Name: 알코올에 의한 C57BL 임신 중 세포 자멸사 / 6 마우스에 대하여, 신경 친 화성 펩타이드, ADNF-9의 효과를 테스트하기위한 실험 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 배우세요 C57BL/6 마우스 태아 뇌에서 알코올 유도 세포 자멸사를 평가하는 방법을. ADNF-9 신경영양 펩타이드의 신경보호 효과를 TUNEL 염색으로 검증하여 태아 뇌 발달 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구 프로젝트는 알코올 남용과 알코올 중독에 국립 연구소에서 보너스 번호 R21AA017735 (YS)에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 알코올 남용 및 알코올 중독이나 건강의 국립 연구소에있는 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 저자는 또한이 원고를 편집 Charisse 몽고메리 감사드립니다.

1. 동물 사육 및 영양 펩타이드 치료 <ol><li> 2 시간 동안 남성의 홈 케이지에 암컷 생쥐 (~ 육주 세, 평균 체중 20g)을 배치하여 품종 C57BL/mice. </li><li> 즉시 나중에 정자 플러그 및 / 또는 질 세포진 검사를 확인합니다. </li><li> 긍정적 인 경우, 배아 0 일 (E0)로이 시점을 지정합니다. </li><li> 최근에 설명 된대로 E7에, 제어 및 치료 그룹에 임신 한 암컷 체중 성냥 (3 그룹)가 할당됩니다 4 : 1) 알코올 (에탄올) 액체 다이어트 그룹 (ALC), 2) 쌍 공급 대조군 (PF), 3) 알코올 노출 액체 다이어트 (ALC/ADNF-9)와 함께 ADNF-9 펩타이드의 복강 내 (IP) 주입을 받아야한다 펩타이드 치료 그룹. ALC 및 PF 다이어트의 준비의 세부 사항 및 IP 주사 절차는 우리의 최근 작업 4에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 영양의 단독 소스로 무료로 이용하실로 제공 할 수 있습니다 매일 알코올 액체 다이어트를 측정한다. PF 액체 다이어트 개별적 t 멍에O는 ALC 댐뿐만 아니라 매일 측정 할 수 있습니다. </li><li> 이전 24 시간 동안 소비 된 액체 다이어트의 볼륨에서 녹음 할 수 있습니다 30 ML 스크류 캡 튜브를 졸업하고 갓 준비한 다이어트 E7에서 E13까지 (매일)가 제공되어야한다. </li></ol> 2. 태아 및 태아의 두뇌 이외에 Microdissection의 해부 <ol><li> 깊이 자궁 경부 전위 다음 CO 2 절차에 마우스를 euthanizing으로 E13에서 임신 한 쥐를 희생. </li><li> 70 % 에탄올로 절개 복부 사이트를 청소합니다. </li><li> 멸균 가위와 집게를 사용하여 복부 절개를합니다. </li><li> 복부가 열리면, 한 집게로 잡고 멀리 자궁 mesometrium를 찢어 다른 집게를 사용하여 자궁을 해부. 배아를 펑 쳐링 방지하기 위해 천천히이 절차를 수행해야합니다. </li><li> 자궁에서 배아를 제거하고 행크스 &#39;밸런스드 소금 솔루션을 포함 (60mm X 15mm) 세포 배양 접시에 전송할<html> (HBSS) 얼음 냉수합니다. </li><li> microdissection을위한 입체 현미경 하에서 전체 배아에서 태아의 뇌를 해부. </li><li> microdissection을위한 초 미세 집게를 사용하여 두개골을 노출 머리의 상단 부분에있는 태아의 피부를 당겨. </li><li> 일단 두개골 노출 명확하게하고 척수와 뇌간 영역에서 뇌의 뒤쪽 부분에서 시작하여 두개골을 벗겨, microdissection을의 실체 현미경 아래에서 시각. </li><li> 머리의 앞쪽 부분에 후방에서 조각에 의한 두개골 조각을 벗겨주십시오. </li><li> 태아의 뇌가 시각적으로 노출되면, 압축을 해제를 진행합니다. </li><li> primordium 후각 망울의 기지에서 metencephalon의 기초에 태아의 뇌를 해부. </li><li> 접미사는 모두 2 ~ 3 일 4 % 파라 포름 알데히드 태아 뇌를 해부. 당신이 서양 얼룩이나 효소 분석을 위해 그들을 테스트하는 경우에는 각 댐에서 다른 태아의 두뇌를 고정 할 수 있습니다. </li></ol>NT &quot;&gt; 참고 : 동물 사용에 대한 절차는 기관 동물 관리에 의해 승인 기관 동물 관리의 지침에 따라하고 건강의 국립 연구소에서 사용위원회 톨레도 대학의위원회에 대한 가이드를 사용했다 실험실 동물의 관리 및 사용. 3. 단면에 대한 젤라틴 태아 두뇌를 포함 <ol><li> 젤라틴 등급 A의 10 %를 준비 </li><li> 중간 껍질 - 멀리 삽입 형을 입력하고 젤라틴 굳은 때까지 기다립니다. </li><li> 응고 된 젤라틴의 상단에 위치 제어 및 태아 치료 태아의 두뇌 나란히. 이 제어 및 실험 그룹 모두 간 세포 죽음의 면역의 일관된 상태를 유지하는 것입니다. </li><li> (젤라틴이 너무 섹시하지 있는지 확인) 완료 형을 만들기 위하여 태아 두뇌의 상단에 젤라틴 액체를 추가합니다. </li><li> 15 분 동안 태아의 뇌를 보유하고 준비된 젤라틴 형 냉장. </li><li> 벗겨다음 임베딩 금형 플라스틱과는 이틀 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 미리 만든 젤라틴을 포함하는 태아의 뇌를 전송합니다. </li><li> 의 장소 섹션은 태아의 뇌를 고정 젤라틴 관상 절편 50 μm의 두께로 vibratome 단면 기계 (라이카 VT 1000S)를 사용. 더 나은 해부학 적 기능을 제공하기 때문에 두께는 우리의 연구에서 테스트됩니다. 또한, 25 ㎛의 두께 이상은 10 % 젤라틴 태아의 두뇌에서 임베디드 관련이 기술을 테스트 할 수 있습니다. 전뇌에서 기저핵 예하 수준에서 vibratome를 사용하여 코로나 섹션이 잘린합니다 </li><li> 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액에 태아의 뇌 부분을 수집합니다. </li><li> 물에 Superfrost 플러스 슬라이드에있는 태아의 뇌 부분을 마운트합니다. </li><li> 15 분의 장착 부분을 건조. </li><li> TUNEL 반응의 다음날 테스트를 위해 PBS에 슬라이드 (태아 뇌 부분에 장착)를 배치. </li></ol> 4. 드에 대한 TUNEL 반응세포 죽음 또는 세포 사멸의 방호 (TUNEL : TDT-중재 dUTP 닉 엔드 라벨, TDT : 터미널 deoxynucleotidyl 전이). 이 분석은 세포 죽음을 결정하기위한 것입니다. <ol><li> 37 ° C (20 ML PBS에 혼합 단백질 분해 효소 K 300 μL)에서 5 분 단백질 분해 효소 K (20 ㎍ / ㎖)을 Superfrost 플러스 슬라이드에 장착 된 태아의 뇌 부분을 처리합니다. 슬라이드) 5 Plend 열린 애스턴에 조립됩니다. </li><li> 궤도 셰이커에 따라 5 분 PBS 세 번으로 태아의 뇌 섹션 (슬라이드에 장착) 린스. </li><li> 3 % 상온에서 10 분 (3 ML 30 % 27 H 2 O 2 ㎖ 100 % 메탄올) (슬라이드 셰이커에 있으면 안)에 대한 메탄올의 H 2 O 2 섹션을 품어. </li><li> 궤도 셰이커 5 분 동안 PBS 세 번에 섹션을 씻어. </li><li> 얼음에 2 분 (4 ° C) (100 μL TritonX + 0.1 g 나트륨 구연산 + 99.9 ML distille에 대한 permeabilization 솔루션의 섹션 (0.1 % 0.1 % 구연산 나트륨의 TritonX-100)를 품다D 물). </li><li> 궤도 셰이커 5 분 동안 PBS의 섹션을 두 번 헹구십시오. </li><li> 슬라이드의 섹션 주위에 건조한 지역. </li><li> PAP 펜을 사용하여 Superfrost 플러스 슬라이드에 장벽을 그립니다. 