Name: 구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: 학습하세요 막단백질 구조 연구를 위한 이황화 교차결합 펩타이드 복합체 생산 및 정제 방법을. 니켈 친화성 크로마토그래피와 역상 HPLC를 활용하여 고품질 샘플을 얻을 수 있습니다.

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멕과 빅토리아 정부 (VESKI 혁신 동지,이 작품에 대한 자금 지원은 국민 건강과 호주의 의학 연구위원회 (WEHI에 독립적 인 연구소 인프라 지원 계​​획은 [IRIISS] 부여 멕과 MJC에 NHMRC 프로젝트 보​​조금 1,011,352)에 의해 제공된다; WEHI에 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원). 멕는 호주 연구 협의회의 엘리자베스 2 세 여왕 동지이다. EFXB는 멜버른 대학에서 노마 힐다 슈스터 장학금 프로그램의 지원을 인정합니다.

1. 복제 및 구조 설계 HindIII와 BamHI 제한 사이트를 (그림 1 참조)를 사용하여 pMM-펩타이드 벡터 (이 요청시 제공 될 수 있습니다)에 관심 시퀀스를 복제. 이중 좌초 된 DNA의 삽입은 다음과 같은 순서로, 통합해야 HindIII 사이트, CNBr의 절단에 대한 단일 메티오닌 코돈, E.를 순서를 코딩 대장균 코돈 최적화 된 펩타이드, 정지 코돈, BamHI 사이트입니다. 펩타이드의 다른 모든 methionines는 제거해야하고 또한 산성 조건에서 흘리고 될 것 같은 dipeptide 순서 ASP-PRO는 피해야한다. 독특한 시스테인 잔류 물은 최종 단지에 이황화 crosslink의 원하는 위치에 따라 각 펩타이드 순서로 소개하고, 다른 모든 cysteine​​s는 세린에게 변형해야합니다. 플라스미드은 선택 kanamycin 저항 카세트를 수행합니다. 2. trpLE - pepti의 표현드 퓨전 <ol><li> (0.1 MM CaCl 2, 2 MM MgSO 4, 3g / L KH 2 PO 4, 7.5 g / L 오세영 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0.5 g / L NaCl, 화장 및 살균 필터 M9/Kan 최소한의 성장 매체 1g / L NH 4 CIA 같으니, 4 G / L 포도당, 50 MG / L kanamycin 황산). 불용성 물질과 살균 필터 오렌지 표면에 뜨는을 제거하려면 30 분, 원심 분리기에 대한 혼합 40 ML H 2 O에 1 타블렛을 분해 :.와 Centrum은 완전한 B-비타민과 추적 금속을 제공하는 아연을 보충 최대 2 주와 M9 4 ML / L를 사용하는을위한 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 재고 솔루션입니다. 참고 : 원하는 경우 15 N 강화 NH 4 CIA 같으니, 13 C-농축 포도당 또는 기타 안정적-동위 원소 - 라벨 전구체이 단계에서 M9 매체에 포함 할 수 있습니다. </li><li> 갓 변형 BL21 (DE3) 변형 E.에서 100 ML 스타터 문화의 예방 M9/Kan 매체에서 대장균. 200 rpm으로 흔들어와 37 ° C에서 하루 아침에 성장. </li><li> 다음날 아침, 스타터 문화의 OD 600 확인 -이 2 이상의 범위에 있어야합니다. Centrum은 - 보충 M9 매체의 1 L 총 볼륨에 100 ML 스타터 문화를 희석. , 2 L 당황 플라스크 (각 플라스크 500 ML 문화)로 분할하고 37 성장 ° C OD 600 0.6에 도달 할 때까지 140 rpm으로 흔들어. </li><li> 18 흔드는 온도를 설정 ° C와 문화가 유도되기 전에 완전히 냉각 할 수 있도록 1 시간에 떨고 계속 진행합니다. </li><li> (OD 600 = 1의 문화에서 50 μl의 이에 상응하는 금액)의 SDS-PAGE 분석을위한 사전 유도 샘플을 채취 한 후, trpLE - 펩타이드 융합의 표현을 유도하기 위해 0.1 mm까지 최종 농도에 IPTG 추가 할 수 있습니다. 18 ° IPTG 유도에 따라 하루 아침에 C/140 RPM (16-20 시간)로 성장하고 계속합니다. </li></ol> 3. 포함 바디 준비 및 니켈 매트릭스 바인딩 <ol><li> 최소한의 중간에서 하룻밤 표현 문화의 최종 OD 600 변수와 우입니다uld 2.5 및 5.0 사이. SDS-PAGE 분석을 위해 샘플을 채취 (OD 600 = 1의 문화에서 50 μl의 이에 상응하는 금액) 5,000 X g에서 20 분을 위해 원심 분리하여 세포를 수집합니다. </li><li> Resuspend 세포 펠렛 50 ML의 용해 버퍼 (50 MM 트리스 - HCL 산도 7.5, 20 MM β-ME, 0.2 M NaCl) 1 L 문화에서. 세포 현탁액은 나중에 처리하기 위해 냉동 보관하실 수 있습니다. </li><li> 5 분을위한 얼음 1 분과 휴식을위한 최대 출력에서​​ 얼음에 sonication으로 세포를 Lyse. 