Name: 미생물 시스템 생물학의 Chemostats의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T20:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: 배우세요 미생물 시스템 생물학에서 키모스탯을 활용한 연속 배양 기술과 수학적 모델링 방법을. 이 기술은 세포 생리학 및 적응 진화 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 자금이 뉴욕 대학을 형성하기 시작에 의해 지원되었다. 우리는 처음에 chemostats로 Sixfors 생물 반응기의 사용을 개발 미륵 던햄와 매트 브라우어 감사합니다.

chemostat를 이용한 연속 배양의 원리는 다양한 구현으로 구현 될 수있다. 모든 chemostats에서는 모든 구성 요소의 무균 상태를 유지하기위한 1) 방법을 가지고하는 것이 필수적입니다, 2) 잘 혼합 된 문화, 배양 용기의 3) 적절한 통풍 및 미디어뿐만 아니라 문화의 제거 4) 신뢰할 수있는 수단. 여기, 우리는 쉽게 다른 설정에 적용 할 수있는 방법을 사용하여 chemostat로 Sixfors 생물 반응기 (Infors 병원)의 사용을 설명합니다. 1. Chemostat 용기를 조립 <ol><li> 메인 스위치를 사용하여 Sixfors를 켭니다. </li><li> 철저히 chemostat 용기, 교반기 어셈블리, 탈 (DI) 물 부착 된 튜브를 씻어. 모든 배관 및 O-링을 점검하고보고 마모 조각을 교체합니다. </li><li> 구동축의지지 기반은 유리 용기에 드라이브 샤프트의 상단은 교반기 어셈블리의 하우징에 물리도록 위로 향하게되어 있는지 확인합니다. stirre을 설정구동축의 하단을 보장 유리기에 R 조립체는 구동축지지 장착된다. 유리 용기에 교반기 어셈블리를 고정하는 클램프를 사용합니다. </li><li> DI 물 약 300 ㎖로 배를 채우십시오. </li><li> 프로브 (2 할) 및 하단 케이스를 풀고 하단 케이스가 전해질 용액을 반쯤 채워진 것을 확인하여 전해질 수준을 확인 용존 산소에서 캡을 제거합니다. 하단 케이스를 Rescrew 및 chemostat 용기에있는 포트에 삽입합니다. 손가락을 꽉 때까지 고정합니다. </li><li> 산도 프로브를 가지고 자사의 저장 버퍼 (3 M의 KCl)에서 제거합니다. 산도 프로브 캡을 제거하고 발효기 1로 연결합니다. Sixfors 제어 화면을 사용하여 발효기 매개 변수 메뉴로 이동하고 &quot;산도를 교정&quot;을 선택합니다. 표준의 pH 7 버퍼와 높은 읽기와 같은 기록 독서에 산도 프로브를 놓습니다. pH를 4 버퍼 및 낮은 읽기와 같은 기록 독서와 반복합니다. 발효기에서의 pH 프로브를 분리, 탈 이온수로 세척하고 프로브 INT를 삽입오 chemostat 용기의 포트. 손가락을 꽉 때까지 고정합니다. </li><li> 랙에 chemostat 용기를 놓습니다. 산도 프로브에 연결되어 보정 된 발효기 (1-6) 용기에 유의하십시오. 산도 프로브의 pH 프로브 뚜껑을 놓습니다. 호일을 사용하여 단단하게 할 2 프로브의 상단 커버. </li><li> chemostat 용기에 부착 된 튜브의 끝 부분에 호일을 접습니다. </li><li> 반복 모든 선박에 대한 1.2-1.8 단계를 반복합니다. </li><li> 액체 사이클 15 분 동안 그 압력 가마로 소독을하여 혈관을 소독. </li></ol> 2. 미디어 준비 <ol><li> 다른 영양소 농도에 배치 문화를 성장하여 영양소 농도의 제한 범위를 설정합니다. 최종 세포 밀도는 초기 영양소 농도의 선형 함수 (도 4) 여기서 영양소 범위로 제한된다. 물론 제한 범위 내에서 영양소 농도를 선택합니다. Saccharomyce와 연구를위한 표준 용지 조성의 예님의 사카로 마이 세스 세레 비시 애는 7-11에서 사용할 수 있습니다. </li><li> 먼저 미디어 튜브의 끝이 호일에 덮여했는지 확인한 후 공기 흡입구 및 언론 매체를 포함하는 고무 플러그 났고 빈 상자 속에 든 대형 유리 병을 압력솥. </li><li> 별도의 용기에서 미디어의 10 L를 준비합니다. </li><li> 100 ㎖ 미디어 병에 500 ㎖의 필터 컵을 연결합니다. 에탄올 소독 집게로면 필터를 제거하고 즉시 미디어 상자 속에 든 대형 유리 병에 여과 포트에 연결합니다. </li><li> 필터 컵에 추가하여 미디어를 살균 진공 소스 필터에 미디어 상자 속에 든 대형 유리 병을 연결합니다. </li><li> 매체의 여과가 완료되면, 금속 클램프 여과 포트를 닫는다. </li></ol> 3. DO 2 프로브를 교정하고 Chemostat 설정 <ol><li> chemostat 혈관 멸균 및 해당 열 재킷 장소에게 용기를 냉각 한 후. 온도 프로브, 산도 프로브, 놀거리와 2 프로브를 연결합니다. 하자배는 할 2 프로브가 극성을 할 수 있도록 최소 6 시간 동안 전원에 앉아. </li><li> 별도의 수집 용기에 각각의 유출 관의 끝을 놓으십시오. 