Name: 테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) shRNA 또는 cDNA 표현과 안정적인 인간 세포 라인의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 학습하세요 테트라싸이클린 유도형 shRNA 및 cDNA 발현을 이용한 안정적인 인간 세포주 생성 방법을. 이 기술은 유전자 기능 연구와 가역적 유전자 조절에 필수적인 도구를 제공합니다.

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우리는 도움이 논의에 대한 우리 연구실의 모든 구성원을 감사드립니다. 우리는 원고의 중요한 읽기 안나 Lisztwan과 크리스티나 Gewinner 감사드립니다. 이 작품은 BBSRC 기금 BB/I021248/1 지원하고 웰컴 트러스트 부여 090090/Z/09/ZAH은 UCL 암 연구소에서 웰컴 트러스트 연구 경력 개발 동료가되었습니다.

1. pcDNA6_TetR_IRES_blast의 복제 <ol><li> 그림 3에 도시 된 바와 같이, 제한 효소 Xba I 및 NCO 나는 TetR 유전자와 blasticidin 저항 (BlastR) 유전자의 프로모터를 제거 할 수있는 플라스미드 pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen)의 일부 다이제스트를 수행합니다. 4.6 킬로바이트 벡터 조각을 분리합니다. </li><li> TetR 유전자에서 polyadenylation 순서를 제거하려면 Xho I 사이트는 즉시 TetR의 정지 코돈 cDNA의 5&#39;end의 보존 Xba I 사이트 잠시 후 cDNA PCR에서 소개합니다. pMigR1_TetR이 플라스미드 생성하기 위해 제한 효소 Xba I과 Xho I을 사용하여 pMigR1 17으로 인한 조각을 Subclone. </li><li> TetR_IRES 조각을 출시 할 제한 효소 Xba I 및 NCO I로 pMigR1_TetR 벡터를 소화. 1.25 이하 삽입 조각을 분리합니다. </li><li> 4.6 킬로바이트 pcDNA6/TR와 1.25 킬로바이트 TetR_IRES 조각을 Ligate. TR관할 E.coli에 결합 제품을 ansform 및 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 원하는 pcDNA6_TetR_IRES_blast의 구조를 확인합니다. </li></ol> 2. 세포 라인의 생성 안정적으로 TetR을 표현 <ol><li> 1 일, 씨 1x10에서 표준 성장 매체를 사용하여 10 cm 조직 배양 접시 당 6 셀 (예 : DMEM 10 % FCS와 보충). 종자 두 개의 플레이트, pcDNA6_TetR_IRES_blast과 transfection 한, 그리고 blasticidin 선택을위한 대조군으로 다른. 가능한 가장 낮은 통로 및 권장 성장 매체를 사용하여 확인하십시오. </li><li> 2 일에서 transfect 제조업체의 지침에 따라 Fugene 6 일 (E2691, Promega)를 사용하여 pcDNA6_TetR_IRES_blast 2 μg과 하나가 판. 두 번째 판을 transfect하지 마십시오. </li><li> 3 일에 두 접시에 5 μg / ML blasticidin를 포함하는 표준 성장 매체를 추가 할 수 있습니다. 최적의 선택 농도가 주어진 셀 라인에 따라 다를 수 있습니다 및 주시기 바랍니다 수도 N사전에 결정해야 eed. </li><li> 일 4 일, 10 cm 접시 5 MG / ML blasticidin를 포함하는 표준 성장 매체를 사용하여 50분의 1과 1 / 100, 25분의 1, 1 / 5 셀을 분할. 제대로 untransfected 또는 transfected 세포를 포함하는 접시에 라벨을해야합니다. 희석 단계마다 두 개의 플레이트를 준비합니다. </li><li> untransfected 접시에있는 모든 세포는 첫 번째 주일 이내에 사망 있도록 매일 셀을 선택합니다. 모든 2-3일 선택 미디어를 변경합니다. </li><li> 1-2주 후, blasticidin 방지 식민지가 표시 될 것입니다. 하나의 식민지가 침투 할 수 있도록 5-50 식민지를 포함하는 접시를 선택합니다. </li><li> 식민지는 약 5mm (또는 더 큰)의 직경에 도달했을 때, 단일 식민지을 선택 복제 실린더를 사용하여 적어도 12 독립적 인 클론을 분리. 24 잘 조직 배양 플레이트 별도의 잘으로 각 복제를 전송합니다. 때 합류, 잘 6 잘 조직 배양 플레이트의 하나에 각도에서 세포를 분리. </li><li> 문화 CL로 이동선택 미디어들. 6 잘 조직 배양 플레이트의 두 단일 우물에 각도에서 때 합류, 분할 세포. </li><li> 각 클론을 테스트하기 위해서는 immunoblotting의 후속 테스트를 위해 다른 잘에 합류 셀 및 수확 세포의 잘 하나를 동결. </li><li> 서양은 마우스 단클론 항 TET02 항체 (MoBiTec GmbH가)를 사용 blotting에 의해 TetR 감지. 대조군으로 부모 세포 라인의 lysate를 포함해야합니다. </li><li> 가장 높은 TetR 식으로 3 클론을 선택하고 각 clonal 문화를 확장합니다. 가능한 한 빨리 각 유망 클론의 주식을 멈춰 봐. 