제브라 피쉬의 인 Gal4을 사용하여 유전자 트래핑

이 프로시저의 전반적인 목표는 GAL4, VP16을 주요 유전자 트랩 리포터로 사용하는 벡터 내의 유전자 파괴 트랜스포존(gene breaking transpose)을 이용하여 돌연변이 물고기를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 유전자 트랩 벡터를 Tol2 트랜스포아제와 함께 제브라피시 배아에 공동 주입함으로써 수행됩니다. 주입된 배아는 수정 후 3일째에 GFP 형광을 통해 스크리닝하며, 가장 밝은 배아의 약 30%를 선택하여 F0 풀(pool)을 구축합니다.

다음으로, 유전자 트랩 이벤트의 생식선 전달 여부를 확인하기 위해 F0 세대 물고기를 U-A-S-M-R-F-P 테스터 라인과 교배합니다. 마지막 단계로 F1 세대를 외교배하여 F2 세대를 확립하고, inverse PCR 및 5' RACE를 통해 유전자 트랩 이벤트의 분자적 특성을 분석하기 위한 배아를 생성합니다. 최종적으로 스크리닝한 F0 물고기 중 약 10분의 1이 유전자 트랩 자손을 생성해야 합니다.

유전자 파괴 트랜스포존(Gene breaking transposon)은 단백질 코딩 유전자의 입구에 통합될 때 돌연변이가 발생하지 않도록 설계되었습니다. 당사의 GBT 벡터는 G four P 16을 주요 유전자 트랩 리포터로 사용합니다. 이러한 수정은 저발현 유전자에 대한 민감도를 높이며, 다른 트랜스젠의 조직 특이적 발현을 위한 G four 드라이버로서 오버어보이드(over avoid) 표현형 없이 유전자 트랩 돌연변이체를 사용할 수 있게 합니다.

저희는 본 방법의 주요 병목 현상이 F zero 물고기의 생식선에서 충분히 높은 비율의 유전자 트랩 삽입을 달성하는 것에 있다고 판단합니다. 이번 시연에서는 DNA 준비, 마이크로인젝션 및 F zero 스크리닝이라는 몇 가지 핵심 단계를 다룰 것입니다. GBTB one 유전자 트랩 벡터는 GAL four VP 16을 주요 유전자 트랩 리포터로 사용합니다.

유전자 트랩 통합을 위해 양 끝에 최소한의 tall two transpose가 사용됩니다. 유전자 트랩 이벤트는 14 X GAL four UAS의 제어 하에 있는 EGFP 리포터에 의해 직접 검출됩니다. 전체 유전자 트랩 카세트는 직접 잠금 P 사이트에 의해 측면이 둘러싸여 있습니다.

이를 통해 Cre 리콤비나제(recombinase) 발현으로 유전자 트랩 이벤트를 가역적으로 만들 수 있으며, 특정 유전자 트랩 삽입과 관찰된 표현형 사이의 인과 관계를 입증할 수 있습니다. 또한, U-A-S-E-G-F-P 카세트 양단에는 직접 반복 FRT 부위가 배치되어 있습니다. Flip 리콤비나제 mRNA를 주입하면 U-A-S-E-G-F-P 카세트가 절제되어, 유전자 트랩 돌연변이에서 EGFP 형광 표지가 제거됩니다. 따라서 미세 주입 이전에 GFP 형광으로 특정 조직이나 발달 단계를 표지하는 형질전환 라인에서도 이를 사용할 수 있습니다.

DNA 전이효소(transpose)와 전이효소 mRNA를 준비합니다. GBTB 단일 유전자 트랩 벡터 DNA를 준비합니다. 표준 미니 프렙 키트를 사용하고 제조사의 프로토콜을 따르되, DNA를 준비할 때 PB 세척 단계를 반드시 포함해야 합니다.

그렇지 않으면, mini prep DNA가 RNA에 의해 오염되어 트랜스포즈 mRNA의 분해를 초래할 수 있습니다. DNA를 RNA-free water로 희석하여 10 nanograms per microliter 농도로 만드십시오. 두 가지 트랜스포즈 mRNA를 준비하려면, 먼저 XboI을 사용하여 pT3 TST2를 선형화하십시오. 다음으로, 한 가지 수정 사항을 적용하여 mMessage mMachine T3 in vitro transcription kit를 사용하여 선형화된 DNA를 전사하십시오.