이 모든 TUNEL 양성 세포의 검출을위한 섹션을 치료하는 데 사용됩니다 용액의 누출을 방지하기위한 것입니다. </li><li> 37 1 시간에 대한 TUNEL 반응 혼합물 (병 1에서 50 μL 병 2 ~ 450 μL) ° C와 섹션을 품어, 컨트롤이 병 2의 용액에서 배양하여 사용됩니다. </li><li> 궤도 셰이커 아래 PBS 세 번 5 분 씻어. </li><li> 조직의 주위에 건조한 지역. </li><li> 37 30 분 동안 컨버터 POD로 섹션을 품어 ° C. </li><li> 트리스 염산 (산도 7.5, 0.05 M)를 5 분 동안 절을 세 번 씻어. </li><li> 0.05 % 3&#39;-3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) 및 0.003 % H 2 O 2 (25 ML 트리스 염산, pH7.5, 0.05 M + 25 ㎕의 3 % H 2 0 2 + 500의 7 분의 섹션을 품어 μL DAB4)에서 Oribtal 통 아래 ° C (얼음)와 어두운 곳에서 () 새로운 5 Plend 오픈 우편물이 절차를 수행해야합니다. </li><li> 궤도 셰이커 아래 PBS 세 번 5 분으로 섹션을 씻어. </li><li> 다음 섹션 프로토콜에 설명 된대로 Nissl 염색법을 처리 한 후 PBS에서 더 이상 24 이상의 시간 동안 PBS에있는 슬라이드 섹션을 유지합니다. </li></ol> 참고 : DAB는 발암 물질이다. 장갑을 사용하고 모두 한 번 실험을 완료 표백제로 사용되는 모든 요리를 청소합니다. 5. 현미경 관찰을위한 태아 뇌 섹션의 준비를 위해 Nissl 염색 <ol><li> Nissl 염색 과정은 생물 안전 후드에서 수행되어야한다. </li><li> 2 분 동안 탈 이온수로 슬라이드 부분을 씻어. </li><li> 2 분 70 % 에탄올의 섹션을 품어. </li><li> 6 분 95 % 에탄올에 섹션을 품어. </li><li> 2 분 70 % 에탄올의 섹션을 품어. </li><li> 탈 와트의 섹션을 씻어2 분 동안 어. </li><li> 크레 실 바이올렛의 섹션 3 분 얼룩 품어. </li><li> 2 분 동안 탈 이온수의 섹션을 씻어. </li><li> 2 분 70 % 에탄올의 섹션을 품어. </li><li> 3 분 95 % 에탄올 + 3 ML 빙초산을에 섹션을 품어. </li><li> 2 분 95 % 에탄올에 섹션을 품어. </li><li> 2 분 3 회 100 % 에탄올에 섹션을 품어. </li><li> 10 분 3 회 크실렌의 섹션을 품어. </li><li> 태아의 뇌 부분을 잡고 슬라이드 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입 및 커버 슬립 유리 슬라이드를 사용하여 장착 할 수 있습니다. </li><li> 장착 하룻밤 현미경 관찰과 분석을하기 전에 슬라이드 둡니다. </li><li> 현미경 관찰과 현미경 사진은 라이카 직립 현미경으로 수행 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Sari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neuroprotective+protein-derived+peptide%2C+NAP%2C+preventing+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL%2F6+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).</li>
<li>Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+peptide%2C+colivelin%2C+prevents+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL%2F6+mice%3A+signaling+pathway+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations.</a> Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).</li>
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<li>Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+proteins+in+fetal+brains+of+alcohol-treated+prenatally+C57BL%2F6+mice%3A+a+proteomic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation.</a> Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).</li>
<li>Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+a+novel+protein+containing+a+femtomolar-activity-dependent+neuroprotective+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide.</a> J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).</li>
<li>Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neurotrophic+factor%3A+structure-activity+relationships+of+femtomolar-acting+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).</li>
<li>Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+fetal+demise+and+growth+restriction+in+a+mouse+model+of+fetal+alcohol+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).</li>
<li>Sari, Y., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+deficits+associated+with+fetal+alcohol+exposure+may+be+protected%2C+in+part%2C+by+peptides+derived+from+activity-dependent+neurotrophic+factor+and+activity-dependent+neuroprotective+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).</li>
<li>Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+femtomolar-acting+neuroprotective+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A femtomolar-acting neuroprotective peptide.</a> J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).</li>
<li>Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+the+human+activity-dependent+neuroprotective+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein.</a> J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).</li>
<li>Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasoactive+intestinal+peptide+%28VIP%29+prevents+neurotoxicity+in+neuronal+cultures%3A+relevance+to+neuroprotection+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease.</a> Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).</li>
<li>Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIP+and+peptides+related+to+activity-dependent+neurotrophic+factor+protect+PC12+cells+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress.</a> J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).</li>
</ol>

