의 장기 분석을위한 면역 능력이있는 배아에 zebrafish 종양 세포를 이식하는 방법을 설명합니다.

종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

Zebrafish 이종이식 모델은 생체 내 미세 환경에서 인간 암 세포의 고처리량 약물 스크리닝 및 형광 이미징을 허용합니다. 당사는 자동 형광 현미경 장착 이미징 유닛을 사용하여 제브라피시의 환자 유래 백혈병 시료에 대한 대규모 자동 약물 스크리닝을 위한 워크플로우를 개발했습니다.

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

여기서는 종양 거동 분석, 전산 면역형화 및 공초점 이미징 정량화를 위한 xenografts 및 지침을 생성하는 팁과 함께 단계별 프로토콜을 제공합니다.

제브라피시 애벌레 제노이식 및 종양 행동 분석의 생성

본 논문은 신경모세포종의 제브라피시 모델에서 종양 전이를 실시간으로 개발, 특성화 및 추적하는 방법을 소개하며, 특히 MYCN 및 LMO1의 과발현을 가진 형질형 제브라피시 라인에서 자발적으로 전이를 발생시합니다.

신경 모세포종 전이의 제브라피시 모델

우리는 간단하고 빠른 병기 결정 방법으로 최적화된 투명한 제브라피시 배아의 난황에 이종 이식을 위한 프로토콜을 설명합니다. 주입 후 분석에는 생존 및 유세포 분석을 통한 이종 이식 세포의 질병 부담 평가가 포함됩니다.

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

표시 셀 다중 광자 현미경을 통해 혀를 이내 구강 암 종양 침략의 양적 모니터링 마우스 모델을 생성에 관련된 기술의 포괄적인 개요는 제공됩니다. 이 시스템은 침입 방지 화합물의 분자 평가 및 약물 효능을위한 유용한 플랫폼이 될 수 있습니다.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

배우세요 제브라피시 자생종양 모델을 활용한 흑색종 조절 유전자 고속 스크리닝 방법입니다. miniCoopR 벡터로 멜라닌세포에서 유전자 발현을 조절하여 종양 발생과 진행을 평가하는 기술을 익히세요.

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

더 많은 동영상 탐색