Name: 오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정 Xenopus Oocytes : 방사성 동위 원소의 Assays에 대한 대안 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 학습하세요 Xenopus oocytes에서 원자 흡광 분광법을 이용한 K⁺-ATPase 양이온 교통 측정 방법을. 방사성 동위원소 대체 안전한 기법으로 세포 이온 항상성 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

저자는 방법 개발의 초기 단계에서 아낌없는 지원을 해준 Ernst Bamberg(막스-플랑크-생물물리학 연구소, 독일), 수많은 유익한 토론을 해준 Kazuhiro Abe(일본 교토 대학), 기술 지원을 해준 Michael Kohl 박사(Analytik-Service, Woltersdorf, 독일)에게 감사를 표합니다. 저자들은 독일 연구 재단 DFG(Cluster of Excellence "Unifying Concepts in Catalysis")의 자금 지원에도 감사를 표하며, 이 기금은 Perkin Elmer AAnalyst 800 장치(SFB 498)에도 자금을 지원했습니다.

<ol><li>Tavraz, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+plasma+membrane+targeting+or+protein+stability+by+certain+ATP1A2+mutations+identified+in+sporadic+or+familial+hemiplegic+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Impaired plasma membrane targeting or protein stability by certain ATP1A2 mutations identified in sporadic or familial hemiplegic migraine.</a> Channels (Austin). 3, 82-87 (2009).</li>
<li>Castillo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscape+of+the+reactions+governing+the+Na%2B+deeply+occluded+state+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+in+the+giant+axon+of+the+Humboldt+squid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Energy landscape of the reactions governing the Na+ deeply occluded state of the Na+/K+-ATPase in the giant axon of the Humboldt squid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 20556-20561 (2011).</li>
<li>Friedrich, T., Bamberg, E., Nagel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2CK%2B-ATPase+pump+currents+in+giant+excised+patches+activated+by+an+ATP+concentration+jump%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Na+,K+-ATPase pump currents in giant excised patches activated by an ATP concentration jump.</a> Biophys J. 71, 2486-2500 (1996).</li>
<li>Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Dempski, R. E., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+E2+state+stabilization+by+specific+alpha%2Fbeta-subunit+interactions+of+Na%2CK-+and++H%2CK-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional significance of E2 state stabilization by specific alpha/beta-subunit interactions of Na,K- and H,K-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 284, 3842-3854 (2009).</li>
<li>Dürr, K. L., Abe, K., Tavraz, N. N., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2P+state+stabilization+by+the+N-terminal+tail+of+the+H%2CK-ATPase+beta-subunit+is+critical+for+efficient+proton+pumping+under+in+vivo+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">E2P state stabilization by the N-terminal tail of the H,K-ATPase beta-subunit is critical for efficient proton pumping under in vivo conditions.</a> J. Biol. Chem. 284, 20147-20154 (2009).</li>
<li>Durr, K. L., Tavraz, N. N., Zimmermann, D., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Na%2CK-ATPase+and+H%2CK-ATPase+enzymes+with+glycosylation-deficient+beta-subunit+variants+by+voltage-clamp+fluorometry+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Na,K-ATPase and H,K-ATPase enzymes with glycosylation-deficient beta-subunit variants by voltage-clamp fluorometry in Xenopus oocytes.</a> Biochemistry. 47, 4288-4297 (2008).</li>
<li>Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+gastric+H%2CK-ATPase+activity+by+cations%2C+voltage+and+intracellular+pH+analyzed+by+voltage+clamp+fluorometry+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Control of gastric H,K-ATPase activity by cations, voltage and intracellular pH analyzed by voltage clamp fluorometry in Xenopus oocytes.</a> PLoS One. 7, e33645(2012).</li>
<li>Tavraz, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+functional+consequences+of+mutations+in+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+alpha2-subunit+causing+familial+hemiplegic+migraine+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Diverse functional consequences of mutations in the Na+/K+-ATPase alpha2-subunit causing familial hemiplegic migraine type 2.</a> J. Biol. Chem. 283, 31097-31106 (2008).</li>
<li>Lorenz, C., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li>
<li>Koenderink, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2CK-ATPase+mutations+in+familial+hemiplegic+migraine+lead+to+functional+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Na,K-ATPase mutations in familial hemiplegic migraine lead to functional inactivation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1669, 61-68 (2005).</li>
<li>Price, E. M. J., Lingrel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+the+Na%2CK-ATPase+alpha+subunit%3A+site-directed+mutagenesis+of+glutamine-111+to+arginine+and+asparagine-122+to+aspartic+acid+generates+a+ouabain-resistant+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in the Na,K-ATPase alpha subunit: site-directed mutagenesis of glutamine-111 to arginine and asparagine-122 to aspartic acid generates a ouabain-resistant enzyme.</a> Biochemistry. 27, 8400-8408 (1988).</li>
<li>Richards, R., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+conformational+dynamics+of+membrane+proteins+in+situ+with+site-directed+fluorescence+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling.</a> J. Vis. Exp. (2627), e2627(2011).</li>
<li>Lafaire, A. V., Schwarz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+dependence+of+the+rheogenic+Na%2B%2FK%2B+ATPase+in+the+membrane+of+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Voltage dependence of the rheogenic Na+/K+ ATPase in the membrane of oocytes of Xenopus laevis.</a> J. Membr. Biol. 91, 43-51 (1986).</li>
