고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술

이 비디오에서는 단 15분 만에 설치류로부터 테스트 물질의 세포 현탁액을 얻을 수 있는 매우 간단하고 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법은 마우스, 랫트 기니피그의 테스트 테스트에 적용되었으며 메타 머신 장치를 사용하여 캡슐화된 조직을 분해합니다. 여과 및 염색 후 세포 inion은 흐를 준비가 됩니다.

세포 분석 또는 세포 집단의 동질성(Homogeneity)은 수컷 GA 분화 중 생화학적 및 분자적 사건을 분석하기 위한 전제 조건입니다. 따라서 30개 이상의 서로 다른 세포 유형을 가진 고환 이질성은 포유류 정자 형성의 분자 기초 연구에 관한 주요 문제 중 하나를 나타냅니다. 이러한 이유로, PU와 원심 삽화를 포함하여 정제된 고환 세포 집단을 풍부하게 하기 위해 다양한 방법이 사용되었습니다.

모든 세포 분리 방법의 첫 번째 단계는 세포 현탁액을 준비하는 것입니다. 그러나 현재 프로토콜은 일반적으로 시간이 많이 걸리고 RNA와 같은 수명이 짧은 분자의 손실을 의미할 수 있으며, 이는 숨은 발현 분석에 바람직하지 않습니다. 여기에 제시된 프로토콜의 주요 장점은 동물 희생과 정자 단계 특이적 분자 연구 사이의 단계를 제거하면서도 동시에 세포 현탁액에서 우수한 품질과 우수한 세포 유형 표현을 보장한다는 것입니다.

이 방법을 개발한 AL Laboratory의 연구원인 Dr.Ana Rodriguez와 세포 분석을 담당한 Federico San Lopez 유세포 분석이 절차를 시연할 예정입니다. 이 절차에는 medicon 및 fcon 액세서리와 함께 meach 시스템이라는 작은 장비가 필요합니다. 그러나 fcon 액세서리는 동일한 기공 크기의 나일론 멤브레인으로 완벽하게 교체할 수 있습니다.

유일하게 필요한 다른 재료와 시약은 유리 스프레드, 두 개의 접시, 가위와 집게, 3-5 밀리리터 주사기, 성가신 대장실, 10 % 태아 기침 혈청 및 NDA가 보충 된 DMM 배양 배지입니다. RNA 조작과 관련된 다운스트림 응용 프로그램이 계획된 경우 프로토콜을 수행하기 위해 모든 재료와 용액을 적절하게 처리해야 합니다. 절개된 고환을 96mm 유리에 넣고, dm이라고 하는 10ml의 보충 얼음이 들어 있는 얼음을 보여줍니다.

TAL Virginia를 제거하고 디캡 고환을 각 면이 2-3mm의 정사각형 조각으로 자릅니다. 이 조각들 중 4-5개를 일회용 분리 제거 메디콘에 넣고 D를 보충하고 메타 머신 시스템에서 50초 동안 처리한 코드 1밀리리터와 함께 놓습니다. 각 의료 장치에는 6개의 마이크로 블레이드로 둘러싸인 약 100개의 육각형 구멍이 있는 고정된 스테인리스 스틸 스크린이 있습니다.

조직은 메디콘 챔버 내부의 금속 로터에 의해 각 구멍으로 옮겨지고 날카로운 구멍을 통과하여 금속 스크린을 통과하여 분리되는 동안 스크린 아래의 마이크로 펌프는 액체를 공급하고 선체를 세척합니다. 바늘이 없는 3-5mm 주사기를 사용하여 medicon의 세포 현탁액에서 결과를 복구합니다. 그런 다음 50 마이크로 미터 팔콘 또는 동일한 4 가지 크기의 나일론 메쉬를 반 밀리리터 매체에 담그고 서스펜션을 여과합니다.

단계를 반복하되 25마이크로미터 나일론 메쉬 또는 이에 상응하는 팔콘 유닛을 사용하여 얼음 위에 놓고 세포 현탁액의 ALI 인용문을 가져와 노이어 챔버에서 계수하고 세포 농도를 배양 배지의 밀리리터당 7개 세포에 대해 1-2배로 조정합니다. 마지막으로, NDA를 최종 농도인 0.2%에 추가하여 세포 펌핑을 방지하고 후속 흐름 연구 중에 근육이 막히는 것을 방지합니다. 세포 생존율을 평가하려는 경우, 유세포 분석 전에 제조업체의 지침에 따라 동물 세포에 대한 살아있는 사체 생존 키트를 사용하여 형광 염료를 첨가하여 이를 수행할 수 있습니다.

