Name: 기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 배우세요 유전자 변형 마우스 모델에서 유방 상피 세포의 시간 경과 영상 분석 방법을. 단일 세포 추적으로 선암성 세포의 행동 변화를 정량화하여 유방암 초기 발생 메커니즘을 규명합니다.

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저자는 라이브 셀 이미징에 자신의 소개를 위해 기술 지원 및 마이클 Rieger에 Bofan 우와 기독교 Raithel 감사하고 싶습니다. NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH의 지원. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst EV A/09/72227 참조. 316 (REN), 국방부 W81XWH-11-1-0074 (REN), 교육 과학 기술부 (R31-10069)의 지원을받는 한국의 국립 연구 재단을 통해 WCU (세계 클래스 대학) 프로그램 (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (설치류 장벽 시설 장비), 그리고 NIH NCI 5P30CA051008 (현미경 및 이미징 및 동물 공유 자원).

<html> 1. 전체 계획 <ol><li> 유전 공학의 유방 땀샘에서 preneoplastic 유방 상피 세포의 주요 문화를 생성하고 야생 형 생쥐을 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 라이브 셀 이미지에게 최대 5 일에 Volocity 이미지 수집 소프트웨어 (버전 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA)를 사용하여 매 15 분 캡처합니다. </li><li> 타이밍 및 상피 세포 식민지 형성의 메커니즘, apoptosis의 입사 및 형태학의 변경 중단을 평가하기 위해 직접 시간 경과 이미지를 볼 수 있습니다. </li><li> 에 생성 Volocity. TIFF 스택을 변환합니다. MetaMorph의 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어 (분자 ​​장치, LLC 서니 베일, CA) 및 이름 바꾸기 디지털 이미지 파일 (이름 바꾸기 2.1.6 사용하여 JPG 파일을 <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get은 / 시스템 / 파일 관리 /-Rename.shtml</a> ) Timm의 추적 도구 소프트웨어 (TTT,과의 호환성을 사용하도록 설정하는 방법tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html)을 선택합니다. </li><li> TTT 사용하여, 세포 분열 (세포 수명)과 세포 분열의 패턴 (대칭 대 비대칭) 사이의 시간을 결정에 대한 세포 운명지도를 생성합니다. </li><li> 다른 유전 공학 마우스 모델 및 / 또는 야생 형 컨트롤 사이에 통계적으로 의미있는 차이가 있는지 확인하기 위해 3 단계 이상 5에서 양적 데이터를 분석합니다. </li></ol> 2. 기본 유방 상피 세포 문화의 생성 <ol><li> 제조업체의 지시 사항 (EpiCult-B 마우스 중간 키트, Stemcell 기술, 밴쿠버, BC)의 변화에​​ 따라 하나의 유방 상피 세포의 분리에 대한 전체 미디어를 준비합니다. 450 ML 에피 컬트-B 매체, 50 ML 에피 컬트 B 확산 보충, 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 50 μg / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PenStr을 결합EP) 10 NG / ML 표피 성장 인자 (EGF). </li><li> 2.1에서 9 부품 전체 미디어가 10 배 Collagenase / Hyaluronidase 혼합물의 한 부분을 결합하여 분리 미디어를 준비합니다. </li><li> 마우스를 안락사시켜야 즉시 검시를 진행합니다. 장소 스티로폼 검시 플랫폼에서의 뒷면에 마우스와 복부 피부가 팽팽하도록 사지를 확보. 하는 70 %의 에탄올과 팔다리 놓인 포함 복부 피부와 머리를, 포화. 중간 각 프런트 사지의 피부를 통해 Y-절개로 확장되는 피부를 통해 중간 선 절개를 (복막를 입력하지 않음)하여 # 2 / 3 (가슴) 및 # 4 / 5 (사타구니) 유방 땀샘에 노출 각 후면 다리의 안쪽 피부를 통해 Y 절개 아래 거꾸로. </li><li> 무딘 절개를 사용 underlyingperitoneum에서 피부를 분리,이 긴장 될 때까지 피부의 양쪽에 철수하고, 핀을 사용하여 스티로폼 검시 플랫폼에 고정하십시오. 바깥 쪽부터, 아까 그 바 말인데의 사려 분별이있는 사용과 무딘 절개를 사용하여ction 가위는 그대로 사타구니 및 / 또는 기본 결합 조직과 근육에서 가슴 유방 땀샘을 분리합니다. 10cm 무균 배양 접시에 더 이상 두 개보다 유방 땀샘을 놓고 조직 문화 후드로 이동합니다. </li><li> 조직 문화 후드에서 노란 색 작은 잘 circumscribed nodules로 표시되어 있습니다 유방 림프절에 대한 분비를 검사합니다. 멸균 메스와 집게를 사용하여 주변 선에서 림프절을 제거합니다. 이 멸균 메스, 각 손에 하나를 사용하여 ~ 1mm 세 조각으로 유방 조직을 이기다. </li><li> 장소 부드럽게 10 ML 피펫을 사용하여 2 ~ 3 배를 아래로 pipetting과로 5 ML 분리 미디어 믹스에서 유방 조직을 다진하고, 5 %의 CO 2와 37 ° C 배양기에서 (최대 ~ 16 시간) 밤 품다 느슨하게 뚜껑이있는 50 ML 원뿔 튜브. </li><li> 다음 날 아침, 붉은 색 BL을 홍보하기 위해 염화 암모늄 솔루션을 버퍼 2퍼센트 FBS, 4 부분을 포함하는 한 부분 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 (HBSS)의 차가운 혼합물을 준비ood 세포 용해 (HFAmCl)뿐만 아니라 차가운 HBSS는 2 % FBS (HF)와 보충. 