Name: 제브라 피쉬의 인 Gal4을 사용하여 유전자 트래핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 배우세요 제브라피쉬에서 Gal4-VP16을 이용한 유전자 트랩 삽입 돌연변이법을 통해 발달생물학 및 유전학 연구를 수행하는 방법입니다. GFP/RFP 이중 형광 스크리닝으로 효율적인 돌연변이체를 선별하고 생식계 전달을 검증합니다.

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우리는 기술 지원을, 원고의 비판적 읽기 라이언 길을 박사 제니퍼 Emtage 감사 및 시약 제브라 피쉬의 관리 및 박사 스티븐 C. Ekker (메이요 클리닉, Rochster, 미네소타)와 함께 도움이됩니다. 우리의 작업은 과학 기술의 템플 대학과 국립 보건원 (R01-HD061749)에 의해 지원되었다.

1. 유전자 트랩의 미세 주입에 의한 F0 세대 생산. AB와 튀빙겐 변종이 가난한 생존을 가지고있는 동안 긴 핀 (TLF)이 가장 관대 한 것 - 우리는 서로 다른 유전 적 배경의 배아 애완 동물 매장 기반의 야생형과 튀빙겐으로,이 절차에 다른 허용 오차를 표시하는 것으로 나타났습니다. <ol><li> 트랜스포존 DNA의 준비. GBT-B1 준비 (pDB783, Balciuniene 등. 준비) 표준 QIAprep의 미니 프렙 키트 (Qiagen 사 27106)를 사용하여 플라스미드 DNA. 그것은 그렇지 않으면 미니 프렙 DNA는 트랜스 포사 mRNA의 저하로 이어지는, RNA 분해 효소에 의해 오염 될 것이다, (QIAprep 절차에서 선택 사항입니다) PB 세척 단계를 포함하는 것이 필수적입니다. 주입하기 전에, 10 NG / μL에 RNase가없는 물 (Ambion AM9937)의 DNA를 희석. </li><li> 트랜스 포사 mRNA의 준비. 를 XbaI를 사용 pT3TS/Tol2 (pDB600) (13)를 선형화 mMessage 기계 T3을 이용하여 선형화 된 DNA를 표기시험 관내 전사 키트 (Ambion AM1348). 우리는 RiboLock RNA 분해 효소 억제제 (ThermoFisher Fermentas EO0381)의 0.5 μl를 추가하여 시험 관내 전사 반응을 수정했습니다. DNA 분해 효소 처리 단계 후, MinElute RNeasy 키트 (퀴 아젠 74204)를 사용하여 mRNA를 순화. 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 시험 관내 전사 된 mRNA의의 품질을 평가. 40 NG / μL에 RNase가없는 물에 mRNA의 희석 및 저장 ° C. -80에서 2 μL 씩 분주로 </li><li> 미세 주입 믹스의 제조. 주입하기 전에, 트랜스 포사의 mRNA를 2 μL 나누어지는 희석 트랜스포존 DNA의 8 μl를 추가합니다. </li><li> 미세 주입. 노른자 / 할구 인터페이스를 목표로, 표준 미세 주입 기술을 사용하여 1 셀 제브라 피쉬 배아의 노른자로 DNA / RNA 혼합물의 3 NL를 주입. 1 세포 단계에서 주입을 보장하기 위해 배아마다 20 분을 수집합니다. 우리의 경험, 숙련 된 사람은 쉽게 1 ~ 1.5 시간에 1,000 배아를 주입 할 수 있습니다. </li><li> 주입 한 후, 왼쪽의 5 μl를 실행트랜스 포사 mRNA의 분해가되지 않았는지 확인하기 위해 품질 관리를위한 1 % 아가 로스 겔에 주사액 위에. </li><li> 주입 된 배아의 관리. 늦은 오후에, 미 수정 및 비정상 배아를 제거하고 100mm 페트리 접시 당 60 ~ 80에 배아를 배포 할 수 있습니다. 이상과 죽은 태아 1 일 포스트 수정 (DPF), 2 DPF 3 DPF에서 제거됩니다. </li><li> GFP의 발현을 선별. 3 DPF에서 GFP의 형광 (그림 3)에 대한 명백한 결함이없는 화면 배아. 상영 (우리는 배 Fluar의 목적으로 자이스 AxioImager 사용) 형광이 장착 된 실체에 하나를 수행 (우리는 니콘 SMZ1500 사용) 또는 직립 현미경에있을 수 있습니다. 낮은 GFP 발현으로 인해의 RNase 오염 (그림 3A)에 실패 주입 또는 트랜스 포사의 RNA의 분해 중 하나를 나타냅니다. F보기 비교 (여러 조직에서 또는 특정 조직의 세포의 높은 비율에서 GFP 발현이 어느 밝은 배아의 약 30 %를 선택igures 3B 및 3C). 1,000 배아의 주입에서, 우리는 일반적으로 최대 100 발달 정상, 높은 GFP - 표현 배아있다. </li><li> 표준 제브라 피쉬 사육 절차를 사용하여 선택 F0 배아를 올립니다. 그것은 양육 선택 주입 된 배아의 20 ~ 30 %가 성인으로 생존 할 것으로 기대하는 것이 합리적이다. </li></ol> 2. UAS의 유지 보수 : MRFP 테스터 라인. 우리는 14xUAS를 생성 한 : 렌즈 별 γCry로 표시 MRFP 라인 : GFP. UAS는 DNA 메틸화를 통해 침묵의 대상이기 때문에, 주식을 전파하는 침묵의 낮은 수준으로 물고기를 선택하는 것이 중요합니다. <ol><li> 개인 UAS 설정 : 우리의 가장 신뢰할 수있는 인 Gal4 유전자 트랩 라인 중 하나와 짝짓기에 대한 MRFP 동형 접합자를, NSF tpl6 (Balciuniene 등 준비에.). </li><li> 다음 날, UAS를 전송 : 배아를 수집하는 동안, 개별 정적 탱크에 배아를 준 MRFP 물고기및 청소. </li><li> 1 DPF 3 DPF에서 GFP 및 RFP 형광을위한 화면 배아. </li><li> UAS의 다음 세대를 확립하기 위해 높은 MRFP 식으로 배아를 준 서로 엇 물고기 : MRFP 라인. </li></ol> 3. F0 물고기의 심사. <ol><li> MRFP 물고기 (그림 4) : 동형 접합 UAS 개별 F0을 교차. 우리는 일반적으로 야생 형 또는 표범 염색 패턴과 라인에 우리의 GBTs를 주입하고, 우리의 동형 접합 UAS : MRFP 라인은 황동 배경입니다. 따라서 GBT 주입 F0 물고기는 UAS에서 쉽게 구별 할 수 있습니다 MRFP 물고기, 상영되는 F0는 남성 또는 여성뿐만 아니라 여부를 기록 할 필요가 없습니다 기록 및 / 또는의 성별을 결정하는 실수로 인한 오류 가능성 각 물고기. 매우 제한된 경험, 등 우리 학부 학생들과 인사 따라서 설정하고 물고기의 교배를 분해 할 수 있습니다. 이 방법은 두 개의 다른 유전 배경임을 단점이있다잠재적 기능 표현형의 손실의 해석을 복잡하게 사용된다. </li><li> 다음 날, 황동 UAS를 반환 MRFP의 물고기를 자신의 탱크에. 배아를 수집하고 검사하는 동안 (우리는 하겐 엑소 테라 Faunarium 소를 사용하지만, 어떤 작은 탱크는이 목적을 위해 이용 될 수있다) 개별 정적 탱크에 배아를 준 F0 물고기를 놓습니다. </li><li> 새로운 배양 접시에 깨끗하고 전송 수집 된 배아 0 일의 오후에 (접시 당 &lt;100). </li><li> GFP 및 RFP 형광 1 DPF에서, 2 DPF 3 DPF를위한 스크린 배아. , GFP 및 RFP 중 모두 긍정적 인 배아를 당겨 GFP / RFP 발현 패턴으로 정렬 (하나 이상의 패턴 클러치에서 관찰되는 경우) 및 F1 세대를 확립을 올립니다. </li><li> (50 ~ 100 배아의 총 수 중에서) 유일한 단점 배아를 생성 F0 물고기를 안락사. </li><li> 긍정의 두 번째 배치를 얻기 위해 다시 GFP / RFP 양성 자손을 생산 F0 물고기를 교차. </li></ol> 4.F1 물고기의 심사. F1 물고기는, F2의 가족을 설정하는 유전자 트랩 발현 패턴을 문서화하고 5 &#39;RACE 및 역 PCR에 의해 유전자 트랩 유전자 좌의 분자 식별을위한 배아의 배치를 동결 상영된다. <ol><li> MRFP 물고기 (그림 4) : 동형 접합 UAS 개별 F1 물고기를 교차. </li><li> 다음 날, 배아를 수집하고 검사하는 동안 개별 정적 탱크에 배아를 준 F1 물고기를 놓습니다. </li><li> GFP 및 RFP 형광 1 DPF에서, 2 DPF 3 DPF를위한 스크린 배아. GFP 및 RFP (24) 모두에 대해 긍정적 인 별도의 사진 배아. </li><li> 5 DPF에서 20 GFP / RFP 양성 20 GFP / 역 PCR에 의한 insertionally 변이 유전자의 식별 및 5에 대한 RFP 음성 배아 &#39;RACE 9,10의 배치를 동결. F2 세대를 확립 나머지 GFP / RFP - 긍정적 인 배아를 올립니다. </li></ol>