마지막으로, TetR - 표현 클론과 함께 부모 세포 라인을 비교하여 관심의 분자 및 세포 생물학적 매개 변수를 검사합니다. 관심의 분자 및 세포 생물학적 매개 변수에 변경을 표시하지 않습니다 가장 높은 TetR 표현으로 &#39;최고&#39;클론을 선택합니다. </li></ol> 3. pTER와 PT-렉스 DEST30 벡터의 파일럿 테스트 표현각각 ING shRNA 또는 cDNAs, <ol><li> 12에 설명 된대로 shRNA 삽입과 플라스미드 pTER를 생성 할 수 있습니다. PT-렉스 DEST30 벡터 (12301-016, Invitrogen) 게이트웨이 기술 (Invitrogen)를 사용하여 관심있는 cDNA를 포함하는를 구성합니다. cDNA 표현의 경우, cDNA에 태그 추가 나중에 exogenously 표현 단백질의 검출을 용이하게합니다. </li><li> Transiently 선택의 transfection 시약을 사용하여 pTER 또는 PT-렉스 DEST30 plasmids (shRNAs 또는 관심 cDNAs 중 하나를 표현)와 부모 대상 셀 라인을 transfect. shRNA 표현 plasmids의 테스트를 위해 높은 transfection 효율을 달성 할 수 있는지 확인합니다. </li><li> 수확 관심의 유전자의 고갈이나 overexpression을 감지하는 기대, 해당 항체를 사용하여 immunoblotting을위한 세포와​​ 과정을 transfected. </li></ol> 4. 테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) pTER 또는 PT-렉스 DEST30 벡터를 사용하여 shRNAs 또는 cDNAs의 표현과 안정적인 세포 라인의 생성 </p&gt; <ol><li> 1 일, 공인 테트라싸이클린 무료 혈청 (; 16000-014 Invitrogen에서 예를 들어 FBS)을 함께 보충 표준 성장 매체를 사용하여 10 cm 판 당 &#39;최고&#39;TetR - 표현 클론의 씨앗 1x10 6 셀 있습니다. pTER (또는 PT-렉스 DEST30) 및 더블 선정 대조군과 같은 하나 판과 transfection을위한 씨앗이 한 판. 가능한 가장 낮은 통로를 이용해야합니다. </li><li> 2 일에서 transfect Fugene 6을 사용 pTER 2 μg (또는 PT-렉스 DEST30)과 하나 판. 두 번째 판을 transfect하지 마십시오. </li><li> 일 3, 5 μg / ML blasticidin 500 μg / ML zeocin (또는 1 MG / ML G418)이 포함 된 표준 성장 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 일 4 일, 5 μg / ML blasticidin 500 μg / ML zeocin (또는 1 MG / ML 포함 10 cm 플레이트 및 표준 성장 매체를 사용하여 50분의 1과 1 / 100, 25분의 1, 1 / 5 셀을 분할 G418). 희석 단계마다 두 개의 플레이트를 준비합니다. </li><li> 첫 번째 주일 이내에 untransfected 접시에있는 모든 세포가 죽었을 확인하고, 매일 셀을 선택합니다.blasticidin 및 zeocin (또는 G418) 모든 3~4일를 포함하는 표준 성장 매체를 변경합니다. </li><li> 2-3주 후, blasticidin / zeocin (또는 blasticidin/G418)를 두 번 방지 식민지가 표시 될 것입니다. 하나의 식민지를 선택 5-50 식민지를 포함하는 접시를 선택합니다. </li><li> 식민지는 약 5mm (또는 더 큰)의 직경에 도달했을 때, 단일 식민지을 선택 복제 실린더를 사용합니다. 최소 24 개인 클론을 분리합니다. 24 잘 조직 배양 플레이트 별도의 잘으로 각 복제를 전송합니다. </li><li> blasticidin (5 μg / ML)와 zeocin (250 μg / ML)의 중간 포함 된 유지 보수 농도의 문화 클론 [또는 G418 (0.5 MG / ML)]. 때 합류, 잘 6 잘 조직 배양 플레이트의 하나에 각도에서 세포를 분리. </li><li> 각 클론을 테스트하기 위해서는 잘 6 잘 플레이트의 세 한 우물에 6 잘 판 중 하나가 합류 분할. 때 합류 잘 하나에서 세포를 동결. tetracyclin을 테스트 나머지 2 우물을 사용하여전자 inducible 표현. 두 번째 잘 테트라 사이클린 무료로 떠난 동안 잘 ... 1 μg / ML의 농도에서 테트라 사이클린을 추가합니다. </li><li> 적절한 항체를 사용하여 immunoblotting을위한 테트라 사이클린, 수확 셀 및 절차에 부화의 24-96 시간 후. cDNA 표현의 유도에 대한 심사 할 때 더 이상 테트라 사이클린 치료는 내생 단백질의 shRNA로 인한 고갈을 결정해야 할 것입니다 동안 짧은 테트라 사이클린의 배양 시간을 권장합니다. </li><li> 원하는 고갈 / overexpression과 적어도 2 클론을 선택하고 각각의 문화를 확장합니다. 가능한 한 빨리 각 유망 클론의 주식을 멈춰 봐. 실험 클론 Tet-에 성장하는 경우가 항상 테트라싸이클린 무료 혈청 및 유지 보수 농도에서 각각의 선택 항생제로 보충 미디어를 사용해야합니다. </li></ol>