미리 따뜻한 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.25 %)는 행크의 균형 소금 솔루션 5 MG / ML Dispase, 1 MG / ML DNase I,와 전체 미디어를 수정. </li><li> 보육의 유방 조직과 원뿔 원심 분리기 튜브를 제거하고 부드럽게 소용돌이 2-3 초를 두 번 파동. 5 분 (실내 온도 또​​는 4 ° C)를 450 × g에서 튜브를 원심 분리기하고, 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 5 분 (실내 온도 또​​는 4 ° C)를 450 × g에서 10 ML의 HFAmCl과 원심 분리기의 최소의 펠렛을 Resuspend하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 펠렛에 3 ML 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하고 5 ML 피펫 처음에 혼합 한 후 실 (1-3 분)까지 P1000 micropipettor와 함께. 5 분 (실내 온도 또​​는 4 ° C)에 대해 450 10 ML HF, 원심 분리기 × g을 추가하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 5 MG / ML Dispase 2 ML 1 MG / ML DNase I 펠릿 1 분을위한 P1000 micropipettor과 믹스에 200 μl를 추가합니다. 샘플 클리오해야udy하지만 실 수 없습니다. 실 경우, DNase I 100 μl를 추가하고 다시 섞는다. </li><li> 5 분 (실내 온도 또​​는 4 ° C) 10 ML 추운 HF, 450에서 40 μm 셀 스트레이너 및 원심 분리기를 통해 변형 × g을 추가하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 전체 미디어의 최종 펠렛을 Resuspend. 세포의 총 수를 (hemocytometer이나 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 카운터를 사용하여) 수량화. 두 유방 땀샘은 약 1 개 10월 6일부터 1일까지 X 10 7 세포를 얻을 수 있습니다. 물론 당 1.5 × 10 5 세포의 밀도를 평면 바닥 6 잘 플레이트에 플레이트 기본 상피 세포. </li></ol> 3. 라이브 셀 이미징 <ol><li> 즉시 세포를 도금 후, 2 / humidity/37를 포화 ° C 온도 배양 챔버 5 % CO 내 현미경 무대에서 안전하게 6 잘 판을 놓습니다. Kohler 조명 및 센터 위상 반지의 콘덴서를 조정합니다. 실험 여기에 제시된를 들어, 역 니콘 이클립스 TE300/PerkinElmer는 디스크 공 촛점을 스피닝10X 목적 렌즈와 widefield 위상 콘트라스트 모드에서 현미경 시스템이 사용되었습니다. </li><li> 오픈 이미지 수집 소프트웨어는 생성하고 시간 경과 이미지에 대한 라이브러리 이름을, 대형 파일에 대한 충분한 공간이있는 위치에 저장합니다. 실험은 여기 활용 Volocity 이미지 수집 소프트웨어 (버전 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA)를 발표했다. </li><li> 플레이트는 15 분의 최소 현미경 보육에 평형 수 있도록 허용합니다. 무대 렌즈 간섭을 방지하기 위해 렌즈를 낮 춥니 다. &quot;무대&quot;제목 아래, &quot;스테이지 조정 &#39;을 선택합니다. 초점 평면, 세트 Z 제목의 &quot;스테이지&quot;아래 &quot;추가 포인트&quot;를 선택하여 X, Y, Z 탭과 마르크 이미징 포인트 미만 = 0.을 Reacquire 위상 콘트라스트 이미지와 같은 이미지를위한 6 잘 플레이트의 각 우물의 중앙에 자리 포인트는 플라스틱 우물의 주변 근처 왜곡 될 수 있습니다. 4 × 4 분야 (650 μm는 x 700 μm 분야), 작은 오버랩 (약 5 %)이 각각의 사각형에 포인트를 마련합니다. &quot;남성 아래의 선택한 지점을 저장전자. &quot; </li><li> &quot;무대&quot;에서 선택 &quot;초점을지도하기 &#39;와 각 지점의 포커스를 설정하라는 메시지가 나타납니다 따릅니다. 시간 당 4 장의 사진을 (매 15 분) 캡처 이미지 수집 타이밍을 설정합니다. 이것은 특정 실험의 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다. &quot;무대&quot;아래의 초점지도를 저장합니다. </li><li> 오른쪽 오른쪽 도구 모음 &#39;이미지 수집 &quot;을 클릭하고 이미지 설정을 저장합니다. 이미지를 시작 레코드 버튼을 누릅니다. 1 시간 후에는, 조정이 필요한 경우 보려면 이미지의 초점을 확인합니다. </li><li> 모니터링 및 세포가 합류 될 때 종료, 5 일 동안 라이브 영상을 계속합니다. </li></ol> 4. 타이밍 및 초기 상피 세포의 콜로니 형성의 메커니즘, Apoptosis의 입사 및 형태학의 변경을 단계적으로 중지를 평가하기 위해 시간 경과 이미지를 직접보기 <ol><li> 시간 경과 이미지를 직접 볼 수는 호환 비디오보기 소프트웨어 (예 : 사용 실적을 할 수 있습니다 <a href="http://www.real.com/" target="_blank">HTTP를 :</a>/ / www.real.com/ 리얼 플레이어 또는 기타 프리웨어 또는 상용 소프트웨어). 이미지는이 단계에서 나. JPG 파일 (5 단계 참조)로 변환 한 후. TIFF 형식으로 볼 수 있습니다. </li><li> 초기 식민지 형성의 메커니즘을 확인하려면 접시에 하나 이미징 사이트를 대표하는 단일 이미지 스택과 함께 시작합니다. 초기 프레임에서 셀은 플로팅 될 것입니다. 첫 번째 상피 세포는 판에 부합시기를 결정하는 일련의 이미지를 따르십시오. 이 단계에서 상피 세포 식별 할 수 있으며, 그들보다 더 cuboidal 형태의 섬유 아세포에서 차별화. 직렬 이미지를 통해이 하나의 상피 세포에 따라 이후 24 시간 동안의 운명을 따르십시오. 이 추가 상피 세포로 둘러싸여되거나 세포 분열 또는 apoptosis를 겪 경우 기록합니다. 상피 세포로 둘러싸여 경우 주변 셀이 다음 초기 점착성의 셀 (들) 또는와 종합 부동 세포에서 파생하는 경우, 식민지 형성의 메커니즘은보고 직접 결정하실 수 있습니다초기 자기편 세포의 분열에서. 