Name: 이미징 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 거대한 리포좀 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 배우세요 거대한 단층 리포좀을 준비하여 막 단백질의 기능적 완전성을 유지하는 방법을 알아보세요. 이 전기형성 기법은 신경과학 및 생물물리학 연구에 활용됩니다.

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우리는 electroformation 장치 구축을위한 브라이언 Venema의 에릭 마틴 슨 감사합니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소의 일반적인 의료 과학 국립 연구소에서 보조금 (SEG에 R01GM100718) 및 보건 국립 연구소의 국립 안과 연구소 (SEG에 R01EY017564)에 의해 재정 지원되었다.

1. 유기 용매에서 지질 증착 : 클래식 프로토콜 <ol><li> . -20 ° C 또는 -80 ° C에서 저장소에서 지질을 제거합니다 RT 따뜻한주의 : 지질은 매우 흡습성이 있으며, 많은 산소에 민감합니다. 건조한 아르곤 또는 질소 가스의 지질을 커버하고 모든 단계에서 공기에 노출을 최소화합니다. </li><li> 필요한 경우, MG / ML 1-10에 클로로포름 또는 헥산에 지질을 중단, 제조 업체의 주장 농도는주의 일반적으로 공칭 것을. 주 : 유기 용제를 사용하는 경우 적절한 장갑 및 기타 개인 보호 장비를 착용하십시오. 대부분의 물질은 여전히이 용매 투과하고 그들이 일시적 보호를 제공하기 때문에 용매, 그들에 유출되는 경우 신속하게 PPE를 제거합니다. </li><li> 에탄올로 두 개의 25 X 37.5 mm ITO 코팅 유리 슬라이드의 양쪽을 청소 </li><li> 원하는 몰비를 달성하기 위해 지질을 섞는다. 각 1cm를위한 ITO 면적의 2 입술로 코팅 할 슬라이드아이디, 믹스 ~ 지질의 15-20 μg. . 모두 25 X 37.5 mm 슬라이드가 완전히 코팅 될 것 인 경우에 예를 들어, 우리는 일반적으로 10 ㎎ / ㎖ 지질 혼합물 주 30 μL를 사용한다 : 텍사스 형광 이미징을위한 레드 DPPE, 그리고 아래 참조에 대한주의 0.1 몰 %를 추가 형광 염료. </li><li> 유리 슬라이드의 ITO 코팅면이 저항계 또는 멀티 미터의 표면 저항을 측정하여이 위를 향하고 있는지 확인하십시오. </li><li> . 용매 저항 주사기주의로 지질을 흡입 : 아니오 접착제 또는 PTFE가 아닌 플라스틱, 유기 용매에 문의해야합니다. </li><li> 주사기 바늘은 매우 ITO 표면에 닿지 않도록 함께, 천천히 슬라이드에 걸쳐 앞뒤로 바늘을 이동 지질을 적용합니다. 유리 표면에 &quot;무지개 광택&quot;을 찾고, 균등하게 표면을 커버. </li><li> 흔적 용매 제거 0.5-1 시간 동안 &lt;1 토르 (1 mmHg로) 진공 빠르게 슬라이드를 놓습니다. 불활성 가스로 진공을 해제합니다. </li><li> 와, 실리콘 가스켓을 적용양쪽에 실리콘 진공 그리스의 얇은 층. 슬라이드의 한쪽 끝에서 노출 폭로 슬라이드 5 mm 이상을 둡니다. </li><li> 제 4 즉시 진행합니다. </li></ol> 2. 제어 탈수위한 작은 리포좀 준비 <ol><li> 단계 1.1에서와 같이 1.4 지질 혼합물을 준비합니다. </li><li> 10-15 mm 직경의 문화 튜브에 아르곤의 스트림 또는 질소 가스를 사용하여 지질을 건조. 지질의 소량, ≤ 0.5 밀리그램, 그 결과 영화는 직접 잔류 용매를 제거하기 위해 0.5 시간 동안 진공 상태로 배치 한 후 수화 될 수 있으며, 2.5 단계로 진행합니다. 지질의 큰 금액도 진공 상태에서, 두꺼운 젤 유기 용매를 트랩하는 경향, 그리고 더 나은 동결 건조에 의해 준비가되어 있습니다; 단계 2.3-4를 참조하십시오. </li><li> , 시클로 헥산에 건조 지질 필름을 중단 마개 아르곤과 물개 덮개, 1 시간의 최소 -80 ° C에서 냉각 블록과 동결에 튜브를 놓습니다. </li><li> 진공 시스템의 추위 블록과 지질 샘플을 배치100 mTorr의에 도달 할 수. 