우리는 ½ 인치 높은 강도 교체 팁과 Misonix의 Sonicator 3000 (최대 출력 600w)을 사용합니다. sonication / 3주기위한 냉각을 반복합니다. </li><li> 20,000 XG 15 분 동안 원심 분리하여 불용성 포함 본체 (IB) 자료를 수집하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. 가벼운 색의 세포 파편의 느슨한, 얇은 층은 울창한 IB 펠릿의 상단에 표시 될 수 있으며,이 방법은 부드러운 교반과 물이나 버퍼를 사용하여 씻겨 할 수 있습니다. 단계 3.3 및 3.4은 IB 분율의 순도를 향상시키기 위해 반복 될 수 있습니다 경우 desi붉은 색. 펠렛 및 표면에 뜨는 물질의 샘플이 포함 기관에 trpLE-TM 퓨전 현지화를 확인 SDS-PAGE 분석에주의해야한다. </li><li> 처리 문화의 리터 당 25-50 ML을 사용하여, 구아니딘 솔루션 (6 M 구아니딘 HCL, 50 MM 트리스 - HCL 산도 8.0, 200 MM NaCl, 1 % 트리톤 X-100, 5 MM β-ME)에 IB 알약을 분해. 이 단계는 교반 및 비정기 온화한 sonication과 함께 몇 시간을 필요로합니다. </li><li> 75,000-100,000 XG에서 1 시간 20 ° C.에 대해 원심 분리하여 IB lysate를 삭제합니다 0.2 μm 막 통해 표면에 뜨는 및 필터를 가만히 따르다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에서 삭제 IB lysate, 또는 물과 구아니딘 솔루션에 equilibrated로 세척 된 니켈 친화 수지와 함께 안전하게 폐쇄 할 수있는 큰 그릇이 조화를 이루고 있습니다. trpLE - DAP12TM는 (그림 3, 차선 2) 여기에 표시된대로 비슷한 정도 표현 fusions을 위해 처리 문화의 리터 당 3-4 ML 해결 수지를 사용하십시오. 객실 t에서 밤새 잠복기에 의해 배치 바인드<html> 부드러운 혼합과 emperature. </li></ol> 4. 온 열 산화에 Crosslinking <ol><li> 전체 볼륨을 통해 유동 될 때까지 지속적으로 추가, 다공질 베드 지원 빈 중력 흐름 열에 IB의 lysate / 니켈 수지 정지를로드합니다. 수집하고 여전히 언 바운드 융합 단백질을 포함 할 수 있습니다 flowthrough을 따로 넣어. </li><li> β-ME 5 MM를 포함하는 우레아 용액의 5 침대 볼륨 (8 M의 우레아, 50 MM 트리스 - HCL 산도 8.0, 200 MM NaCl)과 중력 흐름에 의해 니켈 수지를 씻으십시오. </li><li> β-ME없이 우레아 용액의 5 침대 볼륨으로 다시 니켈 수지를 씻으십시오. </li><li> 20 μM CuSO 4, 글루타티온을 산화 두 음을 보충 된 우레아 용액의 5 침대 볼륨과 니켈 수지에게 세 번 씻으십시오. 이 세척 후, 열 배출구를 닫고 최대 이황화 결합 형성을 허용하도록 실온에서 30 분을 품다. </li></ol> 5. TFA의 용출 및 Quantitation 내용은 &quot;&gt;주의 : Trifluoroacetic 산 (TFA)은 피부와 가스와 접촉에 심각한 화상을 원인은 매우 자극 아르 집중 TFA는 눈 보호와 비 라텍스 장갑과 승인 된 화학 물질 퓸 배출 후드에만 사용되어야합니다 모든 화학 호환성을 확인하십시오.. 자료는 사용, 폴리 프로필렌은이 프로토콜의 모든 단계와 호환됩니다. <ol><li> 물 10 침대 볼륨으로 산화 우레아 용액을 깨끗이 씻어 열 콘센트에 진공 라인을 적용하여 열 침대를 건조. </li><li> 열 배출구를 닫고 단정 (99~100%) TFA의 1.5 침대 볼륨을 추가 할 수 있습니다. 산에도 노출을 보장하고 5 분에 품다 할 수있는 작은 주걱으로 니켈 수지를 젓는다. 열 배출구를 열고 액체를 모두 밀어 필요한 경우 주사기 또는 압축 공기 라인 부드럽게 pressurizing, 산성 eluate를 수집합니다. </li><li> 깔끔한 TFA의 또 다른 1.5 침대 볼륨있는 산 용출 단계를 반복합니다. beade의 완전한 해체를 방지하기 위해이 단계에서 빠르게 작업D 아가로 오스 행렬. 단백질 수율은 맥주 램버트 방정식과 trpLE - 펩타이드 시퀀스의 이론적 몰 흡광 계수에 따라이 시점에서 결정될 수있다. trifluoroethanol의 TFA의 eluate (1시 20분에서 1시 50분까지) (TFE)의 샘플을 희석하고 빈과 같은 희석에 TFA / TFE를 사용하여, 280 nm의에서 흡광도를 측정합니다. </li></ol> 6. CNBr의 소화 주의 : 시안 브로마이드 (CNBr)는 매우 독성 만 승인 된 화학 물질 퓸 배출 후드에서 처리해야합니다. 안전 안경, 실험실 코트와 비 라텍스 장갑 등의 보호구가 절대적으로 필요합니다. CNBr는 습기에 반응하고 열기 전에 실내 온도에 가져해야합니다. 중화 / CNBr 오염 된 솔루션 및 자료의 폐기 방법에 대한 안내는 기관의 안전 사무소에 문의하십시오. <ol><li> 부드럽게 혼합하면서 물 dropwise 추가하여 80% 최종 TFA 농도에 산 eluate을 희석. 