Name: 원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 원자 힘 현미경을 이용해 내피 세포의 Glycocalyx 층을 직접 측정하는 방법을. 생리학적 유하 배양과 마이크론 비드 탐침을 통해 0.7 kPa 탄성률과 380 nm 두께를 정량화합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

저자는이 프로젝트와의 도움을 엘레나 Lomakina, 리처드 Bauserman, 마가렛 젊은, 셰이 Vaknin, 제시카 스나이더, 크리스 Striemer, Nakul Nataraj, 숙취 리 정, Tejas Khire, 그리고 에릭 램을 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIH # PO1 HL 018,208로 운영되었습니다.

1. 방법 1.1 셀 흐름 상공 회의소 세포가 1.0 파 (10 dyn / cm 2)의 전단에 따라 성장 후 정신 병원 MFP3D AFM (산타 바바라, CA)에 직접 전달 될 ​​수 있도록 그림 1에 표시된 흐름 챔버는, 건설되었습니다. <ol><li> 15 분에 한 후 증류수로를 세척 : 흐름 챔버 먼저 피라냐 솔루션 (H 2 O 2 3시 1분 H 2 SO 4) 유리 슬라이드를 청소하여 실험을 준비했습니다. 그들은 그 다음에 구운 된 건조하고 진공 증착 챔버에서 실란 aminopropyl의 triethoxy (APTES)을 코팅. </li><li> 실리콘 가스켓은 실루엣 SD 절단 도구를 사용하여 절단되었습니다. 이것은 우리가 잘게 세포의 성장 동안 유량 및 전단 응력의 제어를위한 흐름 챔버 크기를 제어 할 수있었습니다. 일반적으로 채널은 0.4 mm의 실리콘의 시트에서 긴 19mm에 폭 6.4 mm를 잘라되었습니다. 장군에 필요한 유량테 1.0 파 (10 dyn / cm 2)의 전단 응력은 방정식과 사각형 채널에 판상 흐름을 가정 계산됩니다 : </li></ol><img alt="수식 1" fo:content-width="0.737in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1.jpg" /> Q는 유량이고, τ는 전단 응력이며, μ는 매체의 점도이다 1.0 MPA (0.01 dyn * 초 / cm 2)로 여기 가정, H는 높이이며, w는 유동 챔버의 폭입니다 . <ol start="3"><li> 흐름 챔버의 상단 부분은 세포 배양 접시에있는 가스켓과 정렬과 자기 링으로 고정되었습니다. 조립체는 살균을 위해 이소 프로필 알코올 (IPA)로 가득했다. </li><li> 전체 흐름 시스템은 조립했습니다. 세포 배양 접시의 흐름 포트는 세 방향 밸브에 연결되었습니다. 밸브는 30 ML의 주사기를 엽니 다 연결되었습니다s입니다. IPA 그 다음 4퍼센트 태아 송아지 혈청 (FCS)와 맥코이의 중간의 30 ML에 세척 된 시스템을 통해 플러시되었습니다. 이 시스템은 다음 VEC 기술 세포의 성장 매체 20 ML로 가득했다. 표지는 주사기의 정상에 위치했다. 캐치 저장소의 주사기 캡 피드 저수지로 매체를 이동하는 장소에서 바늘했다. 멸균 0.2 μm 필터는 시스템의 오염을 방지하기 위해 덮개의 공기 유입구에 부착되었다. 흐름 챔버는 세포 심는 준비했습니다. </li></ol> 1.2 세포 배양 <ol><li> 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVEC의) 성장 매체는 VEC 기술에서 구입 (Rensselaer, NY)과 T25 플라스크에 합류로 성장했다. </li><li> 성장 매체는 술병과 2.5 %의 트립신 2 ML을 발표 세포 monolayer에서 제거되었습니다. 세포가 솔루션에 있던되면 trypsinization은 플라스크에 세포 배양 매체의 10 ML를 추가로 침묵했다. </li><li> 일전자 세포 현탁액은 5 분 동안 centrifuged되었고 표면에 뜨는이 삭제되었습니다. 세포는 유동 챔버 내로 분사에 대한 세포 배양 매체 (혈청을 포함) 1 ML에 resuspended되었습니다. </li><li> 세포 현탁액은 (0.5 ML ~ 50,000 세포) 주사기에로드하고 세 방향 밸브를 통해 흐름 챔버에 주입했다. </li><li> 세포는 흐름이 시작되기 전에 2 시간에 정착하고 유리 기판을 준수 할 수 있었다. 