Name: 원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 원자 힘 현미경을 이용해 내피 세포의 Glycocalyx 층을 직접 측정하는 방법을. 생리학적 유하 배양과 마이크론 비드 탐침을 통해 0.7 kPa 탄성률과 380 nm 두께를 정량화합니다.

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저자는이 프로젝트와의 도움을 엘레나 Lomakina, 리처드 Bauserman, 마가렛 젊은, 셰이 Vaknin, 제시카 스나이더, 크리스 Striemer, Nakul Nataraj, 숙취 리 정, Tejas Khire, 그리고 에릭 램을 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIH # PO1 HL 018,208로 운영되었습니다.

1. 방법 1.1 셀 흐름 상공 회의소 세포가 1.0 파 (10 dyn / cm 2)의 전단에 따라 성장 후 정신 병원 MFP3D AFM (산타 바바라, CA)에 직접 전달 될 ​​수 있도록 그림 1에 표시된 흐름 챔버는, 건설되었습니다. <ol><li> 15 분에 한 후 증류수로를 세척 : 흐름 챔버 먼저 피라냐 솔루션 (H 2 O 2 3시 1분 H 2 SO 4) 유리 슬라이드를 청소하여 실험을 준비했습니다. 그들은 그 다음에 구운 된 건조하고 진공 증착 챔버에서 실란 aminopropyl의 triethoxy (APTES)을 코팅. </li><li> 실리콘 가스켓은 실루엣 SD 절단 도구를 사용하여 절단되었습니다. 이것은 우리가 잘게 세포의 성장 동안 유량 및 전단 응력의 제어를위한 흐름 챔버 크기를 제어 할 수있었습니다. 일반적으로 채널은 0.4 mm의 실리콘의 시트에서 긴 19mm에 폭 6.4 mm를 잘라되었습니다. 장군에 필요한 유량테 1.0 파 (10 dyn / cm 2)의 전단 응력은 방정식과 사각형 채널에 판상 흐름을 가정 계산됩니다 : </li></ol><img alt="수식 1" fo:content-width="0.737in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1.jpg" /> Q는 유량이고, τ는 전단 응력이며, μ는 매체의 점도이다 1.0 MPA (0.01 dyn * 초 / cm 2)로 여기 가정, H는 높이이며, w는 유동 챔버의 폭입니다 . <ol start="3"><li> 흐름 챔버의 상단 부분은 세포 배양 접시에있는 가스켓과 정렬과 자기 링으로 고정되었습니다. 조립체는 살균을 위해 이소 프로필 알코올 (IPA)로 가득했다. </li><li> 전체 흐름 시스템은 조립했습니다. 세포 배양 접시의 흐름 포트는 세 방향 밸브에 연결되었습니다. 밸브는 30 ML의 주사기를 엽니 다 연결되었습니다s입니다. IPA 그 다음 4퍼센트 태아 송아지 혈청 (FCS)와 맥코이의 중간의 30 ML에 세척 된 시스템을 통해 플러시되었습니다. 이 시스템은 다음 VEC 기술 세포의 성장 매체 20 ML로 가득했다. 표지는 주사기의 정상에 위치했다. 캐치 저장소의 주사기 캡 피드 저수지로 매체를 이동하는 장소에서 바늘했다. 멸균 0.2 μm 필터는 시스템의 오염을 방지하기 위해 덮개의 공기 유입구에 부착되었다. 흐름 챔버는 세포 심는 준비했습니다. </li></ol> 1.2 세포 배양 <ol><li> 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVEC의) 성장 매체는 VEC 기술에서 구입 (Rensselaer, NY)과 T25 플라스크에 합류로 성장했다. </li><li> 성장 매체는 술병과 2.5 %의 트립신 2 ML을 발표 세포 monolayer에서 제거되었습니다. 세포가 솔루션에 있던되면 trypsinization은 플라스크에 세포 배양 매체의 10 ML를 추가로 침묵했다. </li><li> 일전자 세포 현탁액은 5 분 동안 centrifuged되었고 표면에 뜨는이 삭제되었습니다. 세포는 유동 챔버 내로 분사에 대한 세포 배양 매체 (혈청을 포함) 1 ML에 resuspended되었습니다. </li><li> 세포 현탁액은 (0.5 ML ~ 50,000 세포) 주사기에로드하고 세 방향 밸브를 통해 흐름 챔버에 주입했다. </li><li> 세포는 흐름이 시작되기 전에 2 시간에 정착하고 유리 기판을 준수 할 수 있었다. 