Name: EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: 학습하세요 MultiBac 시스템을 이용한 단백질 복합체 생산 방법으로, 다중 유전자 구조물을 생성하고 봉충세포에서 발현시켜 정제하는 전 과정을 익히세요. 이 기술은 구조생물학 및 신약 개발 연구에 필수적입니다.

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우리는 크리스토프 Bieniossek, 사이먼 Trowitzsch, 다니엘 피츠 제럴드, 유이치로 타카, 크리스티안 Schaffitzel, 이본 Hunziker, 티모시 리치몬드와 도움과 조언 버거 실험실의 과거와 현재의 회원을 감사드립니다. MultiBac 플랫폼과 개발했습니다 아낌없이 스위스 국립 과학 재단 (SNSF) 직원은 국립 공들인 (ANR)와 센터 국립 공들인 Scientifique (CNRS)와 유럽위원회 (EC) 등의 자금 지원 기관에서 지원하는 프레임 워크 프로그램 (FP) 6과 7. 다국적 액세스에 대한 지원은 EC FP7 프로젝트 P-CUBE (에 의해 제공됩니다 <a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">www.p-cube.eu</a> )와 BioStruct-X ( <a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">www.biostruct-x.eu</a> ). 과학의 프랑스 교육부는 특히 투자 회사 디 Avenir에서 프로젝트 FRISBI 통해 EMBL에서 MultiBac 플랫폼을 지원하기 위해 인정 받고 있습니다.