진공을 적용, 그것은 용매 고상하게 오프로 약 1 토르에서 &quot;정지&quot;됩니다. 일단 용매가 완전히 (~ 1 시간) 제거 진공이 수준 이하로 떨어질 것이다. 불활성 가스로 진공을 해제하고 즉시 튜브 또는 수화물을 밀봉하십시오. </li><li> 지질은 진공 반면, 가스를 수화 버퍼는 진공을 사용하여 15-17 불어 내면. </li><li> 최종 농도가 1-10 MG / ML에서 탈기 버퍼를 사용하여 지질 수화물. 천천히 수화 지질을 허용합니다. 후 30 분 - 1 시간, 남은 덩어리를 분해하는 소용돌이. 완전한 수화를 허용하도록 추가 0.5-1 시간을 기다립니다. 다음 단계 완전 탈수를 방지하는 등 최대 200 mm까지 소르비톨 또는 자당으로, osmoticant을 사용합니다. </li><li> 압출 100-200 nm의 직경 리포좀을 준비합니다. 자세한 내용은 제조업체의 압출 프로토콜을 참조하십시오. 버퍼가 ~ 25 mM의 이온 강도 또는 특수 electroformation 전압 프로토콜보다가 4 장에서 필요한 것이 있어야합니다. </li></ol> 3.작은 리포좀의 제어 탈수에 의한 지질 증착 <ol><li> 주의 : 우리의 프로토콜은 지질이 많은 시간 동안 포화 소금 용액과 증기 평형에 배치해야합니다. 우리는 강하게 글로브 박스 또는 유사한 인클로저를 사용하여 불활성 가스 분위기에서 프로토콜을 수행하는 것이 좋습니다. </li><li> 주의 : 단백질을 포함하는 샘플을 준비하는 경우, 완전한 탈수를 방지. 수화물은 따뜻한 물 비커에있는 모든 인클로저의 분위기 나 sonicator 기반의 가습기. 적어도 30 %의 상대 습도가 있는지 확인하기 위해 습도계를 사용합니다. 총 탈수를 방지하기 위해 추가 조치로 작은 리포좀 버퍼에 소르비톨이나 자당을 사용합니다. </li><li> 적절한 상대 습도 포화 소금 용액을 준비합니다. 대상 습도 소포 준비의 삼투압에 따라 달라집니다. 낮은 삼투압의 소포 준비가에 적절하게 탈수 할 수있는 동안 생리적 삼투압과 준비를 위해, 30-45 % RH를 사용75~90% RH (표 1 참조)와 평형. </li><li> 내부 선반 단단히 밀봉 용기에 포화 소금 용액 과잉 소금을 넣어. 아주 잘 한 요구르트 작업을위한 상용 식품 용기. 작성 후 선반을 교체하고 있는지 유체가 선반 아래 5~10mm다는 것을 확인한다. </li><li> 제 1과 깨끗한 ITO 코팅 된 슬라이드. 전도성면을 확인, 샘플 이름으로 비전 도성 쪽 레이블을 멀티 미터를 사용합니다. </li><li> 그리스를 살짝 발라 하나 또는 여러 개의 구멍 실리콘 (USP 등급 VI) 가스켓 (들)의 양쪽. </li><li> 벤치에 슬라이드 전도성 측면을 놓고 electroformation 장치에 연결하기 위해 한쪽 끝에 노출 된 슬라이드 5 mm 이상이 있는지 확인하고, 지질을 적용 할 각 슬라이드에 실리콘 가스켓 (들)을 적용합니다. 좋은 물개를 보장하기 위해 가스켓을 반반하게한다. </li><li> ~ 1-2 밀리그램 / ML에 낮은 소금 isosmotic 버퍼에 소포 준비를 희석. 우리는 더 높은 concentr을 찾을 수관리 포인트 가난한 결과를 생성합니다. </li><li> 1-10 μL 방울의 슬라이드에 지질을 적용합니다. 작은 방울은 일반적으로 더 나은 결과를 생성합니다. </li><li> 포화 소금 용액 위의 내부 선반에 슬라이드를 삽입하고 단단히 밀폐한다. O / N으로 3 시간 동안 RT에서 남겨 컨테이너는 ° C 4에 배치 할 수 있지만, 일부 염을 위해 RH 온도, 그리고 추위에 강하게 의존한다는 것을 참고 평형 시간이 증가합니다. </li><li> 그 결과 영화는 거기에 약간의 무지개 광채를 가질 수 있지만, 어떤 경우에는 거의 건조 된 나타납니다. 