DNA 처리 단계 후에 RibLock RNase 억제제 0.5 µL를 첨가합니다. 표준 키트를 사용하여 mRNA를 정제하고, 아가로스 겔 전기영동을 통해 시험관 내 전사(in vitro transcription)된 mRNA의 품질을 평가합니다. mRNA를 RNase-free water로 40 ng/µL가 되도록 희석하고, 미세주입 직전까지 -80 °C에서 2 µL씩 분주하여 보관합니다. 희석된 transpose DNA 8 µL를 transpose mRNA 2 µL 분주액에 첨가하여 주입 혼합물을 준비합니다.

표준 미세주입 기술을 사용하여 DNA-RNA 혼합물 3 nl를 제브라피시 배아의 난황-세포 경계면을 대상으로 난황에 주입합니다. 주입 후, 트랜스포세이즈 mRNA가 분해되지 않았는지 확인하기 위한 품질 관리를 위해 남은 주입 용액 5 µL를 1% 아가로스 겔에서 전기영동합니다. 주입 약 6~8시간 후, 수정되지 않았거나 죽은 배아를 제거하고 100 mm 페트리 접시당 60~80개의 배아를 분배합니다. 비정상적이거나 죽은 배아는 수정 후 1일, 2일, 3일에 제거하며, 수정 후 3일째에 형광 장치가 장착된 실체 현미경 또는 정립 현미경 하에서 확인합니다.

배아를 스크리닝하고 비정상적인 배아는 제거합니다. 겉으로 드러난 결함이 없는 나머지 배아들을 스크리닝합니다. GFP 형광의 경우, 가장 밝은 F0 배아를 선택하여 본 실험실의 표준 제브라피쉬 사육 절차에 따라 양육합니다.

GBT는 일반적으로 야생형 또는 레오파드 색소 패턴을 가진 라인에 주입됩니다. 사육 대상으로 선택된 주입 배아의 20~30%가 성체까지 생존할 것으로 예상하는 것이 합리적입니다. GBTB 단일 유전자 트랩 벡터의 통합은 두 가지 서로 다른 메커니즘에 의해 EGFP 발현을 유도할 수 있습니다.

첫 번째는 진정한 유전자 트랩(gene trap) 사건입니다. 벡터가 유전자에 삽입되면, 해당 내인성 유전자 전사체의 5' 말단과 GAL4-VP16 사이의 융합 전사체가 생성되며, 이는 단백질의 N-말단과 삽입된 돌연변이 유전자 및 GAL4-VP16을 포함하는 융합 단백질로 번역됩니다. 이 융합 단백질은 14X UAS에 결합하여 EGFP의 전사를 활성화합니다.

두 번째로 바람직하지 않은 사례는 인핸서 트랩(enhancer trap)입니다. EGFP 앞에 위치한 최소 프로모터가 삽입 부위 근처의 인핸서 제어를 받게 되어 GAL4, VP16이 없는 상태에서도 EGFP가 생성되는 현상입니다. 이 두 가지 사례를 구분하기 위해, 렌즈 특이적 gamma crystalline GFP로 표지된 14X UAS-mRFP 형질전환 라인이 제작되었습니다.

Gene trap 이벤트는 GBT가 주입된 물고기를 homozygous U-A-S-M-R-F-P 물고기와 교배시킨 후, GFP와 RFP의 공동 발현을 스크리닝하여 검증합니다. 이러한 공동 발현은 GAL four, VP 16이 생성되어 trans 상태에서 U-A-S-M-R-F-P를 활성화할 때만 가능합니다. F zero 물고기 스크리닝 절차를 시작하려면, 개별 F zero 물고기를 homozygous U-A-S-M-R-F-P 물고기와 교배시킵니다. GBT 주입 물고기는 야생형 또는 leopard 색소 패턴을 가지고 있으며, homozygous U-A-S-M-R-F-P 라인은 brass 배경색을 띠므로, F zero 물고기를 U-A-S-M-R-F-P 물고기와 쉽게 구별할 수 있습니다. 이를 통해 스크리닝 대상인 F zero 물고기가 암컷인지 수컷인지 기록할 필요가 없으며, 각 물고기의 성별을 결정하거나 기록하는 과정에서 발생할 수 있는 잠재적 오류를 제거할 수 있습니다. 다음 날,

황동색 U-A-S-M-R-F-P 물고기를 수조로 돌려보냅니다. 배아를 제공한 F zero 물고기는 개별 정지 수조에 배치하고, 0일 차 오후에 스크리닝용 배아를 수집하여 새로운 Petri dish로 옮깁니다. 수정 후 1일 및 3일에 배아의 GFP 및 RFP 형광 여부를 스크리닝합니다.