1. Multigene 사 식 구문 생성을위한 텐덤 Recombineering (TR) <ol><li> 공동 식 전략 계획. 기증자와 수락 자에 관심 유전자를 삽입하기위한 설계 방법. 귀하의 복잡한 잠재적 인 생리 서브 모듈은 특정 수락 자 및 기증자에 함께 그룹화해야합니다. 개인 기증자와 수락 플라스미드에서 발현 카세트를 결합 BstXI 쌍 7,8는 실리코에 관련된 모든 구문을 생성하고 실험적인 작업을 진행하기 전에 철저하게 전략을 검증 - 원점 복귀 효소 (HE)으로 구성된 곱셈 모듈을 사용합니다.. 예를 들어, 그 유전자는 HE 또는 다른 제한 사이트 및 정확한 열린 독서 프레임 (ORF를)의 존재를 확인해야한다 포함하지 않는 것으로 확인해야합니다. 단백질 생산 수준뿐만 아니라 EXI의 제거를 향상시키기 위해 곤충 세포 코돈과 mRNA의 이차 구조에 최적화 된 합성 유전자를 주문하는 것을 고려해야HE 관심의 유전자에서 사이트 찌르기. 유연한 또는 노출 된 N-또는 선택의 단백질의 C-말단에 대한 문헌 데이터를 기반으로 정화 태그를 배치하는 것이 좋습니다. 개별 단백질의 상대적 양이 복잡한에 의한 화학 양론 문제 제어해야하는 경우 복잡한 여러 가지 단백질 소단위 생산을 목표로 polyprotein 전략을 적용하는 것이 좋습니다. &quot;방법&quot;문서 (전자 실험실 책을 추천합니다) 4 선발 준비합니다 포함 프로젝트의 모든 예상 실험 단계를 완료 Multigene 사 구문 (들)에 이르기까지. 버거 그룹 홈 페이지 (에서 다운로드 할 수 있습니다 크레-ACEMBLER 소프트웨어를 사용하여 예를 들어, 크레-LoxP 융합 플라스미드의 전자 파일을 생성 <a href="http://www.embl.fr/multibac/%20multiexpression_technologies/cre-acembler" target="_blank">www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / CRE-acembler</a> ). </li><li> 선택한 기증자에 관심 유전자를 삽입하고제한 효소와 리가를 사용하거나, 또는 게시 된 프로토콜에 따라 내고 독립적 인 방법을 사용하여 수용체. 5,6,14 당신은 액체 취급 워크 스테이션에 액세스 할 수 있으며 경우 생성되는 구조의 큰 수 (계획 인 경우 조합 방법에 대한 예를 들어) 액체 처리 워크 스테이션을 사용할 수없는 경우 버거 그룹 (그림 2). 14,15가 개발 및 구현 로봇 스크립트를 사용하여 고려 microtitre 플레이트를 사용하여 수동 조작 패션과 같은 HT의 유전자를 삽입 할 수 있습니다. </li><li> 표현 소단위의 화학 양론을 제어 할 필요에 의해 부과 된 제약 조건은 실현 될 수 있습니다. 단백질 복합체의 각 소단위의 화학 양 론적 불균형 발현의 경우들에 의해 간격을 하나의 큰 ORF를 귀하의 복잡한 여러 소단위와 특정 단백질 분해 효소 (예 : 담배 식각 바이러스 NIA 단백질 분해 효소)를 결합하다 할 polyprotein 전략을 적용하는 것을 고려해야pecific 단백질 분해 사이트. 4,8는 고려의 공동 표현은 여러 소단위로 매우 큰 복잡한이 널리 개별 소단위의 분자량에 이르는 경우 단일 식 카세트와 하나 또는 여러 polyproteins합니다. 고려의 공동 발현하는 단백질이 낮은 생산 수율로 특징되는 경우 polyprotein 또는 여러 개의 동일한 표현 카세트와 같은 단백질 코딩 몇 가지 유전자를. 4,13 </li><li> 제한 매핑 (선택적으로 높은 처리량)과 시퀀싱에 의해 복제 된 모든 도너와 억 셉터 구조를 확인합니다. 선택의 Multigene 사 식 구조를 생성하는 크레-LoxP 재조합에 의해 기증자 수락 조합을 융합로 이동합니다. 제한 매핑에 의해 수락 기증자 융합 플라스미드를 정제 검증, 크레-ACEMBLER 또는 참조로 유사한 프로그램에 의해 생성 된 전자 시퀀스를 사용합니다. </li><li> -20 ° C에서 정제 및 검증 기부자, 수락 자 및 기증자 수락 융합을 저장하거나 -80 ° C. 아카이브 PLasmids 나중에 사용을 위해 신중하게 시퀀스 (Microsoft Excel에서 파일 메이커, 등). </li></ol> 2. 복합 Multigene 사에 배큘로 바이러스 생성, 증폭 및 저장 <ol><li> 바이러스 게놈 Tn7 전위에 필요한 기능을 숨겨 DH10 세포로 변환하여 Multigene 사 전송 벡터에게 MultiBac baculoviral 게놈을 통합 할 수 있습니다. Multibac baculoviral 게놈 Tn7 통합 이전 생체 크레 반응에 의해 자신의 LoxP 사이트에서 관심있는 특정 유전자 (YFP 마커, 보호자 등) (Tn7 첨부 파일 사이트에 말초 게놈에 설계)를 미리로드 할 수 있습니다. 13 Tn7 치환 한 후, 관심있는 유전자를 포함하는 복합 배큘로 바이러스와 세포 블루 / 화이트 심사 (β-갈 락토시다 아제의 α-상보성의 손실에 성공 Tn7 전위의 결과에 의해 선택되어 있으므로, 정확한 Tn7 전위와 식민지 선택에 흰색 남아갈치 X-gal을 포함하고있는 고체 배지)와 게놈 알칼리 용해, 에탄올 / 이소프로판올 침전에 의해 준비가되어 있습니다. 5,6 </li><li> 형질 전환 및 초기 바이러스 제작. 멸균 후드에 장소는 6 - 잘 조직 배양 플레이트. 로그 상 SF21 곤충 세포 배양에서 설명 된 배양 배지에 혼합 정제 baculoviral 게놈의 transfection 시약을 추가하여 우물과 형질에있는 세포의 분주 밖으로 씨. 미디어를 제거하여 48-60 시간 후 6 수확 초기 바이러스 ( 높은 품질, 낮은 역가의 바이러스 V 0, 잘 당 일반적으로 3 ML). 추가 2-3 일 에의 한 발송 후 단백질 생산을위한 새로운 미디어 및 테스트 (그리고, YFP 마커가있는 경우, 형광)을 보충합니다. 6,7 </li><li> 바이러스의 증폭, 낮은 MOI 요법. 작은 (100-250 ML) 삼각 플라스크 셰이커 동요에 로그 단계에서 세포의 25-50 ML (ML 당 세포 밀도는 &lt;1X10 6 세포)를 감염 V 0 바이러스를 사용궤도 플랫폼 셰이커 (그림 3). 세포를 카운트하고 세포 (확산 체포) 두배을 중지 할 때까지 매 24 시간을 분할합니다. (셀 당 바이러스 입자의 감염 즉, 수의 다양성) MOI 낮은식이 요법을 따르 세포는 한 번 (MOI &lt;1), 그렇지 않으면 V 0의 작은 볼륨 실험을 반복한다 (적어도) 두 번해야 덧붙였다. 일반적으로, V 0의 3 ㎖를 0.5x10 6 세포 / ㎖의 농도로 SF21 곤충 세포의 25 ML를 감염하는 데 사용됩니다. 이 해로운 것을 방지하는 것이 필수적입니다 이형 유전자의 손실이 발생할 수있는 바이러스에 앰프 및 자동 삭제. 세포 펠렛 및 바이러스를 포함하는 미디어를 제거하여 48-60 시간 후 수확 V 1 바이러스 (25-50 ML). 6, 1X10 6 개의 세포마다 12 또는 24 시간을 제거 펠렛 단백질 생산 및 마커 단백질 (YFP) 신호를 검증.하여 YFP 단백질 생산을위한 새로운 미디어와 시험과 보충 (에 바이러스를 증폭V 2) 더 큰 식 볼륨은 위의 낮은 MOI식이 요법 (세포가 V 1 감염 후 적어도 한 번 두 번해야합니다) 존중 V 1 바이러스 2 L 쉐이크 플라스크에 400 ML의 셀을 감염시켜 목표로하는 경우. 엄격 더 이상 관심의 유전자를 포함하지 않는 결함이 바이러스의 축적을 방지하기 위해 증폭하는 동안 단백질 생산 및 마커 단백질 신호를 테스트 할 수 있습니다. 각각의 증폭에 축적 5-7를 사용하여 세포 펠렛은 관심의 표현 단백질 복합체에 대한 정화 프로토콜을 설정하기위한 단계에서 이미. </li><li> 생산 바이러스의 BIIC 저장. 우리는 강력하게 사용하여 제작 바이러스로 V 2 바이러스를 저장하는 것이 좋습니다 BIIC (B aculovirus - 나는 C ELL 학생을 nsect nfected) 재조합 바이러스의 수정 (관심의 유전자의 예를 들면 손실) 방지하고 높은 표현을 보존하는 방법을 수평의 확산 체포 후 24 시간이 관찰되어 16 펠렛 감염된 세포 -.들이 미디어에 (신진)에 의해 출시 될 직전에이 단계의 세포에 완료 바이러스 입자가 포함되어 있습니다. 액체 질소에 미디어와 세포 펠렛의 동결 분주을 제거하고 무기한 저장합니다. 7,16가 </li></ol> 3. 단백질 생산 및 다운 스트림 처리 <ol><li> 대형 (R) 문화 및 모니터링 YFP를 감염. 생산 실행 (2 L 플라스크에 일반적으로 400 ML)에 대한 더 큰 세포 배양 감염을 V 1, V 2 또는 냉동 BIIC 분주을 사용합니다. 낮은 MOI 요법 (예 :이 감염된 문화가 적어도 한 번 두 배로 감염에 사용되는 바이러스 볼륨을 조정)을 준수하십시오. 플라스크의 수를 곱하여 필요한 경우 감염된 문화 볼륨을 확대합니다. YFP 마커 단백질이 존재하는 경우, 정의 된 간격 1X10 6 개의 세포에서 철수 펠렛 세포를 용해하고 고원이 공업에 도달 할 때까지 YFP 신호의 변화를 모니터링최대 재조합 단백질 생산을 icating. YFP 수준은 형광 신호 (예를 들어 TECAN SPECTRAFluor)을 기록 할 수있는 표준 96 웰 플레이트 리더로 측정 할 수 있습니다. 이 단계에서 수확 세포. -20 ° C (단기) 또는 -80에서 보관 세포 펠렛 ° C (장기). </li><li> 세포 용해 및 분별. 귀하의 단백질 요구 사항 (동결 - 해동, 초음파, 프렌치 프레스, 등)에 맞게 선택의 당신의 마음에 드는 방법으로 세포를 용해. 5-7 분별 세포질과 관심의 단백질의 존재에 대한 핵 및 테스트. 단백질 정제를 단순화하기 위해 결과에 따라 정화 프로토콜을 개발한다. 귀하의 단백질이 핵에있는 경우 높은 KCl을 조건으로 핵 분획에서 단백질을 추출하기 위해 적시 절차를 적용을 고려하십시오. 7,18 </li><li> 단백질 정제 (마이크로 스케일, 대규모). 세포 배양의 종종 작은 볼륨 (10, 25 ml)에 쓰입니다 점에 유의때문에 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템 (L 문화와 더 많은 당 단백질의 자주 10-100 MG)에서 외래 단백질의 일반적으로 높거나 매우 높은 생산 수준으로 관심의 단백질의 상당한 금액을 정화 세포 펠렛을 얻기위한 fficient. 마이크로 정화 (다중 웰 플레이트, microtip을 방법, GE 헬스 케어 ÄKTAmicro 시스템 등)와 함께에서 생화학 및 활동 자료와 종종 나노 리터 규모의 높은 처리량 결정에 대해 원하는 단백질과 복합체의 충분한 양 (HTX을 얻을 수있다 ). 작은의 이온 교환 및 크기 배제 크로마토 그래피와 함께, 정화를 촉진하기 복잡하여 단백질의 노출 소단위에 금속 친화력 정화 (Clonetech 다카라 TALON 퀴 아젠 NiNTA 금속 킬레이트 수지)와 올리고-히스티딘 (6-10 잔류) 태그를 사용하는 것이 좋습니다 예를 들어 ÄKTAmicro 또는 유사한 작은 양 정화 기계를 (그림 4 사용 권 </st룽&gt;). 다른 친화력 정화 단계와 올리고-히스티딘 태그 또는 다른 태그와 친화력 정화뿐만 아니라 이온 교환 (IEX) 단계는 (다른 GST, MBP, CBP에서 선택) 할 수 있고 고려되어야한다, 단백질의 생화학 적 특성에 따라 관심과 개별 환경 설정. 정화 효율을 향상시키기 위해 선호도의 태그를 하나 이상의 단위체를 고려하십시오. 당신의 정제 단백질 단지를 집중하고 글리세롤의 유무에 관계없이 동결 등의 스토리지 프로토콜을 설정할 수 있습니다. 당신의 정제 단백질의 배치 별 변화를 평가하기 위해 (활동 분석, 생화학 및 생물 물리학 시험) 표준으로 적용 할 수있는 품질 관리 기준을 개발한다. </li></ol>