높은 삼투압 시작 솔루션은 지질 필름이 완전히 건조하는 것이 불가능할 수 있으며,이 부정적인 결과에 영향을 미치지 않을 것이다. </li></ol> 4. 거인 리포좀의 Electroformation <ol><li> 특히 지질 필름, 탈수 리포솜에서 형성하는이 쉽게 빠질 수 있습니다.주의 수화물 각 웰은 가스켓의 ​​가장자리에 27 G 주사기 바늘을 삽입하고 천천히 버퍼를 적용하여. 버퍼 수물을 포함 ≤ 200 MM의 자당, ≤ 1 M 소르비톨 ≤ 5 MM의 HEPES. 이상 10 MM 소금 솔루션은 대체 electroformation 전압 프로토콜이 필요할 수 있습니다. ~ 10 % 잘 충진 각 가스켓. </li><li> 참고 : 지질 수화이며, 지질 필름은 즉시 얇은 층으로 갈라 시작 이후 나머지 단계를 신속하게 진행합니다. electroformation이 즉시 시작하면 수익률 및 크기는 극대화된다. </li><li> 한 번의 부드러운 동작으로, 개스킷의 상단에 두 번째 ITO 슬라이드, 전도성 얼굴을 적용합니다. 가스켓 영역 외부와의 첫 번째 오버행 반대 오버행 5 mm 이상을 가지고 있는지 확인하십시오. 좋은 물개를 보장하기 위해 살짝 누르십시오. </li><li> 에탄올을 사용하여 두 개의 돌출부를 청소하고 가스켓에 직면 측면은 멀티 미터를 가진 전도성이 있는지 확인합니다. </li><li> 원하는 경우 챔버는 더 파라 필름 (parafilm) 또는 가벼운 장력 스프링 클립으로 고정 할 수 있습니다. </li><li> , &quot;EMI gask에게 알루미늄 또는 구리 막대를 확보하여 전압 소스에 electroformation 챔버를 연결두 슬라이드의 전도성 표면에 등 거품 &quot;또는 전도성 접착 테이프. 우리는 EMI 개스킷 폼을 사용합니다. 지그 및 클램프 계획 그림 5에 표시됩니다. </li><li> 전기적 접점 사이의 짧고 연락처 멀티 미터를 사용하여 ITO 표면에 올바르게 연결하는이 없는지 확인합니다. </li><li> ° C 최소 10 ° C 42 ° C의 체인 용융 온도보다 52 열, DPPC에 대한 예를 들어, 챔버 (10) ° C 지질의 가장 높은 용융 온도 이상으로 선물을 가열 </li><li> 저염 버퍼, 60-90 분 동안 10 Hz의 사인파, 두 ITO 코팅 된 표면 사이의 각 밀리미터 격차 ~ 0.7 V RMS를 적용합니다. 높은 소금 버퍼, 다른 전압 프로토콜 (참고 문헌 참조)를 사용해야합니다. </li></ol> 5. 이미징 및 문제 해결 <ol><li> 이미지 로다 민 또는 텍사스 레드 염료에 대한 필터 큐브 장착 거꾸로 현미경을 사용하여 리포좀을. 리포좀은 구형해야한다주로 눈으로 unilamellar, 이러한 리포좀에 걸려 &quot;문자열&quot;과 같은 결함. </li><li> 리포좀이 너무 작 으면 적은 지질을 사용합니다. </li><li> 많은 결함이나 몇 리포좀가있는 경우,이 젤 상 지질 때문일 수 있습니다. electroformation 온도를 높이는 것이 좋습니다. </li><li> 거의 또는 전혀 거대한 리포좀 탈수 작은 리포좀의 모든 형성하는 경우, 리포좀 버퍼의 삼투 강도를 줄이거 나 electroformation 버퍼의 삼투 강도를 높일 수 있습니다. 농축 중간 완충 용액에 버퍼의 유입은 입금 지질 필름의 박리가 발생할 수 있습니다. </li><li> 소포 수율, 품질, 또는 크기별로, 그리고 당신이 electroformation 또는 리포좀 버퍼에있는 염분의 pH 버퍼를 포함하는 경우, 다른 electroformation 전압 프로토콜을 고려하십시오. 예를 들어, POTT, 외. 11, 90 분 개최, 50-1,300 Vpp로 / m 30 분에서 전압을 높여, 500 Hz의 정현파를 사용하여 3 단계 프로토콜을 추천합니다N 30-60 분 동안 50 Hz로 주파수를 감소. 백금 티타늄 전극이 경우에 필요할 수 있습니다, 그러나 이것은 실질적으로 프로토콜을 변경하지 않습니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