세포는 37 보육의 흐름에 따라 성장했습니다 ° 1-5일에 대한 C 합류 때까지. </li></ol> 1.3 캔틸레버 준비 및 셀 들여 쓰기 <ol><li> Tipless AFM의 cantilevers (NanoWorld, 스위스)은 5 분에 질산에 세척하고 기상 증착 챔버에서 실란 aminopropyl의 triethoxy (APTES)와 기능화되었습니다. </li><li> 5 행크의 버퍼 소금 솔루션에 (HBSS) 준비되었습니다 무게 NHS-sulfo-LC-비오틴의 MG / ML의 솔루션입니다. cantilevers는 conju 15 분 동안 솔루션에 잠겨 있었다게이트 N-Hydroxysuccinimide (NHS) 화학으로 실란. </li><li> 비오틴 무료 매체의 솔루션은 12 시간에 streptavadin 구슬 200 μl와 VEC 기술 세포 배양 매체 (혈청 포함)의 20 ML을 잠​​복기에 의해 만들어졌습니다. 구슬은 자석 매체에서 제거되었고 매체가 0.22 μm 살균 필터를 통해 필터링되었습니다. </li><li> 흐름 챔버는 세포 배양 접시에서 제거되었고 셀은 37 ° C 비오틴 - 무료 매체에 세척했다. </li><li> 비오틴 무료 매체 1 ML에 streptavidin으로 코팅 2.4 μm 구슬 1 μl의 주식 솔루션을 준비했고, 주식의 100 μl은 세포 배양 접시에 추가되었습니다. </li><li> Streptavidin 비즈는 구슬, retracting 옆에있는 유리 표면에 팁을 착륙 비드 위에 캔틸레버의 꼭대기를 위치 한 다음 구슬과에 휴식 몇 초에 캔틸레버를 눌러 캔틸레버를 포착했다. </li><li> 캔틸레버의 감도 측정했습니다맨 유리의 지역에 압입 및 전압의 함수로 팁 편향을 설정하는 곡선의 기울기를 사용하여 D. </li><li> 캔틸레버의 봄 상수 다음 MFP3D 소프트웨어의 열 보정으로부터 계산되었다. </li><li> 그림 2와 같이 보정 된 캔틸레버는 다음 샘플을 들여 쓰기하는 데 사용되었다. 이 2.4 μm의 구슬은 부드러운 glycocalyx 층의 기계적 성질이 감지 할 수 있도록 세포 표면에 큰 접촉 면적을 제공합니다. 캔틸레버는 세포 핵 및 세포로 끝이 약 3 μm 세포 표면 위의 캔틸레버 높이를 설정하는 데 사용되었다 부드러운 접근 방식 근처에있는 셀 위에 위치했다. 소프트웨어는 7 NN의 최대 힘 1 μm / 초의 속도로 20 반복 들여 쓰기로 설정되었습니다. 약 6 초는 연속 연락처 사이에 경과. 그것은 glycocalyx의 시간에 따라 달라 속성 테스트 들여 쓰기의 다양한 속도를 사용할 수 있지만이 초기에<html> 실험은 단일 들여 쓰기 속도는 (1 μm / 초)가 사용되었습니다. </li></ol> 2. 들여 쓰기 이론 반경 R의 영역과 반 공간 탄성에 들여 쓰기는 들여 쓰기의 힘, F가 방정식에 의해 주어집니다 헤르츠 이론을 사용하여 설명 될 수있다 : <img alt="수식이" fo:content-width="1.157in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2.jpg" /> δ는 어디 들여 쓰기 깊이와 E *는 테스트중인 자료 (그림 3)의 감소 계수입니다. 균일 한 탄성 반 공간을 impinging 끝도없이 치열한 indenter의 경우, E의 *는 방정식에 의해 주어집니다 : 3/50163eq3.jpg &quot;/&gt; E가 어디 탄성 계수와 ν는 재료의 푸 아송 비율입니다. 폴리머 필름과 최근의 작업은 박막 1의 계수와 두께를 결정하기위한 두 레이어 모델의 개발에 영감을하고 있습니다. 우리는 전지 본체의 표면에 균일 한 박막 부드러운 필름 glycocalyx 치료하여 세포 생물학에이 모델을 적용하고 있습니다. 이 모델을 사용하여 시스템의 감소 계수가된다 : <img alt="수식 4" fo:content-width="2.85in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4.jpg" /> E GC는 glycocalyx의 계수이고, E 셀의 전지 본체의 계수이며, P, Q와 N은 경험적으로 폴리머에 맞는에서 결정되었으며, 및 z는 방정식에 의해 주어집니다 상수 : <p class="jove_content" fo:keep- together.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="수식 5" fo:content-width="1.257in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5.jpg" /> t는 glycocalyx 층의 두께입니다. 이러한 매개 변수의 개략적 인은 그림 3에 표시됩니다. 모델은 강성 기판 (1)에 박막의 계수와 두께를 결정하는 정확한 방법 표시되었습니다. 그림 4와 같이이 방정식은, 내피 glycocalyx의 계수와 두께를 결정하는 셀에 들여 쓰기에서 얻은 곡선에 맞게 사용할 수 있습니다.