처음 24 시간 동안 세포 집계 대 세포 분열에 의해 형성된 콜로니 수를 기록합니다. </li><li> 특정 기간 동안 apoptosis를 받아야 처음 자기편 세포의 수를 확인하려면 자기편 된 셀에 개발 apoptosis의 고전적인 기능의 모양에 대한 일련 이미지를 따라 ( <a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a> ) 및 이미지의 전체 기간 동안 또는 특정 시간 프레임 내에서 식별 된 apoptotic 세포의 수를 기록했다. </li><li> 시간이 지남에 따라 문화의 상피 세포가 EMT와 일치보다 가늘고 긴 모양으로 초기 cuboidal 모양에서 자신의 형태를 변경합니다. 이러한 경우가 발생하면 도금 후 일 / 시간을 결정하는 일련 이미지를 따르십시오. </li></ol> 5. 이미지 파일 수정 <ol><li&gt;는 Volocity 소프트웨어를 통해, TIFF 스택에 이미지 파일을 내보낼 수 있습니다. 여기 MetaMorph의 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어는 (분자 장치, LLC 서니 베일, CA) TIFF 스택 ​​파일을 여는 데 사용되었다하고 그 다음 하나. JPG 이미지로 MetaMorph에 저장되었습니다. </li><li> Timm의 추적 도구 소프트웨어에 대한 요구 사항에 따라 이미지 폴더와 파일의 이름을 바꿉니다 이름 바꾸기 2.1.6 (같은 프리웨어 프로그램을 사용 <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml을</a> 그룹으로 파일 이름을 바꾸는 것이). 실험의 모든 폴더와 파일을 포함하는 하나의 폴더를 생성하고 (예를 들어 폴더 이름을 </em&gt; EXPERIMENTNAME). </li><li> 문화 이미징 된 각 점 / 위치에 대한 하위 폴더를 만듭니다. 하위 폴더의 이름을 지정 : EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER합니다. 위치 번호는 3 자리 숫자가 있어야합니다. 예 : 072511RN_p001. 하위 폴더에서 해당 개인 위치의 모든 이미지 파일을 놔. </li><li> timepoint (5 자리 숫자를 사용)이 형식의 각 파일 이름의 끝 부분에 채널 번호 (하나의 시야 채널이 있기 때문에, &quot;0&quot;사용) 추가 : EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample : 072511RN_p001_t00001_w0.jpg </li><li> 먼저 TTT 웹 사이트에서 무료로 프로그램 TTTlogfileconverter를 다운로드하여 각 위치에 대한 로그 파일을 생성합니다. TTTlogfileconverter 프로그램을 시작하고 실험 폴더를 선택합니다. 입력 이미지 간격 (초). 매 15 분 촬영 사진의 경우, 900 초를 입력합니다. 그런 다음 녹색 비밀 로그 파일 버튼을 누릅니다. </li></ol> 6. TTT를 사용하여 단일 셀의 셀 운명지도 생성 <ol><li> CTTTexport라는 폴더를 reate 모든 셀 추적 데이터가 TTT 소프트웨어 지침에 따라 저장 될 위치와 하위 폴더는 TTTfiles라고 </li><li> TTT 프로그램을 시작한 사용자의 이니셜을 선택하고를 클릭하십시오 &quot;계속.&quot; </li><li> 키를 눌러 &quot;설정 NAS를&quot;, &quot;TTTexport&quot;폴더를 생성 한 사용자를 선택하고 확인을 클릭합니다. 브라우저에서 다음 Enter 키를 누릅니다 &quot;로드 위치&quot;버튼을, 실험 폴더를 선택 위치 폴더를 선택합니다. </li><li> 에 안구 요소를 설정 &quot;10 배.&quot; 필요한 이미지의 수를로드 (모든 이미지를로드하는 것은 처음 권장합니다). </li><li> 셀 편집기 창에서 파일 메뉴에서 &quot;새 식민지&quot;를 선택합니다. 영화 창에서 셀을 추적 할 수있는 &#39;트랙 셀 &quot;또는 F2 키를 누릅니다. </li><li> M의 셀을 식별ovie 창 및 셀 위로 커서를 할 때 사용하는 마우스. F2를 클릭 한 후 세포의 번호와 원이 나타납니다. 다음 사진에 셀 사전의 위치를​​ 추적 할 수 키보드의 숫자 패드에있는 &quot;0&quot;키를 사용합니다. 각 프레임을 통해 각 셀의 위치를​​ 따라 커서를 이동합니다. 트랙을 삭제하고 숫자 패드에있는 이전 이미지 프레스 &quot;푸&quot;로 돌아갑니다. &quot;3&quot;셀 프레스를 추적하지 않고 앞으로 프레임을 이동하려면, 전화 번호 패드에 눌러 &quot;1&quot;을 추적하지 않고 뒤로 이동합니다. </li><li> 세포 분열은 영화 창에서 &quot;부&quot;버튼을 클릭 표시합니다. 세포 사망을 표시하려면 영화 창에서 &#39;셀 사망&#39;버튼을 클릭합니다. 부서가 발생되면, 딸 세포는 바로 자동 모드를 추적 할 수있는 셀 편집기 창에서 지정 딸 셀의 원 기호를 클릭하여 동일한 세포 운명지도에서 추적 할 수 있습니다. </li><li> 트리를 저장 F10을 누르십시오. 각 나무는 지정된 출력 배에 저장됩니다어 (TTTExport). 새로운 세포 운명지도를 시작하려면 셀 편집기 창에서 &quot;파일&quot;다음 &quot;열기&quot;메뉴에서 &quot;새 식민지&quot;를 선택합니다. </li><li> 셀 편집기 창에서 &#39;셀 데이터&#39;탭에서 수집 한 후 세포 수명 데이터를 집계. </li></ol> 7. 통계 분석 <ol><li> 어느 학생의 t-테스트를​​ 사용하여 (두 genotypes을 비교하는 경우) 또는 ANOVA 결정 (&gt; 두 genotypes을 비교하는 것은 경우) 등 초기 세포 식민지, 세포 수명 또는 시간 숫자로 파라 메트릭 데이터의 차이는 다른 genotypes 사이 EMT의 모습은 통계적 때까지 경우 중요 하지요. Apoptotic 주파수 번호 / 학생의 t-test 또는 ANOVA를 사용하여 총 도금 셀 또는 자기편 세포의 비율로 파생 맨 - 휘트니 또는 Kruskal-월리스와 비교할 수 있습니다. </li><li> 필요한 실험은 복제 얼마나 많은 결정하는 초기 실험의 분석에서 데이터를 사용하여 전력 테스트를 수행 충분한 s에 대한 수행과 세포 운명지도는 각 복제에서 생성 된사용 가능한 프리웨어를 사용하여 tatistical 전원 (예 : <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a> ). 여기에 제시된 실험에서 유전자형 당 3 쥐에서 파생 된 세포 문화는 특정 유전 수정이 만들어 질 때 세포 식민지 형성과 세포 수명의 통계적으로 의미있는 차이가 있었다 여부를 결정하기에 충분했다. </li></ol>