세포는 37 보육의 흐름에 따라 성장했습니다 ° 1-5일에 대한 C 합류 때까지. </li></ol> 1.3 캔틸레버 준비 및 셀 들여 쓰기 <ol><li> Tipless AFM의 cantilevers (NanoWorld, 스위스)은 5 분에 질산에 세척하고 기상 증착 챔버에서 실란 aminopropyl의 triethoxy (APTES)와 기능화되었습니다. </li><li> 5 행크의 버퍼 소금 솔루션에 (HBSS) 준비되었습니다 무게 NHS-sulfo-LC-비오틴의 MG / ML의 솔루션입니다. cantilevers는 conju 15 분 동안 솔루션에 잠겨 있었다게이트 N-Hydroxysuccinimide (NHS) 화학으로 실란. </li><li> 비오틴 무료 매체의 솔루션은 12 시간에 streptavadin 구슬 200 μl와 VEC 기술 세포 배양 매체 (혈청 포함)의 20 ML을 잠​​복기에 의해 만들어졌습니다. 구슬은 자석 매체에서 제거되었고 매체가 0.22 μm 살균 필터를 통해 필터링되었습니다. </li><li> 흐름 챔버는 세포 배양 접시에서 제거되었고 셀은 37 ° C 비오틴 - 무료 매체에 세척했다. </li><li> 비오틴 무료 매체 1 ML에 streptavidin으로 코팅 2.4 μm 구슬 1 μl의 주식 솔루션을 준비했고, 주식의 100 μl은 세포 배양 접시에 추가되었습니다. </li><li> Streptavidin 비즈는 구슬, retracting 옆에있는 유리 표면에 팁을 착륙 비드 위에 캔틸레버의 꼭대기를 위치 한 다음 구슬과에 휴식 몇 초에 캔틸레버를 눌러 캔틸레버를 포착했다. </li><li> 캔틸레버의 감도 측정했습니다맨 유리의 지역에 압입 및 전압의 함수로 팁 편향을 설정하는 곡선의 기울기를 사용하여 D. </li><li> 캔틸레버의 봄 상수 다음 MFP3D 소프트웨어의 열 보정으로부터 계산되었다. </li><li> 그림 2와 같이 보정 된 캔틸레버는 다음 샘플을 들여 쓰기하는 데 사용되었다. 이 2.4 μm의 구슬은 부드러운 glycocalyx 층의 기계적 성질이 감지 할 수 있도록 세포 표면에 큰 접촉 면적을 제공합니다. 캔틸레버는 세포 핵 및 세포로 끝이 약 3 μm 세포 표면 위의 캔틸레버 높이를 설정하는 데 사용되었다 부드러운 접근 방식 근처에있는 셀 위에 위치했다. 소프트웨어는 7 NN의 최대 힘 1 μm / 초의 속도로 20 반복 들여 쓰기로 설정되었습니다. 약 6 초는 연속 연락처 사이에 경과. 그것은 glycocalyx의 시간에 따라 달라 속성 테스트 들여 쓰기의 다양한 속도를 사용할 수 있지만이 초기에<html> 실험은 단일 들여 쓰기 속도는 (1 μm / 초)가 사용되었습니다. </li></ol> 2. 들여 쓰기 이론 반경 R의 영역과 반 공간 탄성에 들여 쓰기는 들여 쓰기의 힘, F가 방정식에 의해 주어집니다 헤르츠 이론을 사용하여 설명 될 수있다 : <img alt="수식이" fo:content-width="1.157in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2.jpg" /> δ는 어디 들여 쓰기 깊이와 E *는 테스트중인 자료 (그림 3)의 감소 계수입니다. 균일 한 탄성 반 공간을 impinging 끝도없이 치열한 indenter의 경우, E의 *는 방정식에 의해 주어집니다 : 3/50163eq3.jpg &quot;/&gt; E가 어디 탄성 계수와 ν는 재료의 푸 아송 비율입니다. 폴리머 필름과 최근의 작업은 박막 1의 계수와 두께를 결정하기위한 두 레이어 모델의 개발에 영감을하고 있습니다. 우리는 전지 본체의 표면에 균일 한 박막 부드러운 필름 glycocalyx 치료하여 세포 생물학에이 모델을 적용하고 있습니다. 이 모델을 사용하여 시스템의 감소 계수가된다 : <img alt="수식 4" fo:content-width="2.85in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4.jpg" /> E GC는 glycocalyx의 계수이고, E 셀의 전지 본체의 계수이며, P, Q와 N은 경험적으로 폴리머에 맞는에서 결정되었으며, 및 z는 방정식에 의해 주어집니다 상수 : <p class="jove_content" fo:keep- together.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="수식 5" fo:content-width="1.257in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5.jpg" /> t는 glycocalyx 층의 두께입니다. 이러한 매개 변수의 개략적 인은 그림 3에 표시됩니다. 모델은 강성 기판 (1)에 박막의 계수와 두께를 결정하는 정확한 방법 표시되었습니다. 그림 4와 같이이 방정식은, 내피 glycocalyx의 계수와 두께를 결정하는 셀에 들여 쓰기에서 얻은 곡선에 맞게 사용할 수 있습니다.

<ol><li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoindentation+measurement+of+young%27s+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson%27s+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li>