<ol><li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoindentation+measurement+of+young%27s+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson%27s+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li>
<li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li>
<li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li>
<li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li>
<li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+surface+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv.+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li>
<li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li>
<li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li>
<li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules%2C+Erythrocytes%2C+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 두 레이어 모델과 내피 벽에 혈액에 순환 백혈구의 상호 작용을 모델링 할 수 헤르츠 이론에서 계산 값을 사용했습니다. 우리는 10 PN 부하에 따라 50 nm의 직경이 백혈구에 microvillus가 glycocalyx에 약 150 nm의 들여 쓰기 것이라는 총 두께의 일부만 계산했습니다. 이이 실험에서 측정 된 특성을 가진 glycocalyx은, 세포 세포의 상호 작용에 중요한 장벽이며 세포가 백혈구 유착 동안 부착 캐스케이드 동안 극복해야 큰 steric 방해가 될 수 있음을 나타냅니다. 모델에서 등방성 탄성 구조와 glycocalyx을 우리가 대략 여기 사용됩니다. 우리가 표시 할 수있는 기계 측정 모르고 있지만이 경우하지 않습니다, 무슨 glycocalyx의 분자 구조에 대해 알려진 것은이 가능성이 과잉 단순화하는 것이 좋습니다. 사실, glycocalyx은 복잡하고 다양세포의 표면에 구조. 그것은 지향 분자 구조로 구성되어, 잘 정의 된 외부 경계를 부족하고,...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 맥코이의 중간 </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 혈청 </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> 내피 세포 성장 매체 </td><td> VEC 기술 </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> 풀링 된 인간 배꼽 정맥 내피 세포 </td><td> VEC 기술 </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> 황산 </td><td> JT 베이커 </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> 과산화수소 </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-aminopropyl) triethoxysilane </td><td> 올드리치 </td><td> 440140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> 이소 프로필 알코올 </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> Cellgro </td><td> 25-054-C1 </td><td></td></tr><tr><td> 행크의 버퍼 소금 솔루션 </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> sulfo-NHS-LC-비오틴 </td><td> 열 과학 </td><td> 21,335 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavadin 비즈 </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP - 3D AFM </td><td> 망명 연구 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tipless Cantilevers </td><td> Nanoworld </td><td> ARROW-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> 실루엣 SD </td><td> Quickutz </td><td> 실루엣-SD </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 고무 </td><td> Stockwell Elastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 ML의 주사기 </TD&gt; <td> 벤톤 디킨슨 </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 게이지 바늘 </td><td> 벤톤 디킨슨 </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> 확장 세트 </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> 4 방향 밸브 </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> 여성 / 남성 포트 캡 </td><td> 스미스의 의료 </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> 연동 운동의 펌프 </td><td> 왓슨-Marlow </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> 연동 운동의 배관 </td><td> 왓슨-Marlow </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> 무균 필터 </td><td> 막 생활 과학 </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

