Name: 의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨 Drosophila melanogaster (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster 배아 중추 신경계의 단일 뉴런 라벨링 기법을 통해 신경 형태학을 분석하는 방법을. 이 기술은 형광 현미경을 활용하여 유전자 발현 패턴 맥락에서 개별 뉴런을 시각화합니다.

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<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+growth+cone+to+synapse%3A+the+life+history+of+the+RP3+motor+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Suppl%22%5BJournal%5D)">From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron.</a> Dev. Suppl. , 227-238 (1993).</li>
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<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Preparing+Drosophila+Embryos+for+Electrophysiological+Recording+and+Other+Procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures.</a> J. Vis. Exp. (27), e1347(2009).</li>
<li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila%3A+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67, 45-57 (1991).</li>
<li>Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+Drosophila+mushroom+body+neuroblasts+and+generation+of+divergent+embryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages.</a> Development. 139, 2510-2522 (2012).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).</li>
<li>Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+II+can+function+as+a+selective+inhibitor+of+specific+synaptic+arborizations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations.</a> Cell. 81, 631-639 (1995).</li>
<li>Murray, M. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+roundabout+on+growth+cone+dynamics%2C+filopodial+length%2C+and+growth+cone+morphology+at+the+midline+and+throughout+the+neuropile%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile.</a> Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).</li>
<li>Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+axon+pathfinding+in+the+Drosophilia+CNS%3A+a+time-lapse+study+of+an+identified+motorneuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron.</a> J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).</li>
<li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li>
<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li>
<li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+grasshopper+to+Drosophila%3A+a+common+plan+for+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development.</a> Nature. 310, 203-207 (1984).</li>
<li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect%2C+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li>
<li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation%2C+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede%2C+Ethmostigmus+rubripes+%28Brandt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li>
<li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo%3A+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li>
<li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods%3A+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li>
<li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li>
</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

모델 시스템으로 Drosophila 중 하나 큰 장점은 단일 세포 수준의 개발과 기능의 분석을 허용한다는 것입니다. 이 세포 유형의 다양성이 매우 높은이며, 이웃 세포의 기능과 형태가 완전히 다를 수 신경계에 관한 특히 유용합니다. 우리가 여기서 제시하는 방법 중 하나 영구적 인 얼룩이나 형광 현미경에 의해 직접 검사로 변환 할 수있는 염료 개별 뉴런의 라벨 수 있습니다. 은 훌륭한 상세 신경 프로세스 (그림 4)의 형태를 보여준다. . 배아 뇌를, Kunz 동부 표준시를 참조하십시오, 방법의 주요 장점 중 하나는 (배아 복부 신경 코드에 대해 Rickert 외를 볼 2011 년이 조사 할 CNS의 뉴런의 거의 모든 유형의 형태와 수 있다는 것입니다 알., 2012). 또한,의 복잡한 조합을 필요로하지 않습니다유전 요소가 어떻게 유전자 분류 기술의 여러 바와 같이, ...