<li>Morth, J. P., Pedersen, B. P., Toustrup-Jensen, M. S., Sorensen, T. L., Petersen, J., Andersen, J. P., Vilsen, B., Nissen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+sodium-potassium+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the sodium-potassium pump.</a> Nature. 450, 1043-1049 (2007).</li>
<li>Toustrup-Jensen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+terminus+of+Na%2B%2CK%2B-ATPase+controls+Na%2B+affinity+on+both+sides+of+the+membrane+through+Arg935%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The C terminus of Na+,K+-ATPase controls Na+ affinity on both sides of the membrane through Arg935.</a> J. Biol. Chem. 284, 18715-18725 (2009).</li>
<li>Morth, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+Na%2B%2CK%2B-ATPase+and+mapping+of+isoform+differences+and+disease-related+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the Na+,K+-ATPase and mapping of isoform differences and disease-related mutations.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 364, 217-227 (2009).</li>
<li>Yaragatupalli, S., Olivera, J. F., Gatto, C., Artigas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Na%2B+transport+after+an+intracellular+alpha-subunit+deletion+reveals+strict+external+sequential+release+of+Na%2B+from+the+Na%2FK+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Altered Na+ transport after an intracellular alpha-subunit deletion reveals strict external sequential release of Na+ from the Na/K pump.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15507-15512 (2009).</li>
<li>Meier, S., Tavraz, N. N., Durr, K. L., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarization-activated+inward+leakage+currents+caused+by+deletion+or+mutation+of+carboxy-terminal+tyrosines+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%7Balpha%7D+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarization-activated inward leakage currents caused by deletion or mutation of carboxy-terminal tyrosines of the Na+/K+-ATPase {alpha} subunit.</a> J. Gen. Physiol. 135, 115-134 (2010).</li>
<li>Vedovato, N., Gadsby, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+C-terminal+tyrosines+stabilize+occluded+Na%2FK+pump+conformations+containing+Na+or+K+ions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The two C-terminal tyrosines stabilize occluded Na/K pump conformations containing Na or K ions.</a> J. Gen. Physiol. 136, 63-82 (2010).</li>
<li>Chakavarti, B., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+separation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic separation of proteins.</a> J. Vis. Exp. (16), e758(2008).</li>
<li>Kamsteeg, E. J., Deen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+aquaporin-2+expression+levels+in+genotype+-phenotype+studies+in+nephrogenic+diabetes+insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Importance of aquaporin-2 expression levels in genotype -phenotype studies in nephrogenic diabetes insipidus.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 279, 778-784 (2000).</li>
<li>Koenderink, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+analysis+of+the+mutated+Na%2CK-ATPase+cation+binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological analysis of the mutated Na,K-ATPase cation binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 278, 51213-51222 (2003).</li>
<li>Gottardi, C. J., Caplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+requirements+for+the+cell-surface+expression+of+multisubunit+ion-transporting+ATPases.+Identification+of+protein+domains+that+participate+in+Na%2CK-ATPase+and+H%2CK-ATPase+subunit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular requirements for the cell-surface expression of multisubunit ion-transporting ATPases. Identification of protein domains that participate in Na,K-ATPase and H,K-ATPase subunit assembly.</a> J. Biol. Chem. 268, 14342-14347 (1993).</li>
<li>Mathews, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+and+functional+expression+of+the+mouse+and+frog+alpha-subunit+of+the+gastric+H%2B-K%2B-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Primary structure and functional expression of the mouse and frog alpha-subunit of the gastric H+-K+-ATPase.</a> Am. J. Physiol. 268, 1207-1214 (1995).</li>
<li>Horisberger, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+H%2CK-ATPase+beta-subunit+can+act+as+a+surrogate+for+the+beta-subunit+of+Na%2CK-pumps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The H,K-ATPase beta-subunit can act as a surrogate for the beta-subunit of Na,K-pumps.</a> J. Biol. Chem. 266, 19131-19134 (1991).</li>
<li>Guennoun-Lehmann, S., Fonseca, J. E., Horisberger, J. D., Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palytoxin+acts+on+Na%2B%2CK%2B-ATPase+but+not+nongastric+H%2B%2CK%2B-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Palytoxin acts on Na+,K+-ATPase but not nongastric H+,K+-ATPase.</a> J. Membr. Biol. 216, 107-116 (2007).</li>
<li>Horisberger, J. D., Guennoun, S., Burnay, M., Geering, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cation+stoichiometry+and+cation+pathway+in+the+Na%2CK-ATPase+and+nongastric+H%2CK-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci.%22%5BJournal%5D)">Cation stoichiometry and cation pathway in the Na,K-ATPase and nongastric H,K-ATPase.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci.. 986, 127-132 (2003).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Na+,K+- 또는 H+,K+-ATPase를 발현하는 개별 Xenopus 난모세포에 흡수되는 Rb+(또는 Li+)의 양을 측정하는 설명된 방법은 양이온 역수송 P형 ATPase에 대한 수송의 동역학적 또는 열역학적 매개변수를 결정하는 다재다능하고 유연하며 정확한 기술임이 입증되었습니다1,4,5,7,8. 방사성 추적자 플럭스 분석에 대한 안전하고 신뢰할 수 있는 대안이며, 상당히 짧은 시간 내에 광범위한 실험 문제를 해결할 수 있습니다. 이에 따라 방사성 추적자24-27을 사용하여 매우 제한된 데이터만 획득되었습니다. AAS 방법은 전기 중성 수송 활성으로 인해 표준 전기생리학으로 분석할 수 없는 H+,K+-ATPase에 특히 유용합니다. 그러나 이 프로토콜에 표시된 예시적인 데이터는 플럭스 측정과 전압 클램핑의 조합이 ...