어떤 공개가 이루어지지합니다.

본 연구에서 제시 한 방법론과 기술은 태아 태아 두뇌에 알코올 노출과 이러한 효과의 예방에 영양 펩티드의 역할의 효과를 보여줍니다. 이들은 다른 임신 단계에서 남용 또는 태아 뇌의 다른 독성 화학 물질의 다른 약물을 연구하는 방법에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. 사육 패러다임에 관해서, 어떤 경우에는 정자 플러그의 검출은 관찰되지 않을 수 있습니다. 이 시점에서, 그것이 가능한 정자에게 긍정적 인 탐지를 제공 할 수있는 현미경 관찰에서 슬라이드 질 얼룩을 테스트하는 것이 중요합니다. 그것은 수유 PF 제어 및 알코올을 포함하는 액체 다이어트의 자유로운 접근을 포함하는 본 연구에 명시되어 있습니다. 적어도 30 습도의 %와 22-24을 초과하지 않는 온도 ° C 다이어트 1,2를 24 시간 무료로 이용할 중에 다이어트의 품질을 모니터링해야합니다. 또한 요구되는다이어트는 매일 신선한 준비하십시오. 공급 ...

여기에 설명 된 실험 방법의 목표는 먹이 microdissecting 및 세포 죽음을 감지, 번식과 관련된 여러 가지 기술을 사용하여 태아 알코올 노출 모델에서 영양 펩타이드의 신경 효과를 평가하는 것입니다. 우리 실험실에서 작업 알코올의 양 기간에 인간 마시는 패러다임과 유사 할 수있는 적당한 음주의 모델로 알코올과 혼합 액체 음식을 포함했다하면 1-5 소비. 우리와 다른 태아 알코올 노출의 해로운 영향으로부터 신경 세 가지 펩타이드 유도체를 발견했습니다. 동물 모델을 사용하여 배아 단계에서 알코올 노출을 조사 연구는 신경 보호의 잠재적 인 메커니즘의 신분으로 이어질 중재 절차의 개발을 허용 할 수 있습니다. 이 임신 중 알코올 노출의 해로운 효과의 신경 효과와 감쇠에 대한 충분한 정보를 제공 할 수 있습니다. 태아 알코올 노출의 영향을 가능한 한 방지 체외 6,7와 in vivo 1,2,4,8,9의 신경 보호에 관여하는 것으로 알려져있다 펩타이드와 임신 한 생쥐의 치료를 포함 할 수 있습니다. 이러한 펩타이드 중, ADNF-9 또는 SAL로 알려진 SALLRSIPA은, 활동에 따라 신경 영양성 인자 (ADNF) 7,10에서 파생됩니다. 순서 NAPVSIPQ 펩티드라고 NAP, 또 다른 펩티드 활동에 따라 신경 단백질 (ADNP) 6,11에서 파생 된 알코올 노출 12,13과 관련된 산화 스트레스에 대한 강력한 보호 효과를 보여 주었다. 또한, 우리는 최근 태아 알코올 노출 모델 2에 중요한 신경 역할을 표시하는 새로운 합성 펩티드, colivelin을 발견했습니다. Colivelin는 ADNF-9 AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP)으로 구성되어 있습니다. 이 펩티드의 사용의 중요성은 그들이 할 수있는 기능을 가지고있다알코올에 의한 세포 사멸과 뇌의 성장 적자의 영향을 방지하기 위해 뇌 혈액 장벽을 통과. 실험 방법은 알콜에 의한 세포 사멸에 대한 신경 보호 효과를 테스트하기 위해 C57BL / 6 생쥐를 사용 하였다. 우리는 그것이 정자 플러그 및 질 세포진 검사 1-5의 검출에 의해 밝혀 질 수 정확하게, 배아 일 0 (E0)를 추정하기 위해 대신 하룻밤 사육 2 시간 창을 채택했다. 우리는이가 임신 한 쥐에 스트레스를 유발할 수 있습니다 투여 경로를 통해 대신 알코올 배송 무료 액세스로 간주되는, 공급 튜브 액체 다이어트를 사용했습니다. 반면에, microdissection을 조기 배아 단계에서 태아의 뇌를 해부 할 때 발생할 수있는 태아 뇌 조직의 부드러움으로 인해 도전 할 수 있습니다. 여기, 우리는 microdissection을 관련된 모든 문제를 처리하는 시각 기술을 보여줍니다. 또한, 태아의 뇌 절편도 도전 할 수 있기 때문에, 우리는 채택젤라틴 포함 껍질 - 멀리하여 금형 태아 두뇌를 포함 포함하는 기술. 우리는 50 μm의 두께로 무료 부동 섹션에서 태아 뇌를 절단에 성공했다. 이것은 우리가 세포 죽음의 식별을 포함하여, 태아의 뇌 섹션에서 콘텐츠 단백질의 변화를 조사 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Superfrost Plus 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>PAP PEN</td><td>연구 제품 Int. Corp.</td><td></td><td></td>195506</tr><tr><td>5-Plend Open Mailer </td><td>Heathrow Scientific, LLC</td><td>HS 15983G</td><td></td></tr><tr><td>필링 몰</td>드 <td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>현장 세포 사멸 검출 키트, POD</td><td>Roche Diagnostics, Inc</td><td>11684817910</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution</td><td>Invitrogen</td><td>14170-120</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 Type A</td><td>FisherScientific</td><td>G8-500</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>W. NUHSBAUM, Inc</td><td>Leica M60, KL 200 LED</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Vibratome</td><td>Leica, Inc</td><td>Leica VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Moria Ultra Fine Forceps </td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td>2</td></tr>쌍 <tr><td>대학원 30ml 공급 튜브</td><td>Dyets, Inc</td><td>900012</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin Mix </td><td>Bio-Serv. Inc.</td><td>F8031</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 믹스</td><td>바이오 서브 Inc.</td><td>F8598</td><td></td></tr><tr><td>맥아당 덱스트린</td><td>바이오 서브 Inc.</td><td>3650</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올 190 프루프, 5갤런</td><td>111000190-SS05</td><td>Pharmco-AAPER</td><td></td></tr><tr><td>정립 현미경</td><td>W. NUHSBAUM, Inc</td><td>LEICA DM 4000</td><td></td></tr></tbody></table>