<ol><li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li>
<li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li>
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<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li>
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<li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+hematology%22%5BJournal%5D)">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li>
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<li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li>
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</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

중요 단계 그것은 유방 땀샘은 유방 상피 세포의 행동에 연령 관련 변화에 대한 제어 할 수있는 같은 시대의 마우스에서 수확되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 세포를 도금 할 때, 셀의 동일한 번호가 모든 실험에 대한 각각의 우물에 도금해야합니다. 문화가 가능한 직렬 이미지를 통해 여러 개별 셀을 따르도록하고 너무 빨리 합류가되지 않도록 도금 할 때 세포는 상대적으로 희박한해야합니다. 이 플레이트는 equilibrated 후 포커스가 변경됩니다 때문에 접시 이미징 전에 보육에 equilibrated 것이 중요합니다. 일단 영상이 시작되었습니다 초점은 특히 첫 24 시간 이내에 자주 확인하고 필요에 따라 조정해야합니다. 이 보육 규제 및 사전 예열의 온도가 중요합니다. 방을 들락​​날락 사람들의 수는 가능한 한 제한해야합니다. 우리는 보인의 모든 측면을 연습하는 것이 좋습니다g 재현성 및 품질 관리를 보장하기 위해 사전에 실험까지. 모든 세포 배양 실험과 마찬가지로, 불임은 중요한...

