사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브 초파리 배아

이 절차의 전반적인 목표는 초파리 배아에서 세포사멸 세포 제거의 역학을 따르는 것입니다. 이는 Simio GFP 마커가 있는 식세포 집단을 라벨링하는 세포질 GFP 마커를 포함하는 형질전환 파리를 사용하여 수행됩니다. 다음으로, 배아를 주입 후 CNS를 모니터링하기 위해 배치한다.

세 번째 단계는 배아에 5분의 X와 같은 특정 세포사멸 식세포작용 마커를 주입하여 세포사멸 세포를 라벨링하는 것이며, 마지막 단계는 컨포칼 현미경을 사용하여 배아 CNS의 타임 랩스를 기록하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 형광 컨포칼 현미경을 통해 자가사멸 세포 제거의 여러 단계에서 세포자멸사 세포와 식세포의 국소화와 거동을 보여줄 수 있습니다. 고정 배아에 대한 면역조직화학(immunohistochemistry)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포사멸 세포 제거(apoptotic cell clearance)의 역학을 따를 수 있다는 것입니다.

세포사멸(Apoptotic cell clearance)은 다양한 단계를 포함하는 매우 역동적인 과정입니다. 이 기술을 사용하면 세포사멸세포(apoptotic cells)와 대식세포(phagocyte)에 대한 특정 마커를 사용하여 다양한 단계를 따를 수 있습니다. 프로토콜은 기존 시약의 접착제를 만들어 양면 테이프를 굴린 다음 다시 굴려 섬광 바이알에 맞추는 것으로 시작합니다.

바이알에 헵탄을 채우고 param으로 밀봉합니다. 그런 다음 바이알을 너트 테이터에 부착하고 24시간 동안 부드럽게 흔듭니다. 실온에서 다음날 준비된 접착제를 새 바이알로 옮깁니다.

유리 PE를 피펫에 사용하여 준비된 접착제를 새 파일로 옮깁니다. 준비가 되면 피펫 팁을 사용하여 접착제를 바르고 미끄러짐을 덮습니다. 헵탄 접착제 한 방울을 커버 슬립 중앙의 선에 분산시킵니다.

접착제를 몇 초 동안 시도하도록 합니다. 그런 다음 커버 슬립은 이산화탄소로 파리를 마취한 후 밀폐된 상자에 최대 한 달 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.약 400마리의 파리를 수집 용기에 넣고 따뜻한 포도 주스 산란 플레이트를 섭씨 25도에서 2시간 동안 교체합니다. 포도 주스 산란 접시를 모으고 용기를 새 접시로 덮어 파리가 행복하게 지낼 수 있도록 합니다.

채취된 플레이트에는 0시간에서 2시간 된 배아가 들어 있습니다. 배아가 원하는 발달 시점에 도달할 때까지 수집된 포도 주스 산란 플레이트를 배아와 함께 섭씨 25도의 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이 예시에서 배아는 10시간에서 12시간 사이에 배양되므로 발달 후 15기 또는 16단계로 발달합니다.

수돗물과 깨끗한 붓을 사용하여 배아를 플레이트에서 세포로 옮깁니다. 여과기. 엎질러진 배아가 회수될 수 있도록 여과기를 용기 위에 두십시오. 효모 페이스트가 모두 제거될 때까지 수집된 배아를 헹굽니다.

그런 다음 스트레이너 외부를 닦아 여분의 물을 말리십시오. 세포 여과기를 깨끗한 페트리 접시에 넣어 코리온을 충분히 제거합니다. 세포 여과기의 배아를 덮기 위해 50%표백제를 투여하고 2분 동안 기다렸다가 2-3회 저어줍니다.

다음으로, 더 이상 표백제 냄새가 나지 않을 때까지 배아를 헹굽니다. 세포 용기에 있는 배아를 깨끗한 페트리 접시에 넣고 물로 덮어 건조하지 않도록 합니다. 배아를 주입하기 위해.

바늘 풀러와 얇은 벽 유리 필라멘트를 사용하여 미리 주사 바늘을 준비합니다. 원하는 시약 1마이크로리터를 두 개의 바늘에 넣고 한 개의 바늘을 백업 역할합니다. 5분의 X와 같이 쉽게 표백하지 않는 안정적인 마커가 좋은 시약이 됩니다.

이제 직사각형의 포도 주스 한천 조각을 현미경에 놓습니다. 배아를 여과기에서 한천으로 밀어 옮깁니다. 형광 해부 현미경 아래에서 깨끗한 페인트 브러시를 사용하여 GFP 마커를 사용하여 주입할 적절하게 준비된 배아를 선택합니다.

