Name: 사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브 초파리 배아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 학습하세요 사멸 세포 간극의 동역학을 Drosophila 배아에서 실시간 공초점 현미경으로 관찰하는 방법을. GFP 마커와 특이적 표지자를 활용한 이 기술은 조직 항상성 연구에 필수적인 탐식 작용 메커니즘을 밝히는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 마리 퀴리 재 통합 그랜트 (IRG249084)에 의해 지원되었다. 우리는 Kurant 실험실의 모든 구성원을 감사드립니다.

포식 세포 사멸 세포 : 세포의 두 집단을 표시해야합니다 생체 내에서 사멸 세포 간극의 역학을 따르십시오. 대식 세포, 아교 세포 및 외배엽 8 : 우리가 시뮬레이션 할 cytGFP의 배아에서 독점적 식세포 레이블을 마커를 포함하는 초파리 줄을 사용 탐식 세포 인구를 표시합니다. 하나는 혈구 특정 GAL4 드라이버 (CRQ-GAL4)를 포함하는 선 또는 glia의 특정 GAL4 드라이버 (REPO-GAL4)와 UAS 제어 (UAS - GFP)에 따라 유전자 인코딩 형광 리포터 등 식세포에 대해 서로 다른 마커를 사용할 수 있습니다. 사멸 세포 통관시 사멸 세포를 모니터링하려면 우리는 다른 세포 사멸 / 식균 작용 마커를 사용합니다. 아 넥신 V (분자 프로브) 10 사멸 세포에 대한 초기 마커 역할, Phiphilux (OncoImmunin)는 나중에 apopto로 사용되는 형광 카스파 제 3 기판이며,SIS 마커 및 LysoTracker (분자 프로브) phagosome에 마커로 작동합니다. 우리는 microinjection의 시스템 PicoPump PV 820를 사용하여 이러한 시약을 주입. 1. 준비 <ol><li> 헵탄 접착제 : 양면 테이프를 펴고 당신이 섬광 유리 병에 24 시간 동안 파라 필름과 유리 병, 그리고 바위를 밀봉 헵탄으로 채울 수만큼 넣어. 접착제가 너​​무 두꺼운 경우 헵탄 추가 할 수 있습니다. </li><li> 우리는 파리가 미리 예열 포도 주스 한천 플레이트 + 효모 2 시간 동안 풀에 누워 수 있도록하고 25 접시를 전송 ° C ~ 12 시간 (원하는 단계에 따라 달라집니다)에 대한 이전의 미세 주입 및 시간 경과 기록에 주입 배아의. 따라서 우리는 단계 15 개발 16에서 배아를 제공, 25 ° C로 유지 한천 플레이트에서 배아를 수집합니다. </li><li> 바늘 준비 : 주사 바늘을 준비하기 위해, 우리는 &#39;셔터 악기&#39;바늘 풀러 얇은 벽으로 둘러싸인 유리 필라멘트 (FHC 모세관 튜브)를 사용합니다. 풀링 된 모세관의 끝은 파산0.5-2 ㎛의 직경 N. </li><li> 접착제 coverslip을 : 피펫 팁을 사용하여 coverslip에 중간에 한 줄의 헵탄 접착제 한 방울을 분산. 그것은 몇 초 동안 건조하자. 이 coverslips는 몇 가지를 준비합니다. </li></ol> 2. 배아 준비 <ol><li> 한천 플레이트에서 배아를 수집하고 깨끗한 페인트 브러시와 흐르는 물을 사용하여 셀 스트레이너 (SPL 생명 과학)로 전송. 여과기는 폐수를 수집하는 비커에 개최됩니다. </li><li> 모든 효모 붙여 넣기가 제거 될 때까지 물을 사용하여 셀 스트레이너의 배아를 씻으십시오. </li><li> 킴 와이프를 사용하여 여과기의 외부를 닦아 과잉의 물을 말린다. </li><li> 깨끗한 페트리 접시의 셀 스트레이너를 놓고 셀 스트레이너의 배아를 커버하기에 충분한 50 %의 표백제를 추가합니다. 가끔 2 분 (2-3 회)을 교반 배아를 Dechorionate. </li><li> 배아 표백제 냄새 느슨한까지 광범위하게 물로 씻어. </li><li> 청소에 셀 스트레이너를 배치페트리는 최대 건조를 방지하기 위해 물을 배아를 접시 커버. </li><li> 배아 설정을 시작하기 전에, 두 바늘 (때로는 바늘이 막힌 할 수 있습니다)에 필요한 시약 1 μL를로드합니다. 그것은 바늘의 끝을 도달하는 액체 약 5 분 소요됩니다. </li><li> 포도 주스 한천의 사각형 조각을 잘라 현미경 슬라이드에 배치합니다. 페트리 접시에서 깨끗한 페인트 브러쉬를 사용하여 한천 조각에 dechorionated 배아를 전송합니다. </li><li> 형광 해부 현미경으로 제대로 선택 젖은 페인트 브러시를 사용하여 GFP 마커를 표현 배아를 개최하고 닫기를 다른 (그림 1A)의 행 하나 한천 조각의 가장자리에 각 배아를 놓습니다. 배아는 중추 신경계 (CNS)에 아교로 영상 식균 작용에 대한 자신의 복부 측면과 함께 배치해야합니다. </li><li> 한 행에 10 배아를 설정합니다. </li><li> 헵탄 접착제 스트립 (그림 1B, C와 중간에 코팅 coverslip에로 배아를 연결 </strong&gt;). </li><li> 약 5 분 (이 공간의 습도와 주입되는 양에 따라 다름)의 탈수 챔버에 coverslip을 배치합니다. </li><li> 최대 건조 후 더 탈수를 방지하기 위해 할로 카본 오일 700 (시그마)와 배아를 커버한다. </li><li> 위로 향하게 배아 현미경 슬라이드에 coverslip을 배치합니다. 당신은 coverslip에의 이동 방지하기 위해 슬라이드에 물 한 방울을 넣을 수 있습니다. 배아는 이제 주사에 대 한 준비입니다. 주입 위치는 배아의 중간 측면 사이드에 일반적으로있다. </li></ol> 3. 배아 주입 <ol><li> micromanipulator에 바늘을 연결합니다. </li><li> 바늘 끝이 시야에 커버 슬립의 가장자리를 넣고 같은 초점면에 바늘을 조정 중단합니다. 그것은 바늘 끝을 명중하고 중단 할 때까지 매우 신중하게 coverslip을 이동합니다. </li><li> 배아에 초점을 맞추고, 기름에 바늘을 배치하고 바늘에서 액체 방울을 확인하십시오. 그것은 바늘 끝이 된 것을 의미잘 부러. </li><li> 건드리지 않고 바늘 홀더 바늘로 배아를 이동하고 배아에 방울을 주입. 멀리 배아를 이동하고 모든 배아가 주입 될 때까지 다음 단계로 진행합니다. </li></ol> 4. 영상 40X 나 100X 목적으로 거꾸로 공 촛점 현미경에 우리는 이미지 배아를. 우리는 강한 GFP 발현과 주입 후 세포 사멸 세포의 좋은 표시를 보여줍니다 중간에있는 CNS와 잘 배치 배아를 찾습니다. 살아있는 배아의 시간 경과 기록을 위해 우리는 일반적으로 5, 6 공 촛점 조각 (두께 2 μm의 각)을 선택합니다. 그 후, 우리는 전체 세포를 관찰하기 위해 3 조각 (6 μm의 두께)의 투영을합니다. 우리는 안정적이며 쉽게 표백하지 사멸 세포에 대한 마커를 사용합니다. 우리는 60 초 간격으로 기록을 표백 GFP를 방지합니다. 어떤 경우에는 배아 롤링 시작할 수 있습니다비디오 녹화의 시간 동안. 그러므로, 우리는 중지하고 필요한 경우 다시 시작하기 위해 녹음에서 가끔보세요.

