원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

다음 실험의 전반적인 목표는 원자력 현미경 또는 FM을 사용하여 내피 glycocalyx의 기계적 특성을 측정하는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 글리코칼릭스층을 구축하기 위해 생물반응기에서 생리학적 흐름 하에 내피 세포의 단층인 내피 세포의 단층을 먼저 배양하여 달성됩니다. 미크론 크기의 비드는 FM 캔틸레버에 부착되어 압입 중 세포체와 글리코칼릭스의 저항력을 측정하기 위한 프로브로 사용됩니다. 다음으로, 글리코칼릭스 계수를 결정하기 위해 압흔 곡선을 2층 모델에 맞추고, 2층 분석을 기반으로 내피 글리코칼릭스가 0.7킬로 파스칼의 계수와 380나노미터의 두께를 갖는다는 것을 보여주는 두께 결과를 얻습니다.

안녕하세요, 저는 로체스터 대학의 의생명공학과 학과장인 Rick Wa입니다. 최근 몇 년 동안 염증에 대한 내피 글리코칼릭스의 가능한 역할, 특히 염증 중 원치 않는 세포 부착을 방지하기 위한 보호 장벽 역할을 할 수 있는지에 대해 많은 논의가 있었습니다. 이 문제를 둘러싼 질문을 해결하기 위한 핵심 중 하나는 물리적 특성, 즉 이 층의 두께와 강성을 정상적인 조건과 염증 반응 중에 모두 측정할 수 있는 능력입니다.

저는 그레이엄 마쉬입니다. 저는 로체스터 대학교 의생명공학과 대학원생입니다. 내피 글리코칼릭스를 특성화하는 데 있어 가장 큰 문제는 믿을 수 없을 정도로 부드럽다는 것입니다.

우리가 생각해 낸 접근법은 측정 된 힘이 A로 해결 될 수 있도록 A FM 캔틸레버의 끝에 큰 비드를 부착하는 것입니다.이 절차를 시작하고 1.0 파스칼의 전단 응력 하에서 세포를 성장시킬 수있는 여기에 표시된 것과 같은 유동 챔버를 구축 FM.To. 먼저 피라냐 용액의 유리 슬라이드를 15분 동안 세척하여 실험을 위한 플로우 챔버를 준비합니다. 증류수로 세 번 헹구고 섭씨 70도에서 30분 동안 건조시킵니다.

다음으로, 증기 증착에 의한 amino propyl trixi, cy lane 또는 apte로 슬라이드를 코팅합니다. 샘플과 함께 진공 챔버에 부착된 플라스크에 1ml의 apte를 추가합니다. 그런 다음 플라스크의 뚜껑을 닫고 1시간 동안 0.7bar의 진공 청소기를 당깁니다.

이 시간 동안 진공 청소기를 세 번 새로 고칩니다. 다음으로, 실루엣 SD 절단 도구를 사용하여 0.4mm 두께의 실리콘 시트에서 새 플로우 챔버 개스킷을 절단합니다. 수로의 크기는 폭 6.4mm, 길이 19mm이며, 망명 양식 접시에 들어갈 수 있도록 외경을 35mm로 절단했다.

이러한 치수를 사용하여 여기에 표시된 방정식을 사용하여 1파스칼의 순면 응력을 생성하는 데 필요한 유량을 계산합니다. Q는 유량을 나타냅니다. 타우는 순전히 스트레스입니다.

Mu는 매체의 점도입니다. H는 채널 높이이고 W는 흐름 챔버의 너비입니다. 다음 단계는 플로우 챔버의 상단 부분을 세포 배양 접시의 개스킷에 정렬하고 마그네틱 링으로 고정하는 것입니다.

세포 배양 접시의 흐름 포트를 30ml 주사기에 대한 라인으로 3개의 웨이브 밸브에 연결합니다. 그런 다음 이소프로필 알코올로 5분 동안 세척하여 전체 어셈블리를 살균합니다. 그런 다음 알코올을 제거하고 조직에서 자연 건조시킵니다.

배양 후드 McCoy의 중간 온도에서 섭씨 37도까지 4% 태아 송아지 혈청을 예열합니다. 5-10분 동안 건조시킨 후 예열 전 태아 송아지 혈청 30ml로 남아 있는 알코올을 씻어냅니다. 그런 다음 주사기에 veek MCDB 1 31 성장 배지 20ml를 채웁니다.

다음으로, 오염을 방지하기 위해 주사기를 덮습니다. 시스템을 멸균 후드 밖으로 옮길 때 유체에 도달하는 바늘로 캐치 저장소의 캡을 끼워 매체를 업스트림 저장소로 다시 끌어당깁니다. 마지막으로 0.2 미크론 멸균 필터를 캡의 공기 흡입구에 부착하여 인간 제대 정맥을 채취합니다.

내피 세포는 T 25 플라스크에서 합류하도록 성장했습니다. 펠릿화된 세포를 100, 매체에 있는 밀리리터 당 000 세포에 다시 중단하고 주사기로 해결책을 위로 당긴다. 다음 3방향 벨브를 통해서 교류 약실로 현탁액을 주사하십시오.

세포가 침전되어 2시간 동안 유리 기판에 부착되도록 합니다. 흐름을 시작하기 전에 생물 반응기와 세포를 세포가 2 시간 동안 정착하고 부착 할 수있는 인큐베이터로 옮깁니다. 저장소를 연동 펌프에 연결하는 튜브는 인큐베이터 뒤쪽을 통과합니다: 세포가 부착되면 연동 펌프를 원하는 유속으로 설정합니다.