개별 셀의 수준에서 neuronal 형태의 지식은 neuronal 연결 및 CNS 기능을 이해하는 중요한 전제 조건이다. 따라서, 신경 과학의 초기에서, 연구자는 단일 셀 라벨 기술 (이 문제의 역사적인 치료 7 참조) 개발을 모색하고있다. 이러한 Golgi의 착색 등의 고전 방법은 neuronal 형태의 우수한 해상도를 제공하지만, 하나는 착색이 임의의 방식으로 발생 등의 이동 방법으로 신경 세포의 특정 유형의 라벨을 추구하는 경우 적합하지 않습니다. microelectrode에서 염료의 세포 또는 juxtacellular 주입하여 단일 세포를 얼룩위한 방법의 개발은 특정 상표의 요구 사항을 해결. Drosophila에 하나의 뉴런 염료 주입의 응용 프로그램 때문에 유기체와 뉴런 모두의 작은 크기, 큰 도전을 제시. 배아 Drosophila의 그럼에도 불구하고, 단일 신경 세포의 착색 </em&gt; 뉴런은 코리 굿맨 (15)의 연구실에서 1980 년대 중반에 달성되었다. 방법은 eminently 유용하고 지난 20~30년 (예 : 2, 10) 이상 Drosophila의 neuronal 개발을위한 메커니즘으로 몇 가지 주요 통찰력을 제공하고 있지만, 많은 근로자는 주로 때문에 기술적 요구의 그것과 떨어져 shied했습니다. Drosophila의 neuronal 라벨에 유전자 기술의 최근 몇 년 동안 사용 가능 여부는 하나의 신경 세포의 색소 주입의 unpopularity에 공헌하고 있습니다. 막 타겟 GFP 구조의 GAL4-지시 표현은 신경 형태 1, 20 뛰어난 해상도를 제공 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 특정 제한이 있습니다 : 여러 셀에 GFP의 자주 불가피한 표현은 개별 뉴런의 구조를 가리 수 있으며 GAL4 드라이버 라인은 관심의 특정 신경 세포에 표현을 유도 할 수되지 않을 수 있습니다. MARCM (담당자와 모자이크 분석ressible 세포 마커) 방법 8은 개별 세포 수준에서 본질적으로 어떤 신경 세포의 라벨 있지만, 성공적으로 인해 GAL80 단백질의 느린 매출의 배아와 초기 유충에 사용할 수 없습니다를 제공 할 수 있습니다. 유전자 라벨 이러한 제한을 감안할 때, 우리는 Drosophila의 배아에서 해당 단일 신경 세포의 색소 주입이 귀중한 기술을 유지하고 폭 넓은 응용을받을 권리가 생각합니다. 이러한 목표를 촉진하기 위해, 우리는 여기 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 힘의 그림은 후반 Drosophila의 배아 (14)의 복부 neuromeres의 interneurons의 전체 세트의 형태와 우리의 최근 계정에 의해 제공됩니다. 개인 neuronal 세포 유형의 형태학의 다양성과 배의 CNS에서 neuromere 조직의 원리를 모두 공개이 연구는 다른 현재 분류​​ 방법으로 불가능했을 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> DAB </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 100 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4에 2-3 MG / ML </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen / 분자 프로브 </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 에탄올 1 MG / ML </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">포름 알데히드</a> </td><td> 머크 Millipore </td><td></td><td> PBS에서 7,4 % </td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> 글리세린 </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">로스</a> </td><td> 3783 </td><td> PBS의 70% </td></tr><tr><td> 헵탄 접착제 </td><td> 바이어스 도르프 AG </td><td> 첼로 31-39-30 * </td><td> CA를 희석. N-헵탄과 1-1 </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1X </td></tr><tr><td> 트리스 </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">로스</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> 벡터 연구소 </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 공 촛점 현미경 </td><td> Leica </td><td> TCS SP2 </td><td> 형광에 labelings을 확인하고 문서화하는 </td></tr><tr><td> DC -mplifier </td><td> Dragan 공사 </td><td> 초석 ION-100 </td><td> labelings를 수행하는 방법 </td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 X 18mm </td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 X 60mm </td></tr><tr><td> 현미경을 해부 </td><td> Leica </td><td> MZ8 </td><td> 배아를 준비하고 disect하기 </td></tr><tr><td> 플랫 모세 혈관 </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> 외경 1mm, glas 두께 0.1 mm </td></tr><tr><td> 사출 모세 혈관 </td><td> 과학 제품 </td><td> 기가바이트 100 TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator의 R </td><td> Leica </td><td></td><td> labelings를 수행하는 방법 </td></tr><tr><td> 모델 P-97 </td><td> 셔터 악기 </td><td></td><td> 모세 혈관을 해낼 수 있다는 것을 </td></tr><tr><td> 개체 슬라이드 </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld 수 페리 어</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> 과학 현미경 </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop이 운수성 </td><td> photoconversion 후 labelings를 볼 수 있습니다 </td></tr><tr><td> 과학 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> BX50 </td><td> labelings를 수행하는 방법 </td></tr><tr><td> 소니 MC3255 비디오 카메라 </td><td> 소니 / AVT 혼 </td><td> 소니 MC3255 </td><td> photoconversion 후 labelings를 기록하는 </td></tr></tbody></table> 표 1.

