Name: 고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: 배우세요 쥐와 기니피그 등 설치류 고환 조직에서 15분 만에 고품질 세포 현탁액을 준비하는 기계적 분리 방법을. 이 기법은 효소 처리 없이 세포 생존율과 RNA 완전성을 보존하여 유전자 발현 연구에 적합합니다.

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이 작품은 부분적으로 CSIC (I + D 프로젝트 C022)와 PEDECI​​BA에 의해 지원되었다. 저자는 조심스럽게이 프로젝트에 사용되는 모든 기니 돼지 표본을 제공하기 위해 MoFlo 셀 분류기, 그리고 메리 - 몬테비데오에 관한 그들의 관대 한 협업 세포 생물학 장치 (파스퇴르 연구소 드 몬테 비디오)에서 마리엘라 Bollati와 발렌 포로 감사드립니다. 그림 1 그림 2와 3, S. Karger AG, 바젤의 권한 표 1; BioMed 본부의 허가를 재현하고 그림 4와 5는 존 와일리 &amp; 선즈, Inc의 (에 의해 소유 저작권 허가를 복제하거나 적응했다 와일리 - 블랙웰, 2011).

1. 세포 현탁액의 준비 <ol><li> 이러한 IACUC 또는 동급으로 전문위원회의 권고에 따라 사용할 시편을 희생 (우루과이, 국가위원회의 동물 실험에 대한 [CNEA]). 우리의 경우, 펜 토바 비탈의 과량이 투여되었다. </li><li> 표준 승인 절차에 따라 고환을 해부하고 얼음처럼 차가운 DMEM 10 ML을 포함, 얼음 96mm 유리 페트리 접시에 배치 10 % 소 태아 혈청과 보충. </li><li> 투 니카 albuginea을 제거하고 2 사각형 조각으로 캡슐화가 고환을 잘라 - 양쪽에 3mm. </li><li> 그 조각은 다음 Medimachine, 조직이 뚫린 스테인리스 스크린과 금속 회 전자를 포함하는 일회용 기기 내부에 세분화 된 자동 기계 분쇄기로 처리됩니다. 50 μm의 일회용 단위 disaggregator에 스위치 및 프로세스에서 이러한 조각 중 1 - 5 이렇게하려면, 감기의 장소 1 ML은 DMEM 4를 보충<html> 제조업체의 간단한 지침에 따라 50 초합니다. </li><li> 바늘없이 5 ML의 주사기 - 3을 사용하여 세분화 장치에서 결과 세포 현탁액을 복구 할 수 있습니다. </li><li> 0.5 밀리리터 DMEM을 보충와 이전에 담가 50 μm의 나일론 메쉬를 통해 필터링합니다. </li><li> 젖은 25 μm의 나일론 메쉬, 얼음에 장소를 사용하여 다시 현탁액을 필터링합니다. </li><li> 네우 바우 챔버에서 셀을 1로 세포 농도를 조정 - 2 × 10 7 세포 / ML DMEM 배지로. 적어도 4 X 10 7 세포 / 고환 물질의 그램은 일반적으로 얻을 수 있습니다. </li><li> 마지막으로, 세포 응집을 방지하기 위해 0.2 %의 최종 농도 (2 - 나프톨 -6,8 - 디 술폰산, 칼륨 염) NDA를 추가합니다. </li><li> 선택 사항 : 제조업체의 지침에 따라, 동물 세포 시중에서 생존 키트와 함께 고환 세포 현탁액의 세포 생존을 확인합니다. </li></ol> 2. 유세포 분석 ve_content &quot;&gt; 우리의 propidium 요오드의 높은 농도 (PI)로 염색 세포의 분석을 위해 488 nm에서 방출하는 조정 일관된 아르곤 이온 레이저를 장착 한 벡톤 - 디킨슨 FACSVantage 흐름 cytometer에를 사용했습니다. (고정되지 않은에 PI 입구의 문제 스트레스 세포) 다른 9,10 해결되었습니다. <ol><li> PI 염색을위한 50 세포 현탁액에 μg / ML의 최종 농도에서 형광을 추가하고, 0시 10 분 ° 어둠 속에서 C에 대해 품어. </li><li> 레이저 전력은 100 mW의 및 26분의 575 밴드 패스 필터가 FL2에서 PI-방출 ​​형광을 수집하는 데 사용됩니다로 설정됩니다. </li><li> 우리는 70 μm의 노즐 FC 측정을 수행합니다. spermatocyte 인구를 정​​렬, 봉투로 3 분류 방울을 사용하여 일반-R 또는 Normal-C 모드에서 정렬을 설정합니다. 3시 샘플 및 수집 튜브를 유지 - 4 ° C에 냉동 장치를 사용하여. 초당 1,500 ~ 500의 속도로 세포를 분석 할 시료 차이를 조정합니다. </li><li> 분석하는 CellQuest 소프트웨어 (BD)를 사용하여다음 매개 변수 : 앞으로 분산 형 (FSC-H), 측면 산란 (SSC-H), 총 방출 형광 또는 펄스 면적 (FL2-A) 및 형광 방출 또는 펄스 폭 (FL2-W)의 기간. </li></ol> 또한, 우리는 5 μg / ML의 최종 농도에 중요한 염료 훽스트 33342을 고용하고 37 10 분 ° 어둠 속에서 C 동안 배양했다. 세포 분석은 MoFlo cytometer에 (DakoCytomation)를 통해 25 mW의에서 UV 여기 파장 레이저 운영을 탑재 해, 70 μm의 노즐을 사용하여 수행 하였다. 데이터 조작은 정상 V4.3 소프트웨어 (DakoCytomation)로 수행 하였다.