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</ol>

IB는 여기에 설명 된 기술의 일부를 자세히 설명 특허 및 특허 출원에 발명가이다.

그림 2와 3의 비디오 스냅 샷 Multigene 사 표현의 cDNA를에서 로봇을 이용한 세대에서 전체 프로세스를 설명하는 단백질 생산을위한 곤충 세포 배양 감염으로 모든 방법을 구성합니다. 새로운 시약 (플라스미드 및 바이러스) 및 강력한 프로토콜을 표준 운영 절차에 의존하는 파이프 라인을 사용하기 위해 개발되었습니다. 전체 파이프 라인은 그르노블에서 EMBL에서 플랫폼 기술로 구현되었습니다. MultiBac 플랫폼은 multiprotein의 연구에 종사하는 학계 및 업계의 많은 과학자들에 의해 읽혔습니다. 교육 접근은 유럽위원회 (P-CUBE, BioSTRUCT-X)에 의해 자금 전용 액세스 프로그램에 의해 지원됩니다. MultiBac 시스템을 사용하여 단백질의 복잡한 표현을 수행하는 SOP를 여부는 전문가가 아닌 사용자도 쉽게 의무가이 기술을 렌더링하고있다. 로봇을 이용한 작업 partic에 multiprotein의 복잡한 생산을 가속화ul...