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; drosophila melanogaster</em

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

이 글에서 우리는 개별적으로 lipophilic 형광 막 마커 DiI의 juxtacellular 주입에 의한 Drosophila melanogaster의 배아 CNS의 뉴런에 레이블을하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 아주 자세히 neuronal 세포 형태의 시각화 할 수 있습니다. 그것은 CNS에있는 셀에 레이블을 할 수 있습니다 : 대상 뉴런의 세포 기관은 DIC 광학에서 또는 GFP 등의 형광 유전자 마커의 표현으로 시각화 수 있습니다. 라벨 후, DiI는 전송 빛과 DIC 광학으로 세포 형태의 시각화를 허용하도록 photoconversion하여 영구적 인 갈색 얼룩로 변환 할 수 있습니다. 또는 DiI - 라벨 세포는 유전자 도입 형광 기자 단백질이 colocalised 할 수 있도록, 공 촛점 현미경과 직접 관찰 할 수 있습니다. 기술은이 가능 단세포 해상도 돌연변이 phenotypes을 분석하고, 관계없이 유전자형의 모든 동물에서 사용할 수 있습니다.

그림 4는 기술의 전형적인 결과를 보여줍니다, 우리는 여기에 대해 설명합니다. 그림 4A 확실히 해두 고 photoconverted 된 DiI 가득 단일 interneuron의 예를 보여줍니다. 그것은 멋지게 세부의 양이 준비 제공을 보여줍니다. 비 라벨 주변 조직 내에있는 레이블 셀의 공간적 맥락이 표시되고 DIC 광학에서 볼 때, 피질 내의 neuropile 내의 섬유 투영의 전지 본체의 위치를 지정할 수있다. 그림 4B는 염료 드롭가 동시에 표시되고 여러 이웃 셀의 결과로 약간 너무 커서 경우가 있습니다. 이는 종종 어려운 고유 한 세포 기관에 개별 계획에 관련 할 수 있습니다. 또한 직접 형광 현미경으로 볼 때 (NO photoconversion) 배경 해상도가 훨씬 낮은 것을 보여줍니다. 그림 4...

우리는 중추 신경 시스템에 하나의 뉴런을 라벨에 대한 기술 (CNS)의 제시<em&gt; Drosophila</em&gt; 전송 빛 또는 공 촛점 현미경에 의해 neuronal 형태의 분석을 허용 배아.