<ol><li>Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeistrich%2C+ML+%22Methods+of+Cell+Biology%22">Methods of Cell Biology</a>. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).</li>
<li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+separation%2C+physical+characterization%2C+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li>
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<li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li>
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<li>Spanò, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li>
</ol>

여기에 설명 된 최적화 방법은 효소 세제 치료를 피하고 좋은 세포 무결성 및 유형 비율을 유지, 매우 빠르고 재현성 방식으로 쥐 고환 조직에서 세포 현탁액의 준비를 할 수 있습니다. 절차 (15 분 스팬 고환 해부, 조직의 절단 및 가공 포함), 관련 최소한의 처리 및 효소 치료의 부재의 간결함은 주요 장점 중 일부입니다. 이러한 모든 원래의 세포 인구에 존재하는 물질의 대표 샘플이 필요할 때 중요한 짧은 인생 고분자의 좋은 보존을 차지한다. PI 또는 훽스트 33342 하나의 사용에 관하여, 우리는 하나 또는 다른 염료의 고용과 고환 세포 현탁액의 유세포 분석 결과 프로파일에는 분명 차이를 관찰했다. 염료의 선택이 아니라 사용자의 기본 설정와 availabilities에 따라, 그리고 것계획 추가 사용합니다. 한 측면에서, PI는 저렴하고 광범위한 응용 프로그램의 같은 흐름 cytometers 및 UV 레이저를 갖는 분류기의 사용을 요구하지 않습니다. 다른 한편으로, 우리는...

<table><tbody><tr><td>메디머신 시스템</td><td>BD</td><td>340587</td><td></td></tr><tr><td>메디콘 유닛 (50 &mu; m)</td><td>BD</td><td>340591</td><td></td></tr><tr><td>Filcon 단위 (50 &mu; m)</td><td>BD</td><td>340603</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>430-2100</td><td></td></tr><tr><td>태아 종아리 혈청</td><td>PAA</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>NDA</td><td>Chemos BmbH</td><td>277081</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>원액 5 mg/ml; 최종 농도 5 &mu에서 사용; g / ml</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>287075</td><td>원액 1 mg / ml; 50 &mu의 최종 농도에서 사용; g/ml</td></tr></tbody></table>