우리는 동위원소 실험실에 대한 접근, 안전 요구 사항 또는 리튬의 경우와 같이 매우 짧은 붕괴 시간으로 인해 사용할 수 없을 수도 있는 값비싼 방사성 동위원소의 사용과 관련된 제한을 피하기 위해 이온 전위막 단백질의 특정 수송 활성을 조사하기 위해 방사성 추적 실험에 대한 민감하고 안전하며 저렴한 대안을 개발하고 싶었습니다. 우리는 특히 전기중립으로 작동하는 위 H+,K+-ATPase의 활성을 결정하는 데 관심이 있었는데, 그 이유는 효소가 전류를 생성하지 않기 때문에 그 활성은 전기생리학적 방법으로 해결할 수 없기 때문입니다. Na+,K+-및 H+,K+-ATPase는 Rb+를 K+(및 Li+)만큼 효율적으로 수송하기 때문에 루비듐 또는 리튬에 대한 AAS 기술의 높은 감도는 수송 활동의 민감한 검출을 용이하게 합니다. 원자 흡수 분광 광도계는 화학 실험실에 널리 분포되어 있으며 많은 관심 있는 과학자들이 접근할 수 있어야 하는 일반적인 분석 장치입니다. 또한, 우리는 단일 배치 내에서 단백질 발현 수준과 관련하여 현저하게 낮은 세포 간 변동성을 달성할 수 있는 큰 단일 세포(약 1.0-1.5mm 직경)를 활용하는 Xenopus 난모세포 발현 시스템을 활용하고 싶었습니다. THGA-AAS 기술을 사용한 루비듐의 검출 한계(특성 질량)는 10pg 또는 1.2·10-13mol(Rb: 85.47g/mol)이고, 리튬의 경우 5.5pg 또는 7.9·10-13mol(Li: 6.94g/mol)입니다. 제노푸스 난모세포에서 Na+,K+-ATPase의 이종성 발현에 따라 100nA의 펌프 전류가 달성될 수 있으며(이는 초당 약 6.2·1011 기본 전하 또는 1.03·10-12 mol s-1과 동일) 따라서 1분 이내에 6·10-6C의 전하가 수송됩니다. 하나의 순 전하의 수송은 두 개의 Rb+ 이온의 흡수에 해당하기 때문에(3Na+/2K+ 화학량론으로 인해) 1분 동안 100nA 전류는 1.2·10-10 mol Rb+의 흡수에 해당합니다. 따라서 1,000배 희석(1ml 물에서 약 1μl 부피의 난모세포의 균질화)에서도 일반적인 THGA-AAS 샘플(20μl)에는 검출 임계값을 훨씬 초과하는 2.4·10-12mol Rb+(또는 204pg)가 포함되어 있습니다. 따라서 수송 활성이 100배 이상 낮거나 원형질막 발현이 낮은 수송체라도 실험의 플럭스 시간을 적절하게 조정하여 이 기술로 분석할 수 있습니다.
펌핑 속도는 온도에 민감하게 의존하기 때문에(Na+,K+-ATPase에 대한 일반적인 활성화 에너지는 90kJ/mol - 130kJ/mol1-3 범위이며, 이는 20°C에서 22°C로 변화할 때 회전율이 약 30% 증가함), 잘 평형화된 버퍼 용액을 사용하여 정밀한 온도 제어(에어컨) 하에서 플럭스 측정을 수행해야 합니다. 또한, 난모세포는 이온 수송체의 발현을 위한 균질한 크기와 관련하여 신중하게 선택해야 합니다. 이러한 예방 조치를 통해 실험 조건당 약 10개의 세포에서 10% 미만의 실험 표준 오류를 일상적으로 달성할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 예를 들어 양이온 수송4-6의 명백한 Rb+ 친화도, 세포 외 및 세포 내 pH7의 영향 및 수송 중 양이온 배당에 관여하는 잔류물의 돌연변이 효과를 결정할 수 있었습니다4,8. 이 기술의 장점은 이온 플럭스를 난모세포의 2전극 전압 클램핑과 함께 측정할 수도 있다는 것인데, 이는 한편으로는 수송 중 멤브레인 전위의 정확한 제어를 보장하고 다른 한편으로는 이온 플럭스를 멤브레인 전류와 연관시킬 수 있습니다. 따라서, Na+,K+-ATPase의 3Na+/2K+ 화학량론을 검증하고(아래 예시적인 결과 참조) 위 H+/K+-ATPase7의 양이온 수송의 전압 의존성을 결정할 수 있었습니다.