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

이 절차의 전반적인 목표는 초기 17단계 초파리 배아의 중추 신경계에 있는 단일 뉴런에 라벨을 붙이는 것입니다. 이것은 알을 모아 올바른 단계로 발달하도록 함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 계란을 수동으로 염소 처리하고 정렬하는 것입니다.이 디바에 이어, 배아의 집락화와 파일링은 신경삭에 접근할 수 있게 합니다. 마지막 단계는 친유성 다이 다이 eye의 Iono retic 도포에 의해 단일 세포를 라벨링하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 알려진 GFP 발현 패턴의 맥락 및/또는 돌연변이 배경에서 원하는 경우 단일 뉴런 형태학의 시각화를 허용합니다.markum과 같은 기존 단일 세포 표지 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 배아에서 작동하고 식별된 세포를 의도적으로 시각화할 수 있다는 것입니다. 이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 많은 단계가 섬세하여 배우기 어렵기 때문에 매우 유용합니다. 건강한 파리가 한천 판에 배아를 낳을 수 있도록 합니다.섭씨 25도에서 1시간 30분마다 플레이트를 교체하고 배아를 보관합니다. 배아가 필요한 발달 단계에 도달할 때까지 섭씨 25도 또는 18도의 플레이트에서 배아를 배양합니다. 준비가 되면 배아를 양면 접착 테이프로 덮인 슬라이드로 옮깁니다.배아와 함께 한천을 옮기는 것은 테이프에 대한 접착을 방해하므로 피하십시오. 테이프에. 기다리는 동안 배아를 5분에서 10분 동안 건조시킵니다.24mm x 60mm 커버 슬립에 헵탄 접착제를 코팅합니다. 슬라이드 중앙에 작은 접착제 한 방울을 놓고 18mm 정사각형 커버 슬립을 사용하여 매우 얇은 필름으로 펴 바릅니다. 배아가 마르면 바늘로 부드럽게 만집니다.코리온이 쪼개지고 배아가 바늘에 달라붙습니다. 즉시 탈염소 처리된 배아를 한천 블록으로 옮겨 건조를 방지합니다. 복부 쪽이 위로 향하게 하여 10개 연속으로 정렬합니다.메스로 블록에서 여분의 한천을 잘라냅니다. 그런 다음 헵탄 접착제로 코팅된 커버 슬립으로 배아를 부드럽게 만집니다. 그들은 복부 쪽이 아래로 향하게 하여 커버 슬립에 부착해야 합니다.커버 슬립 주위에 접착 테이프 프레임을 바르고 현미경 슬라이드에 부착합니다. 배아를 덮개 슬립 위에 보관하십시오. 각 배아의 뒤쪽 끝 근처에 있는 등쪽에 충분한 양의 PBS로 배아를 덮습니다.유리 바늘로 유리막을 관통하고 등쪽 정중선을 따라 막을 찢고 배아를 막 밖으로 끌어냅니다. 이제 배아 복부 쪽을 헵탄 접착제 기질의 다른 곳에서 아래로 향하게 합니다. 유리 바늘로 체벽을 부드럽게 천공하고 등쪽 정중선을 따라 찢어 배아를 정리합니다.바늘을 사용하여 본체 벽을 아래로 눌러 슬라이드에 달라붙도록 합니다. 장의 앞쪽과 뒤쪽 끝에서 장을 찢고 장을 들어 올립니다. 여러 배아가 동일한 슬라이드에 정리되기 때문에 배아의 방향을 매우 정확하게 파악하거나 배아의 방향을 그림으로 그리는 것이 도움이 됩니다.다음으로, 배아를 PBS의 7.4%포름알데히드에 10-15분 동안 가볍게 고정한 다음 PBS에서 4회 세척하고 배아가 용액 표면에 닿지 않도록 각별히 주의합니다. 표면 장력은 10 x 목표 아래에서 그들을 파괴할 것입니다. 준비된 배아의 시야를 중앙에 배치하고, 배율을 높이고, DIC 광학 장치 또는 형광 아래에서 관심 세포를 찾습니다.타겟 셀이 GFP를 발현하는 경우, 현미경의 자기장 다이어프램이 좁은 조명 너머가 아니라 시야의 가장자리까지 열리는지 확인하십시오. 빔은 마이크로 파이펫의 위치를 정하는 데 도움이 되며, 10 x 대물렌즈로 다시 변경되고 DC 증폭기의 수조 전극을 배아 및 마이크로 파이펫의 경로에서 멀리 떨어진 용액에 배치합니다. 염화리튬 용액으로 채워진 주입 마이크로 피펫을 홀더에 장착하고 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다.코스 컨트롤을 사용하여 마이크로파이펫을 대물렌즈 아래, 배아 위에 배치합니다. 마이크로 페페의 각도가 너무 가파르면 팁에 초점이 맞지 않습니다. 너무 얕으면 샤프트가 수조 벽에 부딪혀 끝이 시야의 중앙에 닿습니다.이제 마이크로 피펫을 내리고 피펫이 PBS에 있고 배아보다 너무 높지 않을 때까지 번갈아 초점을 맞춥니다. 이제 고출력 대물렌즈로 변경하고 피펫을 시야 내 중앙에 배치합니다. 샤프트에 초점이 맞춰지면 팁이 시야의 중앙에 놓일 때까지 마이크로 파이펫을 X축으로 이동합니다.마이크로 피펫 팁은 배아 수준보다 훨씬 높아야 합니다. 형광 조명으로 전환하고 팁을 검사합니다. 염료 눈의 누출을 확인하십시오.염료 눈 결정이 팁에 형성되지 않도록 DC 전류를 조정하십시오. 이제 Z축의 마이크로 피펫을 배아 쪽으로 내립니다. 배아에 초점이 맞춰짐에 따라 점진적으로 초점을 조정합니다.미세 컨트롤을 사용하도록 전환합니다. 주입할 세포를 필드 중앙에 집중시킨 다음 마이크로 피펫 팁에 다시 초점을 맞춥니다. 이 시점부터는 현미경의 스테이지 컨트롤을 사용하여 마이크로 파이펫을 기준으로 배아를 이동하는 것이 더 편리할 수 있습니다.마이크로 피펫 팁을 세포와 접촉시키고 표면에 움푹 들어간 곳을 만듭니다. 몇 초 동안 몇 나노 암페어의 탈분극 전류를 통과시킵니다. 세포에 염료 눈의 작은 결정이 형성되어 세포가 라벨링되었는지 확인합니다.셔터를 짧게 열어 형광등으로 필드를 비춥니다. 세포의 몸체에 라벨링의 징후가 보이면 몇 초 동안 전류를 적용하십시오. 그런 다음 전류를 끄고 스테이지 컨트롤을 사용하여 마이크로 피펫에서 배아를 빠르게 당겨 빼냅니다.D eye 라벨링이 분명하지 않은 경우 마이크로 파이펫이 차단되었을 수 있으며 교체가 필요했을 수 있습니다. 피펫 끝이 세포 뿌리에 있는 다른 조직을 걸고 해당 조직을 더럽히면 마이크로 피펫을 약간 빼내고 세포에 다시 접근한 후 필요에 따라 마이크로 피펫을 교체합니다. 동일한 배아 또는 동일한 슬라이드의 다른 배아에 있는 다른 세포에 계속 라벨을 붙입니다.팁을 시야의 가장자리로 이동하고 절차를 반복합니다. 주입 챔버에서 대부분의 용액을 제거하십시오. 그런 다음 7.4%포름알데히드 PBS를 10분 동안 첨가한 다음 PBS로 4회 세척하여 배아를 고정합니다.이제 준비물은 설명된 프로토콜을 사용하여 컨포칼 현미경 검사를 위해 사진을 변환하거나 장착할 수 있습니다. 다이로 채워진 인터 뉴런은 DIC 광학 하에서 완벽하게 사진 변환되었습니다. 표지되지 않은 주변 조직 내에서 표지된 세포의 공간적 맥락은 잘 해결되었습니다.예를 들어, 피질 내 세포체의 위치와 신경 알약 내 섬유 돌기의 위치는 모두 이 제제에서 볼 수 있습니다. 염료 방울이 너무 컸습니다. 여러 개의 인접 세포가 동시에 표지되어 개별 돌기를 별개의 세포체와 관련시키기가 어렵습니다.또한 형광 현미경 아래에서는 사진 변환 없이는 배경 해상도가 훨씬 낮다는 점에 유의하십시오. 이웃 세그먼트에 있는 다수 세포는 또한 이 준비, 신경 환약에 있는 fales의 빠른 2개의 얼룩에 대하여 항체에서 주사될 수 있다. 세포체가 투명함에도 불구하고 제제는 사진 변환 기간이 길어질 수 있는 부작용을 보여줍니다.더 강하게 표지된 세포는 컨포칼 광학으로 단일 세포를 표지하는 것과 비교하여 과도하게 염색되고 팽창하기 시작하는 경향이 있습니다. GFP 리포터 구조를 운반하는 배아에서 염료 눈 라벨링은 GFP 양성 신경 세포 또는 신경교세포 유형의 특정 집단 내에서 D로 채워진 세포의 공간적 맥락과 정체성을 제공할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 oph 후 배아 CNS에서 단일 뉴런의 라벨링을 준비하고 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.그러나 이 절차를 시도하는 동안 모든 단일 단계가 까다롭기 때문에 전체 절차가 원활하게 실행될 때까지 몇 번의 반복을 예상하십시오.