매체는 저장소 사이를 이동하여 압력 수두와 생물 반응기를 통한 흐름을 생성하여 1 파스칼의 벽 전단 응력을 생성합니다. 챔버가 합류할 때까지 1-5일 동안 섭씨 37도에서 지속적인 흐름으로 세포가 배양하도록 합니다. 캔틸레버 준비를 시작하려면 팁과 FM 캔틸레버를 질산에 5분 동안 세척한 다음 증류수로 헹굽니다.

건조되면 이전에 유리 슬라이드에 대해 표시된 것처럼 증기 증착 챔버에서 apdi로 캔틸레버를 기능화합니다. 그런 다음 Hank의 완충 염 용액에 중량 기준으로 1 밀리리터 당 5 밀리그램의 용액 NHS Sulf O lc, 비오틴을 준비합니다. 캔틸레버를 용액에 15분 동안 담그십시오.

이 반응은 CY 및 말단 하이드록시 산화물을 접합하고 캔틸레버 표면에 비오틴 분자를 나타냅니다. 전날, 20% 혈청이 포함된 vexcel 배양 배지 20ml와 스트렙트 ENC 코팅 비드 200마이크로리터를 결합하여 비오틴이 없는 배지 용액을 준비하기 시작하고 회전하면서 12시간 동안 배양합니다. 실험 당일.

자석을 사용하여 마그네틱 비드를 튜브 바닥으로 2분 동안 당기고 비오틴이 없는 배지가 포함된 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 0.22마이크로미터 필터를 통과시켜 매체를 살균하고 새 튜브에 넣습니다. 다음 단계는 세포 배양 접시에서 플로우 챔버를 제거한 다음 섭씨 37도의 비오틴이 없는 배지 2밀리리터로 세포를 세 번 세척

그런 다음 직경 2.4마이크로미터의 벗겨진 아덴 코팅 비드 1마이크로그램을 추가합니다. 밀리리터당 10마이크로그램의 농도를 세포 배양 접시에 넣고 부드럽게 섞습니다. 다음으로, A FM tib를 스트립핀 비드에 부착하고 일반 유리 표면에 눌러 보정합니다.

이 작업을 수행하려면 팁을 비드 옆의 유리 표면에 착륙시키고 팁을 집어넣은 다음 캔틸레버의 정점을 비드 위에 놓고 몇 초 동안 아래로 누릅니다. 마지막으로 보정된 캔틸레버를 사용하여 샘플을 들여씁니다. 2.4 마이크로미터 비드는 세포 표면과의 접촉 면적이 더 넓어 소프트 글리코칼릭스 층의 기계적 특성을 보다 쉽게 검출할 수 있습니다.

이 위치를 달성하기 위해 세포핵 근처의 세포 위에 캔틸레버를 놓고 팁을 세포에 부드럽게 접근하여 캔틸레버 높이를 세포 표면에서 약 3마이크로미터 위로 설정합니다. 그런 다음 초당 1마이크로미터의 속도로 표면을 20번 들여쓰기하여 최대 7의 힘을 가합니다. 나노 뉴턴은 연속적인 접촉 사이에 6초의 시간이 경과할 수 있도록 합니다.

헤르츠 이론과 관련된 방정식을 사용하여 glycocalyx 층의 두께를 계산합니다. 압흔 F의 힘은 이 방정식으로 설명되며, 여기서 delta는 압흔 깊이입니다. R은 구 반지름이고 estar는 응력을 받는 재료의 결합된 계수입니다.

결합된 탄성 계수 estar를 세포 및 글리코칼릭스 성분으로 분리하기 위해 글리코칼릭스 층을 세포체 표면의 균일하고 얇은 연질 필름으로 처리하고 Clifford의 2층 모델을 사용하고 이 방정식 C.In PQ와 N은 폴리머 맞춤에서 경험적으로 일정한 결정됩니다. M은 고분자 모델의 상수이고, Z는 여기에 표시된 방정식에 의해 박막 또는 글리코칼릭스 층의 두께와 관련이 있습니다. 나노 뉴턴으로 측정된 A FM에 의해 측정된 힘은 표면과 접촉한 후 증가하기 시작하며 처음에는 글리코칼릭스 층 성분에 의해 지배됩니다.

글리코칼릭스(glycocalyx) 층이 압축되면 세포체가 변형의 주요 구성 요소가 됩니다. 파란색 2층 맞춤 선은 4개의 자유 매개변수를 피팅하여 셀 모듈러스, 글리코칼릭스, 레이어 모듈러스 및 글리코칼릭스 레이어 두께를 모두 결정할 수 있는 방정식에서 빨간색으로 표시된 압흔 데이터와 일치하도록 계산했습니다. 25개 셀의 속성이 여기에 표시된 히스토그램으로 컴파일되었습니다.

평균 글리코칼릭스 층 계수는 0.7 플러스 또는 마이너스 0.5 키파 칼로 결정되었고, 글리코 칼릭스 층 두께는 380 플러스 또는 마이너스 50 나노미터로 결정되었습니다. 이 접근법은 염증 중 세포 부착을 조절하는 글리코칼릭스의 역할에 대한 근본적인 질문에 답하는 데 필요한 도구를 제공합니다. 이제 우리는 염증이 발생하는 동안 글리코칼릭스의 특성이 어떻게 변하는지에 대한 질문을 해결할 수 있습니다.

이러한 변화는 어떤 수단에 의해 이루어집니까? 이 접근 방식은 여러 가지 방법으로 확장할 수 있습니다. 예를 들어, glycocalyx의 특성에 대한 새롭고 더 정교한 이론적 설명을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

또는 보다 실용적인 수준에서, 이를 사용하여 숙주의 면역 반응으로부터 이식 가능한 장치를 보호하도록 설계된 생체 영감 표면 코팅을 테스트할 수 있습니다. 저희 작업에 관심을 가져 주셔서 대단히 감사합니다.