<ol><li>Kinchen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+to+die+for%3A+signaling+to+apoptotic+cell+removal+in+worm%2C+fly+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse.</a> Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+signaling%3A+you+can+touch%2C+but+you+can%27t+eat%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat.</a> Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+cells%3A+getting+rid+of+the+corpses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li>
<li>Henson, P. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+removal+in+development+and+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis.</a> Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).</li>
<li>Kurant, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+CNS+clear%3A+glial+phagocytic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila.</a> Glia. 59, 1304-1311 (2011).</li>
<li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133, 498-509 (2008).</li>
<li>Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-independent+cell+engulfment+mirrors+cell+death+pattern+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos.</a> Development. 130, 5779-5789 (2003).</li>
<li>van den Eijnde, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+exposure+of+phosphatidylserine+during+apoptosis+is+phylogenetically+conserved%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved.</a> Apoptosis. 3, 9-16 (1998).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

사멸 세포 간극은 매우 동적이며 세포 사멸의 중요한 마지막 단계입니다. 따라서 프로세스의 실시간 연구는 매우 중요합니다. 여기에 우리가 개발 Drosophila의 배아 집에서 사멸 세포 간극의 모니터링을 가능하게하는 프로토콜을 설명합니다. 사멸 세포 탐식이 절차에서는 세포의 두 집단은 특정 마커를 사용하여 표시해야합니다. 시뮬 cytGFP 기자가 같은 배아에서 동시에 식세포 대 식세포, 아교 및 외배엽 모니터링을 위해 적당하다, w의 hich은 가능한 같은 시간에 다른 포식 세포 인구를 따라 할 수 있습니다. 이 같은 속도, 특이성 및 분해 기능 등 프로세스의 특정 측면을 비교, 동시에 &#39;전문&#39;과 &#39;비 직업적인&#39;정리 공부를위한 큰 장점이다. 이 방법의 단점은 시뮬레이션 할 cytGFP 마커가 대 식세포에 매우 강력하게 표현 훨씬 약한 것입니다같은 영화에서 조정하는 까다로운 일이 될 수 교세포. 그러나 한 특정 Gal4s (대 식세포와 ...

세포 사멸 및 후속 식균 작용을 통해 원치 않는 또는 비정상적인 세포의 적절한 제거는 배아 발달뿐만 아니라 성인에서 조직의 항상성을 위해 중요합니다. 사멸 세포 또는 사멸 세포 간극의 식균 작용은 네 단계로 진행 매우 역동적 인 과정이다 : 사멸 세포에 대한 식세포 (1) 모집 ( &#39;찾기 - 나&#39;), 식균 작용의 대상으로 셀 (2) 인식 ( &#39;- 저를 먹고&#39;)와 (3) engulfment, 세포 사멸 입자 1-5 (4) phagosome에 성숙과 분해에 의해 따랐다. &#39;전문&#39;대식 세포와 미성숙 수지상 세포, 그리고 &#39;비 직업적인&#39;조직 상주 이웃 세포 ​​후생 개발 6,7시 사멸 세포 통관을 위해 매우 중요하다 할 : 식세포의 두 가지 유형이 있습니다. 초파리 개발, 세포 사멸을 통해 불필요한 세포의 제거는 삼m에서 발생늦게 배아 중반 처음으로, 그 중간 번데기, 그리고 다시 성인 초기의 아인 단계. 배아 동안 세포 사멸 입자는 &#39;전문&#39;식세포, 대 식세포, 그리고 &#39;비 직업적인&#39;외배엽과 glia의 8,9에 의해 제거된다. 우리의 이전 연구에서 우리는 배아 동안 포식 세포에서 독점적으로 표현되는 식세포 수용체의 6 미크론 언더을 (SIMU) 발견했습니다. 모사 프로모터를 사용하여 우리는 우리가 살아있는 배아 8에서 동시에 대 식세포, 외배엽과 아교를 모니터링 할 수 탐식 세포 집단 (시뮬레이션 할 cytGFP)에 대한 특정 마커를 생성합니다. 또한, 세포 사멸의 여러 단계에서 사멸 세포에 대한 특정 마커를 사용하여, 우리는 생체 내에서 사멸 세포 간극의 역학을 따라 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Annexin V </td><td>Molecular Probes</td><td>A35108</td><td></td></tr><tr><td>PhiPhiLux G2D2</td><td>OncoImmunin</td><td>A304R2G-5</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker</td><td>Molecular Probes</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">< 강력 > 재질 < / 강력 ></td></tr> <tr><td>모세관 튜빙</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너</td><td>SPL</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>페인트 브러시</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

세포 사멸 및 후속 식균 작용을 통해 원치 않는 또는 비정상적인 세포의 적절한 제거는 (사멸 세포 간극) 모든 후생 생물의 정상적인 발달을 위해 중요합니다. 사멸 세포 간극은 밀접하게 세포의 죽음과 관련된 매우 역동적 인 과정이다 unengulfed 사멸 세포는 거의 정상적인 조건 하에서 생체 내에서 볼 수 있습니다. 사멸 세포 간극의 여러 단계를 이해하고 &#39;전문&#39;식세포와 비교하기 위해 -에 대 식세포와 수지상 세포를 &#39;비 전문&#39;- 조직 상주 이웃 세포 ​​프로세스의 생체 라이브 이미징은 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 라이브 Drosophila의 배아에서 세포 사멸 세포 간극 공부를위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 사멸 세포와 대 식세포에 대한 특정 마커를 사용 식균 작용에서 여러 단계의 역학을 따르십시오. 또한, 우리는 병렬로 두 개의 식세포 시스템을 모니터링 할 수 있습니다 : &#39;전문&#39;대 식세포와 &#39;반 profe개발 중추 신경계 ssional &#39;아교 (CNS). 여기에 설명 된 방법은 사멸 세포 간극의 실시간 연구를위한 훌륭한 모델로 Drosophila의 배아를 사용합니다.