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이 저자가 공개하는 게 없다.

여기에 설명 된 유전자 트랩 벡터와 방법론은 이미 여러 독립적 인 실험실에서 사용하고 있습니다. 우리의 경험, 그 과정에서 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째 중요한 단계는 주입 F0 배아의 유전자 트랩 통합의 높은 속도를 달성하는 것입니다. 이 단계에서 실패는 종종 주입 시약의 RNase 오염, 특히 미니 프렙 DNA에 기인 할 수있다. 그것은 유전자 트랩 실험 한 세포 단계에서 배아를 주입하는 것이 매우 중요합니다. 우리의 경험에서, Tol2 - 매개 형질 전환은 낮은 품질의 DNA 나중에 1 세포 단계 이상 또는 주입하는 경우에도 가능 형질 전환 라인을 얻을 수있다, 매우 효율적입니다. 유전자 트랩 돌연변이 유발을 수행 할 때 벡터 통합의 작은 부분이 효과적인 유전자 트랩 이벤트가 발생하기 때문에 이하의 주사는 훨씬 더 문제가된다. 두 번째 중요한 단계는 우리의 UAS에 교차에 의해 유전자 트랩 이벤트를 확인하는 것입니다 MRFP 라인. MRFP 표현의 부재입니다거의 항상 인핸서 트랩 이벤트 나타낸다. 그러나, 때때로 MRFP 발현의 부족 14X UAS의 침묵을 의미 할 수있다. 그것은 UAS를 유지하는 것이 중요하다 : NSF tpl6에 교차 할 때 높은 RFP 발현과 개인을 사용하여 다음 세대를 전파하여 비 침묵 상태에서 MRFP 라인. 우리는 우리의 유전자 트랩 벡터 및 프로토콜에 몇 가지 개선을 예상 할 수 있습니다. 제 유전자 트랩 컨스 적은 반복 UAS를 사용하는 것이다. 그것은 배 UAS는 세포 배양 실험에서 전체 활성화를 달성하기에 충분하며, 더 적은 반복 UAS 시퀀스 메틸화와 6,25를 침묵에 덜 민감 있다는 것으로 나타났습니다. 또한 국제 마우스 유전자 트랩 컨소시엄에 의해 사용되는 최근 지브라 피쉬 2,26,27 적응 벡터들과 유사하게, 완전 조건부 돌연변이 유발을위한 유전자 트랩 벡터를 설계 할 수있다. 또 다른 개선은 다른 t를 사용하는 것MRFP 기자 라인 : UAS를 생성하는 미 (美) 28 자, 예를 들어 ransposon 시스템. 이 직접 기자 라인과 incrossing로 F0s의 심사에 Tol2 기반 유전자 트랩의 주입을 가능하게합니다. 또한,이 기능 표현형의 손실의 해석은 더 간단하게, 두 개의 서로 다른 유전 적 배경의 사용을 제거한다. 심지어 이러한 개선으로, 여기에 제시된 일반 인 Gal4 유전자 트랩 프로토콜은 아직 완벽하게 적용 할 수있다.