석출물 형태의 경우DD는 다시 단정 TFA의 작은 볼륨 (0.5-1 ML) 솔루션은 물 80 % 재 올바른 다음, 분명히까지. 액체 질소에 동결 즉시 샘플을 lyophilizing, SDS-PAGE 분석을위한 5 μl 미리 알림 견본을보세요. </li><li> 폐쇄, 사전 무게 튜브에 안전하게 독성 화학 물질을 체중 돌봐 또는 화학 퓸 후드 내부의 균형을 사용하여 약 0.2 g / ML에 CNBr 크리스탈을 추가합니다. 완전히 용해 될 때까지 부드럽게 섞는다. 플러시와 불활성 가스 (질소 또는 아르곤 스트림)에서 반응 용기를 밀봉하여 빛으로부터 보호, 실온에서 3-4 시간을 품다. </li><li> SDS-PAGE 분석을위한 5 μl 후 다이제스트 샘플을 가지고 고정 즉시 lyophilize. 예상 펩타이드 단지의 크기에 따라 3.5 kDa 이하의 분자량의 컷오프와 재생 셀룰로오스 투석 카세트 나 튜브 (셀룰로스 아세테이트이 집중 산성에 용해 됨)로 요약 반응을 전송합니다. 에 물 4 L로 하루 아침에 Dialyze화학 연기 후드는 TFA 농도를 감소하고 unreacted CNBr을 분해합니다. 야간 투석시 볼륨이 크게 증가 (만큼 3 배 두에로)에 대한 투석 카세트 나 튜브의 방을 둡니다. </li><li> 투석 카세트 나 튜브 (단백질의 대부분은 TFA 농도가 감소 할 때 침전 됨)에서 일시 중지 침전물과 dialyzed 반응 용액을 제거하고 50 ML 원뿔 튜브에 정지 전송합니다. 고정 물과 CNBr / TFA의 흔적을 제거하는 lyophilize. 이 단계는 몇 일이 필요 할 가능성이 있습니다. 주의 : dialyzed 알림 반응과 투석 물을 모두 독성 및 적절한 예방 조치와 함께 처리 / 처리 된 것으로 간주 계속해야합니다. </li><li> 사전 유도하고 수확 단계, 포함 몸 표면에 뜨는 및 펠렛, TFA의 eluate 및 CNBr - 소화 물질의 문화의 샘플은 SDS-PAGE에 의해 분석 될 수있다. 95 가열하여 샘플을 준비 Invitrogen NuPAGE LDS sampl에 ° C전자 버퍼. TFA의 eluate 및 다이제스트 샘플은 산화 crosslinking의 제품 식별 및 평가를 촉진하기 줄이고 비 절감 두 조건에서 준비되어야한다. </li><li> 가장 작은 다이제스트 제품의 최적 해상도 MES-SDS 실행 버퍼를 사용하여 12% NuPAGE 비스 - 트리스 사전 주조 아크릴 아미드 젤의 샘플을 분리합니다. </li></ol> 7. 이황화 - 가교 펩타이드 복합 단지의 반전 상 HPLC 정화 <ol><li> 예비 규모로 2-3 ML 단정 개미의 산성, 부하 (21.2 X 150mm)에 동결 건조 된 다이제스트 제품의 100 밀리그램까지 분해 애질런트 ZORBAX SB-300 용매의 C3 PrepHT 열 A (일반적으로 10~20%의 아세토 니트릴 5 0.1 % TFA와 물에 이소프로판올 -10 %). </li><li> 적어도 5 열 권 이상의 용매 B의 기울기 (0.1 % TFA로 아세토 니트릴 또는 이소프로판올)에 요약 제품을 Elute. 다른 펩타이드 시퀀스에 대한 최적의 기울기 조건의 선택에 대한 제안 토론을 참조하십시오. </li><li> 보세요SDS-PAGE 분석 및 동결 즉시 lyophilize 각 HPLC 분율 50-100 μl 샘플. HPLC의 용매의 제거는 빠른 것입니다 1-2 시간에 완료해야합니다. </li><li> 더 환원제와 Invitrogen NuPAGE LDS 샘플 버퍼에 95 ° C로 가열하여 SDS-PAGE에 동결 건조 된 HPLC 샘플을 준비합니다. 시원하고 그들과 다시 난방 간단히 중 하나에 100 밀리미터 DTT를 추가 균등이 microcentrifuge 튜브에 각각의 샘플을 분할. </li><li> MES-SDS는 위의 버퍼를 실행과 12% NuPAGE 비스 - 트리스 사전 주조 아크릴 아미드 젤의 감소와 비 감소 HPLC 샘플을 분리합니다. 소형, 소수성 펩티드는 종종 Coomassie 잘 얼룩 차지하지 않고 예상 분자량에서 실행되지 않을 수 있습니다. 그러나, 감소 및 비 감소 시료의 비교 가교 펩타이드 제품과 순도 평가의 식별을 용이하게한다. </li><li> 매트릭스 지원 레이저 탈착 이온화 시간의 비행 (든-TO하여 후보 펩타이드 함유 분수를 분석F) 질량 분석법은 (토론 참조) 관심있는 종을 확인하고 예상 질량을 확인합니다. </li><li> , 결합 순수, 가교 TM 펩타이드 단지를 포함하는 HPLC의 분수를 고정하고 lyophilize 및 수율을 결정하는 최종 제품의 건조 중량을. 높은 이소프로판올 콘텐츠와 분수는 냉동 상태로 유지되지 않을 수 있습니다. 펩타이드 분수 오히려 보송 보송 한 동결 건조 제품보다 필름으로 건조하면, 순수 hexafluoroisopropanol (HFIP)의 작은 볼륨에서 완전히 필름을 다시 분해 정지 한 후 다시 lyophilize. HFIP - 처리 제품은 쉽게 나올 팁과 무거워 작은 흰색 콘해야합니다. </li></ol>