알코올에 의한 c57bl 임신 중 세포 자멸사 / 6 마​​우스에 대하여, 신경 친 화성 펩타이드, adnf-9의 효과를 테스트하기위한 실험 방법

Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

태아의 뇌 성장의 초기 배아 단계에서 태아 알코올 노출의 영향을 조사하는 실험 디자인에 도전하고 있습니다. 이 대부분은 태아의 뇌와 알코올 태아 노출로 인한 세포 사멸 세포의 결정에 대한 자신의 절편의 microdissection을의 어려움 때문이다. 실험은 태아의 뇌 조직에있는 세포 죽음의 식별 사육 쥐에서 시각화 기술을 제공합니다 여기에 설명. 본 연구에서는 C57BL 사용 / 알코올에 의한 세포 사멸에 대한 태아 알코올 노출과 영양 펩타이드의 역할을 연구 동물 모델로 6 마우스. 사육 배아 시대의 정확한 단계를 결정하기 위해 2 시간 매트 창으로 구성되어 있습니다. 설립 태아 알코올 노출 모델은 태아의 뇌에있는 태아 알코올 노출의 효과를 결정하기 위해 본 연구에서 사용되었다. 이것은 임신 한 쥐에 대한 영양소의 유일한 소스로 알코올이나 쌍 공급 액체 다이어트에 무료로 액세스를 포함합니다. <p clasS = &quot;jove_content&quot;&gt; 후자는 도전 할 수 있기 때문에 태아 및 태아의 두뇌 microdissection을의 해부와 관련된 기술은주의 깊게 설명되어 있습니다. microdissection을이 입체 현미경과 초 미세 집게를 필요로합니다. 태아의 뇌를 해부하기위한 단계별 절차를 시각적으로 제공됩니다. 태아의 뇌는 primordium 후각 망울의 기지에서 metencephalon의 기본을 해부한다. apoptosis를 조사를 위해, 태아의 두뇌가 먼저 vibratome 기기와 함께 자신의 절편을 촉진하기 위하여 필 - 멀리 금형을 사용하여 젤라틴에 포함됩니다. 파라 포름 알데히드에 포함 된 고정 태아의 뇌는 쉽게 단면이며, 무료 부동 섹션은 세포 사멸 또는 세포 죽음의 결정에 superfrost 플러스 슬라이드에 장착 할 수 있습니다. TUNEL (TDT-중재 dUTP 닉 엔드 라벨, TDT : 전이 터미널 deoxynucleotidyl) 분석은 세포 사멸 또는 사멸 세포를 식별하는 데 사용되었습니다. 그것은 주목할만한 그 APoptosis 및 세포 매개 세포 독성은 DNA 파편을 특징으로하고 있습니다. 따라서, 시각 TUNEL 양성 세포는 세포 사멸 또는 세포 사멸 세포의 지표입니다. 여기에 실험 디자인은 태아 두뇌에 임신 중에 알코올의 영향을 연구 설립 액체 다이어트의 사용에 대한 정보와 신경성 펩티드의 역할을 제공합니다. 이 번식 임신 한 쥐를 먹이 태아의 두뇌를 microdissecting 및 세포 사멸을 결정을 포함한다. 함께, 이러한 시각 및 텍스트 기술은 태아 두뇌에 유해한 에이전트의 태아 노출 조사를위한 소스가 될 수 있습니다.

실험 방법은 2 시간 사육 창 정확한 임신 단계를 추정하는 것이 필수적입니다 것을 보여 여기에 설명. 우리는 E13의 나이에 배아의 절개를 증명하고있다. 우리는 또한 E13에 태아 뇌의 microdissection을을 보여 주었다. 절차는 그림 1에서 설명한 여러 단계 (AC), 포함한다. 태아의 뇌는 primordium 후각 망울의 기지에서 metencephalon의 기초 (그림 1)을 해부한다. 태아의 뇌는 그 면역 탐지를위한 4 % 파라 포름 알데히드로 고정되어 있습니다. 고정 후, 태아의 뇌는 젤라틴 10 %에 포함되어 있으며 그림 2에 설명 된대로 vibratome는 단면을 준비했습니다. 태아 두뇌의 단계별 임베딩이 낮은 배율에서 수행되었다합니다. 내장 된 태아의 뇌는 그림 1의 높은 배율에서 시각화 할 수 있습니다. 또한, 전뇌에 신경절 예하의 수준에서 관상 태아의 뇌 섹션 수vibratome를 ...

실험 디자인은 태아의 뇌 임신 중 세포 사멸 및 신경성 펩타이드의 응용 프로그램에서 알코올 노출의 효과를 공부에 여기에 초점을 제안했다. 사육에서 태아 뇌의 컬렉션에 대한 자세한 설명이 설명되어 있습니다. 세포 사멸의 결정을위한 기법도 자세히 설명되어 있습니다.