Insertional 돌연변이는 마우스와 식물과 같은 다세포 생물로 세균과 효모 같은 단세포 생물에서 여러 모델 시스템에서 유전자 기능을 해부에 대한 강력한 접근 방법으로 입증되었습니다. 모든 외래 DNA (바이러스, 트랜스포존 플라스미드) 등의 엑손 또는 발기인으로 유전자의 필수 요소를 차단하여 돌연변이로 역할을 할 수있다. 엑손은 일반적인 척추 동물 게놈의 1 ~ 3 %를 차지하기 때문에 이러한 간단한 방식의 유효 대상, 큰 복잡한 게놈에 상당히 작습니다. 제브라 피쉬 (11, 12)에서 레트로 바이러스 insertional 돌연변이 유발의 엄청난 성공에 예시 된 바와 같이 작은 효과적인 목표의 크기가 매우 높은 벡터 통합 가격으로 극복 할 수 있습니다. 대조적으로, 인트론은 척추 동물의 게놈의 약 20 ~ 30 %를 포함한다. 효과적으로 인트론에 널 (null) 또는 통합시 심각한 hypomorphic 돌연변이를 소개 제브라 피쉬, 트랜스포존 기반 insertional 돌연변이 유발 벡터에서 &quot;유전자 파괴 transposo라는 이름의 한NS &quot;(GBTs) 8-10. 효율적인 유전자 트랩 통합을 위해, 그들은 최소한의 Tol2의 트랜스포존 13, 14을 사용합니다. GBTs의 변이원성 물고기 파생 결합 수용체와 전사 종료 / 폴리아 데 닐화 서열에 의존한다. GBT의 돌연변이에 대한 책임 요소가 측면에 있습니다 Cre 호텔 재조합 효소에 의해 절단에 대한 직접적인에 loxP 사이트에서. 따라서, 크레의 mRNA의 주입은 어떤 트랜스포존 시퀀스가 통합 궤적 9,10 유지에도 불구하고, GBT 유발 돌연변이의 효율적 복귀로 연결됩니다. 최근에 출판 된 GBT 벡터는 두 가지 잠재적 인 단점으로 이어지는, 유전자 트랩 기자 9,10로 MRFP를 사용합니다. 첫째, 그것은 직접 형광 기자 융합 단백질에 의해 감지 될 수있을만큼 충분히 높은 수준에서 표현됩니다 제브라 피쉬 유전자의 어떤 부분 알려져 있지 않다. 둘째, 유전자 중 일부분은 필수적인 기능을 가질 것으로 기대된다. 그것은 제브라 피쉬 developme에 필요한 만 1,400-2,400 유전자가있는 것으로 추정되고있다NT (15, 16). 대부분의 유전자 트랩 돌연변이는 명백한 표현형을 표시하고, 따라서 제한된 유틸리티를해야합니다 예상되지 않습니다. 이 두 가지 한계를 극복하기 위해, 우리는 기본 유전자 트랩 기자로 인 Gal4-VP16에 사용할 GBT-R15 9,10을 수정 한 (Balciuniene 등. 준비). GBT-R15의 AUG-이하 MRFP와 같이, 번역 개시 사이트 인 Gal4-VP16에서 제거되었습니다. 유전자 트랩 이벤트의 직접 탐지를 위해, 우리의 벡터는 14 배 인 Gal4 UAS (17, 18)의 제어하에 EGFP 기자가 포함되어 있습니다. 몇 가지 추가 기능은 우리의 양자 유전자 트랩 벡터로 설계된다. UAS는 : EGFP 카세트 직접 FRT 사이트 (그림 1의 회색 갈매기) 어귀이다. EGFP 형광에 의해 취소됨 유전자 트랩 돌연변이를 떠나, EGFP 카세트 : FLP 재조합 효소의 mRNA의 주입은 UAS의 절단에 이르게한다. 그러므로 GFP 형광에 의한 특정 조직이나 발생 이벤트를 표시 유전자 변형 라인에서 사용될 수있다. 기타로GBTs는 전체 유전자 트랩 카세트 직접에 loxP 사이트 (그림 1의 개방 각형)에 의해 측면에 있습니다. 이것은 쉽게 특정 유전자 트랩 통합 사이의 인과 관계의 증거를 설정하고 (그림 2) 표현형을 관찰, Cre 호텔 재조합 효소의 발현에 의한 유전자 트랩 이벤트를 뒤집을 수 있습니다. 마지막으로, 유전자 트랩 카세트 반전 I-SceI 제한 효소 meganuclease 사이트 (그림 1의 검은 색 삼각형)에 의해 측면에 있습니다. 초파리에서 트랜스포존 통합은 종종 P 요소의 부정확 절단에 의해 삭제 (결함)로 변환됩니다. Tol2의 트랜스포존 (또는 미 (美), 피기 백 (PiggyBac) 또는 AC / DS 자 등의 척추 동물에 적극적으로 다른 트랜스포존)의 절단은 삭제로 이어질 수 있다는 증거는 없습니다. 따라서 우리는 I-SceI 제한은 제브라 피쉬의 삭제를 유도 할 수있는 아무런 증거가 없음에도 불구하고, 삭제의 유도에 대한 잠재적 인 대리 방법으로 I-SceI 제한 효소 사이트를 포함. 그것은 주목해야한다 동안 I-SceI 제한 메가클레아는 제브라 피쉬의 형질 전환을 용이하게 할 수 있습니다, I-SceI 제한 효소 meganuclease에 의한 DNA 절단은 DNA 수리 효모에서 오류가 발생하기 쉬운 비 동종 최종 합류 포함 메커니즘 및 포유 동물 세포 19-22을 연구하는 데 사용됩니다. 우리의 유전자 트랩 벡터의 통합은 두 개의 서로 다른 메커니즘에 의해 EGFP 발현으로 이어질 수 있습니다. 