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</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

trpLE-TM fusions의 표현이 있습니다. 우리의 경험에서 trpLE-TM fusions이 저조한 37 ° C에서 풍부한 문화 매체에 표현되며, 여기에 설명 된 문화 조건 수율이 범위를 1-4 TM 도메인에서 포함 된 다양한 시퀀스에 대해 성공적으로 증명 50에서 150 밀리그램 / 순수 그대로 융합의 L. Fusions 인코딩은 세 또는 네 TM GPCR 조각 (인간의 CCR5 각각 TM1-TM3 및 TM4-TM7), 또는 인간의 신호 펩티드 peptidase (4 TM 도메인, 심판 15 참조)의 핵심 촉매 조각은 표현의 범위에서 최저를 나타냅니다 레벨 동안 밀접 범위 (게시되지 않은 데이터)의 최고 끝을 나타내는 여기에 사용 된 순서에 관한 DAP12TM 변종. 최적의 IPTG의 농도는 각각의 새로운 순서에 대해 실험적으로 결정해야합니다. 우리 표준은 0.1 MM, 높은 농도 (최대 1 ㎜) 보통 모두 낮은 표현 수준에 따라 크게 감소 수율 및 낮은 문화 밀도의 결과입니다t의 수...

이 프로토콜은 세부 사항 우리가 솔루션 NMR을 사용하여 구조 연구 이황화 - 안정화 transmembrane의 단지 (TM) 펩티드를 생성하기 위해 개발 절차를. 절차는 ΔtrpLE1413 융합 시스템 (아래 참조)에 의해 부여 강력한 표현을 활용하여 정의 된 구성의 TM의 펩타이드 단지는 현대적인 다차원 NMR 실험에 사용되는 복잡한 안정적-동위 원소의 분류 기술을 사용하여 생성 할 수 있습니다. 우리는 림프구 - 활성화 immunoreceptors이 (최근 1 검토)은 TM 도메인 간의 상호 작용을 통해 여러 막 단백질 subunits에서 조립하는 방법에 대한 중요한 새로운 정보를 공개 여러 NMR 구조를 결정하기 위해 이러한 기술을 고용하고 있습니다. 이 기술은 다른 많은 막 단백질 시스템뿐만 아니라 솔루션 NMR뿐만 아니라 다운 스트림 분석 방법의 다양한 적용됩니다. 여기에 주어진 예는 기본 시스테인 잔류 물을 활용하는 동안자연스럽게 이황화 - 보세 단백질을 모방 복잡한을 만들려면 디자인은 동일하게 일반적으로 이러한 게이 및 이종 dimeric TM 단지와 같은 약한 비 공유 결합 상호 작용에 의해 함께 개최됩니다 복합체를 안정화 할 수 있도록 설계 이황화 채권을 생성에 적합합니다 표피 성장 인자 수용체는 (EGFR) 가족 단백질 2-4 또는 heterodimeric의 αβ 인테그린 단지 5,6. 같은 지방질에서 파생 된 것과 같은 매우 소수성 펩타이드 시퀀스 이중층 - 스패닝 TM 단백질의 일부​​ 것은 생화학 및 biophysical 연구 대단히 어려운 과목입니다. 표준 단백질과 펩타이드 화학 기술을 사용하여 조작하는 것은 매우 어려운 것뿐만 아니라, 그들은 종종 세포에 매우 독성이 있으므로 recombinantly 생산하기가 어렵습니다. 우리 7,8 등 9-11이 가지고에서 프레임 카르복시 - 터미널로 세균 이러한 어려운 펩타이드 시퀀스를 표현 상당한 성공E.에서 파생 된 ΔtrpLE1413 순서의 수정 된 버전 fusions 대장균 TRP 오페론 12. 이 시퀀스로 인코딩 ~ 13 kDa trpLE 폴리펩티드는 T7 프로모터에 따라 높은 수준의 생산 할 수 있으며 완전히 독성 및 / 또는 불안정에 관한 문제가 피할 아르 포함 단체로 지역화되어 있습니다. 아미노 터미널 9 히스티딘 태그 13 trpLE 순서에서 내부 메티오닌과 시스테인 잔류 물을 제거 금속 이온 친화도 크로마토 그래피에 의해 정화되고 소화 할 14 수 trpLE - 펩타이드 fusions는 시안 브로마이드 (CNBr을 사용하는 추가하여 순서의 변경 ) 원하는 펩타이드 시퀀스를 공개합니다. 우리는 성공적으로 많은 사 등의 TM 도메인을 포함 멤브레인 단백질 조각을 대표 trpLE fusions 등의 12 개의 시퀀스 이상을 표현하기 위해이 시스템을 사용하면 (7,8 및 게시되지 않은 결과, 또한 토론 섹션을 참조). 이 프로토콜의 주요 혁신은 구조화 매우 저조한 용해 trpLE-TM fusions 효율적으로 간소화 된 워크 플로우의 맥락에서 이황화 - 가교가 될 수있는 아래의 조건을 식별합니다. 높은 수율 표현, 취급 및 펩타이드 제품의 정화의 여러 측면은 철저하게 최적화하고, 여기에서 제시 한 권고는 비 이황화 - 가교 (monomeric) TM 펩타이드 제품의 생산을위한 동등하게 관련이되어 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 시안 브로마이드 </td><td> 올드리치 </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> 유해 약물. 위험물. 흡입에 의해 매우 독성, 피부에 접촉하고있는 경우는 삼켰다. 산과의 접촉은 매우 독성 가스를 liberates. 수생 생물에 매우 유독, 수생 환경에 장기적인 악영향을 일으킬 수 있습니다. </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic 산 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P.CODE - 1000984387, CAS 번호 76-05-1 </td><td> 유해 약물. 위험물이 있습니다., 심각한 화상을 일으킨다. 