고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

포유류의 고환은 체세포 고환 세포와 생식 세포의 여러 단계를 포함하여 30 개 이상의 서로 다른 세포 유형을 포함 매우 복잡한 기관이다. 이 이질성은 정자 발달의 특정 단계에서 순수한 농축 세포 인구는 대부분의 분자 분석 1 필요에 따라, 포유류의 정자의 기초 연구에 관한 중요한 단점이다. 같은 Staput 2,3, 원심 elutriation 1 및 유동 세포 계측법 등 다양한 전략 (FC) 4,5는 차동 유전자 발현 연구를 활성화하기 위해 농축 또는 정제 고환 세포 인구를 얻기 위해 사용되어왔다. 이것은 세포가 가장 농축 / 정제 방법에 대한 정학 것을 요구된다. 이상적으로, 세포 현탁액은 원래의 조직을 대표하고, 가능한 세포와​​ 몇 multinucleates의 비중이 높은 때문에 -의 형성 경향이그리고 부족한 세포 대단히 짧은 시간 1 - 정액 상피 6,7의 세포 융합 성격. 이전 보고서는 독점적 기계적 방법에 의해 제조 고환 세포 현탁액은 트립신 사람 1보다 더 쉽게 응집 것을 입증했다. RNAses 및 / 또는 트립신 및 특정 스트림 애플리케이션에 바람직하지 않은 특정 고분자 분해에 콜라 리드와 같은 분해하는 효소 반면에, 효소 처리. 이상적인 프로세스는 mRNA가 같은 관심 고분자의 좋은 보존을 달성하기 위하여 가능한 한 짧아야하며 최소한의 조작을 포함해야한다. 단단한 조직에서 세포 현탁액의 준비를위한 현재 프로토콜은 일반적으로 시간이 걸리는 매우 연산자에 의존하고, 선택적으로 특정 세포 유형에게 1,8가 손상 될 수 있습니다. 여기에 제시 프로토콜과 높은 재현성 매우 간단한 기계 세분화의 이점을 결합유세포 분석 및 정렬 4 및 꿍꿍이 유전자 발현 연구 9에 사용할 수있는 좋은 품질의 세포 현탁액을 선도하는 효소 치료의 bsence.

여기에 설명 된 프로토콜을 준비 쥐의 고환에서 잘 분해 된 세포 현탁액의 예는 그림 1에 표시됩니다. 효소 치료 6,8에 이전에 설명한 기계 세분화 방법 2에 비해, 여기에 제시 한 (특히 다른 기계에 비해 훨씬 빠릅니다 적은 처리를 포함, (NOT 연산자에 의존) 쉽게 재현하고 부족한 세포 파편을 렌더링 방법)과 거의 multinucleates (광범위한 조직 조작 1,2의 결과로 형성하는 기술되었다)입니다. 또한, 효소 처리에 반대하는, 그것은 거대 분자에게 분해를 선호 할 수 RNAses, 트립신 및 콜라게나 제의 사용을 피한다. 반면에, 비록 이전의 보고서는 독점적 기계적 방법에 의해 제조 고환 세포 현탁액에 트립신보다 더 쉽게 응집 것을 입증했다에스 1, 본 발명의 방법의 응용 프로그램은 그림 ...

효소 세제를 피 설치류 자료에서 고환 세포 현탁액의 기계적 준비를위한 새로운 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 매우 간단하고 빠르고, 재현성 및 흐름 정렬 및 RNA 추출에 적합한 좋은 품질의 세포 현탁액을 렌더링합니다.

