오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정 Xenopus Oocytes : 방사성 동위 원소의 Assays에 대한 대안

이 절차는 개구리 세포를 생체 내 발현 시스템으로 사용합니다. P-type A, TP, ais 또는 기타 미량 원소 막 수송체를 수송하는 칼륨 계수기의 수송 활성을 정량화하려면 먼저 zap lavis에서 수송체 단백질을 발현합니다. 그런 다음 Cytes는 고정된 시간과 온도 동안 특정 농도의 수송된 양이온을 포함하는 플럭스 용액에서 세포를 배양하여 양이온 흡수를 유도합니다.

또는 두 전극 전압 클램프 기술을 사용하여 멤브레인 전위 제어 하에서 흡수 실험을 수행합니다. 세포를 세척한 후 균질화되면 개별 난모세포가 1밀리리터의 밀리포어 물에 있습니다. 다음으로, 가로로 가열된 흑연 분무로가 장착된 원자 흡수 분광 광도계에서 샘플을 측정합니다.

궁극적으로 원자 흡수에 의한 추적자 플럭스 분석. 분광법은 수송 또는 억제제 역학, 수송 및 수송의 전압 의존성, 스토익 기하학을 결정하는 데 사용할 수 있으며 최종적으로는 약리학적 스크리닝에 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 방사성 동위원소를 사용한 기존 추적 플럭스 실험에 대한 정확하고 저렴하며 안전한 대안이라는 것입니다.

또한 멤브레인 전위가 수송체 기능에 미치는 영향을 정밀하게 측정할 수 있습니다. 이 방법은 P-type A TPA의 구조적 기능적 관계에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 구리 싱크 또는 기타 미량 원소에 특이적인 다른 막 수송 단백질에도 적용할 수 있습니다. 오푸스 세포를 준비하고 Richards와 Demsky가 설명한 대로 CRNA 주입을 수행하여 나트륨 칼륨의 기능적 측정을 위해 세포 내 나트륨 농도를 높입니다.

TPA에서. 먼저, 세포를 나트륨 로딩 버퍼로 옮기고 얼음 위에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 얼음 위에서 최소 30분 동안 로딩 후 완충액에 회복할 세포를 놓습니다.

이제 TPA에서 내인성 나트륨 칼륨을 차단하려면 100마이크로몰 로빙을 포함하는 로딩 후 완충액에서 세포를 15분 동안 배양합니다. 실온에서 2단계 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 Bos 규산 모세관을 당겨 마이크로 전극을 준비합니다. 후면의 유리 전극에 3개의 염화몰 칼륨을 채우고 2개의 전극 전압 클램프 설정의 마이크로 전극 홀더의 은은 염화물 와이어 위에 장착합니다.

다음으로, 유리 마이크로 전극과 두 개의 염화나트륨 한천 브리지를 측정 버퍼가 미리 채워진 기록 챔버에 삽입합니다. 전압 cl 전환amp 앰프를 꺼짐 모드로 전환합니다. 각 유리 전극의 저항을 개별적으로 확인하십시오.

또한 적절한 TEVC 증폭기 디스플레이에서 전압 및 전류 전극의 오프셋 전위를 확인하십시오. 0과 불일치하는 경우 증폭기의 해당 오프셋 조정기로 오프셋을 조정하십시오. 이제 챔버 중앙에 난모세포를 놓고 전류와 전압 전극으로 멤브레인을 부드럽게 관통합니다.

세포의 휴지 전위에 대한 증폭기의 전위 판독값을 확인하십시오. 전환 ampP 클램프 소프트웨어를 사용하여 liifier를 VC 모드로 전환합니다. 세포를 사전 정의된 멤브레인 전위에 고정합니다.

누설 전류의 진폭과 안정성을 모니터링하고, 정의된 시간 동안 루비듐 함유 용액으로 난모세포를 관류합니다. 그리고 p 클램프 소프트웨어로 펌프 전류를 기록하십시오. 그 후 루비듐이 없는 용액으로 세포를 관류하여 루비듐 흡수가 완전히 중단되었는지 확인하십시오.