첫 번째는 진정한 유전자 트랩 이벤트 (그림 1C)입니다 : 벡터는 유전자 (Insertionally 변이 유전자에 대한 IMG), 내생 IMG 성적 증명서 및 인 Gal4-VP16의 5 &#39;사이의 융합 성적 증명서에 통합은으로 만든 및 번역 IMG 및 인 Gal4-VP16에 의해 코드되는 단백질의 N-말단을 포함하는 융합 단백질. 이 융합 단백질은 14 배 UAS에 바인딩하고 EGFP의 전사를 활성화합니다. 두 번째, 덜 바람직 이벤트는 증강 트랩 (그림 1D)입니다 EGFP의 앞에 최소한의 발기인은 AB에서 EGFP의 생산에 이르는 통합 사이트 근처 증강의 제어에 해당인 Gal4-VP16 생산의가 나타나지 않는. 우리의 추정에서 EGFP 발현 사건의 30 % ~ 50 %가 증강 트랩에 기인하고 50~70%는 유전자 트랩 (23)에 기인 (Balciuniene 등. 준비). MRFP 유전자 변형 라인 (그림 1B), 렌즈 별 γCry에 의해 표시의 편의를 위해 : (. Balciuniene 등 준비) GFP 이벤트의 두 클래스를 구분하기 위해, 우리는 14xUAS을 만들었습니다. 유전자 트랩 이벤트는 GFP의 공동 발현 및 RFP (그림 2의 C와 D를 비교)에 의해 확인된다. 우리의 파일럿 화면에서, 우리는 트랜스포존 DNA와 트랜스 포사 mRNA의 혼합물을 주사 270 F0 물고기를 심사 한 후 40 유전자 트랩 이벤트를 회복했다. NSF와 FLR : 우리의 유전자 트랩 통합의 두 이전에 발행 된 화학적으로 유발 된 돌연변이와 유전자에 발생했습니다. 우리의 insertional 돌연변이 NSF tpl6 및 FLR의 tpl24의 표현형 표현형에서 표면적으로 구별해당 화학적으로 유발 된 돌연변이들. 우리는 또한 유전자 트랩 이벤트가 이렇게 널 (null) 대립의 가능성을 증가, 유전자의 5 &#39;말단 근처 인트론 치우쳐 나타나는 지적했다. 우리는 우리의 유전자 트랩 라인 모두 UAS의 침묵 (점박이)의 어느 정도를 관찰 할, 어떤 궤적은 분명히 다른 사람보다 잡에 더 취약합니다. 우리는 우리가 쉽게 혼자 GFP의 발현을 선택하여 적어도 다섯 세대에 걸쳐 우리의 유전자 트랩 라인의 모든 내용을 전파 할 수있게되었습니다로 UAS의 침묵은, 유전자 트랩 라인의 전파를위한 중요한 문제라고 생각하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>선택적 PB 세척 단계는 필수입니다</td></tr><tr><td>XbaI 제한 효소</td><td>ThermoFisher</td><td>ER0681</td><td></td></tr><tr><td>mMessage Machine T3</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase 억제제</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>페놀 추출로 대체 가능 강수량. LiCl을 사용하지 마십시오!</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td>은 <td></td></tr><tr><td>미세주입 바늘을 위한 비DEPC 처리된 붕규산 유리 캡슐</td>이어야 합니다 <td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>교정을 위한 마이크로캡슐</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더 팁</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>바늘 풀러 *</td><td>셔터 Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>microinjection용 실체현미경 * </td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>우리는 또한 투과광 스탠드 Picoinjector와 함께 Wild 5M 및 Olympus SZ61을 사용합니다</td></tr><tr><td>*</td><td>Harvard</td><td>Instruments Pli-90</td> 우리는 또한 GFP/RFP 형광과 함께 <td>Pli-100</td></tr><tr><td>스크리닝 현미경</td>을 사용합니다 *<td>Zeiss</td><td>Zeiss AxioImager</td><td>5X Fluar objective는 충분한 작동 거리를</td></tr> <tr><td>가지고 있습니다.GFP/RFP 형광을 사용한 스크리닝 현미경 *</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* 우리는 실험실에서 성공적으로 사용하기 때문에 이 장비를 제안합니다. 각 범주에서 여러 제조업체의 몇 가지 유사한 옵션을 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