원자 힘 현미경과 내피 glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

백혈구 및 백혈구 캡처하는 동안 혈관 벽의 상호 작용에 대한 우리의 이해는 내피 표면 층의 기계적 성질의 불완전한 이해에 의해 제한됩니다. 이것은 백혈구의 접착 분자가 표면 지형 3 상대적으로 비 균일하게 분포되어 알려져 있습니다, 그 지형이 다른 표면 9 접착제 결합 형성을 제한, 그 생리 접촉 힘 (≈ 5.0 - microvillus 당 10.0 PN)는 등으로 microvilli을 압축 할 수 있습니다 반대 표면 3, 7 분자의 접근성을 증가 자신의 휴식 길이의 세 번째로 조금. 우리는 두 계층 구조, 상대적으로 강성 전지 본체뿐만 아니라 glycocalyx, luminal 표면 6 부드러운 보호 설탕 코팅으로 내피를 고려합니다. 그것은 glycocalyx는 내피 표면 4 백혈구의 접착을 줄이기 위해 장벽의 역할을 할 수 것으로 나타되었습니다.이 보고서에서 우리는 내피 기계 강성이 결합 형성에 영향을 미칠 수 방법을 이해하기 위해 내피 표면의 deformability를 해결하기 시작합니다. 정적 문화에 성장 내피 세포는 강력한 glycocalyx을 표현할 수 없지만, 생리 흐름 조건에서 성장 세포가 생체 2 관찰 대략 glycocalyx에 시작한다. 내피 세포 본체의 계수는 약 5-20 kPa 5로 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 측정되었습니다. glycocalyx의 두께와 구조는 전자 현미경 8을 사용 연구되었으며, glycocalyx의 계수는 간접적 인 방법을 사용하여 추정되었지만, 우리의 지식으로, 살아있는 세포에 glycocalyx 계수의 직접 측정 대한 출판 보고서가 없었습니다 . 본 연구에서는, 우리는 mA 자신의 glycocalyx 표현을 극대화 할 조건에서 배양 된 세포에 새로운 AFM 프로브로 만든 들여 쓰기 실험을 제시내피 glycocalyx의 계수와 두께 KE 직접 측정.

전형적인 실험에서, 20 힘 - 대 - 거리 곡선은 근처 있지만 핵 (~ 2 μm 이내)에, 일반적으로 perinuclear 지역에서, 세포의 특정 지역에서 얻었다. 곡선은 측정 기간 동안 모든 샘플 드리프트에 대한 계정에 정렬 한 후 그림 4에 도시 된 바와 같이, 캔틸레버 노이즈를 제거하는 평균했습니다. 곡선 분석하고 얇은 폴리머 필름 (1)의 계수와 두께를 결정하기 위해 개발되었습니다 두 개의 레이어 모델에 맞게되었습니다. 25 세포의 곡선 맞게에서, 우리는 luminal 층의 계수가 0.7 ± 0.5 kPa이며, 그림 5와 같이 두께가, 380 ± 50 nm의 것으로 판정되었습니다. 전지 본체의 계수는 16 ± 6 kPa입니다. 이 값은 전지 본체와 glycocalyx 5, 8의 두께의 계수의 이전 측정과 좋은 계약입니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