사멸 세포 넥신 V로 표시되며, 아교, 외배엽 및 대 식세포를 시뮬레이션 할 cytGFP으로 표시되는 동영상에서 대표 프레임은 그림 2에 표시됩니다. 각 프레임은 3 조각 2 μm의 각의 투영이다. 단계 15 배아가 제대로 잘 표시 아교 (G)와 함께 중간에 배아 CNS를 보여주는 배치됩니다. CNS 밖에 대부분이다 식세포 (남성), 강한 세포질 GFP 발현을 보여줍니다. 외배엽 세포는 세포질 GFP (E)로 ​​표시되어 있습니다. 많은 넥신 V 양성 세포는 중추 신경계 내부와 외부에서 볼 수 있습니다. engulfment 이벤트를 따라하는 것은 쉬운 일이 아닙니다. 우리는 아교 세포 사멸 입자를 침몰되는 흰색 사각형 하나의 이벤트를 강조했다. 아교 세포의 프로빙 문제 참고 :이 침몰하지 않고 세포 사멸 입자를 몇 번 터치하고 다음 넥신 V의 engulfment과 결말은 사멸 세포 (그림 2 표시 <...

여기에서 우리는 사멸 세포 간극의 역학을 공부하는 효과적인 방법을 설명<em&gt; 생체 내</em&gt;. 이 방법은 살고 채용<em&gt; 초파리</em&gt; 사멸 세포와 대 식세포의 특정 레이블을 사용하여 세포 사멸 세포의 감시 식균 작용을위한 강력한 모델로 배아.