멸균 필터를 통해 공기 공급 장치를 연결하고 공기 흐름을 켭니다. 각 용기에 물은 모든 씰이 제대로 형성되어 있음을 나타냅니다 유출 튜브의 유출한다. </li><li> 원하는 작업 볼륨 (예를 들어 300 ㎖)에 따라 유출 관의 높이를 조정합니다. 우리는 다른 작업의 볼륨을 교정 관의 게재 위치로 표시되어 통치자를 사용합니다. </li><li> chemostat 용기에 미디어 상자 속에 든 대형 유리 병을 연결합니다. 튜브를 유지하기 위하여 에탄올을 사용하여 가능한 한 멸균 종료한다. 펌프 및 오픈 클램프를 통해 펌프 호스를 끼 웁니다. 미디어 chemostat 용기에 흘러 시작할 때까지 수동으로 펌프를 누릅니다. 펌프에서 튜브를 해제, 미디어 chemostat 용기에 자유롭게 흐름한다. 용지가 유출 관에 도달하면, 펌프 및 클램프 튜브를 다시 연결합니다. </li><li> RU에게 시작임펠러 400 RPM으로 설정하고 30 ℃로 설정 온도에 기본 프로그램을 nning </li><li> , DO 2 프로브를 보정 공기 공급 장치를 해제하고 질소 가스로 전환하기 위해. &quot;낮은 읽기&quot;로 적어도 1 시간 기록 측정 값을 기다립니다. 다시 (즉, 주위의 산소 농도를 포함하는) 공기 공급 장치로 전환 &quot;높은 읽기&quot;로 하나 이상의 추가 시간 기록 측정을 기다립니다. </li><li> 아이리스 소프트웨어를 사용하여 데이터의 기록을 시작합니다. </li></ol> 4. 접종 <ol><li> 배양 용기의 상단을 소독하기 위해 70 % 에탄올을 사용합니다. </li><li> chemostat 용기에 용기 상단과 피펫 하룻밤 문화 1 ㎖에 나사를 제거합니다. 나사를 다시 조입니다. </li><li> 아이리스 접종의 시간을 나타냅니다. </li><li> 문화가 초기 고정 단계에 도달하는 약 24 시간을 기다립니다. 문화가 성장함에 따라, 용존 산소와 pH는 감소합니다. 포도당 - 제한적인 미디어의 경우, 용해 된 산소는 고정식 PHA에서 ~ 100 %로 반환그 자체. 다른 영양소의 제한 사항은 용존 산소는 정지상의 &lt;100 %로 유지됩니다. </li></ol> 5. 펌프를 시작 및 정지 상태를 얻으면 <ol><li> 희석 비율은 배양 부피 (얼마나 많은 미디어 시간당 용기로 유입)의 유량을 나누어 계산한다. 예를 들어, 300 ㎖의 0.1 희석율의 볼륨을 사용하여 미디어 30 ㎖가 문화 시간마다 첨가된다는 것을 의미한다. 시스템은 동일한 볼륨을 배양 연속적 희석 것을 보장 용기로부터 제거 된 양의 압력을 받고 있기 때문에. 희석 비율 (D)의 범위는 세포가 chemostat 씻겨 될 위의 셀의 최대 성장률 (μ 최대)를 초과하지 않는 사용할 수 있습니다. </li><li> 원하는 유량을 설정하기 위해, 펌프가 ON과 OFF 시간 (초)를 지정 펌프 설정을 선택한다. 펌프는 ~ 0.11 ㎖ / sec의 속도로 미디어를 제공합니다. </li><li> Sixfors의 INT를 사용하여 프로그램을 정의펌프 타이밍, 온도 및 임펠러 속도를 지정 erface. 프로그램을 시작합니다. </li><li> 액체의 수집 용기를 비우고 시간을 기록한다. </li><li> 적어도 두 시간 후, 용기로부터 제거 된 얼마나 많은 미디어 측정하는 눈금 실린더를 사용한다. 이것은 chemostat 용기에 첨가 한 양을 같게한다. 희석 비율 (D = V 유출 / V 문화 / 시간)을 계산합니다. 계산 희석율 원하는 희석 비율과 일치하지 않을 경우 펌프의 설정을 조정한다. </li><li> 정상 상태에서, chemostat의 세포 밀도는 시간이 지남에 따라 변경되지 않습니다. 이것은 유출을 샘플링하여 문화를 교란하지 않고 측정 할 수 있습니다. 우리는 운영 체제는 적어도 하나의 인구가 두배로 구분됩니다 동일한 세포 밀도 측정으로 정상 상태의 달성을 정의합니다. 정상 상태에 도달하면 문화 희석 개시 후 약 8 문화 세대를 취할 것입니다. 정상 상태에서 세포 즉, (기하 급수적으로 증가영양이 제한된 조건에서 시간에 전자. 지속적인 성장 속도). 인구 (생성 시간)의 배가 시간은 LN (2) / D입니다. </li><li> 주기적으로 일정한 희석 비율이 유지되도록하여 실험 기간 동안 유출 물 부피를 측정하는 것을 계속한다. </li></ol> 6. 응용 프로그램 1 : 정상 상태에서 다른 속도로 성장하고있는 공부 세포 <ol><li> chemostat에서 정상 상태에서, 세포 집단의 성장 속도는 희석 비율과 동일하다. 체계적 희석 비율을 변경하여 서로 다른 속도로 세포가 성장하는 것이 가능하다. 이 세포 부피, 세포주기 단계와 스트레스 저항 등의 성장 속도에 따라 달라 생리 학적 매개 변수의 체계적인 연구를 할 수 있습니다. 또한, 해외의 mRNA, 단백질 및 대사 산물 농도의 정상 상태 정보는 서로 다른 속도로 세포 성장으로 측정 될 수있다. 샘플을 취득하는 방법에는 두 가지가 있습니다 : </li><li> 작은 샘플을 수동적으로 OB 될 수 있습니다1.5 ㎖를 15 ㎖의 튜브 내로 유출 튜브의 단부를 배치하여 부여되었습니다. 