유전 공학 마우스 모델은 공부하고 다른 유전자 병변이 유방암을 개발의 위험에 기여하는 방법을 이해하는 도구입니다. 예를 들어, 유전자 변형 마우스가 게재 한 광고 세 가지 요소의 조합 : 전체 길이 유방암 암 1, 초기 발병 (Brca1) 유방 상피 세포에서 유전자, 종양 단백질 p53의 (Tp53) 세균 라인 haploinsufficiency, 그리고 상피 유방의 손실 셀은 목표 상향 조절 에스트로겐 수용체 알파 Brca1 floxed (F) 11/f11/Mouse 유방 종양 바이러스 (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator (의 100 %에서 유방암의 개발에 (시대) 식 결과 tet 조합) -ER/MMTV-reverse 테트라 사이클린 transactivator (Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53에서보고 된 낮은 비율 + /에 비해 세 12 개월로 rtTA 쥐 - 시대없이 마우스 이상 표현 (~ 50 - 60 %)와 Tp53 haploinsuf없이 Brca1 f11/f11/MMTV-Cre 마우스ficiency (&lt;5 %) 1. preneoplastic 기본 유방 상피 세포의 행동의 동적 시간 경과 영상 적은 쉽게 정적 조직 섹션에 부탁드립니다 셀 동작의 차이를 보여줍니다. 증식과 분화에 변경이 인간의 BRCA1 변이 캐리어의 기본 유방 세포에서 관찰됩니다. 단일 셀 정상적인에서 기본 유방 상피 세포의 중지 및 유전 공학 마우스의 2 제작이 resected 유선 조직의 효소 disassociation을 통해 생성됩니다. 3 시간 경과 이미지는 셀 식민지의 모양과 상피 - 중간 엽 전이 (EMT) 및 apoptosis를 포함한 세포의 형태학의 변화의 입사 메커니즘 및 타이밍을 평가하기 위해 볼 수 있습니다. 세포 운명지도의 생성은 세포 분열 (세포 수명) 및 세포 분열의 패턴 결정 사이의 시간 길이의 정량화는 단일 셀 추적의 사용에 의해 촉진된다. Timm의 추적 도구 (TTT)는 단일 셀의 운명지도를 생성하는 데 사용 공개적으로 사용 가능한 소프트웨어입니다. 세포 운명의 메커니즘을 elucidating에서의 유틸리티는 정상적인 조혈 줄기 세포 개발 6-9 뉴런의 생성을 조사 4,5 설립되었습니다. 10

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> EpiCult-B 자연적으로 흐르는 것과 매체 마우스 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 05,610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B의 확산 보조 식품 마우스 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 05,612 </td><td></td></tr><tr><td> 재조합 인간 표피 성장 인자 (rhEGF) </td><td> StemCell 기술 </td><td> 02,633 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase / Hyaluronidase </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,912 </td><td></td></tr><tr><td> 일회용 Scapels </td><td> 깃 </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 37,150 </td><td></td></tr><tr><td>mmonium 염화 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,913 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 μm 셀 스트레이너 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 27,305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell 기술 </td><td> 06,100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15,140 </td><td></td></tr></tbody></table>

기본 preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

시간 경과 영상은 유방암의 여러 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 배양 주요 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 세포 분열 (세포 수명), apoptotic 세포 번호, 형태학의 변화의 진화, 그리고 식민지 형성의 메커니즘 사이의 시간은 정량 할 수 있으며, 특정 유전 병변을 가진 세포에 비교했다. 기본 유방 상피 세포 문화가 만져서 알 수있는 종양이없는 유방 땀샘에서 생성됩니다. 분비는 신중하게 인접 근육의 명확한 분리와 resected 있으며, 림프절이 제거되며, 풍부한 유방 상피 세포의 단일 셀 중지는 효소 분해 및 여과 뒤에 날카 유방 조직에 의해 생성됩니다. 단일 셀 중지는 라이브 세포 이미징을위한 보육 챔버 내에서 도금과 현미경 바로 아래에 배치됩니다. 각 w에서 4x4 구성에서 열 여섯 650 μm X 700 μm 분야6 잘 접시의 엘자은 5 일 동안 매 15 분 이미징 있습니다. 시간 경과 이미지는 직접 처음 24 세포를 도금 시간 (집계 대 세포 증식), apoptosis의 입사 및 형태학의 변경 사항을 단계적으로 내 세포 식민지 형성의 메커니즘과 주파수를 포함 할 수있다 세포 행동을 측정하는 검사입니다. 단일 셀 추적은 개별 셀 수명과 세포 분열 패턴 조사 측정을위한 세포 운명지도를 생성하는 데 사용됩니다. 양적 데이터는 통계적으로 특정 유전 병변과 상관 행동에 상당한 차이를 평가하기 위해 분석하고 있습니다.

상피 및 섬유 아세포 세포는 세포 형태에 의해 구별 할 수 있습니다. 상피 세포는 cuboidal 모양 (그림 1A-B) 및 양식 세포 식민지 (그림 1A)를 갖추고 있습니다. 섬유 아세포, stromal 세포의 종류, 가늘고 긴 형태 (그림 1C)을 갖추고 있습니다. 세포는 반올림 및 이미징의 시작 (그림 2A-D)에 떠 있었다. 플레이트에 부착 후에는 평면이되었고, cuboidal 형 모양 (그림 2E, H)를 보여 주었다. 문화 4 일까지 상피 세포의 대부분은 EMT과 같은 형태 (그림 2I-L)에 가늘고 긴. 이 변경 사항은 연구 모든 genotypes에서 동일한 연대기가 발생했습니다. Kohler 조명 및 위상 링 정렬이 제대로 설정합니다 (그림 2D, H, L)되지</st...