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 초파리 배아에서 세포 사멸(apoptotic cell) 제거의 역학을 추적하는 것입니다. 이는 세포질 GFP 마커를 포함하여 식세포 집단을 표지하는 형질전환 초파리를 통해 수행됩니다. Simio GFP 마커가 있는 배아를 수집하고 세척한 후 코팅합니다. 그다음, 배아를 주입하기 적절한 위치에 고정하고 중추신경계(CNS)를 모니터링합니다.세 번째 단계는 X in five와 같은 특정 세포사멸 포식 마커를 배아에 주입하여 세포사멸 세포를 표지하는 것이며, 마지막 단계는 공초점 현미경을 사용하여 배아의 중추신경계(CNS)를 타임랩스로 기록하는 것입니다. 궁극적으로, 형광 공초점 현미경을 통해 세포사멸 세포 제거의 서로 다른 단계 동안 세포사멸 세포와 포식세포의 위치 및 행동을 보여줄 수 있습니다. 고정된 배아를 이용한 면역조직화학법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 세포사멸 세포 제거의 역동성을 추적할 수 있다는 점입니다.세포 사멸 세포의 제거는 다양한 단계를 포함하는 매우 역동적인 과정입니다. 이 기술을 통해 세포 사멸 세포와 식세포에 대한 특이적 마커를 사용하여 각 단계를 추적할 수 있습니다. 프로토콜은 일반 시약을 이용해 접착제를 만드는 것으로 시작하며, 양면테이프를 풀었다가 다시 말아서 신틸레이션 바이알에 맞게 넣습니다.바이알에 헵탄을 채우고 파라필름으로 밀봉합니다. 그다음 바이알을 너트 테이터(nut tater)에 부착하고 24시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 다음 날 실온에서 준비된 접착제를 새 바이알로 옮깁니다.유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 준비된 접착제를 새 바이알로 옮깁니다. 준비가 되면, 피펫 팁을 사용하여 커버슬립에 접착제를 도포합니다. 헵탄 접착제 한 방울을 커버슬립 중앙에 선 모양으로 분산시킵니다.접착제가 몇 초 동안 마르도록 둡니다. 커버 슬립은 이산화탄소로 파리들을 마취시킨 후 밀폐된 상자에 담아 실온에서 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다. 25 °C에서 2시간 동안 보관한 따뜻한 포도즙 산란 플레이트를 수집 용기에 넣어 파리 약 400마리를 모읍니다. 포도즙 산란 플레이트를 수거하고, 파리들의 상태를 유지하기 위해 용기를 새 플레이트로 덮어줍니다.수집된 플레이트에는 0~2시간 된 배아가 들어 있습니다. 배아가 포함된 포도 주스 산란 플레이트를 25 °C 인큐베이터로 옮겨 원하는 발달 시점에 도달할 때까지 배양합니다. 본 예시에서는 배아를 10~12시간 동안 배양하여, 발달 후 stage 15 또는 16 단계에 도달하도록 합니다.수돗물과 깨끗한 붓을 사용하여 배아를 플레이트에서 셀 스트레이너(cell strainer)로 옮깁니다. 스트레이너 아래에 용기를 두어 쏟아진 배아를 회수할 수 있도록 합니다. 수집된 배아를 헹구어 효모 페이스트를 완전히 제거합니다.그런 다음 스트레이너 외부를 닦아 과도한 수분을 제거합니다. 코리온을 충분히 제거하기 위해 셀 스트레이너를 깨끗한 페트리 접시에 놓습니다. 셀 스트레이너 내의 배아가 잠길 정도로 50% bleach를 넣고, 2~3회 저어주며 2분 동안 기다립니다.다음으로, 배아에서 표백제 냄새가 나지 않을 때까지 헹굽니다. 배아가 들어 있는 세포 컨테이너를 깨끗한 Petri dish에 넣고, 배아가 마르지 않도록 물로 덮어줍니다. 배아 주입을 위해 준비합니다.니들 풀러(needle puller)와 박벽 유리 필라멘트를 사용하여 주입용 니들을 미리 준비하십시오. 원하는 시약을 두 개의 니들에 1 µL씩 로드하며, 그중 하나는 예비용으로 사용합니다. X in five와 같이 쉽게 탈색되지 않는 안정적인 마커가 시약으로 적합합니다.이제 직사각형 모양의 포도 주스 한천(agar) 조각을 현미경 위에 놓습니다. 