1-5 밀리리터의 샘플 (유량)에 따라 몇 분을 얻을 수있다. 많은 생리 학적 매개 변수는이 샘플에서 측정 할 수있다. </li><li> 유전자 발현, 또는 대사 산물 분석은 가능한 한 빨리 얻을 수 있어야 더 큰 샘플을 필요로합니다. 15 ML 원뿔 관에 유출 관의 끝을 놓으십시오. 유출 관의 금속 끝을 잡고 나사를 풀고 조심스럽게 아래로 누릅니다. ~ 10 ㎖ 샘플은 빠르게 당신의 관을 채울 것입니다. chemostat 용기에 볼륨이 변경되었음을 명심하십시오. 다수의 연속 샘플을 촬영하는 경우에는 일정한 희석 속도를 유지하기 위해 유량을 감소시킬 필요가있을 수있다. </li></ol> 7. 응용 프로그램 2 : 유동 세포 계측법 기반 경쟁 분석 실험을 사용하여 제어 환경에서의 유전자형 사이 성장율의 차이의 정확한 측정 <ol><li> Chemostats 정확하게 영양소 농도의 영향을 정량화하는데 사용될 수있다서로 다른 유전 적 배경 사이의 성장률 (즉, 피트니스)의 차이에. 다른 형광 단백질로 표지 공동 배양 균주에 의해 기하 급수적으로 성장하는 동안 상대적으로 풍부한 변화의 속도가 결정된다. 다른 희석 비율 (D)에서이 분석을 수행하면 체력의 차이에 영양소 농도 (들)의 효과에 대한 연구를 할 수 있습니다. </li><li> 동일한 희석 비율과 300 ㎖를 별도 chemostat 혈관의 두 계통의 정상 상태의 문화를 설정합니다. </li><li> 수동적으로 각 용기로부터 1 ㎖를 샘플링. 세포를 스핀 다운, 인산에 resuspend 4 ℃에서 생리 식염수 (PBS)과 장소를 버퍼 이 샘플들은 이후 유동 세포 계측법 분석을위한 컨트롤입니다 균일 한 세포 샘플을 포함하고 있습니다. </li><li> 멸균 눈금 실린더에 하나의 용기에서 유출 튜브를 놓습니다. 유출 관의 금속 끝을 잡고 나사를 풀고 조심스럽게 chemostat 세포를 추방 아래로 밀어 넣습니다. 언제볼륨은 원래의 위치 (300 ㎖)로 유출 관의 금속 끝을 돌려, 150 ㎖에 도달한다. 다른 눈금 실린더를 사용하여, 제 용기로 반복한다. </li><li> chemostat 용기의 상단에 나사를 제거하는 동안 무균 상태를 유지하기 위해 70 % 에탄올을 사용합니다. 개방에 깔때기를 놓고 chemostat 용기에 다른 문화에서 150 ㎖를 부어. 나사를 다시 조입니다. 두 번째 깔때기를 사용하여, 두 번째 선박으로 반복합니다. 각 chemostat 용기는 이제 두 균주의 혼합물을 포함하고 있습니다. </li><li> 매일 2-6 시간 수동 샘플링을 사용하여 각 선박에서 1 ㎖ 샘플을 얻습니다. 세포를 스핀 다운에 resuspend 4 ℃에서 PBS 및 저장 2~3일 신중하게 각각의 샘플이 촬영 된 시간을 기록하는 샘플 촬영을 계속합니다. </li><li> 실험, 초음파 처리의 끝에서 샘플 ~ 2 × 106 세포 / ml로 희석. 유세포 분석기를 사용하여 각 샘플에서이 균주의 비율을 측정한다. 두 균주는 기하 급수적 성장으로, 상대적인 성장 속도의 차이는시간 (세대 단위로 측정)에 대해 LN의 선형 회귀 (strain1/strain2)에 의해 결정된다. 회귀의 기울기는 다른 하나의 변형 상대 (피트니스 장점 즉) 성장 속도에 비례 차이입니다. </li><li> 혼합 문화가 새로운 정상 상태를 달성하는 데 시간이 걸릴 수 있듯이, 초기 시점 회귀에 제대로 맞지 수 있습니다. 이 문제는 최고 2 ~ 3 세대가 샘플링을 시작하거나 해제 특이하다 빨리 점을 제거하기 전에 경과 할 수 있도록함으로써 해결된다. 한 균주는 다른 outcompeted 일단 반대로, 데이터는 더 이상 유용하지 않으며이 점은 제외한다. </li></ol> 8. 응용 프로그램 3 : 실험 진화 <ol><li> chemostats에서 수행 실험 진화는 영양이 제한된 환경에서 피트니스 증가하는 돌연변이에 대한 선택합니다. 선택은 일반적으로 수백 세대에 걸쳐 수행된다. </li><li> 균주를 사용하여 정상 상태 chemostat 배양 수립알려진 유전자형 (바람직 알려진 게놈 서열)과 정의 된 영양소 제한. </li><li> 적응시키는 인구의 &quot;화석 기록&quot;을 유지하는 것은 수동적으로 2-3 일마다 chemostat 샘플 및 -80 ° C에서 15 % 글리세롤에 샘플을 저장 </li><li> 미디어 저장을 모니터하고 필요에 신​​선한 매체와 보충. </li><li> 수백 세대에 기하 급수적으로 증가하고 문화를 유지한다. </li><li> 선택 접시 고체 한천 플레이트에 세포 샘플의 완료 후에. 세포 식민지로 성장 한 후 이쑤시개를 사용하여 식민지의 공정한 샘플을 선택하고 미디어 100 μl를 포함하는 96 - 웰 플레이트의 각각의 우물에 클론을 접종. 클론 샘플, 밤새 성장 C. -80 °에서 30 % 글리세롤 및 저장의 100 μl를 추가 할 수 있도록 허용 </li><li> 전체 게놈 시퀀싱 및 응용 프로그램 2에 설명 된대로, 적합성 평가 등의 표현형 분석을 수행하는 일반적인 형광 표지 참조 균주를 사용하여 복제를 특징. &lt;/ 리&gt; </ol>