내피 glycocalyx의 기계적 특성은 AFM의 cantilevers에 마이크론 크기의 영역을 사용하여 들여 쓰기에 의해 측정되었다. 내피 세포는 glycocalyx 식을 유도하기 위해 생리 흐름 조건에서 사용자 정의 챔버에 배양 하였다. 데이터는 glycocalyx 두께와 탄성 계수를 결정하기 위해 박막 모델을 사용 분석 하였다.

원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

다음 실험의 전반적인 목표는 원자력 현미경 또는 FM을 사용하여 내피 glycocalyx의 기계적 특성을 측정하는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 글리코칼릭스층을 구축하기 위해 생물반응기에서 생리학적 흐름 하에 내피 세포의 단층인 내피 세포의 단층을 먼저 배양하여 달성됩니다. 미크론 크기의 비드는 FM 캔틸레버에 부착되어 압입 중 세포체와 글리코칼릭스의 저항력을 측정하기 위한 프로브로 사용됩니다. 다음으로, 글리코칼릭스 계수를 결정하기 위해 압흔 곡선을 2층 모델에 맞추고, 2층 분석을 기반으로 내피 글리코칼릭스가 0.7킬로 파스칼의 계수와 380나노미터의 두께를 갖는다는 것을 보여주는 두께 결과를 얻습니다.안녕하세요, 저는 로체스터 대학의 의생명공학과 학과장인 Rick Wa입니다. 최근 몇 년 동안 염증에 대한 내피 글리코칼릭스의 가능한 역할, 특히 염증 중 원치 않는 세포 부착을 방지하기 위한 보호 장벽 역할을 할 수 있는지에 대해 많은 논의가 있었습니다. 이 문제를 둘러싼 질문을 해결하기 위한 핵심 중 하나는 물리적 특성, 즉 이 층의 두께와 강성을 정상적인 조건과 염증 반응 중에 모두 측정할 수 있는 능력입니다.저는 그레이엄 마쉬입니다. 저는 로체스터 대학교 의생명공학과 대학원생입니다. 내피 글리코칼릭스를 특성화하는 데 있어 가장 큰 문제는 믿을 수 없을 정도로 부드럽다는 것입니다.우리가 생각해 낸 접근법은 측정 된 힘이 A로 해결 될 수 있도록 A FM 캔틸레버의 끝에 큰 비드를 부착하는 것입니다.이 절차를 시작하고 1.0 파스칼의 전단 응력 하에서 세포를 성장시킬 수있는 여기에 표시된 것과 같은 유동 챔버를 구축 FM.To. 먼저 피라냐 용액의 유리 슬라이드를 15분 동안 세척하여 실험을 위한 플로우 챔버를 준비합니다. 증류수로 세 번 헹구고 섭씨 70도에서 30분 동안 건조시킵니다.다음으로, 증기 증착에 의한 amino propyl trixi, cy lane 또는 apte로 슬라이드를 코팅합니다. 샘플과 함께 진공 챔버에 부착된 플라스크에 1ml의 apte를 추가합니다. 그런 다음 플라스크의 뚜껑을 닫고 1시간 동안 0.7bar의 진공 청소기를 당깁니다.이 시간 동안 진공 청소기를 세 번 새로 고칩니다. 다음으로, 실루엣 SD 절단 도구를 사용하여 0.4mm 두께의 실리콘 시트에서 새 플로우 챔버 개스킷을 절단합니다. 수로의 크기는 폭 6.4mm, 길이 19mm이며, 망명 양식 접시에 들어갈 수 있

quantifying-mechanical-properties-endothelial-glycocalyx-with-atomic

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 내피 세포를 통한 세포 외 기질 강성 의존성 리스테리아 모노사이토제네스 전파를 평가하기 위한 정량적 타임 랩스 현미경을 보여줍니다. 더 부드러운 하이드로겔은 더 단단한 하이드로겔에 비해 내피 세포를 통한 더 빠른 박테리아 전파를 촉진하며, 이는 박테리아 전파에 대한 매트릭스 강성의 영향을 강조합니다.