생물학적 활성은 단백질과 세포 기능을 촉진하기 위해 콘서트에서 역할을 다른 생체 분자의 어셈블리에 의해 제어됩니다. 주목할만한 예는 메신저 RNA에 DNA에 들어있는 유전 정보를 표기 기계 있습니다. 인간, 100 개 이상의 단백질이다 RNA 중합 효소 II와 같은 TFIID, TFIIH 등과 같은 일반적인 전사 인자. 9 다른 예제를 포함하여 10 더 소단위 대형 multiprotein의 단지를 형성 유전자를 속기 정의와 규제 과정에서 함께 온 리보솜, 단백질 합성, 또는 진핵 생물의 핵 봉투를 통해 생체 분자를 왕복을 담당하는 핵 기공 복합체를 촉매 많은 단백질과 RNA 분자로 구성. 셀에 기본적으로 모두 다 성분계 시스템의 상세한 건축 및 생화학 해부 그들의 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 원핵 세포와 eukar의 구조 규명yotic 리보솜은, 예를 들어, 이러한 고분자 기계 셀에 자신의 지정된 기능을 수행하는 방법에 전례없는 통찰력을 항복 특징 이벤트를 창설. 10,11 리보솜은 최대 세포 질량의 30 %가 리보솜으로 구성되어 있다는 사실로 인해 배양 세포에서 내인성 물질을 정화하여 자세한 연구를위한 충분한 질과 양에서 얻을 수 있습니다. RNA 중합 효소 II는 다른 중요한 단지의 압도적 인 다수가있는 그러나 존재 이미 효모 문화의 적은 크기의 순서로 풍부한, 많은 천 리터 전사의 중심이 필수적인 복합의 세부 원자 뷰를 얻기 위해 처리해야했습니다. 12 따라서 원시 세포, 그리고 훨씬 낮은 금액 네이티브 소스 재료에서 적절하게 정제 할 수 없습니다. 자세한 구조와 기능 분석에 액세스 같은 단지를 렌더링하려면 재조합 테를 사용하여 이종의 생산을 필요로chniques. 재조합 단백질 생산은 생명 과학 연구에 큰 영향을 미쳤다. 대부분의 단백질은 재조합 생산, 그들의 구조와 기능은 높은 해상도 해부 하였다. 구조 유전체학 프로그램은 높은 처리량 (HT) 모드에서 전체 생물의 유전자 제품의 레퍼토리를 해결하기 위해 많은 생물의 게놈의 해명의 장점을 가지고있다. 단백질 구조의 수천 따라서 결정되었습니다. 지금까지, 재조합 단백질 생산을위한 가장 다산 사용되는 시스템은 E.되었습니다 대장균, 많은 발현 시스템이 호스트 외래 생산 년 동안 개발하고 세련되었다. E.에서 단백질 생산을 가능하게하는 기능의 과다를 숨겨 플라스미드 대장균 상업 제공자의 전체 카탈로그를 작성하십시오. 하지만, E. 대장균은 많은 진핵 생물의 단백질을 생산하는 것이 적합하지 않은 특정 제한 사항이 있습니다 및 P의많은 소단위와 관절 단백질 복합체. 따라서, 진핵 호스트 단백질 생산은 증가 최근 몇 년 동안 선택의 방법이되었다. 진핵 생물의 단백질을 생산하기 위해 특별히 잘 적응 시스템은 실험실에서 재배 곤충 세포 배양을 감염 외래 유전자를 운반하는 재조합 배큘로 바이러스에 의존 배큘로 바이러스 발현 벡터 시스템 (BEVS)입니다. MultiBac 시스템은 특히 많은 소단위 (그림 1) 진핵 세포 단백질 단지의 생산에 맞게 조정되어 더 최근에 개발 된 BEVS입니다. MultiBac는 2004 년에 처음 도입되었다. 13는 도입 이후, MultiBac 지속적으로 세련되어 있고, 취급을 간단하게 목적 단백질의 품질을 개선하고 일반적으로 효율적인 표준 운영 절차 (SOP에)를 설계하여 비 전문가 사용자에게 시스템에 액세스 할 수 있도록하는 스트림 - 늘어서있다. 4 MultiBac는 AC에 전 세계적으로 많은 실험실에서 구현되었습니다ademia 산업. 그르노블에서 EMBL에서 다국적 액세스 프로그램은 그들의 연구를 발전이 생산 시스템을 사용하고자 과학자 MultiBac 플랫폼에서 전문적인 교육을 제공하기 위해 유럽위원회에 의해 장소에 넣어했다. 그들은 EMBL 그르노블에서 MultiBac 시설에 운영에 있기 때문에 지금까지 접근되지 않은 많은 단백질 복합체의 구조와 기능 MultiBac으로 제작 샘플을 사용하여 해명했다. 4 다음에서 MultiBac 생산의 필수적인 단계는 프로토콜에 요약되어있다.