형광 색소 선택은 사용 가능한 레이저에 따라 다릅니다. 이 시연에서는 문서를 DNA에 결합하는 다양한 염료의 사용이 표시됩니다. 프로피듐 요 다이어트는 저농도의 고정 또는 사멸 세포에 대한 일반적인 염료이지만, 고농도에서 사용될 때 ROM은 여기에 제시된 방법으로 제조된 현탁액에서 고정되지 않은 고환 세포로 들어가는 것을 발견했습니다.

이는 아마도 반상피의 감각적 특성과 결합하여 세포 간 연결 브리지의 파손으로 이어질 수 있는 기계적 응력 때문일 수 있으며, 프로피듐 요오드화물 염색의 경우 밀리리터당 밀리리터당 50마이크로그램의 최종 농도에서 용액에서 샘플 분석 10분 전에 세포 현탁액에 노출시키고 어둠 속에서 섭씨 0도를 배양하여 프로피듐 뮤 염색 세포를 분석합니다. 추가 분류를 위해 488나노미터에서 방출하도록 조정된 코히어런트 타곤 이온 레이저가 장착된 팩스 밴티지 유세포 분석기를 사용합니다. 레이저 출력은 100 밀리 와트로 설정하고, 형광을 방출 한 프로피듐은 5, 7, 5, 슬래시, 26 밴드 패스 필터를 사용하여 FL 2 검출기를 수집합니다.

유세포 분석을 위해 70마이크로미터 노즐을 사용하고 Squa 소프트웨어를 사용하여 다음 파라미터를 분석합니다. 전방 산란 측면 산란, 총 방출 형광 또는 펄스 영역, 형광 방출 지속 시간 또는 펄스 폭. 결과는 각 형광 수준에서의 이벤트 수를 나타내는 그램 단위로, 측면 산란 대 형광 펄스 영역, 형광 펄스 영역 대 너비를 표시하는 D 플롯으로 표시됩니다.

Doublets는 팩스로 SM 단핵구 집단을 정렬하기 위해 너비에 대한 형광 펄스 면적의 DO 플롯을 사용하여 분석에서 제외되며, 정렬 모드를 일반 R 또는 일반 C로 설정하고 3개의 정렬된 방울을 엔벨로프로 사용합니다. 샘플 차이를 조정하여 초당 500 - 1500의 속도로 세포를 분석합니다. 샘플과 채취 튜브는 냉장 장치를 사용하여 섭씨 3-4도를 유지하십시오.

대안적으로, 현탁액의 세포는 다른 형광 색소로 염색될 수 있습니다. 예를 들어, 바이탈 염료가 있습니다. HER 3 3 3 3 4 2는 밀리리터당 5마이크로그램의 최종 농도까지 사용할 수 있으며 Hirsch를 위해 빛으로부터 보호된 37도에서 최소 10분 동안 배양할 수 있습니다.

3, 3, 3, 4, 2 얼룩 샘플. 세포 분석은 25밀리와트에서 작동하는 UV 여기 파장 레이저와 70마이크로미터 노즐이 장착된 MO 유세포 분석기를 통해 수행되었습니다. Summit 4.3 소프트웨어 또는 이와 유사한 소프트웨어를 사용하여 얼굴 대비 광학 절단 품질 현탁액이 관찰되는 조건에서 세포 현탁액을 분석할 때 이전에 표시된 것과 동일한 매개변수를 분석합니다.

이 프로토콜의 주요 장점은 우선 많은 기계를 사용하여 준비된 고환 세포 현탁액이며 테스트 제왕 절개, 조직 절단, 통증, 기계 처리 및 여과를 포함하여 15 분 만 얻는이 시간 동안 일반적으로 다른 프로토콜에 의해 걸리는 시간의 약 8 분의 1에 걸쳐있습니다. 이 프로토콜의 간결함과 관련된 최소한의 처리는 수명이 짧은 거대분자의 우수한 보존을 설명할 수 있으며, 이는 원래 세포 집단에 존재하는 화합물의 대표적인 샘플이 필요할 때 중요합니다. 메탄은 최소한의 취급을 필요로 하기 때문에 이 표에서 쉽게 재현할 수 있습니다.

성체 쥐를 대상으로 수행하고 유세포 분석으로 분석한 7개의 독립적인 실험에 대한 서로 다른 고환 세포 집단의 상대적 백분율은 방법의 재현성을 보여주기 위해 예로 제시됩니다. 고환 세포 현탁액의 제조를 위해 현재 사용되는 대부분의 입자와 달리, 여기에 제시된 방법은 효소 작용을 포함하지 않습니다. 일반적으로 포함되는 효소인 RNA에 콜라겐분해효소가 떨어지면 조직의 분리에 부적절하지만, 관심 있는 거대분자의 보존에 영향을 미칠 수 있습니다.