<li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li>
<li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li>
<li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li>
<li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+surface+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv.+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li>
<li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li>
<li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li>
<li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules%2C+Erythrocytes%2C+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 두 레이어 모델과 내피 벽에 혈액에 순환 백혈구의 상호 작용을 모델링 할 수 헤르츠 이론에서 계산 값을 사용했습니다. 우리는 10 PN 부하에 따라 50 nm의 직경이 백혈구에 microvillus가 glycocalyx에 약 150 nm의 들여 쓰기 것이라는 총 두께의 일부만 계산했습니다. 이이 실험에서 측정 된 특성을 가진 glycocalyx은, 세포 세포의 상호 작용에 중요한 장벽이며 세포가 백혈구 유착 동안 부착 캐스케이드 동안 극복해야 큰 steric 방해가 될 수 있음을 나타냅니다. 모델에서 등방성 탄성 구조와 glycocalyx을 우리가 대략 여기 사용됩니다. 우리가 표시 할 수있는 기계 측정 모르고 있지만이 경우하지 않습니다, 무슨 glycocalyx의 분자 구조에 대해 알려진 것은이 가능성이 과잉 단순화하는 것이 좋습니다. 사실, glycocalyx은 복잡하고 다양세포의 표면에 구조. 그것은 지향 분자 구조로 구성되어, 잘 정의 된 외부 경계를 부족하고,...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 맥코이의 중간 </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 혈청 </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> 내피 세포 성장 매체 </td><td> VEC 기술 </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> 풀링 된 인간 배꼽 정맥 내피 세포 </td><td> VEC 기술 </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> 황산 </td><td> JT 베이커 </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> 과산화수소 </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-aminopropyl) triethoxysilane </td><td> 올드리치 </td><td> 440140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> 이소 프로필 알코올 </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> Cellgro </td><td> 25-054-C1 </td><td></td></tr><tr><td> 행크의 버퍼 소금 솔루션 </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> sulfo-NHS-LC-비오틴 </td><td> 열 과학 </td><td> 21,335 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavadin 비즈 </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP - 3D AFM </td><td> 망명 연구 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tipless Cantilevers </td><td> Nanoworld </td><td> ARROW-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> 실루엣 SD </td><td> Quickutz </td><td> 실루엣-SD </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 