거대한 리포좀의 Electroformation은 다양한 지질, 준비하고, 버퍼와 호환 유연한 기술로 개발했다. 지질 증착 공정의주의 깊은 관리가 성공에 가장 중요합니다. 우리는 작은 리포좀 제제 간단한 프로세스에서 지질 조절 증착하기 위해 간단한 도구를 발표했다. 상대 습도는 초기 리포솜의 적절한 탈수 중요하며, 최적의 값은 리포좀 현탁액 용질의 초기 농도가 달라집니다. 낮은 상대 습도는 적절한 수준에 더 집중 샘플을 탈수하는 데 필요합니다. electroformation에 사용되는 정확한 수화 프로토콜과 전기장 토론 1,4,7,10,11,22의 점 남아있다. 간단한 프로토콜은 높은 소금 농도, 충전 지질, 또는 용융 매우 높은 농도의 존재 리포좀 electroformation을 시도하기 전에 먼저 마스터해야합니다온도 지질 ING. 초기 부종, 성장, 그리고 분리 : 그 기술을 마스터하고 나면, 더 진보 된 프로토콜은 일반적으로 세 부분으로 electrof...

거대한 리포좀은 (종종 거대한 unilamellar 소포, 또는 GUVs 불리는) 주로 이중층 변형, 측면 상 공존 ( &quot;뗏목&quot;), 막 융합 등 1-4 연구 등의 지질 이중층의 물리학 및 물리 화학을 연구하는 데 사용되었습니다. 쉽게 주변 수성 버퍼보다​​ 다른 할 수있는 수성 내부를 둘러싼 막의 구형 쉘 : 그들은 크게 세포와 같은 구조를 가지고. 그들은 정의에 의해, 직경 ≈ 1-100 μm의, 그래서 그들은 광학 현미경의 다양한 접근 방식을 사용하여 이미지화 할 수 있습니다. 그들은 일반적으로 소프트하면서, 자신의 속성을 쉽게 처리를 위해 조작 할 수 있도록, 삼투 기울기 또는 기계적으로 적용 장력을 사용하여 팽팽하게 만들 수 있습니다. 특히, 리포좀의 &quot;강성&quot;전기 생리학에 대해 &quot;리포좀 연결&quot;또는 절제 패치를 형성하는 것이 간단하게 제어. 과거에, 이온 채널의 재구성은 크게 평면 지질 B에서 수행되었다ilayers. 이제, 거대한 리포솜에서 패치를 형성하고 기존의 전기 생리학 개발 도구의 상당한 떨림을 (형광 현미경, 마이크로 피펫 포부, 신속한 재관류 및 온도 제어 등)를 사용하는 기능을 재구성 연구 5,6를위한 거대한 리포좀은 점점 더 매력적 수 있습니다. 거대한 리포좀 많은 전략에 의해 만들어진되었습니다. 건조 지질 영화는 4,7,8을 재수 때 사실 거대한 리포좀은 붓기 프로세스에 의해 자발적으로 형성한다. 더 빨리 더 준비하는 욕망은,보다 균일 한 리포솜은 electroformation 1,9 그들 가운데 최고 다른 접근, 연구자했다. Electroformation는 건조 지질 필름의 수분에 의존하지만, 지질 막에 걸쳐 진동하는 전기장의 응용 프로그램을 통해 과정을 속도. 필드 또는 물에 의해 분리 된 두 개의 전극, 백금 와이어 하나 또는 인듐 - 주석 산화물 (ITO) 코팅 유리 슬라이드를 적용버퍼링 된에 지질이 침착되어 있습니다. 리포좀의 팽창을 가속화함으로써, 더 큰 리포솜의 높은 수율을 달성 할 수있다. 따라서, electroformation 거대한 리포솜에게 4 생산하는 기본 방법이되었다. electroformation의 메커니즘은 완전히 이해되지 않고, 프로토콜의 대부분은 (예 : 10,11) 경험적으로 개발된다. 그럼에도 불구하고, 우리는 이론과 실증적 결과를 고려하여 무엇을 기대해야하는지에 대해 조금 배울 수 있습니다. 그것은 널리 electroformation은 입금 지질막 10,11 쌓아 개별 지질 이중층 사이의 버퍼의 전기 삼투 흐름을 운전에 의해 발생하는 것으로 생각됩니다. 지질 이중층의 열 변동에 정전기 커플 링은 아마 12 참여하고있다. 이 가설은 질적 10,12 사용할 수 있습니다 전기장의 주파수와 강도에 대한 상한을 예측하고있다. 특히, 그 높은 전도성 솔루션을 예측 ( <eM&gt; 즉, 생리 식염수)는 리포좀 electroformation에게 12을 시작할 수 있습니다 전기 수력 힘을 줄일 수 있습니다. 전기 삼투 유량은 일반적으로 증가 소금 농도가 감소 자주 일부 전기장 발진 주파수 (예를 들어 다른 기하학, 녹색 등. 13이기는하지만)에 만족하고 있습니다. 따라서, 높은 전계 강도와 높은 주파수 범위 10에서, 높은 전도성 솔루션을 합리적입니다. 그러나 막 단백질은 그 얇은 지질막을 떠날 떨어져​​ 증발하는 유기 용매 즉, electroswelling 절차를 전극에 지질 증착의 일반적인 방법으로 호환되지 않을 가능성이 있습니다. 이러한 어려움의 주위에 두 가지 주요 경로가 있습니다 : 거대한 리포좀 형성 한 후 단백질을 통합하거나, 지질이 입금되는 방법을 적용 할 수 있습니다. 우리의 접근 방식은 지질 및 reconsti을 입금하는 다른 5,11에 구축작거나 큰 &quot;proteoliposomes&quot;의 현탁액에서 함께 막 단백질을 tuted. 우리는 (콜린스와 고든 검토)에서 다른 단백질과 지질을 정제에서 proteoliposomes을 생산 길고 더 도전 과정을 설명합니다. 여기에서 우리는 어떤 단백질의 부재에서 프로토콜을 설명하지만 단백질이 포함되는 경우는 동일합니다, 우리는 이온 채널 TRPV1을 포함 proteoliposomes이 GUVs로 변환 및 패치 - 클램프 전기 생리학에 사용할 수있는 것을 보여주는 결과가 있습니다. 모든 electroformation 방식에서 지질 증착 과정에서 지질 샘플을 시각적으로 검사 성공에 중요합니다. 우리의 접근 방식은 이온 채널의 재구성에 대한 전문적인 응용 프로그램 이외의 관련이있을 수 있습니다. 우리가 처음이 프로토콜을 개발하고 지금 그것은 또한 지방질이 electroformation을위한 전극에 부착되는 방법은 결과 GUVs의 조성 이질성에 미치는 영향을 보여왔다 이후 시간에. Bayk알 Caglar 등. 14주의 탈수 리포솜에서 형성 GUVs 다양한 인지질과 콜레스테롤의 혼합물에서 형성 GUVs의 혼 화성 전이 온도에서 2.5 배 작은 변화를했다고했다. 그들의 작품은 지질 혼합물의 지질, 특히 콜레스테롤, 5 월 침전물이 퇴적 지질 필름의 구성에 큰 공간적 변화의 결과로, 유기 용제에서 증착 할 때 나타냅니다. 이 지질 막 단계의 행동 연구에 특히 중요합니다,뿐만 아니라 이온 채널의 기능에 대한 정량적 실험에 중요 할 수 있습니다. 바이칼-Caglar 하였다.의 프로토콜은 비슷하지만 우리 자신과 동일하지 않고, 독자뿐만 아니라 그것을 연구하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 (개요 그림 1 참조) 사용할 수있는 많은 중 하나입니다. 원리 electroformation 성공에 지질 혼합물, 수화, 온도, 다른 용질 (특히 이온), 그리고에 따라 달라집니다형성에 사용되는 과정의 전압 및 주파수. electroformation이 잘 이해됨에 따라, 우리는 우리의 프로토콜을 구체화 할 것으로 예상된다. 마지막으로, 거대한 리포좀을 전주에있는 가파른 학습 곡선이 종종있다. 우리는 리포좀 현탁액 (섹션 2-5)에서 지질을 입금 학습하기 전에 마스터에게 기존의 프로토콜 (제 1, 4, 그리고 필요한 경우 5 장) 제안합니다.