알코올에 의한 C57BL 임신 중 세포 자멸사 / 6 마​​우스에 대하여, 신경 친 화성 펩타이드, ADNF-9의 효과를 테스트하기위한 실험 방법

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

이 절차의 목적은 태아 알코올 노출 모델에서 영양 펩타이드의 신경 보호 효과를 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 실험 동물을 짝짓기한 다음 두 번째 단계로 영양 펩티드로 임신한 암컷을 치료함으로써 달성되며, 태아를 해부하여 실험적 용도로 태아의 뇌를 분리합니다. 다음으로, 태아의 뇌를 절편화를 위해 젤라틴에 삽입한 다음, 세포 사멸 결과를 확인하기 위해 터널 염색을 수행합니다.이는 태아기 알코올 노출이 신경절 돌출부의 터널 양성 세포의 수를 증가시킨다는 것을 보여줍니다. 영양 펩티드의 대조군 투여와 비교하여, D 및 F 9는 대조군 알코올 처리 동물에 비해 터널 양성 세포에서 알코올 유도 증가를 유의하게 감소시켰다. 따라서 태아의 뇌는 매우 작기 때문에 태아의 뇌는 해부하고 처리하기에 매우 작기 때문에 태아의 뇌 해부와 내장 단계를 배우기가 어렵기 때문에 이 금속을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. 약 20g의 6주 된 암컷 마우스를 제거 직후 2시간 동안 수컷 가정용 케이지에 넣습니다.짝짓기가 발생했는지 확인하기 위해 각 암컷에게 정자 플러그가 있는지 확인하십시오. 정자 플러그가 있는 경우 E 7 체중 일치 임신한 여성을 4개 그룹으로 나누는 이 배아 데이 제로를 지정합니다. 한 알코올 액체 다이어트 그룹은 영양소의 유일한 공급원으로 무료로 제공되었습니다.알코올 노출과 함께 DNF 9 펩타이드의 복강 내 주사를 받아야 하는 Two Perfed 대조군 3 펩타이드 치료 그룹. 유동식 다이어트. 30ml 눈금이 매겨진 스크류 캡 튜브에서 24시간 동안 동물이 섭취한 유동식의 양을 기록하여 유일한 영양소 공급원으로 무료 초과를 통해 제공될 수 있는 알코올, 유동식 또는 쌍을 이루는 유동식의 일일 양을 결정합니다.임신한 Myer E 13을 이산화탄소 안락사로 희생한 후 자궁경부 탈구를 한 후 E 7에서 E 13까지 매일 갓 준비한 유동식을 제공합니다. 사체를 누운 자세로 해부판에 놓고 70% 에탄올로 복부를 청소합니다. 멸균 가위와 집게를 사용하여 복부를 절개합니다.복부가 열리면 집게로 자궁을 잡고 두 번째 집게를 사용하여 배아에 구멍을 뚫지 않고 자궁에서 자궁 내막을 천천히 부드럽게 뜯어냅니다. 자궁에서 배아를 조심스럽게 제거하고 행크의 균형 분류 용액으로 옮깁니다.젖은 얼음 위에 60mm x 15mm 크기의 세포 배양 접시에 접시와 얼음 용기를 올려 놓고, 현미 해부를 위한 초미세 집게를 사용하여 실체 현미경 무대에 접시와 얼음 용기를 놓습니다. 머리 윗부분에 있는 배아의 피부를 잡아당겨 두개골을 드러냅니다.두개골이 노출되고 실체 현미경으로 명확하게 시각화되면 집게로 척수와 뇌간 높이의 두개골 기저부를 잡고 두개골을 벗기기 시작합니다. 머리의 뒤쪽에서 앞쪽으로 두개골을 한 조각씩 계속 벗겨냅니다. 뇌가 완전히 노출되면 집게를 사용하여 뇌를 추출합니다.그런 다음 태아의 뇌를 원시 전구 또는 공장 전구의 기저부에서 Met Postfix의 기저부까지 2-3일 동안 4%파라알데히드로 절개한 모든 태아 뇌를 해부합니다. 태아의 뇌는 웨스턴 블롯(western blot) 또는 효소 분석법(enzymatic assay)을 위해 검사할 경우 동결될 수도 있습니다. 증류수에 준비된 A급 젤라틴 10% 용액을 준비한 후 필링 몰드를 반쯤 채우고 젤라틴이 응고될 때까지 기다립니다.대조군과 산전 처리된 태아의 뇌를 응고된 젤라틴 위에 나란히 놓습니다. 