고무 </td><td> Stockwell Elastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 ML의 주사기 </TD&gt; <td> 벤톤 디킨슨 </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 게이지 바늘 </td><td> 벤톤 디킨슨 </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> 확장 세트 </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> 4 방향 밸브 </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> 여성 / 남성 포트 캡 </td><td> 스미스의 의료 </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> 연동 운동의 펌프 </td><td> 왓슨-Marlow </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> 연동 운동의 배관 </td><td> 왓슨-Marlow </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> 무균 필터 </td><td> 막 생활 과학 </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

원자 힘 현미경과 내피 glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

백혈구 및 백혈구 캡처하는 동안 혈관 벽의 상호 작용에 대한 우리의 이해는 내피 표면 층의 기계적 성질의 불완전한 이해에 의해 제한됩니다. 이것은 백혈구의 접착 분자가 표면 지형 3 상대적으로 비 균일하게 분포되어 알려져 있습니다, 그 지형이 다른 표면 9 접착제 결합 형성을 제한, 그 생리 접촉 힘 (≈ 5.0 - microvillus 당 10.0 PN)는 등으로 microvilli을 압축 할 수 있습니다 반대 표면 3, 7 분자의 접근성을 증가 자신의 휴식 길이의 세 번째로 조금. 우리는 두 계층 구조, 상대적으로 강성 전지 본체뿐만 아니라 glycocalyx, luminal 표면 6 부드러운 보호 설탕 코팅으로 내피를 고려합니다. 그것은 glycocalyx는 내피 표면 4 백혈구의 접착을 줄이기 위해 장벽의 역할을 할 수 것으로 나타되었습니다.이 보고서에서 우리는 내피 기계 강성이 결합 형성에 영향을 미칠 수 방법을 이해하기 위해 내피 표면의 deformability를 해결하기 시작합니다. 정적 문화에 성장 내피 세포는 강력한 glycocalyx을 표현할 수 없지만, 생리 흐름 조건에서 성장 세포가 생체 2 관찰 대략 glycocalyx에 시작한다. 내피 세포 본체의 계수는 약 5-20 kPa 5로 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 측정되었습니다. glycocalyx의 두께와 구조는 전자 현미경 8을 사용 연구되었으며, glycocalyx의 계수는 간접적 인 방법을 사용하여 추정되었지만, 우리의 지식으로, 살아있는 세포에 glycocalyx 계수의 직접 측정 대한 출판 보고서가 없었습니다 . 본 연구에서는, 우리는 mA 자신의 glycocalyx 표현을 극대화 할 조건에서 배양 된 세포에 새로운 AFM 프로브로 만든 들여 쓰기 실험을 제시내피 glycocalyx의 계수와 두께 KE 직접 측정.

전형적인 실험에서, 20 힘 - 대 - 거리 곡선은 근처 있지만 핵 (~ 2 μm 이내)에, 일반적으로 perinuclear 지역에서, 세포의 특정 지역에서 얻었다. 곡선은 측정 기간 동안 모든 샘플 드리프트에 대한 계정에 정렬 한 후 그림 4에 도시 된 바와 같이, 캔틸레버 노이즈를 제거하는 평균했습니다. 곡선 분석하고 얇은 폴리머 필름 (1)의 계수와 두께를 결정하기 위해 개발되었습니다 두 개의 레이어 모델에 맞게되었습니다. 25 세포의 곡선 맞게에서, 우리는 luminal 층의 계수가 0.7 ± 0.5 kPa이며, 그림 5와 같이 두께가, 380 ± 50 nm의 것으로 판정되었습니다. 전지 본체의 계수는 16 ± 6 kPa입니다. 이 값은 전지 본체와 glycocalyx 5, 8의 두께의 계수의 이전 측정과 좋은 계약입니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

내피 glycocalyx의 기계적 특성은 AFM의 cantilevers에 마이크론 크기의 영역을 사용하여 들여 쓰기에 의해 측정되었다. 내피 세포는 glycocalyx 식을 유도하기 위해 생리 흐름 조건에서 사용자 정의 챔버에 배양 하였다. 데이터는 glycocalyx 두께와 탄성 계수를 결정하기 위해 박막 모델을 사용 분석 하였다.