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

본 영상에서는 단 15분 만에 설치류의 테스트 시료로부터 세포 현탁액을 얻을 수 있는 매우 간단하고 효율적인 프로토콜을 소개합니다. 이 방법은 마우스, 랫드, 기니피그의 테스트 시료에 적용되었으며, 캡슐화된 조직을 분해하기 위해 메타 머신 장치를 사용합니다. 여과 및 염색 과정을 거치면 세포 현탁액이 유세포 분석을 위한 준비 상태가 됩니다.세포 분석 또는 소팅. 세포 집단의 균질성은 수컷 생식샘 분화 과정 중 발생하는 생화학적 및 분자적 사건을 분석하기 위한 전제 조건입니다. 따라서 30가지 이상의 다양한 세포 유형이 존재하는 정소의 불균질성은 포유류 정자 형성의 분자적 기초를 연구하는 데 있어 주요한 문제 중 하나입니다. 이러한 이유로, PU 및 원심 분리를 포함하여 농축되거나 정제된 정소 세포 집단을 얻기 위해 다양한 방법들이 사용되어 왔습니다.모든 세포 분리 방법의 첫 번째 단계는 세포 현탁액을 준비하는 것입니다. 하지만 현재의 프로토콜은 대개 시간이 많이 소요되며, RNA와 같이 수명이 짧은 분자의 손실을 초래할 수 있어 추후 발현 분석에 바람직하지 않습니다. 본 프로토콜의 주요 장점은 동물 희생부터 정자 단계의 특이적 분자 연구 사이의 단계들을 제거하면서도, 동시에 세포 현탁액 내에서 우수한 품질과 뛰어난 세포 유형 대표성을 보장한다는 점입니다.시연은 이 방법을 개발한 AL Laboratory의 연구원인 Dr. Ana Rodriguez와 세포 분석을 담당한 Federico San Lopez flow cytometry가 진행합니다. 이 절차에는 medicon 및 fcon 액세서리가 포함된 meach 시스템이라는 소형 장비가 필요합니다. 다만, fcon 액세서리는 동일한 공극 크기의 나일론 막으로 충분히 대체 가능합니다.필요한 나머지 재료 및 시약은 유리 스프레더, 디쉬 2개, 가위와 포셉, 3~5 mL 주사기, DMM 배양액(10% fetal calf serum 및 NDA 보충), 그리고 보울 챔버입니다. RNA 조작을 포함한 후속 응용 단계가 계획되어 있다면, 프로토콜 수행을 위해 모든 재료와 용액을 그에 맞게 처리해야 합니다. 적출한 정소를 10 mL의 보충된 차가운 DMM이 들어 있는 96 mm 유리 페트리 접시에 넣으십시오.TAL Virginia를 제거하고, 탈캡된 정소를 각 변이 2~3mm인 정사각형 조각으로 자릅니다. 이 조각 4~5개를 1mL의 보충된 D 코드가 포함된 일회용 분리 메디콘(medicon)에 넣고 메타 머신 시스템(meta machine system)에서 50초 동안 처리합니다. 각 메디콘 유닛에는 6개의 마이크로 블레이드로 둘러싸인 약 100개의 육각형 구멍이 있는 고정 스테인리스 스크린이 포함되어 있습니다.조직은 medicon 챔버 내부의 금속 로터에 의해 각 구멍으로 이동하며, 하단의 마이크로 펌프가 액체를 공급하여 껍질을 씻어내는 동안 날카로운 구멍과 금속 스크린을 통과하며 분리됩니다. 바늘이 없는 3~5 mm 시린지를 사용하여 medicon에서 세포 현탁액 상태의 결과물을 회수하십시오. 그 다음, 50 µm falcon 또는 동일한 크기의 나일론 메쉬를 0.5 mL의 배지로 적신 후, 현탁액을 이를 통해 필터링하십시오.동일한 단계를 반복하되, 25 µm 나일론 메쉬 또는 그에 상응하는 falcon unit을 사용하고 얼음 위에 둡니다. 세포 현탁액의 일부를 취해 noyer chamber에서 세포 수를 측정하고, 배양액 내 세포 농도가 1~2 × 10⁷ cells/mL가 되도록 조정합니다. 마지막으로, 세포 응집을 방지하고 이후의 유세포 분석 중 근육 폐쇄를 막기 위해 NDA를 최종 농도 0.2%가 되도록 첨가합니다. 세포 생존율을 평가하려는 경우, 유세포 분석 전 제조사의 지침에 따라 동물 세포용 live dead viability kit를 사용하여 형광 염료를 첨가함으로써 수행할 수 있습니다.형광 염료의 선택은 사용 가능한 레이저에 따라 달라집니다. 본 시연에서는 DNA에 결합하는 서로 다른 염료들의 사용법을 보여드릴 것입니다. 