이는 대조군과 실험군 간에 일관된 조건을 유지하기 위한 것입니다. 젤라틴이 너무 뜨겁지 않은지 확인하고 태아의 뇌 위에 액체 젤라틴을 추가하여 완전한 틀을 만듭니다.최종 주형은 이 이미지와 유사해야 하며, 태아의 뇌를 담고 있는 준비된 젤라틴 주형을 15분 동안 냉장 보관합니다. 다음으로 임베딩 몰드 플라스틱을 벗겨냅니다. 최종 주형은 다음과 같아야 하며 태아의 뇌가 들어 있는 젤라틴을 이틀 동안 4%파라알데히드로 옮겨야 합니다.3일째에는 고정된 태아 뇌를 함유한 젤라틴 블록을 바이옴 단계에 부착합니다. 그런 다음 관상 동맥 절편을 위해 25-50 미크론 두께로 설정된 viome을 사용하여 뇌를 절편합니다. PBS에 태아 뇌 절편을 수집한 다음 슈퍼 프로스트와 슬라이드에 태아 뇌 절편을 장착하고 15분 동안 건조시킵니다.15분이 경과한 후. 터널 반응의 다음날 테스트를 위해 슬라이드를 PBS에 놓습니다. 먼저 슬라이드를 섭씨 37도에서 5분 동안 밀리리터 단백질 분해 효소 K와 PBS당 20마이크로그램의 용액에 담급니다.그런 다음 PBS에서 오비탈 셰이커로 각각 5분씩 세 번 헹굽니다. 메탄올에 3% 과산화수소를 넣은 절편을 흔들지 않고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 이전과 같이 슬라이드를 세척하십시오.다음으로, 얼음 위에서 2분 동안 투과성 용액에 절편을 배양합니다. 배양 후 PBS에서 두 번 세척했습니다. 이전과 마찬가지로 실험실 티슈를 사용하여 섹션 주변의 슬라이드 영역을 건조시킵니다.그런 다음 두드리는 펜을 사용하여 슬라이드의 섹션 주위를 그립니다. 이것은 염색 용액의 누출을 방지하여 소량을 사용할 수 있습니다. 각 쌍의 한 섹션을 제조업체의 지침에 따라 준비된 터널 반응 혼합물로 배양합니다.터널 시약이 없는 캐리어 용액을 negative control 섹션에 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 배양 시간이 경과하면 이전과 같이 PBS에서 오비탈 셰이커로 슬라이드를 세 번 세척합니다.그런 다음 실험실 물티슈로 조직 주변을 말리십시오. 다음으로, 컨버터 POD 용액으로 절편을 흔들지 않고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 트리스 HCL로 5분씩 섹션을 세 번 헹굽니다.슬라이드를 홀더로 옮기고 0.05%DAB와 0.003%과산화수소가 들어 있는 코플린 병에 넣습니다. 알루미늄 호일로 항아리를 덮고 원하는 경우 이전과 같이 PBS를 세척한 후 7분 동안 얼음 위의 궤도 셰이커에 놓습니다. 슬라이드는 프로토콜의 텍스트 부분에 자세히 설명된 대로 미사일 카운터 염색을 진행하기 전에 PBS에 저장할 수 있습니다.다음 이미지는 신경영양 펩타이드, A DNF 9의 효과를 보여줍니다. 신경절 저명성에서 터널 분석을 사용하여 E 13 단계 태아 알코올 노출은 PF 그룹에 비해 A LC 그룹의 화살촉으로 표시된 세포 사멸 증가를 유도했습니다. 태아 알코올 노출과 함께 D NF 9 투여는 터널 양성 세포의 감소를 유도했습니다. 통계 분석은 AD와 F 9 투여가 터널 양성 세포에서 알코올 유도 증가를 방지한다는 것을 입증했습니다.값은 평균에 평균의 표준 오차를 더한 값으로 표시됩니다. 단일 별표는 P 값이 0.052 미만임을 나타냅니다. 별표는 Newman Coles 사후 테스트에서 P 값이 0.01 미만임을 나타냅니다.각 그룹에는 4의 N이 포함되어 있습니다. 그래서 개발 후,이 기술은 연구자와 뇌 발달 분야에서 생쥐의 약물 또는 화합물 및 뇌 발달의 영향을 탐구하는 방법입니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