제브라 피쉬의 인 gal4을 사용하여 유전자 트래핑

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

대형 클러치 크기와 광학적으로 투명한 배아의 외부 개발은 제브라 피쉬에게 변이 된 유전자의 발현에 태그를 형광 기자를 사용하여 생체 내 insertional 돌연변이 유발을위한 뛰어난 척추 동물 모델 시스템을 확인합니다. 여러 실험실 기자 1-7로 형광 단백질, 인 Gal4 및 LEXA 기반의 전사 활성제를 사용하여, 제브라 피쉬의 증강 및 유전자 트랩 벡터를 구성하고 테스트했습니다. 낮은 돌연변이 (거의 NULL 대립 유전자를 생성되지 유전자에 예를 들어, 통합) 차선의 엄격 성 (증강 및 유전자 트랩 이벤트를 구별 할 수있는 능력의 부족 등)이 벡터는 두 가지 잠재적 인 단점을 가지고 있었다. 유전자 속보 트랜스포존 (GBTs)는 이러한 단점 8-10을 해결하기 위해 개발되었다. 유전자 트랩 이벤트를 직접 검출을위한 보조 기자로 EGFP : 우리는 기본 유전자 트랩 기자와 추가 UAS로 ​​인 Gal4-VP16 사용하기 위해, 첫 번째 GBT 벡터 중 하나, GBT-R15를 수정했습니다.기본 유전자 트랩 기자로 인 Gal4-VP16의 pplication 두 가지 주요 장점을 제공한다. 첫째, 낮은 발현 수준에서 표현의 유전자에 대한 민감도를 증가시킨다. 둘째, 그것은 매우 구체적인 조직의 다른 형질 전환 유전자의 직접적인 표현에 인 Gal4 드라이버로 유전자 트랩 라인을 사용하는 연구자 수 있습니다. 이 유전자 트랩 통합 명백한 표현형 발생하지 않을 수 있습니다 비 본질적인 또는 중복 기능을 가진 유전자에 특히 관련입니다. 기본 유전자 트랩 기자로 인 Gal4-VP16을 사용하는 단점은 결과 인 Gal4-VP16 융합 단백질이 핵을 입력 할 수있을 가능성이과 활성화로 N-말단 신호 서열과 단백질을 코딩하는 유전자가, 트래핑에 순종하지 않는 것입니다 전사. 중요한 사실은, 인 Gal4-VP16의 사용은 핵 단백질에서 미리 선택되지 않는다 : 우리는 핵, 세포질 및 세포막에서 기능하는 단백질을 코딩하는 유전자에 유전자 돌연변이 트랩을 회수.