흡입에 의한 유해. 수생 생물에 유해, 수생 환경에 장기적인 악영향을 일으킬 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 2 - 메르 캅토 에탄올 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P.No M7154, CAS 번호 60-24-2 </td><td> 유해 약물. 위험물. 흡입에 의한, 피부 접촉 및 삼킨 경우 독성. 피부에 자극. 눈에 심각한 손상의 위험. 피부 접촉에 의해 sensitization의 원인이 될 수 있습니다. 수생 생물에 매우 유독, 수생 환경에 장기적인 악영향을 일으킬 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3 - Hexafluoro-2 - 프로 파놀 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 제품 번호 52512, CAS-아냐. 920-66-1 </td><td> 유해 약물. 위험물. 흡입에 의한 위험하고 경우가 삼켰다. 화상됩니다. </td></tr><tr><td> 개미의 산 </td><td> 머크 KGaA </td><td> K41186564 </td><td> 가연성 액체 및 증기. 심각한 피부 화상 및 눈 손상을 발생합니다. </td></tr><tr><td> 요소 </td><td> UNIVAR, AJAX FINECHEM </td><td> 제품 번호, 817, CAS - 아니, 57-13-6 </td><td> 가열, 12 월이산화탄소와 암모니아로 omposes, 구운 경우, 질소 산화물의 작은 양을 방출. 빨갛게 및 피부와 눈의 자극을 일으킬 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 구아니딘 히드로 클로라이드 </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, CAS 번호 : 50-01-1 </td><td> 삼킨 경우 유해한, 심각한 눈 염증을 일으킨다 피부 자극, 급성 독성 구강, 피부 자극, 눈 자극이 발생합니다. </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 시그마 </td><td> 제품 번호 - T8532 CAS 번호 : 9002-93-1 </td><td> 트리톤 X-100는 종종 단백질을 solubilize하기 위해 생화학 응용 프로그램에서 사용하는 nonionic 세제, 100 % 활성 성분입니다. 트리톤 X-100는 항균 특성을가 없으며, 비교적 온화한 비 denaturing 세제를 고려 </td></tr><tr><td> 그의 - 선택 니켈 - 선호도 젤 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 카탈로그 개수-P6611 </td><td> IS-선택 니켈 선호도 젤은 고정 금속 이온 친화도 크로마토 그래피 (아이맥) 제품입니다. HIS - 선택 닉엘 선호도 젤은 특별히 히스티딘이 포함 된 단백질에 바인딩하도록 설계되어 니켈 혐의로 기소 구슬 아가로 오스의 독점적 인 quadridentate 킬레이트입니다. </td></tr><tr><td> (-)-글루타티온, 산화 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 카탈로그 NUM 150,568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonicator </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (단종) </td><td> 최대 전원 출력 600w. 0.5 인치 교체 - 팁 프로브는 0.5 인치 높은 강도, 높은 볼륨 팁과 높은 강도, 낮은 볼륨 팁의 범위를 걸립니다. 이 회사에서 현재 사용할 수있는 가장 가까운 모델은 Q500 및 Q700 있습니다. </td></tr><tr><td> RP-HPLC : 생물학적 DuoFlow 크로마토 그래피 시스템, 소프트웨어 버전 5.3 </td><td> 바이오 RAD 연구소 </td><td> 카탈로그 개수 760-0047, 구성 번호 : AU500571, 시리얼 번호 : 484BR3705 </td><td> 펩티드는 높은 AQ의 위상 HPLC 컬럼을 취소에 바인딩ueous 모바일 위상 및 높은 유기 모바일 위상과 RP HPLC 컬럼에서 용출되어 있습니다. RP에서 HPLC의 펩티드들은 소수성 문자에 따라 구분됩니다. 펩티드는 유기 용매의 선형 그라데이션을 실행하여 분리 할 수​​ 있습니다. </td></tr><tr><td> 준비 HT C3 ZORBAX 300SB-HPLC 분석 칼럼, 21.2 X 150mm, 5 μm의 입자 크기 </td><td> 애질런트 </td><td> 제품 번호 : 895150-909 </td><td> 반대로 상 HPLC 칼럼 </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% 비스 - 트리스 젤 </td><td> 생명 기술 </td><td> NP0341BOX </td><td> 단백질 전기 영동을위한 사전 주조 젤 </td></tr><tr><td> 슬라이드-A-Lyzer G2 투석 카세트, 3.5K MWCO </td><td> 열 과학 </td><td> 제품 번호 : 87724 </td><td> 샘플 투석 </td></tr></tbody></table>