에탄올로 유도된 발달 손상의 분자 메커니즘을 이해하려면, 우리는 에탄올 노출 zebrafish 모델을 개발하고 에탄올에 노출된 후 발생하는 신체적, 세포 및 유전자 개조를...

태아 알코올 노출의 Zebrafish 모델에서 Teratogenic 변경 사항 평가

돌연변이된 알파-시누클레인을 과발현하는 도파민성 뉴런을 포함하는 쥐 배아의 일차 중뇌 배양으로 시작합니다.처리 웰의 배지를 테스트 화합물이 포함된 신선한 배지로 교체하고 대조군 웰의 배지를 일반 배지로 교체합니다. 그런 다음 배양하십시오.대조군에서 알파-시누클레인은 도파민성 뉴런에 독성 응집체를 형성하여 신경돌기 수축을 유발하고 신경 세포 사멸을 초래합니다.치료에서 시험 화합물은 알파-시누클레인과 상호 작용하여 응집을 방지하며 신경돌기 구조를 보존하고 신경 보호 기능을 제공합니다.세포를 고정하고 투과시킨 다음 비특이적 결합 부위를 차단합니다.도파민성 뉴런에 대한 추가 라벨링과 함께 모든 뉴런을 표지하기 위해 1차 항체와 함께 배양합니다.세포를 세척하고 1차 항체에 특이적인 형광단 태그가 있는 2차 항체를 추가합니다.도립 형광 현미경을 사용하여 차등적으로 표지된 도파민성 뉴런을 계산한 다음 공초점 현미경으로 전환하여 신경돌기 길이를 측정합니다.대조군에 비해 치료에서 온전한 신경돌기를...