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<li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 Tet-에 시스템이 크게 특히 조작 유전자가 세포 생존에 필수적인 경우 조작 및 / 또는하기가 어렵 전지 시스템에서 유전자 기능의 분석을 용이하게 있다고 생각합니다. 또한, 매우 구체적인 Tet-에 시스템에 의해 유전자 발현을 제어 할 수있는 능력은 다른 단계 (세포주기의 진행이나 ​​잘 정의 된 차별화 프로세스 동안 예를 들어)에 유전자 기능을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 여기에 제시된 방법은 연구자 생성 할 수 있습니다 원하는 안정적인 Tet-에 크게​​ TetR 양성의 특성에 필요한 분자 및 세포 생물학적 프로파일의 범위에 따라 적절한 시간 프레임 (보통 3-6개월, 내 세포 라인 세포 라인). 의 성공적인 발전 및 응용 프로그램 Tet은 -에 세포 라인,하지만, 여러 가지 요인에 매우 의존한다. 첫째, TetR의 충분히 높은 표현과 세포의 선택테트라 사이클린의 부재에서 전사의 엄격한 억압을 보장하기 위해 필요합니다. 마찬가지로 중요한 것은, TetR을 표...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> 테스트 Tet 무료 </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invivogen </td><td> 개미-BL-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invivogen </td><td> 개미 - 아연-5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> PAA 실험실 </td><td> P31-011 </td><td> 미디어 100 MG / ML </td></tr><tr><td> 안티 TET02 </td><td> MoBiTec GmbH의 </td><td> TET02 </td><td> WB에 1,000분의 1 to 2천분의 1에서 사용 </td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td> Invitrogen </td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> PT-렉스 DEST30 </td><td> Invitrogen </td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 테트라싸이클린 </td><td> 시그마 </td><td> 87,128 </td><td> 2 밀리그램 / 에탄올에 ML </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> 시그마 </td><td> D9891 </td><td> 2 밀리그램 / 물에 ML </td></tr><tr><td> 복제 실린더 </td><td> Bellco 유리 주식회사 </td><td> 2090-00808 </td><td> 다시 사용 가능한 </td></tr></tbody></table>