GFP와 RFP 모두에 양성인 배아를 추출하고, G-F-P-R-F-P 발현 패턴에 따라 분류합니다. 한 클러치에서 하나 이상의 패턴이 관찰되면, 이를 사육하여 F1 세대를 구축합니다. GFP에는 양성이지만 RFP에는 음성인 3D PF 배아는 인핸서 트랩(enhancer trap) 사례에 해당하므로 추출하지 않음에 유의하십시오.

G-F-P-R-F-P 양성 자손을 생성한 F0 물고기를 다시 교배하여 두 번째 양성 집단을 얻습니다. 유전자 트랩 발현 패턴을 기록하기 위한 F2 가계를 구축하고, 유전자 트랩 유전자좌의 분자적 식별을 위해 배아 집단을 동결시키고자 F1 물고기를 스크리닝합니다. 우선 다음 날 개별 F1 물고기를 homozygous U-A-S-M-R-F-P 물고기와 교배합니다. 배아를 생성한 F1 물고기는 개별 정지 탱크에 배치하고, 배아는 수정 후 1일에 스크리닝을 위해 수집합니다.

RFP 표지가 아직 나타나지 않았을 수 있으므로, 수정 후 3일에 배아의 GFP 형광을 스크리닝하여 GFP 양성 배아를 선별하십시오. GFP와 RFP 형광을 모두 스크리닝하고 이중 양성 배아를 선별하십시오. 그런 다음 수정 후 5일에 GFP와 RFP 모두 양성인 배아를 촬영하십시오. inverse PCR 및 5' RACE를 통한 삽입 돌연변이 유전자 식별을 위해 GFP-RFP 양성 배아 20개와 GFP-RFP 음성 배아 20개를 묶음으로 동결하십시오. 주입이 성공한 경우, 남은 GFP-RFP 양성 배아를 성장시켜 F2 세대를 구축하십시오.

gene trap DNA와 tall two transposase mRNA 혼합액이 주입된 배아의 최소 80%에서 어느 정도의 GFP 형광이 나타납니다. GFP 발현이 낮다는 것은 주입이 실패했거나 RNA 오염으로 인해 transposase RNA가 분해되었음을 나타냅니다. 가장 밝은 GFP 양성 배아를 선택하여 F0 풀을 구축했을 때, 스크리닝한 F0 물고기 10마리 중 약 1마리에서 gene trap 후손이 얻어지며, 이 F0 물고기들로부터 gene trap 사건이 회복됩니다.

대부분은 발현되지 않는 여러 개의 전이온 통합 외에 단일 유전자 트랩 이벤트를 전달합니다. 전체 유전자 트랩 카세트가 직접 반복 LoxP 사이트로 둘러싸여 있으므로, 변이된 유전자의 엑손을 파란색 상자로 나타낸 이 도표의 모든 유전자 트랩 돌연변이는 Cre 재조합 효소의 발현을 통해 가역적으로 되돌릴 수 있습니다. 이 이미지들은 NSF TP six 유전자 트랩 라인의 신경계에서 GFP와 RFP의 공발현을 보여줍니다. NSF TP six 배아에 Cre RNA를 주입하면 GFP 및 RFP 발현이 소실됩니다.

예상대로 수정체에서는 GFP 발현의 감소가 나타나지 않음에 유의하십시오. 여기에 기술된 대부분의 절차는 다른 유전자 트랩 스크리닝뿐만 아니라 TOL two 및 기타 트랜스포존을 이용한 일반적인 형질전환 실험에도 적용 가능합니다. 여기에 설명된 유전자 트랩 절차를 통해 매주 20~30회의 F zero 역교배를 수행하면 매주 하나의 유전자 트랩을 회수할 수 있을 것입니다.

하지만, 이 절차는 쉽게 규모를 확장할 수 있습니다.