<table><tbody><tr><td>Bluo-Gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028 (1 g)</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린</td><td>Euromedex</td><td>UT2965-B(25g)</td><td>1,000X에서 10mg/ml</td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Euromedex</td><td>EU0420(25g)</td><td>1,000X에서 50mg/ml</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>SIGMA</td><td>G3632(5g)</td><td>1,000X에서 10mg/ml</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B(5g)</td><td>1,000X 1M에서</td></tr><tr><td>Cre-recombinase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0298</td><td></td></tr><tr><td>X-Treme GENE HP 형질주입 시약</td><td>Roche</td><td>06 366 236 001</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone SFM4 Insect</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30913.02</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>2ml 피펫 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>5ml 피펫 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>10ml 피펫 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>25ml 피펫 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357535</td><td></td></tr><tr><td>50ml 피펫 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>50ml 튜브 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15ml 튜브 Falcon</td><td>Dominique Dutscher</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>1.8 ml cryotube Nunc</td><td>Dominique Dutscher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>100 ml 쉐이커 플라스크 Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211917</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 쉐이커 플라스크 Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211918</td><td></td></tr><tr><td>500 ml 쉐이커 플라스크 Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td>211919</td><td></td></tr><tr><td>2 L 쉐이커 플라스크 Pyrex</td><td>Dominique Dutscher</td><td></td><td></td>211921</tr><tr><td>Certomat Orbital Shaker + plateau</td><td>Sartorius</td><td>4445110, 4445233</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소 탱크 듀어 35 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>M76801</td><td></td></tr><tr><td>생물 안전 캐비닛 더 빠른</td><td>Sodipro</td><td>FASV20000606</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Zeiss</td><td>451207</td><td></td></tr><tr><td>Sf21 곤충 세포</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hi5 곤충 세포</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Tecan freedom EVO 실행 Evoware 플러스</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l 전도성 팁 (검정색),</td> <td>TECAN</td><td>10 612 516</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l 전도성 팁 (검정색)</td> <td>TECAN</td><td>10 612 510</td><td></td></tr><tr><td>시약용 일회용 트로프, 100 ml</td><td>TECAN</td><td>10 613 049</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCR 플레이트 96, 스커트</td><td>Eppendorf</td><td>0030 128.648</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 V 바닥, 비멸균</td><td>BD 팔콘</td><td>353263</td><td></td></tr><tr><td>96 딥웰 플레이트 색상 자연, PP)</td><td>Fisher</td><td>M3752M</td><td></td></tr><tr><td>PS 마이크로플레이트, 96 웰 플랫 바닥</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>96 딥웰 플레이트</td><td>Thermo scientific</td><td>AB-0932</td><td></td></tr><tr><td>24웰 블록 RB</td><td>Qiagen</td><td>19583</td><td></td></tr><tr><td>DpnI 제한 효소</td><td>NEB</td><td>R0176L</td><td>20 U/uL</td></tr><tr><td>NEBuffer 4 10X</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>2X phusion mastermix HF</td><td>Finnzyme</td><td>ref F-531L</td><td></td></tr><tr><td>2X phusion mastermix GC</td><td>Finnzyme</td><td>ref F-532L</td><td></td></tr><tr><td>DGLB 1.5X</td><td>수제</td><td></td><td>7.5% 글리세롤, 0.031% 브로모페놀 블루, 0.031% Xylen cyanol FF</td></tr><tr><td>e-gel</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>낮은 DNA 질량 사다리 e-gel</td><td>Life Technologies</td><td>10068-013</td><td></td></tr><tr><td>E-gel 48 1% 아가로스 GP</td><td>Life Technologies</td><td>G8008-01</td><td></td></tr><tr><td>Nucleo Spin-robot-96 플라스미드 키트</td><td>Macherey Nagel</td><td>740 708.24</td><td></td></tr><tr><td>PCR 클린업 키트, Nucleospin Robot-96 추출물</td><td>Macherey Nagel</td><td>740 707.2</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq 그린 마스터 믹스</td><td>Promega</td><td>M7113</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소, LIC 인증</td><td>Novagen</td><td>70099-3</td><td></td></tr><tr><td>DTT 100</td><td>mM</td><td></td><td></td></tr> <tr>수제<td>우레아 2 M</td><td>수제</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA 500 mM pH 8.0</td><td>수제</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 육수 (밀러) 500 g</td><td>아테나 ES</td><td>103</td><td></td></tr></tbody></table>

embl에서 multibac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

프로테오믹스 연구는 전례없는 정밀도 진핵 세포 프로테옴의 인상적인 복잡성을 밝혔다. 지금 세포에있는 단백질은 주로 고립 된 개체로하지 존재하지만, 대부분의 경우 모든 생명 기능을위한 셀의 조립 라인을 형성, 인간 10 명 이상, 많은 다른 단백질과 관련있는 생물학적 활성을 발휘하는 일반적으로 인정 개념이다. 1 이 multiprotein의 어셈블리의 기능과 구조의 2 지식은 자세한 분석을 위해 우수한 품질과 충분한 양에서의 공급이 필요합니다. 세포에서 많은 단백질 단지의 소수는 진핵 세포에서 특히 네이티브 소스에서 해당 추출을 금지하고, 재조합 생산을 필요로한다. 배큘로 바이러스 발현 벡터 시스템 (BEVS)는 진핵 생물의 단백질을 생산하는 데 특히 유용한 것으로 입증되었습니다,의 활동은 종종 번역 후 처리에 의존하는 다른 일반적으로 사용되는 발현 시스템은 종종 할 수있는지원하지 3. BEVS 관심의 유전자가 차례로 선택의 단백질을 생산하는 곤충 세포 배양을 감염 삽입 된 재조합 배큘로 바이러스를 사용합니다. MultiBac 특히 많은 소단위를 포함하는 진핵 세포 단백질 단지의 생산을위한 맞춤형 된 BEVS이다. 4 효율적인 단백질 생산과 단지를위한 중요한 전제 조건 이상적으로 구현 될 수있는 식 실험에 관련된 모든 단계에 대한 강력한 프로토콜입니다 표준 작업 절차 (SOP)와 비교 쉽게 전문가가 아닌 사용자도 따랐다. 유럽​​ 분자 생물학 연구소 (EMBL)에서 MultiBac 플랫폼은 단백질의 소규모 분석 외래 단백질 생산 특성에 최적화 된 설계 baculoviral 게놈에 유전자의 삽입부터 시작 multiprotein의 복잡한 발현 실험에 관련된 모든 단계에 대한 SOP를 사용 생산 시편. 5-8 플랫폼EMBL 그르노블에서 오픈 액세스 모드로 설치되어 학계 및 단백질의 복잡한 연구 프로젝트를 가속화하는 업계의 많은 과학자를 지원하고 있습니다.