테트라싸이클린-inducible (tet-에서) shrna 또는 cdna 표현과 안정적인 인간 세포 라인의 생성

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

포유류의 세포 생물학 분야의 주요 접근 방식은 공개 할 목적으로, 선택한 셀 라인에 대한 관심의 유전자의 표현의 조작이 하나 이상의 유전자의 과도 / 안정 overexpression 또는 분해를 사용하여 유전자의 기능 (들)의 여러 관심. 불행하게도, 다양한 세포 생물 조사에 대해이 방법은 적합 할 때 세포의 성장 / 확산 결함이나 원치 않는 세포 분화의 유전자 발현 결과의 조작. 따라서, 연구자들은 E.에서 가져온 테트라싸이클린 억제 단백질을 (TetR), 적응 대장균의 테트라 사이클린 내성 오페론 1,2,3 포유류의 세포에 cDNAs을 표현하는 매우 효율적이고 긴밀한 규제 시스템을 생성합니다. 즉, TetR은의 TO에 테트라 사이클린 (Tet - 오프 시스템이라고한다)의 추가시 발기인 지역의 Tet-연산자 (TO)에 바인딩 또는 (2) 바인드에 의해 전사 (1) 블록 개시 하나에 수정되었습니다 티테트라 사이클린의 그 부재 (시스템 Tet 기능이라고한다) (그림 1). Tet - 오프 시스템은 테트라 사이클린의 지속적인 존재를 (이는 조직 세포 배양 매체에 약 24 시간의 반감기가) 필요하다는 불편을 끼쳐 드려 감안할 때 Tet는 -에서 시스템보다 폭이 매우 촉박 개발의 결과, 최적화 된 및 cDNA 표현 효율적인 벡터 시스템은 여기에 사용 된. 바로 짧은 머리 핀의 자형 RNAs (shRNAs)를 표현하는 4 포유류 세포 벡터에서 유전자 최저에 대한 RNA 간섭 (RNAi)의 설립 이후 siRNAs 5-11와 매우 유사한이 기능은 설명했다. 유전자 타겟 세포 생존을 위해 필수적입니다 때 안정적으로 고갈이 적합하지 않을 때문에 그러나, 이러한 shRNA로 인한 최저의 접근 방법은 기존의 한방 전략과 같은 제한이 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 밴 드 Wetering 외. 12 shRNA 표현 벡터 pSUPER에게 수정 5 </su그들에게 관심의 대상 유전자의 테트라 사이클린-inducible 고갈과 안정적인 셀 행을 생성 할 수있게 발기인 지역에에를 삽입하여 P를&gt;. 여기, 우리는 효율적으로 생성하는 방법을 설명 안정된 인간 Tet-inducible에 안정적으로의 overexpression 또는 관심의 유전자의 고갈 중 하나를 운전 세포 라인. 이 방법 사용, 우리는 성공적으로 생성했습니다 Tet-에 크게 중심체 13,14과 15,16 신호를 apoptosis에 산악 표준시 / hMOB / NDR 폭포의 분석을 촉진 세포 라인. 이 보고서에서 우리는 선택의 우리의 벡터를 설명 효율적으로 생성하는 데 필요한 두 개의 연속 조작 단계를 설명뿐만 아니라 인간의 Tet-에 세포 라인 (그림 2). 또한,의 생성을위한 프로토콜을 요약 외에 인간의 Tet-에 세포 라인, 우리는 중요한 기술적 절차에 관한 부분 및 특성화 세포 Tet 기능을 설명합니다.