이제 두 전극 전압 클램프 실험을 중지하십시오. 기록 챔버에서 난모세포를 제거하고 세척을 진행합니다. 4.4단계는 원자 흡수에 따른 루비듐 흡수를 분석합니다.

데이터를 사용한 분광법. 오프셋 전류 감산을 수행하고 P 클램프 패키지의 클램프 핏 프로그램을 사용하여 펌프 전류의 시간 적분을 평가합니다. 난모세포 손상을 방지하려면 200마이크로리터 피펫 팁을 직경 약 2mm로 자르고 녹입니다.

그런 다음 각 난모세포를 측정할 대해 1.5ml의 밀리포어 물로 채워진 1.5ml의 einor 튜브를 준비합니다. 루비듐이 없는 세척 버퍼가 있는 페트리 접시 3개와 밀리포어 물이 담긴 접시 1개를 배열합니다. 이제 5개의 사전 배양된 cyte를 온도 제어 하에 루비듐 플럭스 완충액으로 채워진 3.5cm Petri 접시로 동시에 옮깁니다.

다음으로, 루비듐이 없는 세척 버퍼로 첫 번째 접시에서 세포를 동시에 헹굽니다. 두 번째 및 세 번째 세척을 진행한 다음 밀리포어 물로 부드럽게 헹굽니다. 이제 각 난모세포를 1밀리리터의 밀리포어 물로 채워진 준비된 에프 튜브로 개별적으로 옮기고 용액이 균질하게 탁해질 때까지 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 난모세포를 균질화합니다.

밸브 아르곤 가스 공급 장치를 켭니다. 적절한 중공 음극 램프를 임의의 소켓 위치에 삽입하고 기기를 15분 동안 평형을 이룹니다. 그런 다음 wind lab 32 제어 소프트웨어를 시작하고 램프의 평형을 위해 15분 동안 기다립니다.

가로로 가열된 흑연 분무기 튜브가 양호한 상태인지 확인하십시오. 그런 다음 Wind lab 32에서 THGA 용광로 기술을 선택하십시오. 리터당 10 - 50마이크로그램 사이의 루비듐 리튬 농도가 최소 5개 이상이고 밀리포어 물과 밀리포어 물의 빈 프로브 1개만 있는 보정 샘플을 준비합니다.

이제 메소드 파일이라는 적절한 초기화 파일을 선택합니다. 교정 샘플과 블랭크 프로브의 위치와 농도를 입력합니다. 적절한 자동 샘플러를 선택합니다.

교정 프로브를 측정합니다. 이제 각 난모세포 균질액을 개별 1.2ml 폴리프로필렌 샘플 컵으로 옮기고 이 시험관을 자동 샘플러 트레이에 넣습니다. 자동 샘플러 위치에서 프로브를 식별하기 위해 샘플 정보 파일을 만듭니다.

그런 다음 샘플 부피를 20마이크로리터로 조정하고 실행 완료 후 기기를 시작합니다. 측정된 루비듐의 양이 보정 곡선의 최대값을 초과하는 프로브가 있는지 확인합니다. 이 샘플을 적절하게 희석하고 전기적 인 나트륨 칼륨에 대해 다시 측정하십시오.

TPA 루비듐 플럭스는 순 전하 수송과 루비듐 수송 사이의 상관 관계를 목표로 하는 두 개의 전극 전압 박수 실험에서 측정할 수 있습니다. 여기서 전류 신호의 적분은 7, 840 nku의 총 수송 전하를 산출했습니다. 총 전하와 루비듐 플럭스 사이의 비율은 0.47이었으며, 이는 나트륨 칼륨 APA의 3 나트륨 대 2 칼륨 수송 화학량론과 일치하는 값입니다.