MultiBac 시스템에 의해 달성 이종 단백질의 강력한 공동 발현은 그림 1D (서스펜션 세포 배양 감염 후 48 시간 촬영 프로브)에 표시됩니다. 과다 발현 단백질 밴드는 전체 세포 추출물 (SNP) 및 삭제 해물 (SN)에 명확하게 식별 할 수 있습니다. 생산 된 단백질 재료의 품질과 수량은 종종 그림 1E에서와 같이 같은 유사 분열 체크 포인트 복잡한 MCC 등의 단백질 복합체의 구조 결정을 가능하게하기에 충분합니다. 17 그림 2는 로봇을 이용한 탠덤 recombineering (TR)에 의해 유전자의 조립 실험의 작업 흐름을 표시합니다. 강력한 DNA 어셈블리 프로토콜은 Multigene 사 식 구조의 병렬 조립 로봇 루틴에 스크립트했다. 개별 로봇 단계는 스냅 샷 (- IV 그림 2C, I)로 표시됩니다. 조립하는 DNA의 ...

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

이 실험 과정의 전반적인 목표는 다중 baculovirus 곤충 세포 시스템을 사용하여 단백질 복합체를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 선택한 단백질 복합체를 인코딩하는 다중 유전자 컨스트럭트를 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 박테리아 세포를 형질전환하고 올바른 bacmid를 스크리닝하여 다중 유전자 컨스트럭트를 포함하는 복합 baculovirus를 만드는 것입니다.다음으로, baula 바이러스 게놈을 분리하고 단백질 생산 여부를 테스트한 후, 6-웰 플레이트를 사용하여 소규모로 곤충 세포를 감염시킵니다. 선택한 단백질 복합체를 더 큰 규모로 발현시키고 정제합니다. 최종적으로, 정제된 단백질 복합체를 사용하여 그 구조와 기능을 규명하며, 잠재적으로 신약 개발에 활용합니다.이 기술이 기존의 에코바이러스(echovirus) 시스템보다 갖는 주요 장점은 두 가지입니다. 우선, MultiPro 복합체를 전례 없는 효율로 생산할 수 있습니다. 또한, 최적의 단백질 생산을 위해 에코바이러스를 설계하였기 때문에 생산된 물질의 품질이 훨씬 더 높습니다.이 기술의 활용 범위는 기초 생물학적 질문을 훨씬 넘어섭니다. 본 연구의 멀티 백 플랫폼은 다양한 질병의 유망한 신규 백신 후보가 될 수 있는 단백질을 성공적으로 생산하는 데 사용되었으며, 종양 성장을 유발하는 핵심 단백질 복합체를 생산함으로써 암 연구를 촉진해 왔습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 초기 과정과 멸균 상태 유지의 필요성으로 인해 다소 어려움을 겪을 수 있습니다.따라서 저희는 비전문가 사용자들도 멀티뱅크(multi-bank)를 최대한 쉽게 적용할 수 있도록 표준 작업 절차를 수립하기 위해 많은 노력을 기울였습니다. 로봇 공정 단계는 프로세스가 실제로 작동하는 모습을 볼 때 훨씬 더 쉽게 이해되므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이는 아무리 상세하게 작성된 프로토콜이라 하더라도 단순히 읽는 것만으로는 파악할 수 없는 부분입니다.본 절차를 시작하기 전에, 공동 발현 전략을 신중하게 계획하는 것이 중요합니다. 먼저 In silico로 실험을 시뮬레이션하는 것을 권장합니다.유전자를 수용체 및 공여체 플라스미드에 분배해야 합니다. 생리학적 서브 모듈을 형성할 수 있는 서브유닛끼리 함께 그룹화하는 것이 가장 효과적입니다. 거대 복합체는 많은 단백질 서브유닛을 가지고 있으므로, 많은 유전자가 동시에 발현되어야 합니다.멀티백(multi back) 시스템은 Cre 재조합 효소가 인식하는 lox P라고 불리는 짧은 DNA 서열을 포함하는 작은 DNA 전구체 분자에 유전자를 배치하는 자동화된 루틴을 사용하여 유전자 클로닝을 크게 단순화합니다. 이후 Cre 재조합 효소를 첨가하여 단일 단계 반응으로 이러한 전구체들을 결합시키면, lox P 부위가 있는 모든 요소가 하나의 거대한 DNA 플라스미드로 연결됩니다. 이렇게 만들어진 다중 유전자 구조체는 이어서 멀티백 불라 바이러스(bula virus) 게놈에 삽입됩니다.다수의 컨스트럭트를 생성해야 하는 경우, 로봇 스크립트와 액체 핸들링 워크스테이션의 사용을 권장합니다. 해당 워크스테이션에는 미니 프렙 및 PCR 정제를 위한 진공 장치, PCR 샘플의 자동 로딩을 위한 EEL, PCR 및 배양 단계를 위한 써모사이클러, 세포 재현탁을 위한 셰이커 및 콜드 블록이 갖춰져 있습니다.효소의 경우, 제한 효소와 리가아제를 사용하거나 또는 리게이션 독립적 방법을 사용하여 관심 유전자를 선택된 공여체(donor)와 수용체(acceptor)에 삽입하며, 제한 효소 지도 작성 및 시퀀싱을 통해 모든 공여체 및 수용체 구조체를 검증합니다. CRE LAX P 재조합을 통해 공여체-수용체 조합을 진행하여 원하는 다중 유전자 발현 구조체를 생성합니다. 조립된 다중 유전자 구조체는 특이적으로 설계된 프라이머 세트를 이용한 분석적 PCR 반응으로 검증합니다.로봇 보조 TR 과정의 스냅샷이 여기에 표시되어 있습니다. 여기에는 멀티웰 플레이트에서의 PCR 반응 준비, 템플릿 DNA 및 프라이머 제공, DNA의 PCR 증폭, 그리고 멀티웰 플레이트 내의 알칼리 용해(alkaline lysis)를 통한 박테리아 배양 성장 다중 유전자 컨스트럭트(multi-gene constructs)의 준비 과정이 포함됩니다. 이 절차를 시작하려면, 바이러스 게놈과 TN seven 전이(transposition)에 필요한 기능을 보유한 DH 10 세포로 형질전환하여 다중 유전자 전달 벡터를 멀티 bula 바이러스 게놈에 통합하십시오.관심 유전자를 포함하는 복합 baula 바이러스의 TN seven 전치 세포를 블루-화이트 스크리닝을 통해 선택합니다. 성공적인 TN seven 전치는 beta galacto의 alpha 상보성 결손을 초래합니다. 따라서 정확한 TN seven 전치가 일어난 콜로니는 xal을 포함하는 선택적 APL에서 흰색으로 유지됩니다. 흰색 콜로니로부터 박테리아 배양액을 준비하고, 알칼리 용해 및 에탄올-이소프로판올 침전법으로 backin을 분리합니다.다음으로, 무균 작업대에서 정제된 bao 바이러스 게놈을 곤충 세포에 형질전환합니다. 대수 성장기 SF 21 곤충 세포의 분주액을 6-웰 조직 배양 플레이트에 분배합니다. 