일반적으로 고정된 세포나 사멸된 세포에는 저농도의 propidium iodide 염료를 사용하지만, 본 실험에서 제시한 방법으로 준비한 부유액의 경우, 고농도로 사용했을 때 ROM이 고정되지 않은 정소 세포 내부로 침투한다는 것을 확인하였습니다.이는 아마도 가해진 기계적 스트레스로 인한 것으로 보이며, 정관 상피의 감각적 특성과 결합하여 최소한의 조작만으로도 세포 간 연결 교(connecting bridges)의 파손을 유발할 수 있습니다. Propidium iodide 염색을 위해, 시료 분석 10분 전에 최종 농도가 50 µg/mL가 되도록 세포 현탁액에 용액을 첨가하고 0 °C의 암소에서 배양합니다. Propidium iodide 염색 세포를 분석합니다. 추가 분리를 위해 488 nm에서 방출하도록 조정된 coherent argon ion laser가 장착된 FACS Vantage 유세포 분석기를 사용합니다. 레이저 출력은 100 mW로 설정하며, Propidium iodide에서 방출되는 형광은 575/26 밴드패스 필터를 사용하는 FL2 검출기로 수집합니다.유세포 분석 측정을 위해 70 µm 노즐을 사용하고, squa 소프트웨어를 이용하여 다음 파라미터들을 분석합니다. 전방 산란광(forward scatter), 측방 산란광(side scatter), 총 방출 형광 또는 펄스 면적(pulse area), 그리고 형광 방출 지속 시간 또는 펄스 폭(pulse width)을 분석합니다. 결과는 각 형광 수준에서의 이벤트 수를 나타내는 그래프와, 측방 산란광 대비 형광 펄스 면적 및 형광 펄스 면적 대비 펄스 폭을 표시하는 2D 플롯으로 제시됩니다.정상 R(normal R) 또는 정상 C(normal C) 정렬 모드로 설정된 fax vantage를 사용하여 SM 단핵구 집단을 정렬할 때, 형광 펄스 면적 대 너비의 DO 플롯을 이용하여 더블릿(doublets)을 분석에서 제외합니다. 이때 3개의 정렬 드롭을 엔벨로프로 사용합니다. 초당 500에서 1500개의 세포를 분석할 수 있도록 샘플 차등(sample differential)을 조정하십시오. 냉장 장치를 사용하여 샘플 및 수집 튜브를 3에서 4 °C로 유지하십시오.또는, 부유 세포를 다른 형광 색소로 염색할 수 있습니다. 예를 들어, 생존 염색약인 HER 3 3 3 4 2를 최종 농도가 5 µg/mL가 되도록 사용하여 빛이 차단된 상태로 37 °C에서 최소 10분 동안 배양할 수 있습니다.3, 3, 3, 4, 2개의 염색 시료를 준비합니다. 25 mW의 UV 여기 파장 레이저와 70 µm 노즐이 장착된 MO 유세포 분석기를 사용하여 세포 분석을 수행했습니다. 세포 현탁액을 위상차 현미경으로 관찰하여 품질이 양호한 현탁액임을 확인한 후, Summit 4.3 소프트웨어 또는 유사한 프로그램을 사용하여 이전에 명시된 동일한 파라미터를 분석하십시오.이 프로토콜의 주요 장점은 첫째로, 전용 기기를 사용하여 정소 세포 현탁액을 준비함으로써 정소 적출, 조직 절단, 기기 처리 및 여과를 포함하여 단 15분 만에 완료할 수 있다는 점이며, 이는 일반적인 다른 프로토콜에 소요되는 시간의 약 8분의 1 수준입니다. 이 프로토콜의 신속함과 최소한의 핸들링은 수명이 짧은 거대 분자들을 효과적으로 보존할 수 있게 하며, 이는 원래의 세포 집단에 존재하는 화합물들의 대표성 있는 샘플이 필요할 때 매우 중요합니다. 또한, 핸들링이 최소화되어 있으므로 본 표의 방법은 재현성이 용이합니다.방법의 재현성을 보여주기 위한 예시로, 성체 쥐를 대상으로 수행하고 유세포 분석법으로 분석한 7회의 독립적인 실험에서 나타난 다양한 고환 세포 집단의 상대적 백분율을 제시하였습니다. 고환 세포 현탁액 제조에 현재 주로 사용되는 대부분의 입자와 달리, 본 방법은 효소 작용을 포함하지 않습니다. 일반적으로 포함되는 효소인 collagenase drip은 RNA의 분해에 기여하여 조직 분리가 불충분하게 이루어질 수 있으며, 관심 대상인 거대 분자의 보존에 영향을 줄 수 있습니다.효소 처리 과정을 생략하면 RNA와 단백질의 보존에 유리할 뿐만 아니라 프로토콜 비용을 절감할 수 있습니다. 