2013년 4월 24일
실험 디자인은 태아의 뇌 임신 중 세포 사멸 및 신경성 펩타이드의 응용 프로그램에서 알코올 노출의 효과를 공부에 여기에 초점을 제안했다. 사육에서 태아 뇌의 컬렉션에 대한 자세한 설명이 설명되어 있습니다. 세포 사멸의 결정을위한 기법도 자세히 설명되어 있습니다.
이 절차의 목적은 태아 알코올 노출 모델에서 영양 펩타이드의 신경 보호 효과를 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 실험 동물을 짝짓기한 다음 두 번째 단계로 영양 펩티드로 임신한 암컷을 치료함으로써 달성되며, 태아를 해부하여 실험적 용도로 태아의 뇌를 분리합니다. 다음으로, 태아의 뇌를 절편화를 위해 젤라틴에 삽입한 다음, 세포 사멸 결과를 확인하기 위해 터널 염색
을 수행합니다.이는 태아기 알코올 노출이 신경절 돌출부의 터널 양성 세포의 수를 증가시킨다는 것을 보여줍니다. 영양 펩티드의 대조군 투여와 비교하여, D 및 F 9는 대조군 알코올 처리 동물에 비해 터널 양성 세포에서 알코올 유도 증가를 유의하게 감소시켰다. 따라서 태아의 뇌는 매우 작기 때문에 태아의 뇌는 해부하고 처리하기에 매우 작기 때문에 태아의 뇌 해부와 내장 단계를 배우기가 어렵기 때문에 이 금속을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. 약 20g의 6주 된 암컷 마우스를 제거 직후 2시간 동안 수컷 가정용 케이지에 넣습니다.
짝짓기가 발생했는지 확인하기 위해 각 암컷에게 정자 플러그가 있는지 확인하십시오. 정자 플러그가 있는 경우 E 7 체중 일치 임신한 여성을 4개 그룹으로 나누는 이 배아 데이 제로를 지정합니다. 한 알코올 액체 다이어트 그룹은 영양소의 유일한 공급원으로 무료로 제공되었습니다.
알코올 노출과 함께 DNF 9 펩타이드의 복강 내 주사를 받아야 하는 Two Perfed 대조군 3 펩타이드 치료 그룹. 유동식 다이어트. 30ml 눈금이 매겨진 스크류 캡 튜브에서 24시간 동안 동물이 섭취한 유동식의 양을 기록하여 유일한 영양소 공급원으로 무료 초과를 통해 제공될 수 있는 알코올, 유동식 또는 쌍을 이루는 유동식의 일일 양을 결정합니다.
임신한 Myer E 13을 이산화탄소 안락사로 희생한 후 자궁경부 탈구를 한 후 E 7에서 E 13까지 매일 갓 준비한 유동식을 제공합니다. 사체를 누운 자세로 해부판에 놓고 70% 에탄올로 복부를 청소합니다. 멸균 가위와 집게를 사용하여 복부를 절개합니다.
복부가 열리면 집게로 자궁을 잡고 두 번째 집게를 사용하여 배아에 구멍을 뚫지 않고 자궁에서 자궁 내막을 천천히 부드럽게 뜯어냅니다. 자궁에서 배아를 조심스럽게 제거하고 행크의 균형 분류 용액으로 옮깁니다.젖은 얼음 위에 60mm x 15mm 크기의 세포 배양 접시에 접시와 얼음 용기를 올려 놓고, 현미 해부를 위한 초미세 집게를 사용하여 실체 현미경 무대에 접시와 얼음 용기를 놓습니다. 머리 윗부분에 있는 배아의 피부를 잡아당겨 두개골을 드러냅니다.
두개골이 노출되고 실체 현미경으로 명확하게 시각화되면 집게로 척수와 뇌간 높이의 두개골 기저부를 잡고 두개골을 벗기기 시작합니다. 머리의 뒤쪽에서 앞쪽으로 두개골을 한 조각씩 계속 벗겨냅니다. 뇌가 완전히 노출되면 집게를 사용하여 뇌를 추출합니다.
그런 다음 태아의 뇌를 원시 전구 또는 공장 전구의 기저부에서 Met Postfix의 기저부까지 2-3일 동안 4%파라알데히드로 절개한 모든 태아 뇌를 해부합니다. 태아의 뇌는 웨스턴 블롯(western blot) 또는 효소 분석법(enzymatic assay)을 위해 검사할 경우 동결될 수도 있습니다. 증류수에 준비된 A급 젤라틴 10% 용액을 준비한 후 필링 몰드를 반쯤 채우고 젤라틴이 응고될 때까지 기다립니다.
대조군과 산전 처리된 태아의 뇌를 응고된 젤라틴 위에 나란히 놓습니다. 이는 대조군과 실험군 간에 일관된 조건을 유지하기 위한 것입니다. 젤라틴이 너무 뜨겁지 않은지 확인하고 태아의 뇌 위에 액체 젤라틴을 추가하여 완전한 틀을 만듭니다.
