뇌 이식 Microdevices과 주변 조직의 손상 조직 학적 특성

이 절차의 목적은 설치류 뇌 조직에 만성적으로 이식된 마이크로 장치 주변의 온전한 뇌 조직 인터페이스를 이미지화하는 것입니다. 이것은 먼저 퀵 셀 실리콘 엘라스토머와 두 부분으로 된 치과용 아크릴을 사용하여 개두술을 덮고 뇌 이식 장치 주위에 두개골 캡을 형성함으로써 수행됩니다. 고정액 및 사후 조직 처리로 동물을 관류한 후, 장치의 뇌 이식 부분은 치과용 아크릴을 태워 없애고 빠른 세포를 절단하여 머리 캡에서 분리합니다.

다음으로, 뇌를 제거하고 viome으로 잘라 조직 단면에 있는 임플란트를 캡처합니다. 마지막 단계는 라벨링을 세척하여 형광 이미징을 위한 조직을 준비한 다음 광학 투명 용액으로 조직 단면을 투명하게 하는 것입니다. 궁극적으로, 컨포칼 현미경은 침투하는 뇌 임플란트가 세포 내 규모에서 주변 조직에 생성하는 온전한 생물학적 반응을 보여주는 데 사용됩니다.

장치인 explaning과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술이 이식된 장치를 둘러싼 조직과 부착된 조직을 파괴하는 것을 방지하여 인터페이스 조직을 온전하게 검사할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 고급 면역조직화학 및 현미경 기술에 의존하며 뇌 이식 장치를 둘러싼 영역을 자세히 설명하는 컨포칼 현미경 데이터를 생성합니다. 이 방법은 국소 세포 사멸, 신경교세포 흉터 형성 및 혈관 재편성이 뇌 이식 마이크로 전극 장치의 수명에 실제로 영향을 미치는 정도와 같은 신경 보철 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 뇌에 이식된 미세 전극 배열의 만성 신경 인터페이스에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 방법과 관련된 기술은 이식 된 캐뉼러 또는 광섬유를 포함한 신경 과학 연구의 다른 영역에도 적용 할 수 있습니다 흄 후드에서 열에 민감한 장갑을 착용 한 상태에서 집게와 작은 가위를 사용하여 아크릴 두개골 캡 주변의 피부와 기타 조직을 조심스럽게 제거하여 절차를 시작하십시오. 군용 다리미를 사용하여 움푹 들어간 아크릴에 창을 만들고 아래에 있는 퀵 씰링 영역을 노출시킵니다.

장치는 투명한 빠른 밀봉으로 둘러싸여 있어야 합니다. 다음으로, 수술 현미경으로 한 쌍의 곡선 형 마이크로 가위로 실리콘 엘라스토머를 자릅니다. 그런 다음 핀셋과 마이크로 가위로 장치가 뇌에 들어가는 위치까지 빠른 밀봉의 작은 조각을 제거합니다.

개두술의 표면을 따라 계속 절단하여 폴리실리콘과 두개골에 부착되는 장치 구성 요소를 뇌에 이식된 구성 요소와 분리합니다. 노출된 장치 구성 요소를 절단할 때 주의하십시오. 고정된 조직에 있는 보형물을 밀거나 끌지 마십시오.

그런 다음 그 후 생암을 사용하여 조심스럽게 헤드 캡 주변의 뼈를 제거합니다. 주걱을 사용하여 이식된 장치가 있는 뇌를 두개골에서 분리합니다. 이제 HBHS로 채워진 유리 페트리 접시에 뇌를 넣으십시오.

뇌 블록과 면도날을 사용하여 뇌를 절단하고 이식된 장치의 각도와 밀접하게 일치하는 평면을 만듭니다. 그런 다음 두 개의 면도날을 뇌 조직을 통해 눌러 Vibram에 장착될 평평한 표면을 노출시킵니다. 다음으로 Vibram 플랫폼 아래에 얼음을 놓습니다.

그런 다음 종이 타월로 조직 표면을 잠시 말리십시오. 그 후, 가장 넓은 치수가 진동 톤 블레이드의 이동 방향과 평행하도록 샘플을 배치하여 블레이드가 잠재적으로 조직을 넘어뜨리는 것을 방지하고 평평한 평면을 스테이지에 즉시 접착합니다.tage 슈퍼 접착제로. 접착제가 식힌 PBS를 조직 주위의 비브라토 접시에 고정시킨 후.

이제 최대 진동률을 사용하여 250-500미크론 사이의 조직 조각을 자르고 수평에서 10도의 블레이드 각도로 느린 블레이드 진행 속도를 사용합니다. 그런 다음 브러시와 스쿱 스패츌라로 슬라이스를 조심스럽게 수집하고 HBHS를 섭씨 4도의 24웰 플레이트에 보관하는 동안 슬라이스를 수집하고 24웰 플레이트로 제거할 때 각 슬라이스의 두께와 위치를 기록해 둡니다. Insitu 장치가 보이면 약 500미크론 두께의 조직 절편을 수집합니다.

더 얇은 조직 절편을 수집하기 위해 단일 조직 절편에서 장치를 캡처하기 위해 100미크론 절편을 조심스럽게 수집하여 장치에 밀접하게 접근할 수 있습니다. 이 시점에서 500미크론 미만의 슬라이스를 장치 내부로 수집할 수 있습니다. HBHS에서 세척할 때마다 5분씩 슬라이스를 세 번 세척하여 조직 처리를 시작합니다.

그런 다음 나트륨 보라 하이드라이드에서 15분 동안 배양합니다. 슬라이스의 각 면은 작은 페인트 브러시를 사용하여 슬라이스를 천천히 뒤집고 이식된 장치 주변의 어떤 부분도 건드리지 마십시오. 스테인리스 스틸 또는 테프론 코팅된 마이크로 스푼을 작은 붓과 함께 사용할 수도 있습니다.