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<li>Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+control+of+cell+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular control of cell size.</a> Nat. Cell Biol. 3, 918-921 (2001).</li>
<li>Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+hopf+bifurcation+in+a+live+predator-prey+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system.</a> Science. 290, 1358-1360 (2000).</li>
<li>Cohen, E. P., Eagle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+chemostat+for+the+growth+of+mammalian+cells%3A+characteristics+of+cell+growth+in+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture.</a> J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Chemostats 성장 제어 정상 상태 조건에서 미생물의 배양을 가능하게한다. 세포는 고정 외부 환경의 결과로 일정한 속도로 연속적으로 성장한다. 이것은 외부 환경이 지속적으로 변화하고 세포 성장의 레이트가 환경이나 유전자형의 복잡한 상호 작용에 의해 결정되는 회분식 배양 방법과 대조적이다. 따라서, 배치 배양 위에 chemostats에서 미생물을 배양의 주요 장점은 실험적으로 세포의 성장 속도를 제어 할 수있는 능력이다. 세포가 성장하는 속도는 영양 감지, 신호 전달, 고분자 합성과 대사 등의 무수한 세포 프로세스 사이의 상호 작용의 결과이다. 글로벌 분석 방법과 함께 chemostats를 사용하여 수의 조사 방법 세포가 조절과 함께 휴대 과정을 조정하는 방법을 반대로 성장에 미치는 영향의 속도는 기본 셀의 프로세스와성장의 속도. 야생형 세포 연구는 RNA와 단백질의 세포 농도는 뿌리깊은 세포의 성장 6의 비율에 의해 영향을받는 등 최근이 사체 <sup...