시간 경과 영상은 특정 행동 매개 변수 독특한 유전 적 병변 사이에 상관 관계가 있는지 확인하기 위해 유방암 위험 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 기본 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 평가하는 데 사용됩니다.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

다음 실험의 전반적인 목표는 유방암에 걸리기 쉬운 유전적 병변이 1차 배양에서 송과체 플라스틱 기억 세포의 행동을 변화시키는지 여부를 확인하는 것입니다. 이는 유전자 조작 마우스에서 원발성 유방 상피 세포를 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 살아있는 세포 타임랩스 이미징은 5일에서 7일에 걸쳐 수행되어 세포 행동을 분석하기 위한 동영상을 만듭니다.그런 다음 단일 세포를 추적하는 소프트웨어 프로그램을 사용하여 유방암의 다른 유전자 조작 마우스 모델에서 분리된 세포의 행동을 정량화하고 비교합니다. 결과는 특정 유전적 병변이 종양 이전 기억에서 다른 행동을 유도한다는 것을 보여줍니다. 단일 세포 추적을 사용하여 수행된 정량적 행동 분석을 기반으로 한 상피 세포.이 방법은 다양한 유전적 병변이 종양 전단계 맘 유방 상피 세포의 행동을 어떻게 변화시키는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 종양 전단계, 다른 장기의 세포, 모든 장기의 암세포와 같은 다른 시스템에 적용할 수 있으며, 가능한 치료 유도 행동 변화에 대한 연구뿐만 아니라 절차를 보여주는 정상 및 암 조직의 기질 세포 행동 비교를 포함합니다. 오늘은 이 출판물의 선임 저자인 프리실라 퍼스(Priscilla Firth) 박사와 조지타운 대학교 롬바르디 암 연구 센터(Lombardi Cancer Research Center)의 현미경 및 이미징 공유 리소스 센터 관리자인 피트 존슨(Pete Johnson)이 참석합니다.쥐를 안락사시키고 즉시 부검을 진행하십시오. 스티로폼 부검 플랫폼에 누운 마우스를 놓고 복부 피부가 팽팽하게 당겨지도록 네 팔다리를 모두 고정합니다. 팔다리 피부를 포함한 복부 피부와 모발을 70% 에탄올로 적십니다.2번과 3번, 4번과 5번을 피부를 관통하는 정중선 절개로 유선을 노출시킵니다. 네 팔다리의 내측 피부를 통해 두 개의 y 절개로 절개 부위를 연장합니다. 둔기 절개를 사용하여 복막에 들어가지 않도록 주의하십시오.기저 복막에서 피부를 분리합니다. 팽팽해질 때까지 피부의 양쪽을 뒤로 당기고 바깥쪽에서 시작하여 플랫폼에 고정합니다. 가위를 사용하여 온전한 내부 및/또는 흉부 유선(mammary gland)을 아래에 있는 결합 조직과 근육으로부터 분리하는 뭉툭한 절개를 합니다.10cm 페트리 접시에 하나 또는 두 개의 유선을 놓고 조직 배양 후드로 이동합니다. 이제 유선에서 유선 림프절이 있는지 검사합니다. 황색을 띤 작고 잘 둘러싸인 결절.메스와 집게를 사용하여 주변 땀샘에서 제거합니다. 메스 두 개를 사용하여 유방 조직을 밀리미터 크기의 입방체로 다집니다. 다진 유방 조직을 50mL의 해리 매체가 있는 50ml 원뿔형 튜브에 넣습니다.부드러운 양이온과 섞어 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음날 뚜껑을 느슨하게 유지하십시오. 1차 상피 세포를 분리하고 배양합니다.세포를 도금 한 직후. 6개의 웰 플레이트를 배양 챔버 내의 현미경 스테이지에 안전하게 배치합니다. 접시가 최소 15분 동안 평형을 이루도록 합니다.Kohler 조명에 대한 집광기를 조정하고 위상 링을 중앙에 배치합니다. velocity와 같은 이미지 수집 소프트웨어를 열고 타임랩스 이미지에 대한 라이브러리를 만들고 이름을 지정한 다음 대용량 파일을 저장할 수 있는 충분한 공간이 있는 위치에 저장합니다. 스테이지 렌즈 간섭을 피하기 위해 렌즈를 내리십시오.스테이지 제목 아래에서 calibrate stage를 선택하고 X, Y, Z 탭에서 초점 평면 세트 Z가 0과 같습니다. 그리고 스테이지 아래에 있는 Add Point를 선택하여 이미징 포인트를 표시합니다. 방향: 이미징 지점을 각 웰의 중간에 배치합니다.위상차 이미징은 플라스틱 웰 주변 근처에서 왜곡될 수 있습니다. 정사각형의 점을 4x4 필드의 각각 약 5%가 겹치도록 정렬합니다. 선택한 점을 스테이지 아래에 저장합니다.스테이지에서 포커스 맵 만들기를 선택하고 프롬프트에 따라 각 포인트의 포커스를 설정합니다. 그런 다음 시간당 적절한 수의 사진을 캡처할 수 있도록 이미지 획득 타이밍을 설정합니다. 이제 스테이지 아래에 포커스 맵을 저장합니다.오른쪽 도구 모음에서 이미지 획득을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 진행합니다. 