각 웰에 정제된 bao 바이러스 게놈과 형질전환 시약을 배양액에 혼합하여 첨가합니다. 형질전환된 세포를 27 °C에서 흔들지 않고 48~60시간 동안 배양합니다.48~60시간 후, 배지를 제거하고 신선한 배지로 보충하여 초기 바이러스 또는 V zero를 수확한 다음, 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 2~3일 후에 단백질 생성 여부를 테스트하고, YFP 마커가 있는 경우 바이러스 증폭을 위해 형광을 테스트합니다. 초기 바이러스인 V zero를 사용하여 오비탈 플랫폼에서 교반되는 소형 삼각 플라스크 내 로그 단계의 세포 25~50 mL를 감염시킵니다.세포 수를 측정하고 세포 분열이 멈출 때까지 24시간마다 세포를 분할하십시오. 낮은 감염 다중도 또는 MOI 계획을 따르십시오. 세포는 최소 한 번 이상 분열해야 하며, 그렇지 않을 경우 더 적은 부피의 V zero를 첨가하여 실험을 반복하십시오. 왼쪽 이미지는 multi back baula virus에 감염된 후의 감염되지 않은 곤충 세포를 보여줍니다.오른쪽 이미지에서 보는 바와 같이, 감염된 곤충 세포는 증식이 중단되고 크기가 증가했습니다. 48~60시간 후, 세포를 펠렛화하여 V1 바이러스를 수확하십시오. 바이러스가 포함된 배지를 제거하여 보관하십시오.신선한 배지로 세포를 재현탁하여 삼각 플라스크로 다시 옮깁니다. 12시간 또는 24시간마다 원심분리로 침전시켜 1×10⁶개의 세포를 수거하며, 더 많은 발현량이 필요한 경우 단백질 생성 및 마커 단백질 신호를 테스트합니다. 2L 쉐이커 플라스크에서 최대 400mL의 세포에 V1 바이러스를 감염시켜 바이러스를 추가로 증폭합니다.낮은 MOI 요법을 따른 후, 재조합 바이러스의 변형을 방지하고 높은 발현 수준을 유지하기 위해 흉내 바이러스 감염 곤충 세포(VIC) 방법을 사용하여 V1 바이러스를 생산 바이러스로 보관할 것을 강력히 권장합니다. 증식 정지가 관찰된 24시간 후에 감염된 세포를 펠렛화합니다. 이 단계에서 세포는 배지로 방출되기 직전의 완전한 바이러스 입자를 포함하고 있습니다.배지를 제거하고 동결 보존액에서 세포 펠릿을 재현탁한 후, 단백질 생산 공정을 위해 cryo tube에 BIIC를 동결합니다. 더 큰 규모의 세포 배양물에 감염시키기 위해 V one, V two 또는 동결된 BIC 분주액을 사용하십시오. 일반적으로 2L 플라스크의 400mL 배양물은 낮은 MOI 체계를 따릅니다.감염된 배양물이 최소 한 번은 배가될 수 있도록 감염에 사용되는 바이러스 부피를 조정합니다. YFP 마커 단백질이 존재하는 경우, 정해진 간격으로 1×10⁶개의 세포를 채취하여 초음파 처리 및 원심분리한 후 96웰 플레이트로 옮깁니다. 형광 신호를 기록할 수 있는 표준 96웰 플레이트 리더기를 사용하여 YFP 수준을 측정하고, 재조합 단백질 생산이 최대치에 도달했음을 나타내는 고점(plateau)에 이를 때까지 YFP 신호의 변화를 모니터링합니다. 이 단계에서 세포를 수확하고, 세포 펠릿을 단기적으로는 -20°C에, 장기적으로는 -80°C에 보관합니다. 세포는 단백질의 요구 사항에 맞게 설계된 방법으로 용해시킨 후, 세포질과 핵을 분리해야 합니다.분획된 핵 단백질은 일반적으로 핵 펠릿(nuclear pellet)에서 발견되는 반면, 세포질 단백질은 세포질에 남아 있습니다. 분획법을 통해 단백질 정제 과정을 크게 단순화할 수 있습니다.한 번의 원심분리 단계만으로도 많은 오염 물질을 제거할 수 있기 때문에, 멀티웰(multi-well) 또는 마이크로 팁(micro tip) 기반 정제와 같은 소형화된 정제 방법을 활용하면 소규모 초기 세포 배양액으로부터 단백질 복합체를 편리하게 정제할 수 있습니다. ACTA micro와 같은 소량 크로마토그래피 시스템과 결합하여, 향후에는 전체 실험 설정을 소형 탁상형 애플리케이션으로 소형화 및 통합하여 클로닝 워크스테이션과 인터페이스하는 단계가 진행될 것입니다.현재 개발 중이며 본 목적에 사용될 마이크로스케일 배치 로봇이 여기에 나와 있습니다. 여기에서 보는 바와 같이, 멀티 백 시스템(multi back system)을 통해 이종 단백질의 강력한 공동 발현이 이루어집니다. 과발현된 단백질 밴드는 전세포 추출물(WCE)과 정제된 용해물에서 명확하게 식별됩니다.생산된 단백질 물질의 품질과 양은 대개 충분합니다. 이를 통해 본 도식에 표시된 유사분열 체크포인트 복합체(MCC)와 같은 단백질 복합체의 구조적 결정을 가능하게 합니다. 종종 이러한 분석적 정제 과정의 수득률은 전자 현미경을 포함한 다양한 수단으로 정제된 복합체의 구조와 기능을 분석하기에 충분합니다.우리가 개발한 표준 작업 절차를 통해 전문 지식이 없는 사용자도 우리의 접근 방식을 쉽게 적용할 수 있으며, 우리의 기술은 현재 Nikola에서 소형 단백질에 적용되는 것과 마찬가지로 대형 단백질 복합체에 관심이 있는 많은 실험실에서 활용될 수 있습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 여러분의 야심 찬 연구 목표를 위해 전례 없는 양과 품질로 관심 단백질 복합체를 생산하기 위한 multi bag 사용법을 충분히 이해하시게 될 것입니다. 본 시스템을 사용하는 데 특별한 안전 조건은 요구되지 않습니다.하지만 바이러스가 세포 내에서 복제되지는 않더라도, 부주의하게 취급할 경우 감염될 수 있다는 점에 유의하십시오. 따라서 이 절차를 수행하는 동안 멸균 조건을 세심하게 관리하는 것이 필수적입니다. 당사의 방법은 이미 전 세계 600개 이상의 실험실에서 널리 사용되고 있습니다.저희의 기술을 활용해 보십시오. 저희는 향후 이 방법이 인간의 복합 구역(complex zone)을 다루는 대규모 구조 유전체학 연구의 핵심적인 부분이 될 것이라고 믿습니다. 이는 질병의 근원을 밝히는 데 기여하며, 장기적으로는 새롭고 더 나은 약물과 치료법 개발로 이어질 수 있을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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구조 기반 약물 설계 약물 개발에 중요한 역할을한다. 병렬로 여러 대상을 추구하는 것은 크게 선 발견의 성공의 기회를 증가합니다. 다음 문서는 감염성 질환 시애틀 구조 유전체학 센터 PB2 인플루엔자 단위체의 유전자에 대한 구조 결정을위한 멀티 타겟 접근 방식을 활용하는 방법 강조한다.