세포의 성장은 유전과 환경 요인의 1,2 상호 작용의 복잡한 네트워크에 의해 조절된다. 세포 성장의 인성 규정은 그 연구에 대한 시스템 레벨 접근을 필요로한다. 그러나, 조절 된 세포 성장의 엄격한 실험적 연구는 세포가 성장하는 속도를 제어하는​​ 어려움에 의해 도전된다. 또한, 가장 간단한 실험에서 세포 외 조건은 그들이 증식과 세포가 지속적으로 환경을 변경 자주 역동적이고 복잡하다. 정의 불변 및 제어 환경에서 세포 성장률 실험 제어를 가능하게 세포를 배양하는 방법에있어서, 이러한 문제에 대한 해결책은 chemostat에 의해 제공된다. chemostat를 사용하여 연속 배양하는 방법은 독립적으로 1950 년에 모 노드 3 노빅 &amp; Szilard 4에 의해 설명되었다. 원래 생각으로, 세포는 사기꾼 미디어의 고정 된 볼륨에서 재배되는tinually 새로운 미디어 및 기존 미디어와 세포의 동시 제거 (그림 1)을 첨가하여 희석. 결합 상미 분 방정식 (도 2) 세포 밀도 (x)와 chemostat 용기에서 성장 제한 영양소 (들)의 농도의 변화율을 설명한다. 중요한 사실은, 방정식이 시스템은 정상 상태에서, 세포 (즉, 지수 적 성장 속도 상수)의 비 성장 속도가 속도와 동일하다는 현저한 함축적으로 단일 (아닌) 안정 안정 상태 (도 3) 예측 하는 문화는 (D) 희석된다. 희석 비율을 변화시킴으로써 그것은 다른 성장 속도와 영양소 제한의 상이한 조건 하에서 세포의 정상 상태의 개체군을 확립 할 수있다. chemostats을 사용하여 성장 속도의 제어 실험에서는 세포의 생리 변화에 대한 이해의 발전에 중요했다성장 5,6의 속도로. 그러나, 미생물 학적 방법이 이전의 의지는 20 세기 후반 동안 분자 생물학 연구에 폭발하는 동안 점점 더 모호하게되었다. 오늘, 미생물과 다세포 생물 및 시스템 수준의 분석을위한 게놈 스케일 방법의 출현으로 모두 성장 제어에 대한 새로운 관심은 chemostats의 사용에 대한 의욕을 갱신했다. 여기, 우리는 세포의 성장 속도의 정확한 제어 및 chemostats를 사용하여 유일하게 할 수있는 외부 환경에 투자 세 가지 응용 프로그램을 설명합니다. 성적 증명서 및 대사 산물로 - - 배위 성장률 규제 첫째, 우리는 생체 분자의 수천의 풍요 로움이 방법을 조사하기 위해 chemostats의 사용을 설명합니다. 둘째, 우리는 chemostats 경쟁 실험을 사용하여 영양이 제한 환경에서 서로 다른 유전자형 사이의 성장 속도의 차이의 정확한 추정치를 얻기 위해 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 셋째, 우리가 설명하는 방법 chemostats 수일정한 영양이 부족한 환경에서 성장하는 세포의 적응 진화를 연구하는 데 사용할 수. 이러한 예는 chemostats 환경의 상호 작용 및 적응 진화하여 세포 성장 조절 유전자의 시스템 수준의 조사를 가능하게되는 방법을 예시.