성공적인 분사에서, 배아의 적어도 80 %는 GFP 형광의 일부도 (도 3)을 표시 유전자 트랩 DNA / Tol2의 트랜스 포사 mRNA의 혼합물로 주입했다. 밝은 GFP - 긍정적 인 배아 (그림 3C)가, F0 풀을 설정하는 선택하면 약 10 상영 F0 물고기의 유전자 트랩 자손을 얻을 것입니다. 유전자 트랩 이벤트가 회수되는 F0 물고기 가운데, 대부분은 몇 가지가 아닌 표현 트랜스포존의 통합뿐만 아니라 하나의 유전자 트랩 이벤트를 전송합니다. 그러나, 우리는 하나의 F0 개인에서 4 유전자 트랩 회선을 설치했다. 유전자 트랩 라인에서 GFP / RFP 발현 패턴은 (후각 전구의 예를 들어) 매우 조직의 특정 상당히 유비쿼터스 이르기까지 다양합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> 그림 1. 티그는 함유 GAL4 양자 유전자 트랩 벡터 GBT-B1 및 해당 응용 프로그램. A. 인 Gal4 함유 유전자 트랩 벡터의 구성 요소 : Tol2 5 &#39;와 Tol2 3&#39;는 최소한의 Tol2의 트랜스포존 (13)을 종료, CSA, 잉어 β-액틴 결합 수용체 8 ^ 인 Gal4-VP16, AUG-이하 인 Gal4-VP16, ZP ( GBT-R15 9, 10에서 A), 제브라 피쉬의 β-액틴 3 &#39;UTR 및 폴리 (A) 요소. EGFP 발현 카셋트 17,18 : 14XUAS, EGFP 및 SV40의 P (A)는 UAS의 성분이다. 화살표는 UAS의 활성화를 나타냅니다 유전자 트랩에 의해 생산 인 Gal4-VP16로 EGFP B. 14XUAS :. GFP 카세트 : 렌즈 별 γCry로 표시 MRFP 전이 유전자. 화살표는 UAS의 활성화를 나타냅니다 MRFP 인 Gal4-VP16로 트랜스 C. 유전자 트랩 이벤트에.. 블루 박스는 엑손 있습니다. 접합은 점선. D. 증강 트랩 이벤트로 표시됩니다. 증강 (갈색 상자) 부근의 벡터의 통합 갈색 화살표에게 (이 증강의 제어하에 최소한의 EGFP 프로모터를 배치 할 수 있습니다). 이것은 EGFP의 조직 - 특이 적 발현을 초래할 것이지만, 인 Gal4-VP16은 이루어지지 않기 때문에, MRFP 발현은 활성화되지 않는다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> 그림 2. Cre 호텔 재조합 효소를 사용하여 유전자 트랩 이벤트의 복귀. 유전자 트랩 돌연변이 (A)와 크레 - 복귀 유전자 트랩 대립 유전자 (B)의 A, B. 다이어그램. C, D. GFP (C)의 공동 발현과 NSF tpl6 유전자의 신경 시스템의 RFP (D) 트랩 라인. E, NSF tpl6 배아에 ​​크레 RNA의 F. 주입 GFP (E)의 손실 및 RFP (F) 표현으로 이어집니다. 예상대로 렌즈에서 GFP 발현의 어떠한 감소는 없다는 것을주의한다. 그림 3. GBT-B1 (pDB783) 유전자 트랩 주입 배아. . 배아의 임의의 그룹 (B) 및 양육 선택 하이 익스 프레 : A. 태아가 pGBT-B1 (pDB783) 신체 B 혼자 디스플레이 작은 GFP의 형광 주사, C. 배아 pGBT-B1과 Tol2 트랜스 포사 mRNA의 주입 (C). <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> 그림 4. 인 Gal4 유전자 트랩 라인 설립을위한 실험 개요. 혼자 녹색 유전자 트랩이나 증강 트랩 이벤트에 대한 모자이 시즘을 나타내는 반면 부분적으로 중복되는 그린 / 레드 구조, GFP 및 RFP의 공동 발현을 나타냅니다.

이 프로토콜은 제브라 피쉬의 차 기자로 기본 기자와 GFP / RFP로 인 Gal4-VP16을 사용하여 유전자 트랩 insertional 돌연변이 유발의 방법을 설명합니다. 약 한 고 표현 F0 물고기 수익률 유전자 트랩 자손을 GFP 및 RFP를 공동으로 표현하는 10 명 중. 심사 절차는 쉽게 insertional 돌연변이 화면을 수행하는 실험실의 크기에 적응하기 위해 확장 할 수 있습니다.