단일 세포 실험에 대한 이 A a s 기술의 재현성은 전기 중성으로 작동하는 양성자 칼륨에 대해 0.49의 기울기 계수로 총 전하와 루비듐 수송 사이의 선형 상관 관계를 생성하는 반복 실험의 결과에 의해 나타납니다. A: TPA, 루비듐 흡수의 농도 의존성 및 특정 억제제 S CH 2 8 0 8 0 에 대한 민감도를 결정할 수 있습니다. 난모세포의 상이한 배치에서 이러한 측정은 최대로 검출된 루비듐 흡수량의 10% 미만의 unin 주입된 난모세포로의 백그라운드 흡수를 보여주며, 이는 SCH 2 8 0 8 0의 첨가에 둔감합니다.

대조적으로, cyte를 발현하는 proton potassium atpa의 플럭스는 배경 수준으로 감소합니다. 10 micromolar s CH 2 8 0 8 0 을 추가하면 특정 흡수 값을 플로팅하면 루비듐 나트륨에 대한 ATP의 회전 수송 양성자의 겉보기 친화도를 계산할 수 있으며, 이는 수송 중 세포 외곽 양이온 결합 포켓에 대한 경쟁과 일치하는 루비듐에 대한 겉보기 친화력의 감소를 초래합니다. 두 개의 전극 전압 클램프에 의한 막 전위 제어 하에서 루비듐 흡수 실험과 a s 결정의 조합은 양성자 칼륨 APA에 의한 루비듐 수송의 전압 의존성을 결정하기 위해 적용될 수도 있습니다.

다양한 pH 조건에서 루비듐 플럭스 실험을 사용하여 양성자 칼륨 APA 돌연변이의 기능적 효과를 조사할 수 있습니다. 예를 들어, C 말단 결실이 다른 양성자 칼륨 APA 돌연변이의 루비듐 수송 활성을 분석한 결과, 루비듐 흡수 활성은 삭제된 아미노산의 수에 따라 점차 감소하는 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도, 10 마이크로몰 SC 2 8 0 8 0에 의한 루비듐 흡수 억제 정도는 델타 Y 구조체에 대해 현저하게 감소하는 반면, 델타 YY 및 델타 Q-E-L-Y-Y는 모든 SDS 페이지 분석에서 10 마이크로몰 S CH 2 8 0 8 0에 더 이상 민감하지 않은 반면, 다양한 결실 구조체에 대한 막 분획 내 단백질의 총량은 유사하다는 것을 나타냅니다.

그러나, 원형질막 분획 내 단백질의 상대적인 양은 약물 억제 결과와 함께 C 말단 결실로 감소했습니다. 이러한 데이터는 동반 텍스트에서 논의된 바와 같이 반응 주기 중간체의 정상 상태 분포에 영향을 미치며, 루비듐 플럭스는 활성화 에너지와 같은 열역학적 매개변수를 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 양성자에 의한 루비듐 흡수 칼륨 atpa는 난모세포를 발현하고 있으며 온도에 크게 의존합니다.

aous 플롯은 데이터의 우수한 선형 상관 관계를 생성하여 몰당 96킬로줄의 활성화 에너지를 생성합니다. 리튬 흡수에 대한 첫 번째 결과는 세포의 비특이적 리튬 흡수가 낮은 반면, 양성자 칼륨 atpa에 의한 흡수는 용량 의존적 방식으로 증가하고 SC 2 8 0 8 0에 내성이 있는 것으로 나타났습니다. 이 데이터는 정지 양성자 리튬 사이클링 동안의 효소 상태에 대한 실마리를 제공합니다.

이 절차를 시도하는 동안 균일한 크기의 cyte를 선택하고 현재 각 플럭스 실험에 대한 배양 시간과 온도를 고수하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이에 따라 S 절차를 수행합니다. 가스 정골 요법 또는 고혈압과 같은 인간 질병에 대한 치료를 위한 새로운 약물을 식별하기 위해 약물 검사와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.