<table><tbody><tr><td>Infors-HT Sixfors Chemostat</td><td>적절한 기술 리소스, Inc.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 병 9.5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-887-1</td><td>미디어 용기 및 호스 Fisher</td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>05-867</td><td>미디어 용기 및 호스</td></tr><tr><td>스토퍼, 크기 12, 그린 네오프렌</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-62991-42</td><td>미디어 용기 및 호스 스트레이트</td></tr><tr><td>커넥터</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30703-02</td><td>미디어 용기 및 호스 일반</td></tr><tr><td> 목적 타이 4 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9557052</td><td>미디어 용기 및 호스</td></tr><tr><td>튜빙, 실리콘 고무</td><td>소형 부품</td><td>B000FMWTDE</td><td>미디어 용기 및 호스</td></tr><tr><td>튜빙, 실리콘, 3/8 인치 OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1Q</td><td>미디어 용기 및 호스</td></tr><tr><td>튜빙, 실리콘, 7/32 인치 OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1E</td><td>미디어 용기 및 호스 용</td></tr><tr><td>튜빙, 스테인리스 스틸, 3/16 인치 OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K164</td><td>미디어 용기 및 호스</td></tr><tr><td>튜빙, 스테인리스 스틸, 3/8 인치 OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K161</td><td>미디어 용기 및 호스 후크</td></tr><tr><td>커넥터</td>용 <td>Fisher Scientific</td><td>14-66-18Q</td><td>미디어 용기 및 호스 래</td></tr><tr><td>칫 클램프</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-06403-11</td><td>미디어 용기 및 호스</td></tr><tr><td>루어용, 미디어</td><td>용기 및 Hosing</td>Luer용 여성 <td>Cole-Palmer</td><td>EW-45512-34</td></tr>, 미디어 용기 및 Hosing Millipore Aervent MTGR05010 62mm 필터, 0.2 &mu용 <tr><td>남성</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-45513-04</td><td></td></tr><tr><td>; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>MTGR05010</td><td>For Media Vessel and Hosing</td></tr><tr><td>PTFE Acrodisc CR 13 mm 필터, 0.2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9131037</td><td>미디어 용기 및 호스 직접</td></tr><tr><td>판독 유량 튜브 공기</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32047-77</td><td>질소 가스 설정</td></tr> 용 <tr><td>직접 판독 유량 튜브</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32048-63</td><td>질소 가스 설정</td></tr><tr><td>가스 비례 장치 다중 튜브 프레임</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-50</td><td>질소 가스 설정</td></tr><tr><td>레귤레이터,</td><td></td><td></td><td>질소 가스 설정</td></tr> 호스 <tr><td>어댑터, 스테인리스 스틸</td><td>Airgas</td><td>Y99-26450</td><td>, 질소 가스 설정</td></tr><tr><td>호스 남성 어댑터</td>N145D580, <td>Airgas</td><td>WES544</td><td>질소 가스 설정용</td></tr><tr><td>Norprene Tubing</td><td>US Plastics</td><td>57280</td><td>질소 가스 설정</td></tr><tr><td>삼각대 베이스</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-58</td><td>질소 가스 설정</td></tr><tr><td>밸브 카트리지</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03217-92</td><td>질소 가스 설정</td></tr><tr><td>Carboy 10 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-963-2A</td><td>미디어 준비</td></tr><tr><td>Steritop 멸균 진공 병 상단 필터, 1,000 ml, PES 멤브레인; 45mm 목 크기</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGP-T10-RE</td><td>미디어 준비</td></tr><tr><td>미디어 병 100ml, 45mm 목 크기</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-800-100</td><td>미디어 준비</td></tr><tr><td>칼슘 클로라이드 &미드도트; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>미디어 시약</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>미디어 시약</td></tr><tr><td>마그네슘 황산염&미드도트; 7H2O</td><td>시그마 알드리치</td><td>230391</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td><td>성 Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>황산암모늄 Fisher</td><td>Scientific</td><td>AC423400010</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마 알드리치</td><td>P9541</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>붕산</td><td>시그마 알드리치</td><td>B6768</td><td>미디어 시약</td></tr><tr><td>구리 설페이트 및 미드 도트; 5H2O</td><td>시그마 Aldrich</td><td>209198</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>요오드화 칼</td>륨 <td>시그마 Aldrich</td><td>60400</td><td>미디어 시약</td></tr><tr><td>염화철 및 중점; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>I88-100</td><td>미디어 시약</td></tr><tr><td>황산 망간 및 미드닷; H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>미디어 시약</td></tr><tr><td>나트륨 몰리브덴산염&미드닷; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>미디어 시약</td></tr><tr><td>황산아연 및 미드도트; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>비오틴</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>판토텐산 칼슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC24330-1000</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>엽산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>이노시톨(일명 myo-inositol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12226-1000</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>니아신(일명 니코틴산)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>p-아미노벤조산</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC14621-2500</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>피리독신 HCl</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P9755</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>리보플라빈</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4500-25G</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>티아민 HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP892-100</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>류신</td><td>시그마 Aldrich</td><td>L8000-100G</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0750</td><td>배지 시약</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0155-08-5</td><td>배지 시약</td></tr></tbody></table>

