구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지

이 프로토콜은 막 단백질이 지질 포집 도메인을 통해 서로 어떻게 상호 작용하는지 이해하는 것을 목표로 하는 구조 연구를 위해 막관통 펩타이드의 공유 안정화 복합체를 생성합니다. 먼저, 대장균에서 관심있는 막관통 서열을 포함하는 hist 태그가 지정된 융합 단백질을 발현합니다. 그런 다음 니켈 친화성 매트릭스를 사용하여 귄과 세제를 사용하여 개재체 분획에서 단백질을 추출합니다.

hist 태그가 지정된 융합 단백질을 농축하고 황화이(di sulfide)는 산화제를 함유한 용액으로 컬럼을 세척하여 직경 형태로 가교합니다. 다음으로, Tri Fluor acetic acid에서 가교 결합 융합 단백질을 용출하고 시아노겐 브로마이드로 처리하여 융합 파트너를 방출하고, 역상 HPLC에 의해 digest 혼합물에서 가교 펩타이드 생성물을 분리합니다. 궁극적으로 제품의 정체와 순도는 SDS 페이지 및 질량 분석 분석을 통해 검증됩니다.

이 기술의 주요 장점은 용액 또는 고체 상태 NMR과 같은 기술을 사용하여 구조 연구를 위해 순수한 사회 측정 복합체가 생성된다는 것입니다. 두 개의 막관통 도메인이 상호 작용하는 것으로 알려진 경우에도 펩타이드 용해도와 복합체 형성은 실험 조건에서 종종 상충됩니다. 잘 정의된 공유 안정화 복합체로 시작하면 고품질 데이터 수집을 위해 테스트할 수 있는 실험 조건의 범위를 크게 확장할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 이러한 극도로 소수성 단백질 조각을 처리하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 이 프로토콜과 함께 제공되는 원고에 제공된 조언은 예측 및 정제 과정에서 가장 일반적인 몇 가지 문제에 대한 몇 가지 간단한 솔루션을 제공하도록 설계되었습니다. 구개(Palate), 50ml의 용해 완충액에서 삼겹살 펩타이드 융합 및 재현탁을 발현하는 박테리아의 1리터 배양물.

그런 다음 1 분 동안 최대 출력으로 3 사이클의 초음파 처리를 수행하고 5 분 동안 얼음에서 식히십시오. 20에 분리기분리에 의하여 불용해성 포함 몸 물자를 가을걷이, 15 분 동안 000 G 경사시키고 상층액을 따로 두십시오. 초음파 처리 및 원심 분리 단계는 IB 분획의 순도 향상이 필요한 경우 반복 될 수 있습니다.

SDS 페이지 분석을 위해 펠릿 및 상등액 물질의 샘플을 예약하여 트립을 확인합니다. 개질체에 대한 TM 융합 국소화는 이제 배양 리터당 25-50밀리리터를 사용하여 귓용액에 개질체 펠릿을 용해시킵니다. 가공: 실온에서 몇 시간 동안 부드럽게 섞어 가끔씩 햇볕을 쬐십시오.

다음으로, 75, 000에서 100, 000 시간 동안 G 시간에 원심분리에 의해 개재체 용해물을 제거합니다. 실온에서 50ml 원추형 튜브의 0.2미크론 멤브레인을 통해 슈퍼nat를 여과합니다. 투명화된 개재물 용해물을 guine 용액과 평형을 이룬 니켈 친화성 수지와 결합하여 배치 결합합니다.

서스펜션을 실온에서 밤새 부드럽게 혼합합니다. 개재물 본체 용해물 니켈 수지 현탁액을 전체 부피가 통과할 때까지 다공성 베드 지지대가 있는 빈 중력 흐름 기둥에 로드합니다. 결합되지 않은 융합 단백질을 여전히 포함할 수 있는 흐름을 수집하고 제쳐둡니다.

그런 다음 중력으로 니켈 수지를 세척하십시오. 5 밀리몰 빔 메르캅토에탄올을 함유하는 5 베드 부피의 요소 용액으로 유동합니다. 세 번째 세척을 위해 빔 메르캅토에탄올 없이 두 번째 세척을 수행합니다.

황산구리와 산화글루타티온이 보충된 요소 용액을 사용하십시오. 그런 다음 컬럼 배출구를 닫고 실온에서 30분 동안 배양하여 최대 이황화물 결합 형성을 허용합니다. 산화 요소 용액을 10 베드 용량의 물로 씻어냅니다.

그런 다음 진공 라인을 적용하여 컬럼 베드를 건조시키고 컬럼 배출구를 닫습니다. 이제 화학 안전 후드에 1.5 베드 부피의 깔끔한 TFA를 추가하고 작은 주걱으로 니켈 수지를 저어 산에 균일하게 노출되도록 한 다음 5 분 동안 배양합니다. 산 용출액을 수집하고, 필요한 경우 모든 액체를 밀어내기 위해 압축 된 에어라인으로 부드럽게 가압합니다.

또 다른 1.5 bed 부피의 깔끔한 TFA로 산 희석 단계를 반복합니다.단백질 수율을 측정하려면 TFA EIT를 트리 플루오로 에탄올로 희석하고 A-T-F-A-T-E에 대해 280나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 산성 elu를 적가화하여 최종 TFA 농도를 80%로 희석합니다. 부드럽게 섞으면서 물을 첨가합니다.