제브라 피쉬의 인 Gal4을 사용하여 유전자 트래핑

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

이 프로시저의 전반적인 목표는 GAL4, VP16을 주요 유전자 트랩 리포터로 사용하는 벡터 내의 유전자 파괴 트랜스포존(gene breaking transpose)을 이용하여 돌연변이 물고기를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 유전자 트랩 벡터를 Tol2 트랜스포아제와 함께 제브라피시 배아에 공동 주입함으로써 수행됩니다. 주입된 배아는 수정 후 3일째에 GFP 형광을 통해 스크리닝하며, 가장 밝은 배아의 약 30%를 선택하여 F0 풀(pool)을 구축합니다.다음으로, 유전자 트랩 이벤트의 생식선 전달 여부를 확인하기 위해 F0 세대 물고기를 U-A-S-M-R-F-P 테스터 라인과 교배합니다. 마지막 단계로 F1 세대를 외교배하여 F2 세대를 확립하고, inverse PCR 및 5' RACE를 통해 유전자 트랩 이벤트의 분자적 특성을 분석하기 위한 배아를 생성합니다. 최종적으로 스크리닝한 F0 물고기 중 약 10분의 1이 유전자 트랩 자손을 생성해야 합니다.유전자 파괴 트랜스포존(Gene breaking transposon)은 단백질 코딩 유전자의 입구에 통합될 때 돌연변이가 발생하지 않도록 설계되었습니다. 당사의 GBT 벡터는 G four P 16을 주요 유전자 트랩 리포터로 사용합니다. 이러한 수정은 저발현 유전자에 대한 민감도를 높이며, 다른 트랜스젠의 조직 특이적 발현을 위한 G four 드라이버로서 오버어보이드(over avoid) 표현형 없이 유전자 트랩 돌연변이체를 사용할 수 있게 합니다.저희는 본 방법의 주요 병목 현상이 F zero 물고기의 생식선에서 충분히 높은 비율의 유전자 트랩 삽입을 달성하는 것에 있다고 판단합니다. 이번 시연에서는 DNA 준비, 마이크로인젝션 및 F zero 스크리닝이라는 몇 가지 핵심 단계를 다룰 것입니다. GBTB one 유전자 트랩 벡터는 GAL four VP 16을 주요 유전자 트랩 리포터로 사용합니다.유전자 트랩 통합을 위해 양 끝에 최소한의 tall two transpose가 사용됩니다. 유전자 트랩 이벤트는 14 X GAL four UAS의 제어 하에 있는 EGFP 리포터에 의해 직접 검출됩니다. 전체 유전자 트랩 카세트는 직접 잠금 P 사이트에 의해 측면이 둘러싸여 있습니다.이를 통해 Cre 리콤비나제(recombinase) 발현으로 유전자 트랩 이벤트를 가역적으로 만들 수 있으며, 특정 유전자 트랩 삽입과 관찰된 표현형 사이의 인과 관계를 입증할 수 있습니다. 또한, U-A-S-E-G-F-P 카세트 양단에는 직접 반복 FRT 부위가 배치되어 있습니다. Flip 리콤비나제 mRNA를 주입하면 U-A-S-E-G-F-P 카세트가 절제되어, 유전자 트랩 돌연변이에서 EGFP 형광 표지가 제거됩니다. 따라서 미세 주입 이전에 GFP 형광으로 특정 조직이나 발달 단계를 표지하는 형질전환 라인에서도 이를 사용할 수 있습니다.DNA 전이효소(transpose)와 전이효소 mRNA를 준비합니다. GBTB 단일 유전자 트랩 벡터 DNA를 준비합니다. 표준 미니 프렙 키트를 사용하고 제조사의 프로토콜을 따르되, DNA를 준비할 때 PB 세척 단계를 반드시 포함해야 합니다.그렇지 않으면, mini prep DNA가 RNA에 의해 오염되어 트랜스포즈 mRNA의 분해를 초래할 수 있습니다. DNA를 RNA-free water로 희석하여 10 nanograms per microliter 농도로 만드십시오. 두 가지 트랜스포즈 mRNA를 준비하려면, 먼저 XboI을 사용하여 pT3 TST2를 선형화하십시오. 다음으로, 한 가지 수정 사항을 적용하여 mMessage mMachine T3 in vitro transcription kit를 사용하여 선형화된 DNA를 전사하십시오.DNA 처리 단계 후에 RibLock RNase 억제제 0.5 µL를 첨가합니다. 표준 키트를 사용하여 mRNA를 정제하고, 아가로스 겔 전기영동을 통해 시험관 내 전사(in vitro transcription)된 mRNA의 품질을 평가합니다. mRNA를 RNase-free water로 40 ng/µL가 되도록 희석하고, 미세주입 직전까지 -80 °C에서 2 µL씩 분주하여 보관합니다. 희석된 transpose DNA 8 µL를 transpose mRNA 2 µL 분주액에 첨가하여 주입 혼합물을 준비합니다.표준 미세주입 기술을 사용하여 DNA-RNA 혼합물 3 nl를 제브라피시 배아의 난황-세포 경계면을 대상으로 난황에 주입합니다. 주입 후, 트랜스포세이즈 mRNA가 분해되지 않았는지 확인하기 위한 품질 관리를 위해 남은 주입 용액 5 µL를 1% 아가로스 겔에서 전기영동합니다. 주입 약 6~8시간 후, 수정되지 않았거나 죽은 배아를 제거하고 100 mm 페트리 접시당 60~80개의 배아를 분배합니다. 비정상적이거나 죽은 배아는 수정 후 1일, 2일, 3일에 제거하며, 수정 후 3일째에 형광 장치가 장착된 실체 현미경 또는 정립 현미경 하에서 확인합니다.배아를 스크리닝하고 비정상적인 배아는 제거합니다. 겉으로 드러난 결함이 없는 나머지 배아들을 스크리닝합니다. GFP 형광의 경우, 가장 밝은 F0 배아를 선택하여 본 실험실의 표준 제브라피쉬 사육 절차에 따라 양육합니다.GBT는 일반적으로 야생형 또는 레오파드 색소 패턴을 가진 라인에 주입됩니다. 사육 대상으로 선택된 주입 배아의 20~30%가 성체까지 생존할 것으로 예상하는 것이 합리적입니다. GBTB 단일 유전자 트랩 벡터의 통합은 두 가지 서로 다른 메커니즘에 의해 EGFP 발현을 유도할 수 있습니다.