그런 다음 이미징 설정을 저장합니다. 녹화 버튼을 눌러 한 시간 후에 이미징 프로세스를 시작하고 이미지의 초점을 확인하여 조정이 필요한지 확인합니다.세포가 합류하는 5일 동안 실시간 이미징을 모니터링하고 계속합니다. 획득한 디지털 이미지를 모니터링하고 처음 24시간 동안 초점 맵을 자주 조정하는 것이 중요한데, 그 이유는 세포가 그 이후에는 적어도 하루에 두 번 플레이트에 부착되기 때문입니다. 세포에 초점이 맞춰져 있고 배양물이 오염되지 않았는지 확인합니다.초기 군집 형성 메커니즘을 결정하려면 플레이트의 한 이미징 부위를 나타내는 단일 이미지 스택으로 시작합니다. 초기 프레임에서 세포는 떠 있고 상피 세포와 섬유 아세포 세포는 세포 형태에 따라 구별 될 수 있습니다. 상피 세포는 직육면체 모양을 가지며 세포 식민지를 형성합니다.기질 세포의 일종인 섬유아세포는 길쭉한 형태를 가지고 있습니다. 첫 번째 상피 세포가 플레이트에 부착되는 시점을 확인하기 위해 연속 이미지를 따르십시오. 이 단계에서 상피 세포는 더 많은 직육면체 형태에 의해 섬유아세포와 식별되고 구별될 수 있습니다.연속 이미지를 통해 이 단일 상피 세포를 추적하고 이후 24시간 동안 그 운명을 따라가십시오. 세포가 추가 상피 세포에 둘러싸이거나, 세포 분열을 겪거나, 세포사멸을 겪는 경우, 상피 세포로 둘러싸인 경우, 집락 형성 메커니즘은 주변 또는 세포 분열의 응집으로부터 결정될 수 있습니다. 처음 24시간 동안 세포 응집 대 세포 분열에 의해 형성된 콜로니의 수를 기록하여 특정 기간 동안 세포자멸사를 겪는 초기에 부착된 세포의 수를 결정합니다.시간이 지남에 따라 부착되어 온 세포에서 발달하는 세포사멸의 고전적인 특징이 나타나는 모습에 대한 연속 이미지를 따르십시오. 배양 중인 상피 세포는 초기 직육면체 모양에서 더 길쭉한 모양으로 형태를 변경합니다. EMT와 일치합니다.시리얼 이미지를 따라 도금 후 요일과 시간을 확인하십시오.이 경우 TTT 프로그램을 시작하여 시작하십시오. 사용자 이니셜을 선택하고 계속을 클릭합니다. set NAS를 누르고 사용자가 만든 TTT 내보내기 폴더를 선택한 다음 확인을 클릭합니다.브라우저에서 실험 폴더를 선택합니다. 위치 폴더를 선택한 다음 로드 위치 버튼을 누릅니다. 안구 인자를 10배로 보냅니다.필요한 이미지 수(일반적으로 모든 이미지)를 로드합니다. 이 분석을 사용하는 경우. 셀 편집기 창에서 처음으로 동영상 창의 파일 메뉴에서 새 식민지를 선택합니다.트랙 셀 버튼을 누르거나 F를 두 번 누릅니다. 셀 추적을 시작합니다. 동영상 창에서 셀을 식별하고 셀 위에 커서를 놓습니다.셀 번호가 있는 원은 F 2를 클릭한 후에 나타나야 합니다. 숫자 패드의 0 키를 사용하여 셀의 위치를 추적하고 다음 그림으로 이동합니다. 커서를 이동하여 각 프레임을 통해 각 셀의 배치를 따릅니다.트랙을 삭제하고 이전 이미지로 돌아가려면 숫자 패드에서 delete 키를 눌러 셀을 추적하지 않고 프레임을 앞으로 이동하려면 세 번 누릅니다. 추적하지 않고 뒤로 이동하려면 하나를 누릅니다. 동영상 창에서 세포 분열을 표시하려면 분할 버튼을 클릭하여 동영상 창에서 세포 사멸을 표시하고 세포 사멸을 클릭합니다.분열이 발생하면 동일한 세포 운명 맵에서 딸 세포를 추적할 수 있습니다. 이렇게 하려면 셀 편집기 창으로 이동하여 지정된 점 셀의 원 기호를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 그러면 추적 모드가 자동으로 시작되고 이제 F 10을 눌러 트리를 저장합니다.각 트리는 지정된 출력 폴더에 저장됩니다. 셀 편집기 창에서 새 황산염 맵을 시작하려면 열기 메뉴를 선택하고 파일을 클릭한 다음 클릭합니다. 새로운 콜로니 세포는 이미징 시작 시 둥글게 떠다녔습니다.크기 막대는 200 미크론과 같습니다 플레이트에 부착 한 후 평평하게되어 직육면체 유형의 외관을 보여주었습니다. 4일간의 배양까지 대부분의 상피 세포는 형태학적으로 EMT와 같이 길어졌습니다. 이러한 변화는 모든 유전자형에서 동일한 연대기로 발생했으며, 부유 세포는 정의된 개별 상피 세포 군체로 발달했습니다.도금 후 24시간까지 연속 이미지 분석을 통해 이러한 콜로니가 세포 분열이 아닌 세포 응집에 의해 생성되었음을 밝혔습니다. BRCA의 붕괴는 그 자체로 형성된 군체의 수를 바꾸지 않았습니다. TP 53 haplo insufficiency의 추가는 형성된 군체의 수를 크게 줄였습니다.마찬가지로, 발현에 ER 알파를 추가하면 이 절차에 따라 형성된 콜로니의 수가 크게 증가했습니다. 단일 세포 추적과 결합된 타임 랩스 이미징을 사용하는 다른 방법을 수행하여 특정 치료 접근 방식 또는 추가 유전적 병변이 세포 행동을 어떻게 변화시키고 치료 반응 또는 암 진행에 영향을 미칠 수 있는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