<table><tbody><tr><td>4.0 Ethicon Vicryl 봉합사 재료</td><td>Johnson</td><td>V633H</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium hystolyticum의 콜라겐분해효소 1A</td>형<td>Sigma Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>고순도 PCR 제품 정제 키트</td><td>Roche Applied Science</td><td>11732676001</td><td> </td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine Kit SP6/ T7</td><td>Ambion</td><td>1340, 1344</td><td></td></tr><tr><td>Ouabain octahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3125</td><td></td></tr><tr><td>Tricain (에틸 3-aminobenzoate 메탄 설포 네이트 염)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>닭 달걀 흰자위의 트립신 억제제 III-O</td> 형 <td>Sigma Aldrich</td><td>T2011</td><td></td></tr><tr><td>SCH28080</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4443</td><td></td></tr><tr><td>AAnalyst 800</td><td>Perkin Elmer</td><td>0993-5256</td><td></td></tr><tr><td>WinLab32TM</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPhotometer</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000.012</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 모세 혈관</td><td>과학 제품</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>헤마토크릿 튜브 3.5"</td><td>Drummond Scientific</td><td>3 000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>중공 음극 램프 리튬</td><td>Photron</td><td>P929LL</td><td></td></tr><tr><td>중공 음극 램프 루비듐</td><td>Photron</td><td>P945</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 풀러 </td><td>Narishige</td><td>모델 PC-10</td><td></td></tr><tr><td>난모 세포 기록 챔버 RC-10</td><td>Warner Instr.</td><td>W4 64-0306</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II 주입 펌프</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 샘플 컵 (1.2 ml)</td><td>Perkin Elmer</td><td>B0510397</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac - Concentrator 모델 5301</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.210</td><td> </td></tr><tr><td>THGA 튜브</td><td>Perkin Elmer</td><td>B3000641</td><td></td></tr><tr><td>터보 TEC-10CX 증폭기</td><td>NPI 전자</td><td>TEC-10CX</td><td></td></tr></tbody></table>