<table><tbody><tr><td>디지털 멀티미터</td><td>애질런트 기술, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td><td>U1232A 또는 이와 유사한</td><td>모든 멀티미터는 가능하지만 테스트 중인 저항에 훨씬 더 많은 전류를 적용하는 구식 아날로그 옴미터는 피하십시오.</td></tr><tr><td></td><td>Fluke</td><td>117 또는 177</td><td>모든 멀티미터가 가능하지만 테스트 중인 저항에 훨씬 더 많은 전류를 적용하는 구식 아날로그 옴미터는 피하십시오.</td></tr><tr><td>Function Generator</td><td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td><td>33210A 또는 유사</td><td>대부분의 함수 발생기는 간단한 프로토콜에서 작동합니다. 이 프로그래밍 가능한 모델은 고급 전기형성 프로토콜에 유용합니다. 발전기가 10V 피크 투 피크를 50 &#937로 구동할 수 있는지 확인하십시오. </td></tr><tr><td>로드 ITO 코팅 유리 슬라이드</td><td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td><td>CB-90IN-S107 또는 이와 유사한</td><td>두 개의 슬라이드를 만들기 위해 반으로 나누십시오, 25mm x 37mm</td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a> </td><td>CNi3233 또는 이와 유사한</td><td></td></tr><tr><td>습도계</td><td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td><td>445815</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 고무 시트</td><td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td><td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td> 고순도 EMI 가스켓<td>에 USP 등급 VI 실리콘 사용</td></tr><tr><td></td><td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td><td>4202-PA-51H-01800 또는 유사한</td><td>제품 Mouser에 의해 배포 <a href="http:// www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td></tr><tr><td>TxR-DHPE</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td><td>T1395MP</td><td>다른 형광 표지된 지질을 사용할 수 있지만 TxR-DHPE는 가장 밝고 광안정성이 가장 높은 지질 중 하나입니다.</td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td><td>850457P 또는 850457C</td><td>지질은 분말(P) 또는 클로로포름(C)으로 주문할 수 있습니다.</td></tr> <tr><td>POPS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034P/C</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr></tbody></table>