안정적 TetR을 표현 RPE-1 세포 라인의 초기 특성에 대한 예는 그림 4에 표시됩니다. 부모 셀 라인 (대조군 역할을 함) 외인성 TetR 단백질을 표현하지 않는 동안 모든 RPE-1 클론은 (그림 4 차선 1), (레인 2, 5 비교) TetR의 수준을 다양한 표현합니다. RPE-1 중 TetR 식의이 유사 Tet이 기능 세포 클론 예상되며, plasmids을 표현 TetR의 표현부터 플라스미드 통합 사이트에 크게 의존합니다. 의 안정적인 RPE-1 Tet-에 세포 클론 MST3의 키나제에 대한 지시 표현 shRNAs 여러 클론 관심의 유전자 (그림 5)의 가장 효율적인 고갈과 세포 라인을 정의하기 위해 테스트해야하는 보여줍니다. 특성 도시 된 경우 (그림 5) 세포 클론 # 1, # 2, # 3은 추가적인 분석을 위해 선정되었습니다. 변화 전shR...

inducible과 관심의 유전자의 치료 cDNA overexpression 또는 shRNA로 인한 똑 다운과 인간의 세포 라인을 생성하기 위해 신속하고 간단한 방법. 이 방법은 일시적 transfection 방법 또는 기존 최저 / 한방 전략에 의해 변경하기가 어렵 안정적으로 높은 reproducibly 조작 세포 라인에 연구자 수 있습니다.

테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) shRNA 또는 cDNA 표현과 안정적인 인간 세포 라인의 생성