오세영, k와 h, k-atpase에 의해 양이온 교통 측정<em&gt; xenopus</em원자 흡수 분광 광도법에 의한&gt; oocytes : 방사성 동위 원소의 assays에 대한 대안

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

전기막 수송체 Na+,K+-ATPase에 의한 양이온 수송은 전기생리학으로 측정할 수 있는 반면, 전기중립으로 작동하는 위 H+,K+-ATPase는 조사하기가 더 어렵습니다. 많은 수송 분석은 충분한 신호 대 잡음 비율을 달성하기 위해 방사성 동위원소를 사용하지만, 필요한 보안 조치는 인체 노출 또는 분석 설계와 관련하여 엄격한 제한을 가합니다. 또한, 세포막을 통한 이온 수송은 막 전위에 의해 결정적인 영향을 받는데, 이는 세포 배양 또는 프로테오리포좀 제제에서 직접적으로 제어되지 않습니다. 여기에서는 미량의 화학 원소에 대한 원자 흡수 분광 광도법(AAS)의 뛰어난 감도를 활용하여 단일 세포에서 Na+,K+- 또는 위 H+,K+-ATPase에 의한 Rb+ 또는 Li+ 수송을 측정합니다. Xenopus 난모세포를 발현 시스템으로 사용하여 자동 시료 주입기에서 로드된 횡가열 흑연 분무기(THGA) 용광로가 장착된 AAS 장치에서 단일 난모세포 균질액 샘플을 측정하여 세포로 운반되는 Rb+(Li+)의 양을 측정합니다. 대조 난모세포로 또는 ATPase 특이적 억제제 적용 중 비특이적 Rb+ 흡수의 배경이 매우 작기 때문에 많은 수의 실험 조건을 동시에 포함하는 복잡한 동역학 분석 계획을 구현하거나 부위 특이적 돌연변이 수송체의 수송 용량과 동역학을 높은 정밀도로 비교할 수 있습니다. 또한, 양이온 흡수는 단일 셀에서 측정되기 때문에 플럭스 실험을 TEVC(two-electrode voltage-clamping)와 함께 수행하여 멤브레인 전위와 전류를 정확하게 제어할 수 있습니다. 이를 통해 예를 들어 Na+,K+-ATPase의 3Na+/2K+ 수송 화학량론을 정량적으로 결정할 수 있었고 전기 중성으로 작동하는 위 H+,K+-ATPase에 의한 양이온 수송의 전압 의존성을 처음으로 조사할 수 있었습니다. 원칙적으로 이 분석은 K+ 수송 막 단백질에 국한되지 않지만, 중금속 또는 전이 금속 수송체의 활성 또는 세포내 과정에 의한 화학 원소 흡수를 처리하는 데에도 동일하게 효과적일 수 있습니다.