거름망에 있는 배아들을 슬라이드하여 한천 위로 옮깁니다. 형광 해부 현미경 하에서 깨끗한 페인트 붓을 사용하여, GFP 마커를 통해 주입에 적합한 단계의 배아를 선택합니다.젖은 붓을 사용하여 선택한 배아들을 복측이 위를 향하도록 10개씩 한 줄로 옮깁니다. 이 줄을 agro 블록의 가장자리에 배치합니다. 배아의 중추신경계에서 GFP를 관찰할 수 있습니다.이제 헵탄 접착제 스트립을 사용하여 배아를 커버슬립에 부착하십시오. 주입의 성공을 위해서는 배아의 올바른 위치 선정이 매우 중요합니다. 충분한 시간을 들여 배아가 적절한 방향으로 정밀하게 배열되었는지 확인하십시오.다음으로, 커버슬립을 탈수 챔버에 약 5분 동안 둡니다. 배아를 건조시킨 후, 추가적인 탈수를 방지하기 위해 Hello carbon oil 700으로 덮어줍니다. 마지막으로, 현미경 슬라이드 위에 물 한 방울을 떨어뜨립니다.그런 다음 배아가 위로 향하게 하여 커버 슬립을 젖은 현미경 슬라이드 위에 올립니다. 이제 배아에 주입할 준비가 되었습니다. 마이크로 매니퓰레이터(micromanipulator)와 피코 펌프(pico pump)에 바늘을 부착하는 것으로 시작하십시오.펌프는 질소를 바늘 안으로 밀어 넣어 주입되는 액체의 양을 조절합니다. 현미경 하에서는 풋 페달을 통해 질소의 게이트 방출을 제어합니다. 바늘 끝에 초점을 맞추고, 바늘 끝과 커버 슬립이 모두 정확하게 초점에 들어오도록 하여 바늘 끝을 커버 슬립의 가장자리 근처에 위치시키십시오.커버 슬립을 바늘 끝에 닿아 부러질 때까지 이동시킵니다. 개구부의 직경은 0.5~2 µm가 되어야 합니다. 이제 배아에 초점을 맞춥니다.바늘을 오일 속으로 넣습니다. 바늘 끝이 올바르게 절단되었다면, 오일 속으로 액체 한 방울이 새어 나와야 합니다. 바늘 홀더를 만지지 않은 상태에서 페달을 밟을 때, 배아의 측면 가장자리가 바늘에 찔리도록 스테이지를 이동시킵니다.배아에 용액 한 방울을 빠르게 주입합니다. 배아를 옮긴 후, 10개의 배아 모두에 주입이 완료될 때까지 다음 배아로 이동하며 반복합니다. 40 x 또는 100 x 대물렌즈가 장착된 도립 공초점 현미경으로 배아를 촬영합니다.CNS가 중앙에 위치하고 GFP 발현과 세포 사멸 세포의 표지가 뚜렷하게 나타나는 적절한 위치의 배아를 찾습니다. 타임랩스 기록을 위해, 이러한 위치에서 마이크론 스틱(micron stick)으로 표시할 5~6개의 공초점 슬라이스를 선택합니다. GFP 광퇴색이 문제가 되지 않는 간격인 60초마다 스캔을 수행합니다.그 후, 전체 세포를 관찰하기 위해 6 micron 두께의 슬라이스 3개를 투영합니다. 경우에 따라 비디오 녹화 중에 배아가 구르기 시작할 수 있습니다. 따라서 배아가 움직여 녹화 시간이 낭비되지 않도록 기록 과정을 모니터링하십시오.적절하게 배치된 15단계 배아에서는 중앙에 배아 CNS가 나타나며, g로 표시된 glia가 잘 라벨링되어 있습니다. M으로 표시된 대식세포는 대부분 CNS 외부에 위치하며, 강한 세포질 GFP 발현을 보입니다. 외배엽 세포 E 또한 세포질 GFP로 라벨링되어 있습니다.이 프레임들은 annexin V로 표지된 세포 사멸 세포와 GFP로 표지된 외배엽 및 대식세포를 보여줍니다. 각 프레임은 3개 슬라이스의 투영 이미지이며, 각 슬라이스의 두께는 2 microns입니다. 많은 annexin V 양성 세포들이 중추신경계(CNS) 내부와 외부에서 관찰됩니다.상자 안의 이벤트는 글리아 세포가 세포 사멸 입자를 포식하는 모습을 보여줍니다. 글리아 세포의 탐색 행동에 주목하십시오. 글리아 세포는 세포 사멸 세포의 발달 이후, 포식을 결정하기 전에 해당 세포 사멸 입자를 몇 차례 접촉합니다.이 기술은 세포사멸 세포 제거 분야의 연구자들이 발생 과정 중 세포사멸 세포의 포식 작용을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 기술을 사용하여 우리는 세포사멸 세포 제거의 매우 역동적인 거동을 탐구할 수 있습니다.