인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

단백질 동시 발현은 단백질 복합체의 in vitro 재구성에 대한 강력한 대안이며 in vivo에서 생화학 및 유전자 검사를 수행하는 데 도움이 됩니다. 여기에서 우리는 단백질 복합체를 얻고 세포의 돌연변이 빈도를 조정하기 위해 대장균에서 단백질 공동 발현을 사용하는 것에 대해 보고합니다.

단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em

이 연구는 pMGX 플라스미드 시스템을 사용하여 대장균 에서 단일 플라스미드로부터 다중 유전자의 T7 매개 공동 - 발현을위한 방법을 기술한다.

유도 성 T7 RNA 중합 효소 매개 멀티젠 발현 시스템, pMGX

안정화 신규 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 된 아민 반응성 단백질 가교제를 사용하여 변성 조직 파쇄물로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법 (PAGE) 시스템이 제공된다.

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

이 원고는 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 새로운 방법은 경쟁 바인딩 파트너와 함께 형성 된 복합물 뿐만 아니라 유엔 complexed 개별 단백질을 제외 하는 동안 특정 격리 및 어떤 두 상호 작용 단백질의 다운스트림 proteomic 특성화를 촉진 한다.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

우리는 분할-BioID, 근접 라벨 기술 BioID에 따라 단백질 조각-보완성 분석 결과 대 한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 두 주어진된 단백질의 상호 작용 활성화, 그것은 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 맞는 단백질 복합물의 proteomics 분석을 수 있습니다. 간단 하 고 비용 효율적인 메서드와 표준 실험실 장비에만 필요 합니다.

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)은 생화학, 생물리, 구조 연구에 사용되는 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제(PRMT)의 발현 선별 및 생산을 위한 견고한 플랫폼이다. 밀리그램 수량의 물질은 대부분의 PRMT 및 진핵 발현 플랫폼을 요구하는 관심있는 다른 단백질을 위해 생성될 수 있다.

바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 재조합 PRMT 단백질 생산

여기서 우리는 MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광법 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 사내에서 개발된 단백질을 신속히 서열화한 병원성 박테리아에 의해 생성되는 단백질의 신속한 식별을 위한 프로토콜을 제시합니다. 메타안정 단백질 이온 단편 때문에 아파르트산 효과 및 이러한 특이성은 단백질 식별을 위해 이용된다.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

이 프로토콜은 MultiBac Baculovirus 시스템을 사용하여 인간 myosin-7a holoenzyme을 재조합 생산하고 맞춤형 in vitro 필라멘트 글라이딩 분석을 사용하여 운동성을 연구하는 절차를 자세히 설명합니다.

인간 Myosin-7a의 MultiBac 시스템 기반 정제 및 생물물리학적 특성 분석

학습하세요 MultiBac 시스템을 이용한 단백질 복합체 생산 방법으로, 다중 유전자 구조물을 생성하고 봉충세포에서 발현시켜 정제하는 전 과정을 익히세요. 이 기술은 구조생물학 및 신약 개발 연구에 필수적입니다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

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