젖은 붓을 사용하여 선택한 배아를 복부 면이 위로 향하게 하여 10줄로 이동합니다. agro 블록의 가장자리에 행을 배치합니다. GFP는 배아 중추 신경계에서 볼 수 있습니다.

이제 배아를 헵탄 접착제 스트립으로 커버 슬립에 부착합니다. 배아의 올바른 위치는 주입의 성공에 매우 중요합니다. 시간을 갖고 배아가 올바른 방향으로 정확하게 정렬되어 있는지 확인하십시오.

다음으로, 커버 슬립을 탈수실에 약 5분 동안 넣습니다. 배아를 건조시킨 후 추가 탈수를 방지하기 위해 Hello carbon oil 700으로 덮습니다. 마지막으로 현미경 슬라이드에 물 한 방울을 놓습니다.

그런 다음 배아가 있는 커버 립을 젖은 현미경 슬라이드에 올려 놓습니다. 이제 배아를 주입할 준비가 되었습니다. 마이크로미터 매니퓰레이터와 피코 펌프에 바늘을 부착하는 것으로 시작합니다.

펌프는 질소를 바늘로 밀어 넣어 주입되는 액체의 양을 제어합니다. 풋 페달은 현미경 아래에서 질소의 게이트 배출을 제어합니다. 바늘 끝에 초점을 맞추고 바늘 끝과 덮개 슬립의 가장자리 근처에 놓고 바늘 끝과 덮개 슬립에 초점을 매우 조심스럽게 맞춥니다.

커버 슬립이 바늘 끝에 닿아 부러질 때까지 움직입니다. 개구부 직경은 1/2에서 2 마이크로 미터이어야합니다. 이제 배아에 초점을 맞춥니다.

바늘을 오일에 넣습니다. 바늘 끝이 올바르게 부러진 경우 오일로 액체 한 방울이 누출되어야 합니다. 바늘 홀더를 건드리지 않고 페달을 밟을 때 배아의 측면 가장자리가 바늘에 찔리도록 스테이지를 이동합니다.

용액 한 방울을 배아에 빠르게 주입합니다. 배아를 멀리 옮기고 10개의 배아가 모두 주입될 때까지 다음 배아로 진행합니다. 40 x 또는 100 x 대물렌즈가 있는 도립 컨포칼 현미경에서 배아를 이미지

중추신경계(CNS)가 중간에 있는 잘 배치된 배아를 찾아 강력한 GFP 발현과 세포사멸세포(apoptotic cells)의 표지를 보여줍니다. 타임랩스를 녹화하려면 5개 또는 6개의 컨포칼 슬라이스를 선택하여 이 위치에 미크론 스틱을 고정합니다. GFP 표백이 문제가 되지 않는 간격으로 60초마다 스캔을 수행합니다.

그런 다음 6미크론 두께의 3개 조각을 투영하여 전체 세포를 관찰합니다. 어떤 경우에는 비디오 녹화 중에 배아가 굴러가기 시작할 수 있습니다. 따라서 배아를 이동하는 데 시간이 낭비되지 않도록 기록을 모니터링하십시오.

적절하게 배치된 15기 배아는 배아 중추신경계가 중간에 있고 g 대식세포 M으로 표시된 잘 표지된 신경교세포가 있으며, 이는 대부분 중추신경계 쇼 외부에 있습니다. 강력한 세포질 GFP 발현. 외배엽 세포 E는 또한 세포질 GFP로 표지됩니다.

이 프레임은 5에서 ex로 표지된 세포사멸세포와 cite GFP로 표지된 clea ectoderm 및 대식세포를 보여줍니다. 각 프레임은 세 개의 슬라이스로 투영되며 각 슬라이스의 두께는 2미크론입니다. 5개의 양성 세포에 있는 많은 ex는 CNS 내부와 외부에 있습니다.

박스형 이벤트는 자가사멸 입자를 삼키는 신경교세포를 보여줍니다. 신경교세포(glial cell)의 프로빙(probing) 거동을 주목하라. 그것은 apoptotic 입자를 몇 번 만지고, 그 발달 후에 apoptotic 세포를 삼키기 전에

이 기술은 세포사멸 세포 제거(apoptotic cell clearance) 분야의 연구자들이 개발 중 세포사멸 세포의 식세포작용(phagocytosis)을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 기술을 사용하여 apoptotic cell clearance의 매우 역동적인 거동을 탐색할 수 있습니다.