이미징 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 거대한 리포좀 준비

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

전기 생리학 녹음 화학적 지질 막에 이온 채널의 재구성이 중요한 단백질의 기능을 식별하고 탐구 할 수있는 강력한 기술이다. 그러나, 평면 이중층과 같은 고전적인 준비는, 재구성 채널과의 멤브레인 환경에서 수행 할 수있는 조작과 실험을 제한 할 수 있습니다. 거대한 리포좀의 더 많은 세포와 같은 구조 지질 환경의 제어를 희생하지 않고도 기존 패치 - 클램프 실험을 허용합니다. Electroformation는 전극 표면에 증착 얇은 주문한 지질 막에 전압을 교류의 응용 프로그램에 의존 직경 거대한 리포솜에게&gt; 10 ㎛를 생성하는 효율적인 의미입니다. 고전 프로토콜은 유기 용매에서 입금 할 지질 요구 때문에 그러나, 그것은 이온 채널과 같은 덜 강력한 막 단백질과 호환되지 않으며 수정해야합니다. 최근 홍보otocols 우리가 우리의 실험실에서 단백질을 함유 리포솜에 적응 부분적으로 탈수 작은 리포좀에서 거대한 리포좀을 전주 위해 개발되었습니다. 우리는 여기서 배경, 장비, 기술 및 작은 리포좀 분산에서 거대한 리포좀의 electroformation의 함정을 제시한다. 우리는 다음에 더 도전 프로토콜을 시도하기 전에 먼저 마스터해야하는 고전적인 프로토콜로 시작합니다. 우리는 포화 소금 용액과 증기 평형을 사용하여 작은 리포좀의 제어 부분 탈수의 과정을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 electroformation 자체의 과정을 보여줍니다. 우리는 고품질 리포좀을 생산하고 최상의 결과를 보장하기 위해 각 단계에서 준비 육안 검사를 설명하기 위해 사내에서 할 수있는 간단한, 저렴한 장비를 설명합니다.