원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

다음 실험의 전반적인 목표는 원자력 현미경 또는 FM을 사용하여 내피 glycocalyx의 기계적 특성을 측정하는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 글리코칼릭스층을 구축하기 위해 생물반응기에서 생리학적 흐름 하에 내피 세포의 단층인 내피 세포의 단층을 먼저 배양하여 달성됩니다. 미크론 크기의 비드는 FM 캔틸레버에 부착되어 압입 중 세포체와 글리코칼릭스의 저항력을 측정하기 위한 프로브로 사용됩니다. 다음으로, 글리코칼릭스 계수를 결정하기 위해 압흔 곡선을 2층 모델에 맞추고, 2층 분석을 기반으로 내피 글리코칼릭스가 0.7킬로 파스칼의 계수와 380나노미터의 두께를 갖는다는 것을 보여주는 두께 결과를 얻습니다.안녕하세요, 저는 로체스터 대학의 의생명공학과 학과장인 Rick Wa입니다. 최근 몇 년 동안 염증에 대한 내피 글리코칼릭스의 가능한 역할, 특히 염증 중 원치 않는 세포 부착을 방지하기 위한 보호 장벽 역할을 할 수 있는지에 대해 많은 논의가 있었습니다. 이 문제를 둘러싼 질문을 해결하기 위한 핵심 중 하나는 물리적 특성, 즉 이 층의 두께와 강성을 정상적인 조건과 염증 반응 중에 모두 측정할 수 있는 능력입니다.저는 그레이엄 마쉬입니다. 저는 로체스터 대학교 의생명공학과 대학원생입니다. 내피 글리코칼릭스를 특성화하는 데 있어 가장 큰 문제는 믿을 수 없을 정도로 부드럽다는 것입니다.우리가 생각해 낸 접근법은 측정 된 힘이 A로 해결 될 수 있도록 A FM 캔틸레버의 끝에 큰 비드를 부착하는 것입니다.이 절차를 시작하고 1.0 파스칼의 전단 응력 하에서 세포를 성장시킬 수있는 여기에 표시된 것과 같은 유동 챔버를 구축 FM.To. 먼저 피라냐 용액의 유리 슬라이드를 15분 동안 세척하여 실험을 위한 플로우 챔버를 준비합니다. 증류수로 세 번 헹구고 섭씨 70도에서 30분 동안 건조시킵니다.다음으로, 증기 증착에 의한 amino propyl trixi, cy lane 또는 apte로 슬라이드를 코팅합니다. 샘플과 함께 진공 챔버에 부착된 플라스크에 1ml의 apte를 추가합니다. 그런 다음 플라스크의 뚜껑을 닫고 1시간 동안 0.7bar의 진공 청소기를 당깁니다.이 시간 동안 진공 청소기를 세 번 새로 고칩니다. 다음으로, 실루엣 SD 절단 도구를 사용하여 0.4mm 두께의 실리콘 시트에서 새 플로우 챔버 개스킷을 절단합니다. 수로의 크기는 폭 6.4mm, 길이 19mm이며, 망명 양식 접시에 들어갈 수 있도록 외경을 35mm로 절단했다.이러한 치수를 사용하여 여기에 표시된 방정식을 사용하여 1파스칼의 순면 응력을 생성하는 데 필요한 유량을 계산합니다. Q는 유량을 나타냅니다. 타우는 순전히 스트레스입니다.Mu는 매체의 점도입니다. H는 채널 높이이고 W는 흐름 챔버의 너비입니다. 다음 단계는 플로우 챔버의 상단 부분을 세포 배양 접시의 개스킷에 정렬하고 마그네틱 링으로 고정하는 것입니다.세포 배양 접시의 흐름 포트를 30ml 주사기에 대한 라인으로 3개의 웨이브 밸브에 연결합니다. 