의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨 Drosophila melanogaster

이 절차의 전반적인 목표는 초기 17단계 초파리 배아의 중추 신경계에 있는 단일 뉴런에 라벨을 붙이는 것입니다. 이것은 알을 모아 올바른 단계로 발달하도록 함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 계란을 수동으로 염소 처리하고 정렬하는 것입니다.

이 디바에 이어, 배아의 집락화와 파일링은 신경삭에 접근할 수 있게 합니다. 마지막 단계는 친유성 다이 다이 eye의 Iono retic 도포에 의해 단일 세포를 라벨링하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 알려진 GFP 발현 패턴의 맥락 및/또는 돌연변이 배경에서 원하는 경우 단일 뉴런 형태학의 시각화를 허용합니다.

markum과 같은 기존 단일 세포 표지 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 배아에서 작동하고 식별된 세포를 의도적으로 시각화할 수 있다는 것입니다. 이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 많은 단계가 섬세하여 배우기 어렵기 때문에 매우 유용합니다. 건강한 파리가 한천 판에 배아를 낳을 수 있도록 합니다.

섭씨 25도에서 1시간 30분마다 플레이트를 교체하고 배아를 보관합니다. 배아가 필요한 발달 단계에 도달할 때까지 섭씨 25도 또는 18도의 플레이트에서 배아를 배양합니다. 준비가 되면 배아를 양면 접착 테이프로 덮인 슬라이드로 옮깁니다.

배아와 함께 한천을 옮기는 것은 테이프에 대한 접착을 방해하므로 피하십시오. 테이프에. 기다리는 동안 배아를 5분에서 10분 동안 건조시킵니다.

24mm x 60mm 커버 슬립에 헵탄 접착제를 코팅합니다. 슬라이드 중앙에 작은 접착제 한 방울을 놓고 18mm 정사각형 커버 슬립을 사용하여 매우 얇은 필름으로 펴 바릅니다. 배아가 마르면 바늘로 부드럽게 만집니다.

코리온이 쪼개지고 배아가 바늘에 달라붙습니다. 즉시 탈염소 처리된 배아를 한천 블록으로 옮겨 건조를 방지합니다. 복부 쪽이 위로 향하게 하여 10개 연속으로 정렬합니다.

메스로 블록에서 여분의 한천을 잘라냅니다. 그런 다음 헵탄 접착제로 코팅된 커버 슬립으로 배아를 부드럽게 만집니다. 그들은 복부 쪽이 아래로 향하게 하여 커버 슬립에 부착해야 합니다.

커버 슬립 주위에 접착 테이프 프레임을 바르고 현미경 슬라이드에 부착합니다. 배아를 덮개 슬립 위에 보관하십시오. 각 배아의 뒤쪽 끝 근처에 있는 등쪽에 충분한 양의 PBS로 배아를 덮습니다.

유리 바늘로 유리막을 관통하고 등쪽 정중선을 따라 막을 찢고 배아를 막 밖으로 끌어냅니다. 이제 배아 복부 쪽을 헵탄 접착제 기질의 다른 곳에서 아래로 향하게 합니다. 유리 바늘로 체벽을 부드럽게 천공하고 등쪽 정중선을 따라 찢어 배아를 정리합니다.

바늘을 사용하여 본체 벽을 아래로 눌러 슬라이드에 달라붙도록 합니다. 장의 앞쪽과 뒤쪽 끝에서 장을 찢고 장을 들어 올립니다. 여러 배아가 동일한 슬라이드에 정리되기 때문에 배아의 방향을 매우 정확하게 파악하거나 배아의 방향을 그림으로 그리는 것이 도움이 됩니다.

다음으로, 배아를 PBS의 7.4%포름알데히드에 10-15분 동안 가볍게 고정한 다음 PBS에서 4회 세척하고 배아가 용액 표면에 닿지 않도록 각별히 주의합니다. 표면 장력은 10 x 목표 아래에서 그들을 파괴할 것입니다. 준비된 배아의 시야를 중앙에 배치하고, 배율을 높이고, DIC 광학 장치 또는 형광 아래에서 관심 세포를 찾습니다.

타겟 셀이 GFP를 발현하는 경우, 현미경의 자기장 다이어프램이 좁은 조명 너머가 아니라 시야의 가장자리까지 열리는지 확인하십시오. 빔은 마이크로 파이펫의 위치를 정하는 데 도움이 되며, 10 x 대물렌즈로 다시 변경되고 DC 증폭기의 수조 전극을 배아 및 마이크로 파이펫의 경로에서 멀리 떨어진 용액에 배치합니다. 염화리튬 용액으로 채워진 주입 마이크로 피펫을 홀더에 장착하고 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다.