우리의 예제에서, 우리는 약 55 몰 % POPC (1 파르 미트-2-oleoyl-SN-팔미 - 포스 포 콜린), 15 몰 % POPS (1 파르 미트-2-oleoyl-SN-팔미-phosphoserine의 혼합물에서 리포좀을 준비 , 30 몰 % 콜레스테롤, 0.1 몰 % 텍사스 1,2 - dipalmitoyl-SN-phosphoethanolamine (TXR-DPPE) 레드 라벨.이 구성은 18 신경절 (dorsal root ganglion) 지질의 약 대표로 선택되었다. 우리는 15 몰 %가 청구주의 지질 (여기 POPS)는 (예를 들어, 발데 등. 4) electroformation에서 사용할 수있는 것의 한계 근처에 있습니다. 가수 분해 및 과산화에 의한 지질 분해는 많은 지질 혼합물 많은 중요한 실험 (토론 참조) 특히 중요한 문제입니다. 혼자 명확...

패치 클램프 전기 생리학과 결합 될 때 정의 된 구성의 거대한 리포좀으로 기능 막 단백질을 재구성하는 강력한 방법입니다. 그러나 기존의 거대한 리포좀 생산 단백질의 안정성과 호환되지 않을 수 있습니다. 우리는 순수 지질이나 이온 채널을 포함하는 작은 리포좀의 거대한 리포좀 생산을위한 프로토콜을 설명합니다.

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 소포체 막에 통합된 막 단백질의 기능적 무결성과 호환되는 방식으로 거대 단층 소포(giant uni lamellar vesicles)를 제조하는 것입니다. 이는 우선 ITO 코팅 유리 슬라이드와 같은 전도성 표면에 지질 또는 작은 리포좀을 증착함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 용매를 제어된 방식으로 증발시켜 전도성 표면에 균일한 지질 막을 형성하는 것입니다.다음으로, 적절한 완충액으로 지질 막을 조심스럽게 재수화하고 전기 형성 챔버를 준비합니다. 마지막 단계는 지질 막에 교번 전압을 가하여 거대 단층 밀러 소포(giant unal Miller vesicles)를 생성하는 것입니다. 최종적으로, 소포를 이미징하여 크기와 품질을 결정하고 고전적인 기술을 사용하여 형성된 소포와 비교합니다.지질 침착은 숙련되기 어려울 뿐만 아니라 많은 변수에 영향을 받으며 육안 검사로 확인하는 것이 가장 정확하므로, 이 프로토콜의 시각적 시연이 유용합니다. 이 절차를 시작하기 전에, -20 °C 또는 -80 °C의 보관 장소에서 지질을 꺼내 실온으로 가온하십시오. 가능하다면 글로브 박스와 같은 불활성 가스 분위기에서 실험을 수행하십시오.다음으로, 지질을 건조 아르곤 또는 질소 가스로 덮고 모든 단계에서 공기 노출을 최소화합니다. 지질이 유기 용매 형태로 제공되지 않은 경우, 0.3 mg의 지질을 10 mg/mL 농도의 클로로포름 또는 사이클로헥산에 현탁합니다. 제조업체가 명시한 농도는 일반적으로 명목상 수치임을 유의하십시오.에탄올을 사용하여 25 mm x 37.5 mm 크기의 ITO 코팅 유리 슬라이드 2매의 양면을 세척합니다. 그 다음, 형광 이미징을 위해 지질에 0.1%의 Texas red DPPE를 추가합니다. 멀티미터로 표면 저항을 측정하여 유리 슬라이드의 ITO 코팅 면이 위를 향하고 있는지 확인하며, 이때 저항값은 수백 옴(ohm)으로 나타납니다.용매 내성 시린지에 지질을 흡입하되, 시린지 바늘이 ITO 표면에 완전히 닿지 않도록 합니다. 바늘을 슬라이드 위에서 앞뒤로 움직여 지질을 천천히 도포합니다. 유리 표면에 무지갯빛 광택이 나타나는지 확인하며 표면을 고르게 덮습니다.이후 슬라이드를 빠르게 진공 데시케이터에 넣고, 챔버를 1 tor 미만의 진공 상태로 0.5~1시간 동안 펌핑하여 잔류 용매를 완전히 제거합니다. 그 다음 불활성 가스로 진공을 해제합니다.실리콘 가스켓의 양면에 실리콘

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 지원되는 지질 이중층(SLB)에서 자연살해(NK) 세포의 면역학적 시냅스 형성을 시각화하는 기술을 보여줍니다. SLB는 먼저 형광단 표지된 NK 세포 활성화 수용체 리간드로 표지된 다음 NK 세포로 배양합니다. 그 후, 세포는 중합된 액틴 및 퍼포린 양성 용해 과립을 위해 염색됩니다. 이 접근 방식을 사용하면 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경을 사용하여 시냅스 형성을 시각화할 수 있습니다.