이제 실온에서 세척 용액으로 세척 당 5 분으로 조각을 세 번 씻으십시오. 실온에서 2시간 동안 세척액에 차단하면서 슬라이스를 뒤집습니다. 2시간 후 1시간 후, 섭씨 4도에서 약 48시간 동안 1차 항체의 슬라이스를 배양합니다.

다음으로, 세척액으로 3분씩 빠르게 6회 세척합니다. 그런 다음 세척 용액으로 1 시간 세척을 6 번 수행하십시오. 그 후, 섭씨 4도에서 약 48시간 동안 2차 항체로 배양합니다.

다시 말하지만, 3분 동안 빠르게 씻은 다음 씻는 용액으로 1시간 동안 6번 씻습니다. 그 후, 세척 용액을 제거하고 글리세롤 기반 U2 스케일 세척 용액을 첨가하십시오. 접시를 호일로 덮고 섭씨 4도에서 보관하십시오.

두꺼운 조각이 약 1주일 동안 또는 매우 두꺼운 조직 부분을 섭씨 4도에서 2-3주 동안 청소하도록 합니다. 클리어런스 후 클리어링 용액을 장착 매체로 사용하여 슬라이드에 조직 섹션을 장착합니다. 모든 슬라이드를 투명한 매니큐어로 밀봉하고 더 긴 작동 거리 현미경 대물렌즈를 사용하여 빛에서 섭씨 4도 떨어진 곳에 보관하십시오.

레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 또는 두 개의 광자 현미경으로 이미징을 시작하십시오. XS L SM seven 10 Carl Xi send 소프트웨어와 컴퓨터 제어 XY 변환 스테이지를 사용하여 투명화 용액의 굴절률을 보정하기 위해 임플란트 주변의 3D 파노라마를 이미지화하는 것을 시연합니다. 이 데모에서는 U2 투명화 솔루션을 위해 Leica Zen 현미경 소프트웨어에 굴절률 값 1.4를 입력합니다.

이 설정은 장치 근처 조직의 굴절률 불일치를 설명하기 위해 Z 단계 간격을 미묘하게 조정합니다. 낮은 레이저 출력, 약 0.5-5% 및 큰 Z 단계 크기를 사용하여 각 형광 채널에 대해 zdi 차원에서 적절한 Z축 창 및 데이터 수집 설정을 대략적으로 평가합니다. 그런 다음 Zen 파노라마 소프트웨어를 사용하여 최종 파노라마의 XY 중심에서 대물렌즈를 설정하고 x축과 y축에 필요한 수집 위치 수를 결정합니다.

관심 영역을 커버하려면 스택의 첫 번째 프레임과 마지막 프레임을 빠르게 확인하여 Z축 수집 창을 재평가하고 마무리합니다. 다음으로, 검출기 감도와 레이저 출력을 증가된 깊이에 따라 적절하게 램프하도록 수동으로 설정합니다. 목표는 일반적으로 조직 절편에 대한 이미징 깊이에 관계없이 거의 동일한 이미지 강도를 유지하고 높은 배경 노이즈를 방지하는 것입니다.

필요한 경우 각 형광 이미지 데이터 시리즈를 수집하여 신호 중복을 방지하고 레이저 라인을 순차적으로 실행합니다. 데이터 또는 투과율 데이터를 수집하도록 소프트웨어 설정을 변경하고 6 33 나노미터와 같은 더 길고 투과성이 높은 파장 레이저를 사용하여 이러한 채널을 캡처합니다. 그런 다음 적절한 레이저 출력을 결정하고 반사율 및 투과율 수집에 대한 감도를 감지하고 이식된 장치 주변에서 동일한 수집 시리즈를 반복합니다.

마지막으로, 나중에 처리, 정량화 및 분석을 위해 데이터를 내보냅니다. 슬라이드의 어느 한 쪽을 통한 이미징을 통해 MEA의 실리콘 지지부를 따라 있는 미세아교세포가 한쪽에서 보이고 전극 부위를 따라 미세아교세포가 보이며 다른 쪽에서 트레이스가 보이는 그림과 같이 장치 주변의 인터페이스를 평가할 수 있습니다. XY translation stage를 사용하여 장착된 조직을 이미지화할 수 있게 되면 전체 조직 절편에 걸친 형광 라벨의 개요를 원하는 해상도로 생성할 수 있습니다.

여기서, 갈고리 3, 3, 3, 4, 2로 염색된 세포핵 및 3 2 9로 표지된 단핵구 미세아교세포. Anti IBA one은 별도의 채널에서 동시에 이미지화되었습니다. 투과광과 반사율도 수집하여 후크 및 IVA one 데이터에 대한 4주 임플란트의 위치를 보여주고, 모든 채널의 오버레이를 보여주지만, 투과광은 여기에 표시되어 있습니다.

국소 조직 반응 분석을 위해 고배율로 수집된 이식된 마이크로 장치 주변의 형태학적으로 보존된 조직 계면에 대한 자세한 검사를 수행할 수 있으며, 반사율 및 투과율을 통해 장치의 국소화를 가능하게 하며, 형광 항체 또는 화학 라벨을 통해 온전한 조직 계면을 따라 조직 구성 요소를 자세히 이미징할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 헤드 캡을 통해 이식된 장치를 조심스럽게 분리하는 데 시간을 할애하고 이 단계가 30분 이상 소요되도록 계획하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이식된 장치가 포함된 뇌 절편을 수집하고 처리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

또한 이러한 장치를 둘러싼 신경생물학을 설명하는 조직학적 데이터를 라벨링하고 수집할 수 있어야 합니다.