코스 컨트롤을 사용하여 마이크로파이펫을 대물렌즈 아래, 배아 위에 배치합니다. 마이크로 페페의 각도가 너무 가파르면 팁에 초점이 맞지 않습니다. 너무 얕으면 샤프트가 수조 벽에 부딪혀 끝이 시야의 중앙에 닿습니다.

이제 마이크로 피펫을 내리고 피펫이 PBS에 있고 배아보다 너무 높지 않을 때까지 번갈아 초점을 맞춥니다. 이제 고출력 대물렌즈로 변경하고 피펫을 시야 내 중앙에 배치합니다. 샤프트에 초점이 맞춰지면 팁이 시야의 중앙에 놓일 때까지 마이크로 파이펫을 X축으로 이동합니다.

마이크로 피펫 팁은 배아 수준보다 훨씬 높아야 합니다. 형광 조명으로 전환하고 팁을 검사합니다. 염료 눈의 누출을 확인하십시오.

염료 눈 결정이 팁에 형성되지 않도록 DC 전류를 조정하십시오. 이제 Z축의 마이크로 피펫을 배아 쪽으로 내립니다. 배아에 초점이 맞춰짐에 따라 점진적으로 초점을 조정합니다.

미세 컨트롤을 사용하도록 전환합니다. 주입할 세포를 필드 중앙에 집중시킨 다음 마이크로 피펫 팁에 다시 초점을 맞춥니다. 이 시점부터는 현미경의 스테이지 컨트롤을 사용하여 마이크로 파이펫을 기준으로 배아를 이동하는 것이 더 편리할 수 있습니다.

마이크로 피펫 팁을 세포와 접촉시키고 표면에 움푹 들어간 곳을 만듭니다. 몇 초 동안 몇 나노 암페어의 탈분극 전류를 통과시킵니다. 세포에 염료 눈의 작은 결정이 형성되어 세포가 라벨링되었는지 확인합니다.

셔터를 짧게 열어 형광등으로 필드를 비춥니다. 세포의 몸체에 라벨링의 징후가 보이면 몇 초 동안 전류를 적용하십시오. 그런 다음 전류를 끄고 스테이지 컨트롤을 사용하여 마이크로 피펫에서 배아를 빠르게 당겨 빼냅니다.

D eye 라벨링이 분명하지 않은 경우 마이크로 파이펫이 차단되었을 수 있으며 교체가 필요했을 수 있습니다. 피펫 끝이 세포 뿌리에 있는 다른 조직을 걸고 해당 조직을 더럽히면 마이크로 피펫을 약간 빼내고 세포에 다시 접근한 후 필요에 따라 마이크로 피펫을 교체합니다. 동일한 배아 또는 동일한 슬라이드의 다른 배아에 있는 다른 세포에 계속 라벨을 붙입니다.

팁을 시야의 가장자리로 이동하고 절차를 반복합니다. 주입 챔버에서 대부분의 용액을 제거하십시오. 그런 다음 7.4%포름알데히드 PBS를 10분 동안 첨가한 다음 PBS로 4회 세척하여 배아를 고정합니다.

이제 준비물은 설명된 프로토콜을 사용하여 컨포칼 현미경 검사를 위해 사진을 변환하거나 장착할 수 있습니다. 다이로 채워진 인터 뉴런은 DIC 광학 하에서 완벽하게 사진 변환되었습니다. 표지되지 않은 주변 조직 내에서 표지된 세포의 공간적 맥락은 잘 해결되었습니다.

예를 들어, 피질 내 세포체의 위치와 신경 알약 내 섬유 돌기의 위치는 모두 이 제제에서 볼 수 있습니다. 염료 방울이 너무 컸습니다. 여러 개의 인접 세포가 동시에 표지되어 개별 돌기를 별개의 세포체와 관련시키기가 어렵습니다.

또한 형광 현미경 아래에서는 사진 변환 없이는 배경 해상도가 훨씬 낮다는 점에 유의하십시오. 이웃 세그먼트에 있는 다수 세포는 또한 이 준비, 신경 환약에 있는 fales의 빠른 2개의 얼룩에 대하여 항체에서 주사될 수 있다. 세포체가 투명함에도 불구하고 제제는 사진 변환 기간이 길어질 수 있는 부작용을 보여줍니다.

더 강하게 표지된 세포는 컨포칼 광학으로 단일 세포를 표지하는 것과 비교하여 과도하게 염색되고 팽창하기 시작하는 경향이 있습니다. GFP 리포터 구조를 운반하는 배아에서 염료 눈 라벨링은 GFP 양성 신경 세포 또는 신경교세포 유형의 특정 집단 내에서 D로 채워진 세포의 공간적 맥락과 정체성을 제공할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 oph 후 배아 CNS에서 단일 뉴런의 라벨링을 준비하고 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

그러나 이 절차를 시도하는 동안 모든 단일 단계가 까다롭기 때문에 전체 절차가 원활하게 실행될 때까지 몇 번의 반복을 예상하십시오.