미생물 시스템 생물학의 chemostats의 사용

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

세포는 외부 세계로부터의 신호에 응답하여 자신의 성장의 속도를 조절한다. 세포가 성장함에 따라, 다양한 세포 과정은 고분자 합성, 신진 대사와 세포 분열주기에 궁극적으로 책임 등 조정해야합니다. chemostat 실험적으로 세포의 성장 속도를 제어하는​​ 방법은, 체계적 연구의 강력한 수단을 제공하는 방법 성장률​​ 영향 세포 과정 - 세포의 성장 속도를 제어 규제 네트워크 - 유전자 발현 및 대사 등. 세대 chemostats 수백 유지하면 세포 성장을 제한하는 환경 조건에서 미생물의 적응 적 진화를 연구하기 위해 사용될 수있다. 우리는 chemostat 문화의 원리를 설명하는 자신의 작업을 설명하고 그들의 다양한 응용 프로그램의 예를 제공합니다. 20 세기 중반에 소개 된 후 폐기의 기간을 다음과 게놈 규모의 방법론의 융합은 리뉴얼의 terest 세포의 성장과 적응 진화의 분자 기준의 규정에 생물학 연구에 chemostats의 사용에 르네상스를 자극한다.

chemostats의 주요 장점은 희석 비율을 변화시킴으로써 실험적 세포의 성장 속도를 제어 할 수있는 능력이다. 출아 효모, 사카로 마이 세스 세레 비시 애, 세포의 형태는 세포 분열주기에서의 위상이 유익하다. 높은 성장률과 인구 unbudded 세포의 비율 (그림 5A)을 측정하여 결정 적극적으로 세포를 분할하는 높은 비율을 포함한다. chemostat 문화의 글로벌 mRNA 발현의 분석은 많은 유전자의 발현이 차등 성장률 (그림 (b)와 그림 5C)의 함수로 표현되는 것으로 나타났습니다. 상이한 유전자형의 상대적인 적합성이 형광 표지 된 세포를 사용 chemostats 경쟁 어 세이를 수행함으로써 결정 계측법 분석 (도 6a)를 흐르게 할 수있다.도 6b는 변이주가 COM시킨 대표적인 결과를 나타낸다<html> 찬란 태그 야생형 균주에 대해 peted...

세포의 성장 속도는 규제 과정 및 세포 생리학의 주요 결정 요인이다. chemostats를 이용한 연속 배양은 세포 성장과 이러한 네트워크는 세포 성장을 최적화하기 위해 발전을 제어하는​​ 분자 네트워크의 학습을 용이 영양소 한정하여 세포 성장 속도의 외인성 제어를 가능하게한다.

미생물 시스템 생물학의 Chemostats의 사용

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

다음 발표의 전반적인 목표는 케모스탯(chemostat)의 원리를 설명하고, 그 작동법을 시연하며, 케모스탯을 이용한 응용 사례들을 제공하는 것입니다. 이는 먼저 케모스탯 용기를 조립하여 접종한 후, 일정 속도로 기존 배지와 세포를 제거하면서 새로운 배지를 지속적으로 추가함으로써 이루어집니다. 수리 모델링을 통해 각 케모스탯 내의 세포 밀도 변화와 성장 제한 영양소의 농도 변화를 기술합니다.이러한 방정식들을 사용하면 세포 및 영양분 농도가 일정하고, 세포의 비성장률이 세포 제거 속도와 동일한 단일 비제로(non-zero) 안정 정상 상태를 예측할 수 있습니다. 케모스탯 내에서 세포 성장과 환경을 정밀하게 제어하는 기능과 다른 기술들을 결합하면, 세포 성장 조절, 유전적 변화 및 적응 진화에 대한 시스템 수준의 연구 결과물을 얻을 수 있습니다. 다른 배양 기술과 비교했을 때 이 세포 배양 방법의 주된 장점은 성장률이 제어되며 세포의 외부 환경이 일정하게 유지된다는 점입니다.이 방법은 특정 환경에서의 세포 성장 조절과 적응 진화의 분자적 기초가 무엇인지와 같은 세포 생물학 및 진화 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 헤모스탯(hemostat) 배양 장치를 설정하고 유지하는 과정은 포함된 단계와 구성 요소가 매우 많아 어려우므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 메인 스위치를 사용하여 six four 시스템의 전원을 켜는 것으로 이 절차를 시작하십시오.다음으로, 헤모스탯 용기, 교반 어셈블리 및 연결된 튜브를 탈이온수로 충분히 헹굽니다. 모든 튜브와 O-링을 점검하고 마모된 부품은 교체하십시오. 교반 어셈블리와 구동축의 조립이 완료되면, 용기에 DI water 300 milliliters를 채웁니다.용존 산소 프로브의 전해질 수위를 확인하여 하단 케이스의 절반이 전해질 용액으로 채워져 있는지 확인하십시오. 다음으로, pH 프로브를 교정하십시오. 교정이 완료되면 발효조에서 프로브를 분리하십시오.DI water로 헹군 후 지혈 겸자 용기의 포트에 삽입하십시오. 손으로 조일 수 있을 때까지 나사를 돌려 고정합니다. 프로브가 연결된 상태에서 지혈 겸자 용기를 랙에 배치하고, pH 프로브가 어떤 발효조에서 보정되었는지 용기에 기록하십시오. 마지막으로, pH 프로브에 캡을 씌우고 용존 산소 프로브와 모든 노출된 튜브 끝부분을 오토클레이브용 호일로 덮어 프로브와 튜브를 오토클레이브 멸균 준비하