최종 주형은 이 이미지와 유사해야 하며, 태아의 뇌를 담고 있는 준비된 젤라틴 주형을 15분 동안 냉장 보관합니다. 다음으로 임베딩 몰드 플라스틱을 벗겨냅니다. 최종 주형은 다음과 같아야 하며 태아의 뇌가 들어 있는 젤라틴을 이틀 동안 4%파라알데히드로 옮겨야 합니다.
3일째에는 고정된 태아 뇌를 함유한 젤라틴 블록을 바이옴 단계에 부착합니다. 그런 다음 관상 동맥 절편을 위해 25-50 미크론 두께로 설정된 viome을 사용하여 뇌를 절편합니다. PBS에 태아 뇌 절편을 수집한 다음 슈퍼 프로스트와 슬라이드에 태아 뇌 절편을 장착하고 15분 동안 건조시킵니다.
15분이 경과한 후. 터널 반응의 다음날 테스트를 위해 슬라이드를 PBS에 놓습니다. 먼저 슬라이드를 섭씨 37도에서 5분 동안 밀리리터 단백질 분해 효소 K와 PBS당 20마이크로그램의 용액에 담급니다.
그런 다음 PBS에서 오비탈 셰이커로 각각 5분씩 세 번 헹굽니다. 메탄올에 3% 과산화수소를 넣은 절편을 흔들지 않고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 이전과 같이 슬라이드를 세척하십시오.
다음으로, 얼음 위에서 2분 동안 투과성 용액에 절편을 배양합니다. 배양 후 PBS에서 두 번 세척했습니다. 이전과 마찬가지로 실험실 티슈를 사용하여 섹션 주변의 슬라이드 영역을 건조시킵니다.
그런 다음 두드리는 펜을 사용하여 슬라이드의 섹션 주위를 그립니다. 이것은 염색 용액의 누출을 방지하여 소량을 사용할 수 있습니다. 각 쌍의 한 섹션을 제조업체의 지침에 따라 준비된 터널 반응 혼합물로 배양합니다.
터널 시약이 없는 캐리어 용액을 negative control 섹션에 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 배양 시간이 경과하면 이전과 같이 PBS에서 오비탈 셰이커로 슬라이드를 세 번 세척합니다.
그런 다음 실험실 물티슈로 조직 주변을 말리십시오. 다음으로, 컨버터 POD 용액으로 절편을 흔들지 않고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 트리스 HCL로 5분씩 섹션을 세 번 헹굽니다.
슬라이드를 홀더로 옮기고 0.05%DAB와 0.003%과산화수소가 들어 있는 코플린 병에 넣습니다. 알루미늄 호일로 항아리를 덮고 원하는 경우 이전과 같이 PBS를 세척한 후 7분 동안 얼음 위의 궤도 셰이커에 놓습니다. 슬라이드는 프로토콜의 텍스트 부분에 자세히 설명된 대로 미사일 카운터 염색을 진행하기 전에 PBS에 저장할 수 있습니다.
다음 이미지는 신경영양 펩타이드, A DNF 9의 효과를 보여줍니다. 신경절 저명성에서 터널 분석을 사용하여 E 13 단계 태아 알코올 노출은 PF 그룹에 비해 A LC 그룹의 화살촉으로 표시된 세포 사멸 증가를 유도했습니다. 태아 알코올 노출과 함께 D NF 9 투여는 터널 양성 세포의 감소를 유도했습니다. 통계 분석은 AD와 F 9 투여가 터널 양성 세포에서 알코올 유도 증가를 방지한다는 것을 입증했습니다.
값은 평균에 평균의 표준 오차를 더한 값으로 표시됩니다. 단일 별표는 P 값이 0.052 미만임을 나타냅니다. 별표는 Newman Coles 사후 테스트에서 P 값이 0.01 미만임을 나타냅니다.
각 그룹에는 4의 N이 포함되어 있습니다. 그래서 개발 후,이 기술은 연구자와 뇌 발달 분야에서 생쥐의 약물 또는 화합물 및 뇌 발달의 영향을 탐구하는 방법입니다.
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본 연구는 태아 알코올 노출 모델에서 영양 펩타이드의 신경 보호 효과를 조사합니다. 번식부터 태아 뇌 수집까지의 절차와 세포 사멸을 평가하는 데 사용된 기술에 대해 자세히 설명합니다.
This method enables mechanistic de-risking of neuroprotective compounds in prenatal alcohol exposure models by quantifying apoptosis in fetal brain tissue. It supports target validation and assay development for trophic peptides by providing reproducible, quantitative readouts of cell death in disease-relevant systems. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking peptide treatment to reduced apoptotic markers in a standardized preclinical model.
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing in neurodevelopmental risk models.