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

본 절차의 전반적인 목적은 테트라사이클린(tetracycline) 유도성 S-H-R-N-A 또는 CDNA 발현이 가능한 안정적인 인간 세포주를 구축하는 것입니다. 먼저 표적 세포에 tatar 발현 플라스미드를 형질전환하고 blastercidin 내성 세포를 선별합니다. 그 다음 개별 콜로니를 분리하여 Tet 억제 단백질을 안정적으로 발현하는 세포를 스크리닝합니다.다음으로, Tet 반응 요소(Tet response element)의 제어 하에 표적 유전자 발현을 조절하도록 설계된 플라스미드를 teta 발현 효율이 가장 좋은 클론에 형질전환합니다. 이중 선택(double selection) 하에 있는 형질전환 세포에서 단일 콜로니를 분리하고, 웨스턴 블로팅을 통해 원하는 Teton 클론을 선별합니다. 최종적으로, 이렇게 얻은 Teton 클론을 사용하여 특정 표적이 선택된 생물학적 파라미터에 미치는 영향을 조사할 수 있습니다.실험실의 박사후 연구원인 Marty Gomez Martinez가 해당 절차를 시연합니다. 동일한 CMV 프로모터로부터 Tet Repressor와 Blain 내성 유전자의 발현을 유도하는 벡터를 생성합니다. 10 cm 조직 배양 접시 2개에 표준 성장 배지를 사용하여 6×10⁵개의 세포를 각각 분주합니다. 한 접시는 tatar 발현 플라스미드 형질전환용으로, 다른 한 접시는 Blain 선택을 위한 음성 대조군으로 사용합니다. 다음 날, FU gene six를 사용하여 한 접시에 2 µg의 TTA 발현 플라스미드를 형질전환합니다.제조사의 지침에 따라 배양액을 두 플레이트 옆에서 하룻밤 동안 배양합니다. 24시간 후, 사용 중인 실험 세포주에 최적화된 농도의 blasticidin이 포함된 표준 성장 배지를 첨가하고 세포를 회수합니다. 그 다음, 연속 희석을 위해 10 cm 플레이트에 라벨을 부착하고, 5 µg/mL의 blasticidin이 포함된 표준 성장 배지를 사용하여 연속 희석된 세포를 중복으로 플레이팅하며, 이때 선택되지 않은 세포(unselected cells)와 형질전환된 세포(transfected cells)가 포함된 플레이트에 정확히 라벨을 부착하십시오. 세포를 관찰하며, 특히 선택되지 않은 세포가 포함된 플레이트의 모든 세포가 첫 일주일 이내에 사멸했는지 확인하십시오.blaster soin 내성 콜로니가 나타나는 1~2주 후부터 2~3일마다 선택 배지를 교체하십시오. 콜로니의 직경이 약 5 mm에 도달했을 때 단일 콜로니를 분리할 수 있도록 5~50개의 콜로니가 포함된 플레이트를 선택하십시오. 클로닝 실린더를 사용하여 단일 콜로니를 픽킹함으로써 최소 12개의 독립적인 클론을 분리하십시오.각 클론을 24웰 플레이트의 개별 웰로 옮겨 세포가 confluence 상태가 될 때까지 배양합니다. 각 콜로니의 세포를 회수하여 6웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 배양액이 cofluent 상태가 되면 선택 배지에서 클론 배양을 계속합니다.각 웰의 세포를 6-웰 조직 배양 플레이트의 두 개 단일 웰로 나눕니다. 테스트할 각 클론에 대해, 합류도가 높은 세포가 담긴 한 개의 웰은 동결합니다. 두 번째 웰의 세포를 수확합니다. 이는 tatar 단백질 발현 평가를 위한 것입니다.부모 세포주(parental cell line)의 용해물을 음성 대조군으로 사용하여 클론들에 대해 western blot을 수행함으로써 tatar 단백질을 검출합니다. mouse monoclonal anti Tet zero two 항체를 사용하십시오. tatar 발현 수준이 가장 높은 3개의 클론을 확장 배양하십시오.가능한 한 빨리 유망한 각 클론의 프리즈 스톡(Free stocks)을 제작하십시오. 이제 클론 세포들이 관심 있는 분자 및 세포 파라미터의 분석을 위한 준비가 되었습니다. 모세포주와 tatar 발현 클론들을 비교하여, 관심 있는 분자 및 세포 생물학적 파라미터에 어떠한 변화도 나타내지 않으면서 tatar 발현량이 가장 높은 최적의 클론을 선택하십시오.