구조 연구 생산 이황화 - 안정화 transmembrane의 펩타이드 단지

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

막 단백질의 지질 내장 된 알파 - 나선형 도메인 간의 물리적 상호 작용은 막 단백질 단지의 접이식 및 조립과 같은 transmembrane (TM) 신호와 세포 표면 단백질 수준의 조절, 동적 인 프로세스에서 매우 중요한 역할을한다. 특정 시퀀스의 연결을 운전 구조적 기능을 이해하는 것은 TM의 펩타이드 단지의 정교한 biophysical 및 생화학 분석이 필요합니다. 그러나, TM 도메인의 극단적 인 소수성는 표준 펩타이드 화학 기술을 사용하여 조작하도록 매우 어렵게 만듭니다, 그리고 적절한 학습 자료의 생산은 종종 prohibitively 도전 증명한다. 펩티드는 현재 안정적으로 나선형 conformations 및 양식 단지를 채택 할 수있는 환경을 확인하는 것은 자발적으로 어려움의 추가 수준을 추가합니다. 여기 E.하에 게이 또는 자료에서 이종 dimeric TM의 펩타이드 단지의 생산을위한 절차를 제시 안부난, 따라서 핵 자기 공명에 대한 안정적인 동위 원소 라벨 (NMR) 또는 상대적으로 저렴하게 다른 응용 프로그램이 아닌 천연 아미노산의 설립을 허용. 이 방법의 주요 혁신은 TM 단지는 생산 및 세제, 지질 또는 기타 막 모방 재료로 재구성 할 때 안정적인 화학 양 론적하고 균일 한 구조를 형성 할 수 covalently 관련 (이황화-가교) 어셈블리로 정화된다는 것입니다. 우리는 하나의 TM 도메인 또는 가교 단지를 생산 여부 동등하게 적용하고 새로운 TM 시퀀스에이 방법을 조절하기위한 조언을 제공 표현과 정화에 대한 조심스럽게 최적화 된 절차를 제시한다.