time-lapse-imaging-primary-preneoplastic-mammary-epithelial-cells

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

근원:마리나 아란테스 라디키1, 빅터 카를로스 멜로1,빅토리아 파스 마차도1, 마르시아 크리스티나 올리베이라 다 로샤1, 자클린 바즈 데 올리베이라1, 루아나 크리스티나 카마르고1,2, 루이스 알렉상드르 뮐만1, 리카르도 벤테스 아제베도1, 소니아 나이르 바오1, 주앙 파울로 피게이로 롱고11브라질리아 대학교 생물과학연구소, 2브라질리아대학교 심리학연구소 기초심리과정학과이 비디오는 루시페라아제 발현 유방 선암종 세포를 암컷 마우스에 주입하고 생물발광 신호를 모니터링하여 시간 경과에 따른 원발성 및 전이성 종양 성장을 평가함으로써 생체 내에서 종양 진행을 추적하는 절차를...

암컷 마우스 모델에서 유방 종양 진행의 생물발광 이미징

우리는 안티 - 암 치료에 영상 응답하는 방법을...

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

임상 적으로 전이성 유방암에서 유방 유관 시스템 결과에 아데노 바이러스 크레와 잠재 돌연변이의 활성화. YFP 발기인의 설립은 말초 전이성 종양 세포의 추적을 할 수 있습니다. 이 모델은 잠재 전이, 항 종양 면역, 유방암을 치료하는 새로운 면역 요법을 디자인을 공부하는 데 유용합니다.

유방암의 소설 형질 전환 마우스 모델 : 아데노 바이러스 크레와 유관 상피의 대상으로 전이성 유방암의 개시

손상 조직을 사용 organoids 차 세포 배양은 다세포 생체 내 미세 환경을 모방 모델 시스템을 제공한다. 우리는 효소 조직을 중단하지 않고 형태를 차별화 혼합 세포 배양 계통 및 전시회를 영속 무 혈청 차 유방 상피 조직 배양 모델을 개발했다. 유방 organoids&gt;는 6 개월 가능한 남아있다.

비 효소, Mammospheres의 자연 발생에 대한 사전 침습 유방 병변의 혈청이없는 조직 문화

동소 유방암 차 종양 모델 원발 종양의 외과 적 제거가 기재되어 자발적 전이를 생성하는 마우스의 수명을 연장한다. 종양 성장 및 진행 모니터링하고 루시퍼 형광 이미징에 의해 정량화된다.

자발적 유방암 전이의 동소 이식 마우스 모델

이 프로토콜의 목표는 마우스 유방 땀샘으로 Cre 발현 아데노바이러스의 자궁 내 주입에 기초한 새로운 유방암 모델링 접근을 기술하는 것입니다. 이 접근은 세포 모형 및 기관 특정 조작을 시간적으로 통제한 방식으로 oncogenic 사건을 둘 다 허용합니다.

마우스 유방 동맥에 Cre 발현 아데노 바이러스의 경막 주사를 통해 유방암 모델링

이 작업은 녹색 형광 단백질 및 생물 발광 신호의 검출뿐만 아니라 정량적 분자 검출 기술의 통합에 의해 종양 하중을 정확하게 평가하기 위한 고급 프로토콜을 미리 설정합니다.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

이 프로토콜은 교체 가능한 뚜껑 (R.MIW)이있는 새로운 유방 이미징 창을 설명합니다. R.MIW의 이식 후 생체 내 현미경 검사는 다른 발달 단계에서 세포 해상도로 건강하고 병든 유선의 종방향 및 다일 이미징을 허용합니다.

교체 가능한 뚜껑이있는 유방 이미징 창을 사용하는 종방향 생체 내 현미경 검사

여기에 설명된 생체내 영상화 방법은 대사 보조인자 NAD(P)H로부터의 콜라겐 초고조파 생성 및 내인성 형광을 이용하여 표지되지 않은 종양 미세환경을 종양, 기질 및 혈관 구획으로 비침습적으로 분절하여 4D 생체내 영상의 심층 분석을 한다.

유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법

본 프로토콜은 레이저 스캐닝 컨포칼 및 다광자 현미경에 의한 수유 마우스 유선의 생체 내 이미징을 위한 손쉬운 기술을 설명합니다.

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland(유선의 생체 내 세포내 현미경)

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

배우세요 유전자 변형 마우스 모델에서 유방 상피 세포의 시간 경과 영상 분석 방법을. 단일 세포 추적으로 선암성 세포의 행동 변화를 정량화하여 유방암 초기 발생 메커니즘을 규명합니다.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

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