관심 있는 HRNA 삽입물이 포함된 PTER 플라스미드를 생성합니다. 또한 gateway 기술을 사용하여 관심 있는 CDNA가 포함된 PT REX desk 30 벡터를 구축합니다. 모세포 타겟 세포주에 PTER 또는 P T-Rex S 30 플라스미드를 일시적으로 형질전환합니다.선택한 transfection 시약을 사용하여 transfection을 수행합니다. 그 후 transfected 세포를 회수하고 immunoblotting을 통해 표적 유전자 발현을 평가합니다. 1일 차에, 인증된 tetracycline-free serum이 첨가된 표준 성장 배지를 사용하여 최적의 tetracycline 발현 클론 2개 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, FUgene 6를 사용하여 A-S-H-R-N-A 또는 CDNA 발현 플라스미드 2 µg을 단 하나의 플레이트에만 형질전환합니다. 3일 차에 5 µg/mL의 blasticidin과 500 µg/mL의 hygromycin 또는 blasticidin과 G418이 포함된 표준 성장 배지를 첨가합니다. 이후 4일 차에 세포를 분할하여 표준 성장 배지를 이용한 희석 복제 플레이트를 생성함으로써 이중 선택을 수행합니다.항생제 처리로 인한 세포 사멸 반응을 매일 확인하고, 3~4일마다 배지를 보충하십시오. 2~3주 후, blaster aside in zein 또는 blaster aside in G four 18 이중 내성 콜로니가 나타나기 시작합니다.5개에서 50개의 콜로니가 형성된 플레이트를 선택하여, 콜로니의 직경이 약 5 mm 또는 그 이상이 될 때까지 단일 콜로니 배양을 수행합니다. 클로닝 실린더를 사용하여 단일 콜로니를 채취한 후, 24웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰로 옮겨 배양합니다. 클론은 5 µg/mL의 blaster, soin 및 50 µg/mL의 유지 농도가 포함된 배지에서 배양합니다.Eosin 또는 blaster soin 및 G four 18을 사용합니다. 세포가 confluence 상태가 되면, 각 웰의 세포를 6-웰 조직 배양 플레이트의 단일 웰로 분할하여 옮깁니다. 다시 confluence 상태가 되면, 세포를 6-웰 플레이트의 3개 웰로 분할하여 100% confluence까지 배양합니다.유도성 발현을 테스트하기 위해 한 웰의 세포를 동결하고, 한 웰에는 1 µg/mL의 tetracycline을 첨가하며 다른 한 웰의 세포는 그대로 둡니다. tetracycline이 없는 상태로 24~96시간 동안 배양하며, CD NA 발현의 유도를 스크리닝할 때는 짧은 시간을, S-H-R-N-A 매개 내인성 단백질 고갈을 결정할 때는 더 긴 시간을 사용합니다. 그 후 세포를 수확하고 적절한 항체를 사용하여 면역 블로팅을 위해 처리합니다.원하는 결핍 또는 과발현을 나타내는 클론을 최소 두 개 선택하여 각 배양물을 확장하십시오. 유망한 각 클론의 프리즈 스톡(free stocks)을 가능한 한 빨리 만들어 두는 것을 잊지 마십시오. tatar의 안정적 발현을 위한 인간 망막 상피 세포주의 초기 특성 분석 결과, 모든 RPE one 클론이 다양한 수준의 tatar을 발현하는 것으로 나타났습니다.예상한 대로, parental RPE one 세포주는 외래 tatar 단백질을 발현하지 않습니다. RPE one Teton 세포 클론 간의 Tet R 발현 차이는 플라스미드 통합 위치를 반영합니다. 본 실험에서는 MST three kinase를 표적으로 하는 RNA를 발현하는 안정적인 RPE one Teton 세포 클론의 특성을 분석하였으며, 추가 분석을 위해 3개의 세포 클론을 선정하였습니다.이 영상을 시청하신 후, 연구 대상인 RNA 또는 cDNA의 비조절 발현을 통해 안정적인 인간 세포주를 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