쥐 배아 뉴런에서 알파-시누클레인 독성에 대한 시험 화합물의 신경 보호 효과 평가

우리는 동시에 6 마우스 새장을 수용 쉽게 사용할 재료를 사용하여 알코올 증기 챔버의 구조를 보여줍니다. 우리는 더 이상 인간의 임신 3의 삼보 격에 해당하는 태아 알코올 노출의 마우스 모델에서의 사용에 대해 설명합니다. 이 패러다임은 임신과 출생 후의 일 1-12 동안 동물을 노출합니다.

인간 발달의 세 삼 분기의 상당 기간 동안 알코올에 쥐를 노출하는 데 사용 증기 챔버의 건설

여기에 제시된 프로토콜의 목표는 태아기 뇌 발달 과정에서 쥐를 중간 수준의 알코올에 노출시키는 절차를 설명하고 성인기 동안 사회적 행동의 변화를 정량화하는 것입니다.

보통 태아 알코올 노출과 성인 쥐의 사회적 행동의 정량화

추적 eyeblink 클래식 컨디셔닝 (ECC) 평가 하는 데 사용 되었다 hippocampal 종속 연관 학습 했다 성인 쥐에 투여 초기 신생아 두뇌 개발 하는 동안 알코올의 높은 농도 (11.9 %v / v). 일반적으로, ECC 절차는 많은 심리적, 생물 의학 설정을 통해 뇌 기능 장애를 탐지 하기 위한 사운드 진단 도구입니다.

태아 알코올 스펙트럼 장애의 쥐 모델에서 Hippocampal 기능 장애를 평가 하기 위해 추적 Eyeblink 클래식 컨디셔닝의 사용

수프라스피날 영역에서 일시적인 수용체 잠재적 인 바닐라 노이드 유형 1 (TRPV1)은 뇌 기능에 있는 몇몇 역할을 하기 위하여 건의되었습니다. 여기에 설명된 마우스에서 수지 척추 TRPV1 둔감화를 위한 수지성 관절 의 주입을 위한 프로토콜이 설명되어 있다. 일부 통증 검사에 대한 절차도 제시됩니다.

수지 성 소와 쥐의 통증 검사를 가진 뇌경치료

이 작품은 적절한 노출 방법에서 배아 처리 및 에탄올 분석에 헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 사용하여 제브라피쉬 배아에서 에탄올 수준을 정량화하는 프로토콜을 설명합니다.

헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 이용한 제브라피시 배아의 에탄올 수치 정량화

이 프로토콜에서는 동일한 마우스 배아에서 태아의 뇌 조직과 고품질의 비용혈 혈청을 동시에 수집하는 방법을 설명합니다. 우리는 이 기술을 활용하여 산모의 식이 노출이 Nf1 (신경섬유종증 1형)에 대한 이형접합 마우스의 다량 영양소 프로필과 태아 신경 발달에 어떤 영향을 미치는지 조사했습니다.

신경섬유종증 1형에서 영양 및 신경 발달에 대한 산모의 식단의 효과를 평가하기 위한 태아 쥐 뇌 및 혈청의 동시 수집

법적 제한이 변경되어 카나비노이드 제품에 대한 접근성이 높아짐에 따라 특히 임신 중 이러한 노출의 영향을 연구하기 위한 모델을 개발하는 것이 매우 중요합니다. 자발적 섭취를 통한 중등도의 산전 카나비노이드 노출에 대한 전임상 모델이 개발되어 보다 심층적인 조사가 가능해졌습니다.

신경 발달 결과에 미치는 영향을 평가하기 위한 태아 델타-9-테트라하이드로칸나비놀 노출의 전임상 모델

이 논문은 초기 임신 염증이 신경발달에 미치는 영향을 연구하기 위한 모체 면역 활성화(MIA) 마우스 모델을 생성하는 포괄적인 프로토콜을 제공하며, 신뢰성과 재현성을 보장하는 주요 지표를 포함합니다.

초기 임신 모체 면역 활성화 마우스 모델 생성을 통해 태아 염증이 신경발달에 미치는 영향을 평가한다

배우세요 C57BL/6 마우스 태아 뇌에서 알코올 유도 세포 자멸사를 평가하는 방법을. ADNF-9 신경영양 펩타이드의 신경보호 효과를 TUNEL 염색으로 검증하여 태아 뇌 발달 연구에 활용할 수 있습니다.

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