그런 다음 이소프로필 알코올로 5분 동안 세척하여 전체 어셈블리를 살균합니다. 그런 다음 알코올을 제거하고 조직에서 자연 건조시킵니다.배양 후드 McCoy의 중간 온도에서 섭씨 37도까지 4% 태아 송아지 혈청을 예열합니다. 5-10분 동안 건조시킨 후 예열 전 태아 송아지 혈청 30ml로 남아 있는 알코올을 씻어냅니다. 그런 다음 주사기에 veek MCDB 1 31 성장 배지 20ml를 채웁니다.다음으로, 오염을 방지하기 위해 주사기를 덮습니다. 시스템을 멸균 후드 밖으로 옮길 때 유체에 도달하는 바늘로 캐치 저장소의 캡을 끼워 매체를 업스트림 저장소로 다시 끌어당깁니다. 마지막으로 0.2 미크론 멸균 필터를 캡의 공기 흡입구에 부착하여 인간 제대 정맥을 채취합니다.내피 세포는 T 25 플라스크에서 합류하도록 성장했습니다. 펠릿화된 세포를 100, 매체에 있는 밀리리터 당 000 세포에 다시 중단하고 주사기로 해결책을 위로 당긴다. 다음 3방향 벨브를 통해서 교류 약실로 현탁액을 주사하십시오.세포가 침전되어 2시간 동안 유리 기판에 부착되도록 합니다. 흐름을 시작하기 전에 생물 반응기와 세포를 세포가 2 시간 동안 정착하고 부착 할 수있는 인큐베이터로 옮깁니다. 저장소를 연동 펌프에 연결하는 튜브는 인큐베이터 뒤쪽을 통과합니다: 세포가 부착되면 연동 펌프를 원하는 유속으로 설정합니다.매체는 저장소 사이를 이동하여 압력 수두와 생물 반응기를 통한 흐름을 생성하여 1 파스칼의 벽 전단 응력을 생성합니다. 챔버가 합류할 때까지 1-5일 동안 섭씨 37도에서 지속적인 흐름으로 세포가 배양하도록 합니다. 캔틸레버 준비를 시작하려면 팁과 FM 캔틸레버를 질산에 5분 동안 세척한 다음 증류수로 헹굽니다.건조되면 이전에 유리 슬라이드에 대해 표시된 것처럼 증기 증착 챔버에서 apdi로 캔틸레버를 기능화합니다. 그런 다음 Hank의 완충 염 용액에 중량 기준으로 1 밀리리터 당 5 밀리그램의 용액 NHS Sulf O lc, 비오틴을 준비합니다. 캔틸레버를 용액에 15분 동안 담그십시오.이 반응은 CY 및 말단 하이드록시 산화물을 접합하고 캔틸레버 표면에 비오틴 분자를 나타냅니다. 전날, 20% 혈청이 포함된 vexcel 배양 배지 20ml와 스트렙트 ENC 코팅 비드 200마이크로리터를 결합하여 비오틴이 없는 배지 용액을 준비하기 시작하고 회전하면서 12시간 동안 배양합니다. 실험 당일.자석을 사용하여 마그네틱 비드를 튜브 바닥으로 2분 동안 당기고 비오틴이 없는 배지가 포함된 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 0.22마이크로미터 필터를 통과시켜 매체를 살균하고 새 튜브에 넣습니다. 다음 단계는 세포 배양 접시에서 플로우 챔버를 제거한 다음 섭씨 37도의 비오틴이 없는 배지 2밀리리터로 세포를 세 번 세척하는 것입니다.그런 다음 직경 2.4마이크로미터의 벗겨진 아덴 코팅 비드 1마이크로그램을 추가합니다. 밀리리터당 10마이크로그램의 농도를 세포 배양 접시에 넣고 부드럽게 섞습니다. 다음으로, A FM tib를 스트립핀 비드에 부착하고 일반 유리 표면에 눌러 보정합니다.