generation-stable-human-cell-lines-with-tetracycline-inducible-tet-on

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

E4orf4 유도 세포 죽음에 ACF 염색질 리모델링 요소의 기여가 측정되었다. 프로토콜은 doxycycline 치료는 ACF subunits Acf1과 SNF2h의 조건 최저를 유도하는 세포 클론의 선택이 포함되어 있으며, inducible 세포 라인에 E4orf4 유발 세포 죽음을 측정 할 수있는 DAPI 분석을 사용합니다.

E4orf4 - 유도 세포 사망에 최저 효과의 유전자 발현 및 측정의 조건부 최저위한 셀 라인의 작성

이 비디오는 마우스 모델의 테트라사이클린 또는 Tet-On 유전자 발현 시스템을 보여줍니다. 테트라사이클린 유도체인 독시사이클린(doxycycline)이 존재할 때, 역테트라사이클린(reverse tetracycline)으로 제어되는 트랜스액티베이터(transactivator) 단백질로 구성된 Tet-On 시스템이 활성화되고 관심 유전자를 발현합니다.

Inducible Tet-On 조절 가능한 시스템 기반 유전자 발현 In Vivo: 마우스 모델에서 표적 유전자 전사 활성화를 위한 테트라사이클린 유도 유전자 발현 시스템

이 동영상은 관심 유전자와 조절 플라스미드를 포함하는 플라스미드로 transfection하여 배양된 세포에서 유전자 발현을 조절하는 방법을 설명합니다. 이 플라스미드의 발현은 테트라사이클린 또는 그 합성 유사체에 의해 제어될 수 있으므로 이 시스템은 조절 가능한 유전자 발현을 연구하는 데 유용한 모델입니다.

유도성 Tet-Off 조절 시스템: Tetracycline-Off 시스템을 사용하여 배양된 세포의 유전자 발현을 조절하는 In vitro 방법

여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.

항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성

여기서 우리는, 기존 TCR의 TCRα 또는 TCRβ 페어링 말초 T 세포 수용체 레퍼토리 상보 hemichain으로 관심 항원 특이성을 보유하여 항원 특이 적 T 세포 수용체 (TCR도)을 생성하는 신규 한 방법을 설명한다. 드 노보 생성 TCR도 선호도 변화와 항원 특이성을 유지한다.

생성<em&gt; 드 노보</em&gt; 중심 Hemichain의 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 항원 특이 적 인간 T 세포 수용체

이종 발현 시스템을 통해 공부하는 이온 채널은 생물 의학 연구의 핵심 기술이되고있다. 이 논문에서는, 유도 성 프로모터의 조절하에 일시적인 형질 감염을 수행함으로써 엄격하게 제어 이온 채널 표현을 달성하는 시간 효율적인 방법을 제안한다.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

이 프로토콜 공부 monocytes/세포 종양 microenvironment에의 채용에 있는 종양 세포 유래 단백질의 역할에 대 한 특히 암 세포 선 및 그것의 사용, 기능 Tet에 시스템 설정에 대 한 방식으로 제공 합니다.

암 세포 선 종양 Microenvironment에 Monocytes/대 식 세포의 모집 연구에서 유전자 발현의 조건부 최저

여기 선물이 있는 어떤 단백질 수 수 조건부로 비활성화 역 그것의 지배적인 부정적인 돌연변이 버전 overexpressing에 의해 지배 부정적인 유도할 수 있는 시스템을 개발 하는 프로토콜.

유도할 수 있는 고 가역 지배-네거티브 (DN) 단백질 억제

여기서, 우리는 파이펫 전기화 기술에 결합된 유도성 발현 시스템을 이용하여 1차 폐포 상피 세포에서 전사체의 전사체의 후전사 변조를 연구하는데 사용될 수 있는 도구를 제시한다.

1 차적인 폐포 상피 세포에 있는 mRNA 전사체의 안정성의 조사를 위한 능률적으로 통제된 플라스미드 발현 시스템

이 프로토콜에서, 우리는 조건부 녹다운 시스템과 환자 유래 GCSCs의 줄기에 대한 클러스터진의 효과를 연구하기 위해 적응된 구 형성 분석서를 사용하여 실험 설계를 제시한다. 프로토콜은 CSC의 다른 모형에 있는 줄기 관련 유전자의 체외 및 생체 내 기능 둘 다 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.

결합된 조건부 녹다운 및 적응된 구체 형성 분석은 환자 유래 위암 줄기 세포의 줄기 관련 유전자를 연구하기 위하여

학습하세요 테트라싸이클린 유도형 shRNA 및 cDNA 발현을 이용한 안정적인 인간 세포주 생성 방법을. 이 기술은 유전자 기능 연구와 가역적 유전자 조절에 필수적인 도구를 제공합니다.

테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) shRNA 또는 cDNA 표현과 안정적인 인간 세포 라인의 생성

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