live-imaging-apoptotic-cell-clearance-during-drosophila

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

이 비디오는 Drosophila melanogaster의 균질화된 배아 세포에서 세포사멸 세포 삼킴을 시각화하는 면역염색 기술을 보여줍니다. 이 방법은 자가사멸 세포 삼킴의 정도를 결정하여 세포 생리학에 대한 통찰력을 제공합니다.

Phagocytosis Assay: Drosophila melanogaster의 배아 세포에서 세포사멸 세포 삼킴을 시각화하는 면역염색 기술

이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

카스파 제 활성의 낮은 농도를 포함하는 전체 동물의 건강한 세포를 검출하기 위해, CaspaseTracker 지정된 고감도 바이오 센서 초파리에 대해 생성 하였다. 카스파 따라 바이오 활성 데스 자극의 부재 하에서 최적 조건 하에서 사육 성인 동물의 내부 장기에 걸쳐 긴 수명이 건강한 세포에서 검출된다.

생체 내에서 바이오 센서는 초파리에서 비 세포 사멸 카스파 활동을 추적

우리는 여기에 Drosophila 의 분산 배아 세포를 사용하여 식균 작용 분석을 설명합니다. 그것은 우리가 생체 내 식균 작용 수준을 쉽고 정확하게 정량화 할 수있게하며, 세포 사멸 세포의 식균 작용에 필요한 새로운 분자를 확인합니다.

에있는 Apoptotic 세포를위한 Phagocytosis 검정 Drosophila 태아

여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

학습하세요 사멸 세포 간극의 동역학을 Drosophila 배아에서 실시간 공초점 현미경으로 관찰하는 방법을. GFP 마커와 특이적 표지자를 활용한 이 기술은 조직 항상성 연구에 필수적인 탐식 작용 메커니즘을 밝히는 데 활용됩니다.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브

더 많은 동영상 탐색