기계적으로 준비한 세포 현탁액이 트립신 처리한 것보다 더 쉽게 뭉친다는 보고가 이전에 있었으나, 본 프로토콜에서는 효소 작용 없이도 세포 현탁액이 충분히 잘 분리됨을 확인하였습니다. 특히 NDA를 첨가하는 것이 세포 응집을 방지하는 데 매우 유용한 것으로 입증되었습니다.최소한의 세포 파편만이 관찰되는 세포 분석 결과는 현탁액의 품질이 우수함을 입증합니다. 기발표된 정보에 따르면, 전적으로 기계적인 방법으로 세포 현탁액을 준비하거나 트립신을 사용했을 때 원형 정자의 약 13%가 다핵으로 나타납니다. 하지만 기계로 준비된 많은 현탁액에서는 다핵 세포가 매우 드물게 나타나는데, 이는 주로 조직 조작의 결과로 다핵 세포가 생성된다는 점에서 엉킴이 감소했기 때문인 것으로 보입니다.이 사진에서는 마니머신(many machine)으로 준비한 쥐 고환 세포 현탁액의 예를 관찰할 수 있습니다. 보시는 바와 같이, 세포질이 잘 보존되어 있으며, 다양한 설치류의 마니머신 준비 고환 현탁액 내 C2C 및 4C 세포 집단의 상대적 비율은 온전한 PE의 비율과 일치했습니다.이는 여기서 설명한 방법이 특정 세포 유형을 선택적으로 손상시키지 않는다는 가정을 뒷받침합니다. 놀랍게도, 기계로 준비된 많은 현탁액에서의 세포 유형 표현도는 전통적인 적하(drippin) 준비 방법보다 훨씬 더 잘 유지됩니다. 확인하실 수 있듯이, 본 방법으로 처리된 고환 세포 현탁액에서 얻은 세포 그래픽(cyto graphics)은 이전에 보고된 결과와 실질적인 차이가 없습니다.실제로, 얻어진 히스토그램과 닷 플롯은 DNA 함량에 따른 세 가지 특징적인 4C, 2C 및 C 고환 세포 집단과 고도로 응축된 반수체 정자를 나타내는 명백한 sub-haploid 집단을 보여줍니다. 이러한 프로파일은 각각 Hoechst 또는 propidium iodide 염색 현탁액에서 관찰되었으며, 이는 성체 및 juvenile 표본 모두에서 마찬가지였습니다. 정자 형성 세포의 분리는 DNA 함량에 기반한 선택적 고환 집단뿐만 아니라, sleep-tine 및 tine myocytes와 같이 DNA 함량은 동일하지만 염색질 응축 수준이 다른 하위 집단에 대해서도 98% 이상의 순도로 성공적으로 수행되었습니다.기니피그 시험 현탁액에서 관찰할 수 있듯이, 프로토콜에 RNA 처리가 포함되지 않았음에도 분류된 세포군은 양호한 RNA 품질을 나타내어 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)로 염색된 세포군에서도 차등 유전자 발현 연구가 가능했습니다. 이러한 관점에서, 다른 염료와 달리 프로피디움 아이오다이드는 DNA뿐만 아니라 이중 가닥 RNA도 염색한다는 점을 상기할 필요가 있습니다. 하지만 기니피그 고환 현탁액 분석 그래픽을 보면, 프로피디움 아이오다이드를 DNA 특이적 염료인 vibrant ized cycle orange와 병행하여 사용했을 때 유사한 프로파일을 얻었으며, 이는 RNA 염색이 사이토메트리 히스토그램 패턴에 유의미한 영향을 주지 않음을 보여줍니다.이 목록은 제시된 프로토콜의 주요 장점을 요약한 것입니다. 여기에 설명된 최적화된 방법은 고환 적출, 조직 절단 및 ME 머신 시스템을 통한 처리를 포함하여 단 15분 만에 설치류의 다양한 정자 단계에 대한 세포 분석용 적절한 고환 세포 현탁액 조제를 가속화할 수 있게 합니다. 이러한 간결함, 더 높은 재현성 품질 및 세포 현탁액 내의 세포 유형 비율은 현재 사용되는 다른 더 지루하고 시간이 많이 소요되는 자가 조제 기술의 훌륭한 대안이 됩니다.또한, 이 방법은 조작 과정이 매우 적고 효소와 세제를 사용하지 않으므로, 유전자 발현 연구와 같이 정밀함이 요구되는 후속 응용 단계에 이상적인 선택입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직 aggitation에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS Dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 nerual 조직이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