Xenopus 난모세포 발현 시스템에서 AAS를 이용해 K+- (또는 Rb+)-대향수송 P-type ATPase에 의한 Rb+ 섭취량을 정량화하면 효소 반응 속도론적 파라미터를 신뢰성 있게 결정할 수 있습니다.
Na+/K+-ATPase의 운송 화학양론 결정
전기발생성 Na+/K+-ATPase의 경우, 순 전하 이동(펌프 전류의 시간 적분)과 Rb+ 이동 간의 상관관계를 분석하기 위한 이전극 전압-클램프(two-electrode voltage-clamp) 실험을 통해 Rb+ 유속을 측정할 수 있습니다. 그림 1A는 1 mM Rb+가 포함된 용액을 Na+,K+-...

우리는 Xenopus 난모세포에서 효소의 이종 발현을 통해 K+-역수송 P형 ATPase의 활성을 정량화하고 원자 흡수 분광 광도법으로 개별 세포로의 Rb+ 또는 Li+ 흡수를 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 방사성 동위원소 플럭스 실험에 대한 민감하고 안전한 대안으로 복잡한 동역학 연구를 용이하게 합니다.

오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정<em&gt; Xenopus</em원자 흡수 분광 광도법에 의한&gt; Oocytes : 방사성 동위 원소의 Assays에 대한 대안

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

본 실험 절차는 개구리 난모세포를 in vivo 발현 시스템으로 사용합니다. 칼륨 역수송 P-type ATPase, TP, ais 또는 기타 미량 원소 막 수송체의 수송 활성을 정량화하려면, 먼저 수송체 단백질을 Xenopus laevis 난모세포에서 발현시킵니다. 그 다음, 특정 농도의 수송 대상 양이온이 포함된 flux 용액에서 세포를 정해진 시간과 온도 동안 배양하여 양이온 섭취를 유도합니다.또는, 2전극 전압 고정법(two electrode voltage clamp technique)을 사용하여 막전위 제어 하에 흡수 실험을 수행합니다. 세포를 세척한 후, 개별 난모세포를 1 mL의 millipore water에서 균질화합니다. 다음으로, 횡방향 가열 흑연 원자화로(transversely heated graphite atomize furnace)가 장착된 원자 흡광 광도계로 샘플을 측정합니다.최종적으로 원자 흡수 분광법을 이용한 추적자 플럭스 분석은 운송 또는 억제제 동역학, 운송의 전압 의존성 및 운송의 화학량론적 기하학적 구조를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 향후 약리학적 스크리닝에 활용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 방사성 동위원소를 사용하는 전통적인 추적자 플럭스 실험에 비해 정확하고 저렴하며 안전한 대안이라는 점입니다.또한 막 전위가 운반체 기능에 미치는 영향에 대한 정밀한 측정을 제공합니다. 이 방법은 P-type A TPA의 구조-기능 관계에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 구리 싱크 또는 기타 미량 원소에 특이적인 다른 막 운반체 단백질에도 적용될 수 있습니다. Richards와 Demsky가 설명한 대로 opus 세포를 준비하고 cRNA 주입을 수행하여, 나트륨-칼륨의 기능적 측정을 위해 세포 내 나트륨 농도를 높이십시오.TPA 단계에서, 먼저 세포를 나트륨 로딩 버퍼로 옮기고 얼음 위에서 45분 동안 배양합니다. 그 후, 세포를 포스트 로딩 버퍼에 넣고 얼음 위에서 최소 30분 동안 회복시킵니다.이제 TPA의 내인성 나트륨-칼륨 통로를 차단하기 위해, 100 µM lobeline이 포함된 post loading buffer에서 세포를 15분 동안 배양합니다. 실온에서 2단계 마이크로 피펫 풀러(two step micro pipette puller)를 사용하여 보로실리케이트 모세관을 당겨 마이크로 전극을 제작합니다. 유리 전극의 뒷면부터 3 M 염화칼륨(potass

measuring-cation-transport-nak-hk-atpase-xenopus-oocytes-atomic

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

식물에서 영양소 및 독성 플럭스의 측정은 식물 영양 및 독성 연구에 필수적입니다. 여기에서는 칼륨(K+) 및 암모니아/암모늄(NH3/NH4+) 플럭스를 예로 사용하여 온전한 식물 뿌리의 유입 및 유출 측정을 위한 방사성 추적자 프로토콜을 다룹니다. 이러한 기술의 장점과 한계에 대해 설명합니다.