형태를 침전시키는 경우 용액이 명확해질 때까지 소량의 TFA를 다시 추가하십시오. 그런 다음 물로 80%로 다시 수정하십시오. SDS 페이지 분석을 위해 5마이크로리터 프리다이제스트 샘플을 예약하고 액체 질소에서 즉시 동결합니다.

다음으로, 시료 1ml당 약 0.2g에 대해 시아노겐 브로마이드 결정의 무게를 잰다. 독성 화학 물질의 무게를 안전하게 측정하도록 주의하십시오. 안전 후드에 있는 샘플에 시아노겐 브로마이드를 추가하고 완전히 녹을 때까지 부드럽게 혼합합니다.

이제 불활성 가스 씰 내에서 반응 용기를 세척하고 빛으로부터 보호된 실온에서 3-4시간 동안 배양합니다. SDS 페이지 분석을 위해 5마이크로리터 사후 분해 시료를 예약하고 액체 질소에 즉시 동결하고 사전 분해 시료와 함께 동결 건조합니다. 그런 다음 분해 반응을 재생된 셀룰로오스 투석 카세트로 옮겨 부피를 크게 증가시킬 수 있습니다.

화학적 팜므 후드에 있는 4리터의 물에 대해 밤새 샘플을 투석합니다. 다음날 아침, 투석 카세트에서 부유 단백질 침전물이 있는 투석 반응 용액을 제거하고 현탁액을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 며칠 동안 샘플을 동결 및 동결 건조하여 물과 시아노겐, 브롬화물 및 TFA의 흔적을 제거하고 용액이 완전히 제거될 때까지 최대 100mg의 동결건조 소화 제품을 3밀리리터의 깔끔한 포름산 혼합으로 용해합니다.

5ml 시료 루프를 사용하여 용매 A 흐름에서 분취 스케일 zoax SB 300 C3 컬럼에 시료를 로드합니다. 그런 다음 분해 생성물을 용매 B의 그래디언트로 최소 5 컬럼 부피에 걸쳐 용리시킵니다. SDS 페이지 및 MALDI TOF 질량 분석법으로 HPLC 분획을 분석하여 관심 종을 식별하고 예상되는 질량 동결 건조를 확인합니다.

가교 결합된 펩타이드 생성물을 포함하는 HPLC 분획물. 제품이 분말이 아닌 필름으로 건조되면 소량의 HFIP에 다시 용해시켜 액체로 동결하고 동결 건조할 수 있습니다. 다시 말하지만, 그 결과는 쉽게 기울어지고 무게가 측정되는 푹신한 흰색 원뿔이 될 것입니다.면역 수용체 막횡단 신호 분자의 막관통 및 플래그 영역을 암호화하는 DNA 염기서열.

DAP 12는 힌디어 3 및 BAM H 1 제한 부위를 사용하여 PMM 펩타이드 벡터로 클로닝되었습니다. 그 결과 생성된 박테리아 발현 구조체는 시아노겐 브로마이드 절단 및 산화적 가교를 위한 고유한 내부 메티오닌 및 시스틴 잔기를 가진 his 태그가 지정된 트립 융합 단백질을 생성합니다. tripe fusions에 대해 달성되는 발현 수준은 부착된 펩타이드의 아미노산 서열에 따라 다릅니다.

이 제제는 1리터의 배양액과 4밀리리터의 니켈 매트릭스에서 약 120mg의 순수한 온전한 융합 단백질을 생성했습니다. 세포 용해 후, 융합 단백질은 봉입체 펠릿에 국한되었습니다. 니켈 정제 된 tripe DAP 12 TM 융합의 약 70 %는 DME 형태로 이황화 가교되었습니다.

DAP 12 TM 펩타이드 산물은 총 CYANOGEN 브로마이드 분해 샘플에서 쉽게 식별할 수 없지만, 환원된 분해 샘플에서 손상되지 않은 융합 및 트립 단편 띠를 비교하면 이러한 일반적인 분해 산물 분리에서 융합 분해가 약 60% 완료되었음을 나타냅니다. 역상 HPLC를 사용하는 예비 규모 C3 컬럼에서 용매 B.The diss 황화물 가교 펩티드 제품의 2단계 구배에 암시된 바운드 제품은 비 환원 및 환원 조건에서 주요 HPLC 분획의 SDS 페이지 분석에서 확인할 수 있습니다. Maldi tof 질량 분석 분석은 6729.2 Daltons의 주요 제품과 함께 피크 4에서 deme 펩타이드의 정체를 확인합니다.

시안노겐 브로마이드 유기 용제 및 농축 산으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이러한 절차를 수행하는 동안 적절한 보호 장비를 착용해야 하며 시안화 브로마이드는 승인된 화학 안전 후드 밖에서 취급해서는 안 됩니다. 이 기술은 림프구 막 내의 단백질 상호 작용을 통해 다중 소단위 면역 수용체가 어떻게 조립되는지를 보여주는 막관통 펩타이드 복합체의 세 가지 다른 용액 n mr 구조에 대한 핵심 연구 자료를 제공했습니다.

우리는 이 기술의 적용이 다른 막 단백질 시스템에도 동일한 가치를 입증할 것이라고 믿습니다.