trpLE fusions에 달성 표현의 수준은 변수 첨부 된 펩타이드의 아미노 산 순서에 크게 의존한다. 그림 3은 사전 유도의 SDS-PAGE 분석 (차선 1) 시간의 수확 (차선 2) 표시 문화 1 리터과 4 ML의 니켈 매트릭스에서 순수한 그대로 trpLE-DAP12TM 융합의 약 12​​0 밀리그램이 나왔고 문화에서 샘플. trpLE - DAP12TM 융합의 모든으로 표면에 뜨는 (레인 3)에 반대 포함 몸 펠릿 (레인 4)로 번역되었습니다. 니켈 - 정화 trpLE-DAP12TM 융합의 약 70 % dimeric 양식 (: TFA의 eluate의 비 감소 및 감소 된 샘플 그림 3, 레인 5, 6)에 이황화 - 가교했다. 이 trpLE-DAP12TM 융합을위한 일반적인 결과이지만, crosslinking 효율은 엔지니어링 cysteine​​s의 위치와 다릅니다. DAP12TM의 펩타이드 제품은 총 CNBr ...

막 임베디드 단백질 도메인 간 상호 작용의 Biophysical 및 생화학 연구는 적절한 학습 자료를 얻는 첫 번째있는 많은 기술적 도전을 직면하고 있습니다. 이 문서는 솔루션을 핵 자기 공명 (NMR) 및 기타 분석 응용 프로그램의 구조 분석에 적합 이황화 - 안정화의 transmembrane의 펩타이드 복합체를 생산하고 정화를위한 프로토콜을 설명합니다.

구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

이 프로토콜은 막 단백질이 지질 포집 도메인을 통해 서로 어떻게 상호 작용하는지 이해하는 것을 목표로 하는 구조 연구를 위해 막관통 펩타이드의 공유 안정화 복합체를 생성합니다. 먼저, 대장균에서 관심있는 막관통 서열을 포함하는 hist 태그가 지정된 융합 단백질을 발현합니다. 그런 다음 니켈 친화성 매트릭스를 사용하여 귄과 세제를 사용하여 개재체 분획에서 단백질을 추출합니다.hist 태그가 지정된 융합 단백질을 농축하고 황화이(di sulfide)는 산화제를 함유한 용액으로 컬럼을 세척하여 직경 형태로 가교합니다. 다음으로, Tri Fluor acetic acid에서 가교 결합 융합 단백질을 용출하고 시아노겐 브로마이드로 처리하여 융합 파트너를 방출하고, 역상 HPLC에 의해 digest 혼합물에서 가교 펩타이드 생성물을 분리합니다. 궁극적으로 제품의 정체와 순도는 SDS 페이지 및 질량 분석 분석을 통해 검증됩니다.이 기술의 주요 장점은 용액 또는 고체 상태 NMR과 같은 기술을 사용하여 구조 연구를 위해 순수한 사회 측정 복합체가 생성된다는 것입니다. 두 개의 막관통 도메인이 상호 작용하는 것으로 알려진 경우에도 펩타이드 용해도와 복합체 형성은 실험 조건에서 종종 상충됩니다. 잘 정의된 공유 안정화 복합체로 시작하면 고품질 데이터 수집을 위해 테스트할 수 있는 실험 조건의 범위를 크게 확장할 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 이러한 극도로 소수성 단백질 조각을 처리하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 이 프로토콜과 함께 제공되는 원고에 제공된 조언은 예측 및 정제 과정에서 가장 일반적인 몇 가지 문제에 대한 몇 가지 간단한 솔루션을 제공하도록 설계되었습니다. 구개(Palate), 50ml의 용해 완충액에서 삼겹살 펩타이드 융합 및 재현탁을 발현하는 박테리아의 1리터 배양물.그런 다음 1 분 동안 최대 출력으로 3 사이클의 초음파 처리를 수행하고 5 분 동안 얼음에서 식히십시오. 20에 분리기분리에 의하여 불용해성 포함 몸 물자를 가을걷이, 15 분 동안 000 G 경사시키고 상층액을 따로 두십시오. 초음파 처리 및 원심 분리 단계는 IB 분획의 순도 향상이 필요한 경우 반복 될 수 있습니다.SDS 페이지 분석을 위해 펠릿 및 상등액 물질의 샘플을 예약하여 트립을 확인합니다. 개질체에 대한 TM 융합 국소화는 이제 배양 리터당 25-50밀리리터를 사용하여 귓용액에 개질체 펠릿을 용해시킵니다.