첫 번째는 진정한 유전자 트랩(gene trap) 사건입니다. 벡터가 유전자에 삽입되면, 해당 내인성 유전자 전사체의 5' 말단과 GAL4-VP16 사이의 융합 전사체가 생성되며, 이는 단백질의 N-말단과 삽입된 돌연변이 유전자 및 GAL4-VP16을 포함하는 융합 단백질로 번역됩니다. 이 융합 단백질은 14X UAS에 결합하여 EGFP의 전사를 활성화합니다.두 번째로 바람직하지 않은 사례는 인핸서 트랩(enhancer trap)입니다. EGFP 앞에 위치한 최소 프로모터가 삽입 부위 근처의 인핸서 제어를 받게 되어 GAL4, VP16이 없는 상태에서도 EGFP가 생성되는 현상입니다. 이 두 가지 사례를 구분하기 위해, 렌즈 특이적 gamma crystalline GFP로 표지된 14X UAS-mRFP 형질전환 라인이 제작되었습니다.Gene trap 이벤트는 GBT가 주입된 물고기를 homozygous U-A-S-M-R-F-P 물고기와 교배시킨 후, GFP와 RFP의 공동 발현을 스크리닝하여 검증합니다. 이러한 공동 발현은 GAL four, VP 16이 생성되어 trans 상태에서 U-A-S-M-R-F-P를 활성화할 때만 가능합니다. F zero 물고기 스크리닝 절차를 시작하려면, 개별 F zero 물고기를 homozygous U-A-S-M-R-F-P 물고기와 교배시킵니다. GBT 주입 물고기는 야생형 또는 leopard 색소 패턴을 가지고 있으며, homozygous U-A-S-M-R-F-P 라인은 brass 배경색을 띠므로, F zero 물고기를 U-A-S-M-R-F-P 물고기와 쉽게 구별할 수 있습니다. 이를 통해 스크리닝 대상인 F zero 물고기가 암컷인지 수컷인지 기록할 필요가 없으며, 각 물고기의 성별을 결정하거나 기록하는 과정에서 발생할 수 있는 잠재적 오류를 제거할 수 있습니다. 다음 날,황동색 U-A-S-M-R-F-P 물고기를 수조로 돌려보냅니다. 배아를 제공한 F zero 물고기는 개별 정지 수조에 배치하고, 0일 차 오후에 스크리닝용 배아를 수집하여 새로운 Petri dish로 옮깁니다. 수정 후 1일 및 3일에 배아의 GFP 및 RFP 형광 여부를 스크리닝합니다.GFP와 RFP 모두에 양성인 배아를 추출하고, G-F-P-R-F-P 발현 패턴에 따라 분류합니다. 한 클러치에서 하나 이상의 패턴이 관찰되면, 이를 사육하여 F1 세대를 구축합니다. GFP에는 양성이지만 RFP에는 음성인 3D PF 배아는 인핸서 트랩(enhancer trap) 사례에 해당하므로 추출하지 않음에 유의하십시오.G-F-P-R-F-P 양성 자손을 생성한 F0 물고기를 다시 교배하여 두 번째 양성 집단을 얻습니다. 유전자 트랩 발현 패턴을 기록하기 위한 F2 가계를 구축하고, 유전자 트랩 유전자좌의 분자적 식별을 위해 배아 집단을 동결시키고자 F1 물고기를 스크리닝합니다. 우선 다음 날 개별 F1 물고기를 homozygous U-A-S-M-R-F-P 물고기와 교배합니다. 배아를 생성한 F1 물고기는 개별 정지 탱크에 배치하고, 배아는 수정 후 1일에 스크리닝을 위해 수집합니다.RFP 표지가 아직 나타나지 않았을 수 있으므로, 수정 후 3일에 배아의 GFP 형광을 스크리닝하여 GFP 양성 배아를 선별하십시오. GFP와 RFP 형광을 모두 스크리닝하고 이중 양성 배아를 선별하십시오. 그런 다음 수정 후 5일에 GFP와 RFP 모두 양성인 배아를 촬영하십시오. inverse PCR 및 5' RACE를 통한 삽입 돌연변이 유전자 식별을 위해 GFP-RFP 양성 배아 20개와 GFP-RFP 음성 배아 20개를 묶음으로 동결하십시오. 주입이 성공한 경우, 남은 GFP-RFP 양성 배아를 성장시켜 F2 세대를 구축하십시오.gene trap DNA와 tall two transposase mRNA 혼합액이 주입된 배아의 최소 80%에서 어느 정도의 GFP 형광이 나타납니다. GFP 발현이 낮다는 것은 주입이 실패했거나 RNA 오염으로 인해 transposase RNA가 분해되었음을 나타냅니다. 가장 밝은 GFP 양성 배아를 선택하여 F0 풀을 구축했을 때, 스크리닝한 F0 물고기 10마리 중 약 1마리에서 gene trap 후손이 얻어지며, 이 F0 물고기들로부터 gene trap 사건이 회복됩니다.대부분은 발현되지 않는 여러 개의 전이온 통합 외에 단일 유전자 트랩 이벤트를 전달합니다. 전체 유전자 트랩 카세트가 직접 반복 LoxP 사이트로 둘러싸여 있으므로, 변이된 유전자의 엑손을 파란색 상자로 나타낸 이 도표의 모든 유전자 트랩 돌연변이는 Cre 재조합 효소의 발현을 통해 가역적으로 되돌릴 수 있습니다. 이 이미지들은 NSF TP six 유전자 트랩 라인의 신경계에서 GFP와 RFP의 공발현을 보여줍니다. NSF TP six 배아에 Cre RNA를 주입하면 GFP 및 RFP 발현이 소실됩니다.예상대로 수정체에서는 GFP 발현의 감소가 나타나지 않음에 유의하십시오. 여기에 기술된 대부분의 절차는 다른 유전자 트랩 스크리닝뿐만 아니라 TOL two 및 기타 트랜스포존을 이용한 일반적인 형질전환 실험에도 적용 가능합니다. 여기에 설명된 유전자 트랩 절차를 통해 매주 20~30회의 F zero 역교배를 수행하면 매주 하나의 유전자 트랩을 회수할 수 있을 것입니다.하지만, 이 절차는 쉽게 규모를 확장할 수 있습니다.

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생물학

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