labeling-single-cells-central-nervous-system-drosophila

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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이 비디오는 신경교세포의 단세포 이미징을 위한 형질전환 초파리 뇌의 면역형광 염색을 보여줍니다. 뇌는 신경교세포 특이적 재조합효소 시스템의 제어 하에 항원 항원결정기의 다양한 조합과 융합된 막 표적 단백질을 발현합니다. 분리되고 고정된 뇌는 항원 항원결정기에 특이적인 1차 항체로 염색된 후 형광단 접합 2차 항체로 염색됩니다. 이 라벨링을 통해 다양한 뇌 영역에 걸쳐 서로 다른 신경교세포 하위 집단을 동시에 이미징할 수 있습니다.

신경교세포의 단세포 이미징을 위한 초파리 뇌의 면역형광 염색

출처: Inal, M. A. et. al., Retrograde tracing of Drosophila Embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes(유성필 형광 염료를 사용한 {{}}초파리{{}} 배아 운동 뉴런의 역행 추적. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 친유성 염료를 사용하여 Drosophila 운동 뉴런의 역행 표지 방법을 보여줍니다. 염료는 축삭돌기로 들어가 역행적으로 이동하고 뉴런을 녹색으로 표시하여 컨포칼 현미경 하에서 뉴런의 형태와 투영을 자세히 시각화할 수 있습니다.

Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes (형광 친유성 염료를 사용한 초파리 운동 뉴런의 역행 라벨링)

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

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의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨

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