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

심사 양적, 높은 처리량의 표현과 소규모 대장균 문화의 융합 단백질의 분석 정화하기위한 프로토콜을 설명하고 이황화 풍부한 동물 독의 표적 단백질의 발현에 적용됩니다.

에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화<em&gt; E. 대장균</em

방법은 (연쇄상 구균 - Tactin) 수지가 공유 비스 (술포 숙신 이미 딜) 수베 (BS3)와 가교 수정 스트렙 타비 딘에 트윈 패 혈성 태그가 융합 단백질 및 특정 단지의 효율적인 정제에 설명되어 있습니다. 방법은 빠른 속도, 좋은 표적 단백질의 회수 및 고순도의 이점을 갖고, 질량 분석법에 의한 후속 분석과 호환된다.

한 단계 연쇄상-Tactin 수지 비스 (술포 숙신 이미 딜)로 가교 수베 (BS3)에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질과 그들의 단지의 정화

특이성이 높고 부작용이 적은 암 약물을 종양 부위에 전달하려면 나노 입자를 기반으로 하는 새로운 방법이 필요합니다. 여기에서는 과산화수소 매개 산화에 의해 쉽게 준비될 수 있고 종양이 감소하는 환경에서 효율적으로 해리되어 페이로드를 방출할 수 있는 이황화 가교 미셀에 대해 설명합니다.

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이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

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Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1)은 인간 병원균 Clostridium difficile에서 분비되는 metalloprotease 및 유망한 약물 표적입니다. 여기에서는 이 단백질의 생산 및 구조 결정에 필요한 모든 방법을 설명합니다.

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다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

선물이 thioether/비닐의 건설에 대 한 프로토콜 황화 닿는 헬리컬 펩 티 드 사진 유도 thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation를 사용 하 여.

헬리컬 펩 티 드를 통해 사진 유도 Thiol-ene 또는 yne Hydrothiolation Thioether/비닐 황 화물-곁에 건설

여기, 선물이 붙일 functionalize dibromomaleimide와 Qβ VLP에 disulfides에 절차. 우리는 Qβ 식 및 정화, dibromomaleimide 기능성된 분자의 합성 및 dibromomaleimide와 Qβ 사이 활용 반응 설명합니다. 결과 노란색 형광 활용된 입자 셀 안에 형광 프로브로 사용할 수 있습니다.

Dibromomaleimide-아 황산 화학에 의해 형광 PEGylated 바이러스 같은 입자 활용 유도 만들기

1, 2-dithiolane의 합성에 대 한 프로토콜 펩 티 드와 펩 티 드에서 자기 조립 결과 supramolecular 구조의 특성 수정.

합성 및 특성 1, 2-Dithiolane의 수정 자가 조립 펩 티 드

시스테인 부유한 펩 티 드 그들의 이황화 연결에 따라 고유한 3 차원 구조로 접어. 개별 이황화가 성체의 타겟된 합성 필요한 때 버퍼 산화 원하는 이황화 연결 리드 하지 않습니다. 프로토콜 선택 합성 펩 티 드 3 이황화 결합 그리고 NMR 및 MS/MS를 사용 하 여 그들의 구조 분석을 다루고 있다.

합성 및 다른 아 황산 연결 된 μ-Conotoxin PIIIA이 성체의 구조 결정

이황화 물 결합은 오랫동안 많은 단백질의 구조를 안정화 시키는 것으로 알려져 왔다. 이러한 고리에 의해 안정화 된 다중 이성질체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석을 통해 서 이다. 여기서,이 방법은 인간 뼈 골 육 종 세포의 dUTPase OS 로부터 핵이 소 형태를 분석 하 여 예시 된다.

비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 화학적 가교 결합으로 포유류 세포에서 이황화 물 조합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 배양에 검출

학습하세요 막단백질 구조 연구를 위한 이황화 교차결합 펩타이드 복합체 생산 및 정제 방법을. 니켈 친화성 크로마토그래피와 역상 HPLC를 활용하여 고품질 샘플을 얻을 수 있습니다.

구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지

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