효소 처리의 부족은 RNA와 단백질 보존에 유리할 뿐만 아니라 프로토콜을 더 저렴하게 만듭니다. 기계적으로 준비된 세포 현탁액이 트립이 주입된 세포 현탁액보다 더 쉽게 뭉친다는 사실이 이전에 보고되었지만, 우리는 이 프로토콜이 효소 작용이 없는 상태에서 잘 분리된 세포 현탁액으로 이어진다는 것을 발견했습니다. NDA를 포함하면 세포 응집을 방지하는 데 매우 도움이 되는 것으로 입증되었습니다.

현탁액의 우수한 품질은 관찰된 최소한의 세포 파편에 의해 판단되는 대로 샘플이 세포 분석을 받을 때도 입증됩니다. 발표된 정보에 따르면, 원형 정자의 약 13%는 세포 현탁액이 독점적인 기계적 방법으로 준비되거나 트립신이 있는 상태에서 다핵으로 발견됩니다. 그러나 많은 기계 준비 현탁액은 매우 희소하며, 다핵 생성은 주로 조직 조작의 결과로 생성된다고 명시되어 있기 때문에 엉킴을 줄이기 위한 것일 수 있습니다.

쥐 고환에서 많은 기계로 준비된 세포 현탁액의 예가 이 그림에서 관찰됩니다. 보시다시피. 세포질은 잘 보존되어 있으며, C, 2 개 및 4 개의 C 세포 집단의 상대적 비율은 다른 설치류에 대한 많은 기계 준비 고환 현탁액에서 손상되지 않은 PE의 것을 재 조립합니다.

이는 여기에 설명된 방법이 특정 세포 유형을 선택적으로 손상시키지 않는다는 가정을 뒷받침합니다. 놀랍게도, 많은 기계 준비 현탁액에서 세포 유형 표현은 기존의 drippin 준비 방법보다 훨씬 더 잘 유지됩니다. 보시다시피, meine 처리된 고환 세포 현탁액에 대해 얻어진 세포 그래픽은 이전에 보고된 것과 실질적으로 다르지 않습니다.

실제로, 얻어진 히스토그램과 점도표는 DNA 함량을 기반으로 한 세 가지 특징적인 4개의 C to C 및 C 고환 세포 집단과 고도로 응축된 반수체 정자를 나타내는 명백한 subha 집단을 나타냅니다. 이러한 프로파일은 각각 지속성 또는 프로피듐 요오드화물 염색 현탁액에 대해 관찰되었으며, 이는 성체 및 청소년 표본을 나타냅니다. 유사분열 세포의 분류는 DNA 함량을 기반으로 선택된 고환 집단 또는 DNA 함량은 동일하지만 수면 타인 및 타인 근세포와 같은 염색질 응축 수준이 다른 하위 집단에 대해 98% 이상의 순도로 성공적으로 달성되었습니다.

기니피그 테스트 중단에서 관찰할 수 있듯이, 프로토콜에는 RNA 처리가 포함되지 않기 때문에 분류된 집단이 우수한 RNA 품질을 제공하고 프로피듐 요오드화물 염색 집단에 대해서도 차등 유전자 발현 연구를 허용합니다. 그런 의미에서, 다른 염료, 프로피듐 요오드화물 염색, DNA 및 이중 가닥 RNA와 달리 기니피그 고환 현탁액 분석의 이 그래픽에서 프로피듐 요오드화물을 사용하여 얻은 유사한 프로필이 생생한 사이클 오렌지와 병렬로 생성된다는 점을 상기할 가치가 있습니다. 이는 RNA 염색이 세포 측정 히스토그램 패턴에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주는 중요한 DNA 특이적 염료입니다.

이 목록에는 백분율 프로토콜의 주요 장점이 요약되어 있습니다. 여기에 설명된 최적화된 방법을 사용하면 ME 기계 시스템을 통한 고환 해부, 조직 절단 및 처리를 포함하여 설치류의 다양한 정자 단계에 대한 세포 분석을 위한 적절한 고환 세포 현탁액을 단 15분 만에 빠르게 준비할 수 있습니다. 세포 현탁액의 간결성, 높은 재현성 품질 및 세포 유형 비율은 현재 사용 중인 다른 지루하고 시간이 많이 소요되는 자가 준비 기술에 대한 좋은 대안이 됩니다.

또한 이 방법은 조작이 거의 필요하지 않고 효소 및 세제를 피하기 때문에 유전자 발현 연구와 같은 섬세한 다운스트림 응용 분야에 이상적인 선택입니다.