이 작업을 수행하려면 팁을 비드 옆의 유리 표면에 착륙시키고 팁을 집어넣은 다음 캔틸레버의 정점을 비드 위에 놓고 몇 초 동안 아래로 누릅니다. 마지막으로 보정된 캔틸레버를 사용하여 샘플을 들여씁니다. 2.4 마이크로미터 비드는 세포 표면과의 접촉 면적이 더 넓어 소프트 글리코칼릭스 층의 기계적 특성을 보다 쉽게 검출할 수 있습니다.이 위치를 달성하기 위해 세포핵 근처의 세포 위에 캔틸레버를 놓고 팁을 세포에 부드럽게 접근하여 캔틸레버 높이를 세포 표면에서 약 3마이크로미터 위로 설정합니다. 그런 다음 초당 1마이크로미터의 속도로 표면을 20번 들여쓰기하여 최대 7의 힘을 가합니다. 나노 뉴턴은 연속적인 접촉 사이에 6초의 시간이 경과할 수 있도록 합니다.헤르츠 이론과 관련된 방정식을 사용하여 glycocalyx 층의 두께를 계산합니다. 압흔 F의 힘은 이 방정식으로 설명되며, 여기서 delta는 압흔 깊이입니다. R은 구 반지름이고 estar는 응력을 받는 재료의 결합된 계수입니다.결합된 탄성 계수 estar를 세포 및 글리코칼릭스 성분으로 분리하기 위해 글리코칼릭스 층을 세포체 표면의 균일하고 얇은 연질 필름으로 처리하고 Clifford의 2층 모델을 사용하고 이 방정식 C.In PQ와 N은 폴리머 맞춤에서 경험적으로 일정한 결정됩니다. M은 고분자 모델의 상수이고, Z는 여기에 표시된 방정식에 의해 박막 또는 글리코칼릭스 층의 두께와 관련이 있습니다. 나노 뉴턴으로 측정된 A FM에 의해 측정된 힘은 표면과 접촉한 후 증가하기 시작하며 처음에는 글리코칼릭스 층 성분에 의해 지배됩니다.글리코칼릭스(glycocalyx) 층이 압축되면 세포체가 변형의 주요 구성 요소가 됩니다. 파란색 2층 맞춤 선은 4개의 자유 매개변수를 피팅하여 셀 모듈러스, 글리코칼릭스, 레이어 모듈러스 및 글리코칼릭스 레이어 두께를 모두 결정할 수 있는 방정식에서 빨간색으로 표시된 압흔 데이터와 일치하도록 계산했습니다. 25개 셀의 속성이 여기에 표시된 히스토그램으로 컴파일되었습니다.평균 글리코칼릭스 층 계수는 0.7 플러스 또는 마이너스 0.5 키파 칼로 결정되었고, 글리코 칼릭스 층 두께는 380 플러스 또는 마이너스 50 나노미터로 결정되었습니다. 이 접근법은 염증 중 세포 부착을 조절하는 글리코칼릭스의 역할에 대한 근본적인 질문에 답하는 데 필요한 도구를 제공합니다. 이제 우리는 염증이 발생하는 동안 글리코칼릭스의 특성이 어떻게 변하는지에 대한 질문을 해결할 수 있습니다.이러한 변화는 어떤 수단에 의해 이루어집니까? 이 접근 방식은 여러 가지 방법으로 확장할 수 있습니다. 예를 들어, glycocalyx의 특성에 대한 새롭고 더 정교한 이론적 설명을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.또는 보다 실용적인 수준에서, 이를 사용하여 숙주의 면역 반응으로부터 이식 가능한 장치를 보호하도록 설계된 생체 영감 표면 코팅을 테스트할 수 있습니다. 저희 작업에 관심을 가져 주셔서 대단히 감사합니다.

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