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 개발 및 저렴한 비용에 즉시 사용할 수 각지에서 만들어진 작은 chemostats의 소형 풋 프린트 배열을 확인. 생리학 및 실험 진화 결과는 큰 볼륨 chemostats과 비슷했다. ministat 배열은 기존 chemostat 실험, 기능 유전체학, 화학 심사 어플리케이션을위한 컴팩트 저렴하고 접근 할 플랫폼을 제공합니다.

다중 Chemostat 배열의 설계 및 사용

약물 농도를 동적으로 조정하여 항생제 약물 내성의 특성을 분석할 수 있는 저비용의 구성 가능한 모비드도스타트를 설명합니다. 이 장치는 다중화된 미세유체 플랫폼과 통합될 수 있습니다. 이 접근 방식은 실험실 항생제 약물 내성 연구를 위해 확장할 수 있습니다.

디자인과 낮은 비용의 사용, 자동 Morbidostat 박테리아의 적응 진화에 대한 항생제 약물 선택에서

여기서는 chemostat 문화 사용 조건 하에서 미생물 적응 진화 실험을 얻을 프로토콜을 제시한다. 또한, 진화 된 균주의 게놈 분석은 설명한다.

Chemostat를 사용하여 미생물의 적응 연구소 발전을위한 절차

우리는 거꾸로 현미경으로 유출 물에 미생물의 문화와 정기적으로 이미지 세포를 조명하기 optogenetic 시스템과 함께 사용 연속 배양 장치를 설계했다. 조명 동적 응답은 며칠에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전 자동화된다.

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

여기서 우리는 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석을 통해 황색 포도상 구균과 이후 분석에서 대사 물질의 추출을위한 프로토콜을 기술한다.

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근<em&gt; 포도상 구균</em

Microbioreactor 시스템에 다양 한 조건에서 48 병렬 세포 배양의 동시 작업에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 셀 문화 과정, 수확 및 후속 항 체 titer 분석을 설명 합니다.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

이 더에이 버 프레임 워크는 실험적 파라미터에 대 한 높은 분해능과 동적 제어를 통해 고 처리량의 지속적인 미생물 배양을 가능 하 게 합니다. 이 프로토콜은 복잡 한 피트 니스 실험을 수행 하기 위해 시스템을 적용 하는 방법을 보여 주며, 사용자가 여러 개별 문화권에 대 한 자동화 된 제어를 프로그래밍 하 고, 측정 하 고, 수집 하 고, 실시간으로 실험 데이터와 상호 작용 하는 방법을 안내 합니다.

에 버 버를 사용 하 여 자동화 된 고 처리량, 지속적인 세포 성장 실험 설계

미세 유체 및 밀리유체 설정 내에서 광용해로 동적 화학 적 경관의 생성을위한 프로토콜이 제시된다. 이 방법론은 운동성 행동, 영양소 섭취 또는 미생물의 화학 물질에 대한 적응을 포함한 다양한 생물학적 과정을 단일 세포 및 집단 수준에서 연구하는 데 적합합니다.

미생물 행동을 연구하기 위한 제어된 동적 화학 적 경관 생성

여기에 제시된 것은 환경에서 직접 미생물 행동의 연구를 가능하게 하는 최근 개발된 미세 유체 장치인 시투 화학분석분석의 프로토콜이다.

수생 생태계에서 미생물 행동을 검사하는 시투 화학 분석분석

미생물 대사의 광유전학적 조절은 발효 과정에 대한 유연한 동적 제어를 제공합니다. 여기의 프로토콜은 다양한 부피 규모에서 화학 및 단백질 생산을위한 청색광 조절 발효를 설정하는 방법을 보여줍니다.

미생물 화학 및 단백질 생산을 위한 광 조절 발효

우리는 밀리유체 연속 배양 장치(MCCD)에 대한 프로토콜을 제시하는데, 이는 수백 나노몰 농도까지 지속된 저영양 조건이나 시간적 영양분 변동 조건에서 세균 집단을 미세한 시간 척도로 배양할 수 있게 합니다.

영양소가 낮고 변동하는 상태에서 대 장 균 연구를 위한 연속 배양 밀리플루이딕 장치

배우세요 미생물 시스템 생물학에서 키모스탯을 활용한 연속 배양 기술과 수학적 모델링 방법을. 이 기술은 세포 생리학 및 적응 진화 연구에 필수적인 도구입니다.

미생물 시스템 생물학의 Chemostats의 사용

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