마우스 신경 조직에서 단일 셀 Suspensions의 생성

이 비디오는 고환의 구성 요소인 쥐 정세관에서 Sertoli 세포를 분리하는 절차를 보여줍니다. 효소 분해 및 반복 세척은 Sertoli 세포가 용액으로 방출되는 것을 촉진하며, 이는 증식 및 성장을 위해 추가로 배양될 수 있습니다.

Isolation of Immune Regulatory Sertoli Cells from Mouse Seminiferous tubbules (쥐 정액 세뇨관에서 면역 조절 세르톨리 세포(Immune Regulatory Sertoli Cells) 분리

성인 마우스에서 spermatogonial 줄기 및 전구 세포 라인을 도출하고 유지하는 간단한 방법은 여기 제공됩니다. 방법은 성인 마우스 testis의 체세포 구획에서 발생하는 피더 세포를 활용합니다. 이 기술은 유전자 변형, 노크 - 아웃 등의 일반적인 마우스 변종에 적용하고, 똑 -의 생쥐.

장기 성인 마우스 SSC 라인의 유도를위한 문화 Spermatogonial 줄기 및 전구 세포의 일련 농축 (SSCs)

STA-PUT 방법은 크기와 밀도에 따라 정자 형성 세포의 다른 인구의 분리 할 수​​ 있습니다.

STA-PUT 속도의 침전을 사용하여 정자 형성 세포 유형의 분리

여기서 물질은 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 구조를 보존하기 위해 개발된 방법을 설명한다. 이를 3차원(3D) 슬라이드 방법이라고 합니다. 이 방법은 비핵화 구조의 검출을 위한 감도를 향상시키고, 시상 혼성화(FISH)에서 면역형광, DNA 및 RNA 형광에 적용가능하다.

고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 아키텍처를 보존하는 슬라이드 준비 방법

차 세르 톨리 (Sertoli) 세포는 면역 보호 특성의 염증이나 감염, 및 이용 기간 동안 고환 면역 특권, 신호 전달 연구가 필요합니다. 여기에서 우리는 고도로 정제 차 세르 톨리 (Sertoli) 세포와 쥐의 고환에서 세뇨관 세포의 분리를 위해 효소 기반의 프로토콜을 설명합니다.

쥐 고환의 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 분리 및 세뇨관 세포

이 연구는 다른 포유 동물 종의 고환 조직으로부터 정제 된 배아 세포 집단을 얻는 방법의 표준화를 기술한다. Hoechst-33342 및 propidium iodide로 염색하는 기계적 고환 해리와 남성 생식 생물학의 비교 연구에서 폭넓게 응용할 수있는 FACS 분류법을 결합한 간단한 프로토콜입니다.

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

여기에 제시된 것은 표준 실험실 장비와 불연속 소 혈청 알부민 밀도 그라데이션을 사용하여 성인 마우스 고환에서 파키틴 정자 세포, 둥근 정자 및 길쭉한 정자를 풍부하게하기위한 프로토콜입니다.

표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포와 정자의 농축

여기서, 우리는 시판되는 마이크로웰 배양 시스템을 사용하여 고환 특이적 조직 구조를 가진 돼지 고환 오르가노이드의 재현 가능한 생성을 위한 프로토콜을 제시한다.

마이크로웰 배양을 이용한 고환 특이적 구조를 이용한 돼지 고환 오르가노이드 생성

여기서, 1차 신생아 골린 고환 세포로부터 고환 오르가노이드를 발생시키는 네 가지 방법은 즉, 세포외 매트릭스(ECM) 및 ECM-없는 2D 및 3D 배양 환경으로 기술된다. 이러한 기술은 여러 연구 응용 프로그램을 가지고 있으며 시험관 내고 발달 및 생리학을 연구하는 데 특히 유용합니다.

추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성

여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

배우세요 쥐와 기니피그 등 설치류 고환 조직에서 15분 만에 고품질 세포 현탁액을 준비하는 기계적 분리 방법을. 이 기법은 효소 처리 없이 세포 생존율과 RNA 완전성을 보존하여 유전자 발현 연구에 적합합니다.

고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술

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