방사성 트레이서와 식물에 미네랄 영양 성분 및 독성 물질의 플럭스를 측정

이 글의 첫 번째 부분에서는 원형질막에서 소포성 Na+/H+ 교환체를 발현하는 돌연변이 세포주를 선택하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 부분에서는 세포 내 pH 측정 및 빠른 이온 흡수를 기반으로 하는 프로토콜을 제공하며, 이는 이러한 교환기의 이온 선택성과 운동 파라미터를 결정하는 데 사용됩니다.

나의 기능적 특성<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; 선택을 양자가 살해 사용하여 세포 내 구획의 교환기는 플라즈마 막에서 그들을 표현하는

세포막의 수송체는 세포막 또는 세포층을 가로질러 이온을 차등적으로 분리할 수 있으며 조직 생리학, 복구 및 병리학에서 중요한 역할을 합니다. 우리는 생체 내에서 단일 세포 및 조직에서 특정 이온 플럭스를 측정할 수 있는 이온 선택적 자체 참조 미세전극에 대해 설명합니다.

이온 선택적 자체 참조 미세 전극 기술을 이용하여 세포 외 이온 플럭스 측정

이 프로토콜은 초파리에서 격리 Malpighian (신장) 세관에서 유체 분비 속도를 측정 할 수있는 램지 분석의 사용을 설명합니다. 또한, 이온 전극의 특정 사용 transepithelial 이온 플럭스의 계산을 가능하게 분비 유체 나트륨 및 칼륨 농도를 측정하기 위해, 설명한다.

램지 분석의 사용은 유체 분비 및 이온 플럭스 요금을 측정하는<em&gt; 초파리</em&gt; Malpighian하는 Tubule

이 기사에서는 이온 채널에서 구조적 재배치를 조사하기 위해 말레이 미드 염료 대신 형광 비정상적인 아미노산 (fUAA)이 사용되는 기존의 VCF (Voltage-Clamp Fluorometry)의 향상에 대해 설명합니다. 이 절차에는 Xenopus oocyte DNA 주입, RNA / fUAA 동시 주입, 동시 전류 및 형광 측정이 포함됩니다.

전압 클램프 형광 측정법<em&gt; Xenopus</em&gt; 형광성 비 자연 아미노산을 이용한 난 모세포

이 원고는 양성자 교통 시스템의 활동을 측정 하 양성자-선택적 전극 및 패치 방법 클램핑의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이러한 메서드는 일반적으로 양성자 수송 활동, 적당 한 감도, 시간 해상도 및 부족 한 세포내 환경 제어 등을 연구 하는 데 사용 하는 기술의 몇 가지 제한 사항이 극복.

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

여기, 선물이 생리학 및 약리학 바인딩에서 GABAA 수용 체에 활성 화합물을 발견 하는 프로토콜.

감마-Aminobutyric 산 성 수용 체 변조 소설 화합물의 발견에 대 한 메서드 있는 Neurotransmission 입력

니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 된 ATPase 분석제는 소분자 미오신 억제제의 반고 처리량 스크리닝에 적응되었다. 이 운동 분석은 384웰 마이크로플레이트 형식으로 실행되며 총 반응량은 웰당 20 μL에 불과합니다. 이 플랫폼은 거의 모든 ADP 생산 효소에 적용되어야 합니다.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

본 프로토콜은 뉴런 K-Cl 공동 수송체 KCC2의 기능 및 활성을 연구하기 위한 웨스턴 블로팅 기술의 적용을 강조합니다. 상기 프로토콜은 웨스턴 블로팅을 통한 키나아제 조절 부위 Thr906/1007에서의 KCC2 인산화의 조사를 기술한다. 또한 KCC2 활성을 확인하는 추가 방법이이 텍스트에서 간략하게 강조 표시됩니다.

웨스턴 블로팅을 이용한 뉴런 K-Cl 공동수송체 KCC2의 기능 및 활성 연구

학습하세요 Xenopus oocytes에서 원자 흡광 분광법을 이용한 K⁺-ATPase 양이온 교통 측정 방법을. 방사성 동위원소 대체 안전한 기법으로 세포 이온 항상성 연구에 활용됩니다.

오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정

더 많은 동영상 탐색