지원되는 지질 이중층에서 NK 세포 면역학적 시냅스 형성의 초고해상도 이미징

생체 내 이미징을 위한 형광단의 사용은 옵소니화, 빠른 제거, 낮은 검출 감도 및 숙주에 대한 세포 독성 효과로 인해 크게 제한될 수 있습니다. 필름 수화 및 압출에 의한 리포솜 내 형광단의 캡슐화는 형광 소멸 및 보호로 이어져 높은 검출 감도로 in vivo 이미징을 가능하게 합니다.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질 생체 광학 이미징

전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

여기에서는 면역학적 시냅스를 형성하는 유리 지지 지질 이중층 기술과 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경의 초고해상도 이미징 기술의 조합을 설명합니다. 이 프로토콜의 목표는 이러한 두 가지 기술을 성공적으로 수행하는 데 필요한 지침을 사용자에게 제공하는 것입니다.

유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

이 기사에서는 전자 상자성 공명 연구를 위한 5층 리간드 게이트 채널의 위치 지정 스핀 라벨링 및 재구성 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 모든 멤브레인 단백질에 적용할 수 있습니다. 여기에 설명된 재구성 방법은 정의된 지질 시스템에서 거시적 및 단일 채널 전류의 패치 클램프 측정에도 사용할 수 있습니다.

사이트 감독 스핀 라벨 및 펜타 머 리간드 - 게이 티드 이온 채널의 EPR 분광 연구

여기, 우리는 단일 분자 감도와 ~ 15 밀리 초 시간 해상도와 편광 TIRFM를 사용하여 리포좀과 미세 유체 채널에 지원 이중층 사이에 하나의 SNARE 매개 융합 이벤트를 감지하는 프로토콜을 제시한다. 지질 용해성화물 분리를 동시에 검출 할 수있다. 리포좀의 크기, 지질 확산과 융합 기공 특성을 측정한다.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

포함 하는 단일 체인 amphiphiles 리, 특히 지방산, 단일 체인 amphiphiles의 독특한 화학적 특성으로 인해 그 포함 diacylphospholipids에 비해 뚜렷한 속성을 전시 한다. 여기 우리는 준비, 정화, 그리고 이러한 amphiphiles의 전체 또는 일부 구성 리의 사용에 대 한 기술을 설명 합니다.

준비, 정화, 및 지방산 포함 된 리의 사용

우리는 지역화 된 칼슘 이온 기울기를 사용 하 여 소포의 비접촉 식 micromanipulation 위한 기술 제시. 주변에 거 대 한 지질 기 칼슘 이온 솔루션의 microinjection는 막 관 돌출의 생산의 결과로 지질 막 개장 하기 위하여 이용 된다.

막 거 대 한 소포 지역화 된 칼슘 이온 기울기에 대 한 응답에서의 개장

여기, 선물이 연락처 거품 bilayer 메서드를 사용 하 여 지질 bilayers의 대형을 위한 프로토콜. 물 거품 물-오일 인터페이스에는 단층은 형성 하는 그것에 의하여, 유기 용 매에 불어 진다. 두 펫은 bilayer를 형성 하기 위하여 거품을 도킹 하려면 조작 됩니다.

패치-Clampers에 대 한 연락처 거품 Bilayers 지질 Bilayer 실험

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

이 프로토콜은 수동 endolysomal patch-clamp system을 사용하여 세포 내 소포의 이온 채널 활성을 직접 측정하는 방법을 자세히 설명합니다. 엔도리소좀(endolysosome)을 확대하고 이러한 소포를 수동으로 분리하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식을 통해 연구원은 절차를 정확하게 복제하고 적용할 수 있습니다.

단일 Endolysosomal 소포 분석을 위한 Patch-Clamp 기법

배우세요 거대한 단층 리포좀을 준비하여 막 단백질의 기능적 완전성을 유지하는 방법을 알아보세요. 이 전기형성 기법은 신경과학 및 생물물리학 연구에 활용됩니다.

이미징 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 거대한 리포좀 준비

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