세포외 기질 강성에 따른 박테리아 전파를 평가하기 위한 정량적 타임랩스 현미경

내피 내피 / glycocalyx 표면 층은 이상적인 intravital 현미경을 사용하여 공부하고 있습니다. Intravital 현미경은 기술적 같은 폐 등 움직이는 장기에 도전하고 있습니다. 우리는 동시 brightfield 및 형광 현미경은 자유롭게 - 이동에 내피 표면 층의 두께를 추정하는 데 사용할 수 있습니다 방법을...

마우스 폐 내피 표면 층의 생체 측정

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

우리는 내피 세포 단층 내에서 접착 세포의 실제 수를 정량화할 수 있는 시험관 내 방법을 보고합니다.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

우리는 원자력 현미경을 사용하여 마우스에서 대동맥을 분리하고 탄성 계수를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

우리는 면역학적 연구를 위한 단 하나 T 세포 및 비드 입자를 가진 원자력 현미경 (AFM) 캔틸레버를 기능화하는 프로토콜을 제시합니다. AFM에 의해 단일 쌍 T 세포 수지상 세포 결합을 조사하고 형광 이미징을 통해 AFM에 의해 단일 고체 입자에 대한 대식세포의 실시간 세포 반응을 모니터링하는 절차가 도시된다.

단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

거의 UV 리소그래피 및 견인력 현미경 검사법은 마이크로패턴 하이드로겔의 세포력을 측정하기 위해 결합됩니다. 단일 셀의 표적 광 유도 방출은 동일한 샘플에서 많은 수의 측정을 가능하게 합니다.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

원자력 현미경(AFM) 프로브 팁이 샘플 표면에 가하는 접촉 면적과 힘을 정량화하면 나노 크기의 기계적 특성을 측정할 수 있습니다. 탄성 계수 또는 기타 나노기계적 특성을 측정하기 위해 연질 및 경질 샘플의 공기 또는 유체에서 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 구현하는 모범 사례에 대해 설명합니다.

원자력 현미경 캔틸레버 기반 나노인덴테이션: 공기 및 유체의 나노 스케일에서 기계적 특성 측정

우리는 관련 혈관 흐름 조건에서 혈관 내피 세포(EC)를 배양하기 위해 조정 가능한 젤라틴 기반 기질을 합성하고 특성화했습니다. 이 생체 모방 표면은 생리학적 및 병리학적 조건을 모두 복제하여 EC 행동에 대한 기계적 힘을 연구하고 혈관 건강 및 질병 메커니즘에 대한 이해를 증진합니다.

내피 세포 반응을 연구하기 위해 기질 강성과 흐름을 통합하는 시험관 내 모델

이 프로토콜은 쥐 폐 조직의 냉동 절편을 준비하고, 원자력 현미경 힘 매핑 실험을 수행하고, 데이터를 분석하여 천연 쥐 폐 기저막의 Young's modulus를 결정하는 방법을 시각화합니다.

원자력 현미경 도출된 힘 맵에서 토착 쥐 폐 기저막의 Young's Modulus 추출

배우세요 원자 힘 현미경을 이용해 내피 세포의 Glycocalyx 층을 직접 측정하는 방법을. 생리학적 유하 배양과 마이크론 비드 탐침을 통해 0.7 kPa 탄성률과 380 nm 두께를 정량화합니다.

원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

더 많은 동영상 탐색