이미징 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 거대한 리포좀 준비

이 절차의 전반적인 목표는 소포막에 통합된 막 단백질의 기능적 무결성과 호환되는 방식으로 거대한 uni lamellar 소포를 준비하는 것입니다. 이는 먼저 지질 또는 작은 리포좀을 ITO 코팅된 유리 슬라이드와 같은 전도성 표면에 증착하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 전도성 표면에 균일한 지질 필름을 얻기 위해 제어된 방식으로 용매를 증발시키는 것입니다.

다음으로, 적절한 완충액에 지질막을 조심스럽게 재수화하고 전기 형성 챔버를 준비합니다. 마지막 단계는 지질 필름에 진동 전압을 가하여 거대한 unal Miller 소포를 생성하는 것입니다. 궁극적으로 소포는 크기와 품질을 결정하고 고전적인 기술을 사용하여 형성된 소포와 비교하기 위해 이미지화됩니다.

이 프로토콜의 시각적 시연은 지질 증착이 마스터하기 어려울 수 있고 많은 변수에 의존할 수 있으며 육안 검사를 통한 최상의 분석이기 때문에 유용합니다. 이 절차를 시작하기 전에 섭씨 영하 20도 또는 영하 80도의 저장소에서 지질을 제거하고 실온으로 가열하십시오. 가능하면 글로브 박스와 같은 불활성 가스 분위기에서 실험을 수행하십시오.

다음으로, 건조 아르곤 또는 질소 가스로 지질을 덮고 모든 단계에서 공기 노출을 최소화합니다. 지질이 유기 용매로 공급되지 않는 경우 0.3mg의 지질을 클로로포름 또는 시클로 헤인에 10ml당 10mg으로 현탁합니다. 제조업체가 언급한 농도는 일반적으로 명목상에 불과합니다.

에탄올을 사용하여 2 25mm x 37.5mm ITO 코팅 유리 슬라이드의 양면을 청소합니다. 그런 다음 형광 이미징을 위해 지질에 0.1%의 텍사스 레드 DPPE를 추가합니다. 멀티미터로 표면 저항을 측정하여 유리 슬라이드의 ITO 코팅된 면이 위를 향하고 있는지 확인하며, 이는 수백 옴의 저항으로 표시됩니다.

주사기 바늘이 ITO 표면에 완전히 닿지 않도록 하여 지질을 용매 저항성 주사기로 흡입합니다. 슬라이드를 가로질러 바늘을 앞뒤로 움직여 지질을 천천히 바릅니다. 표면을 고르게 덮고 유리 표면에 무지개 광택이 있는지 확인합니다.

이 위치에 따라 슬라이드를 진공 상태로 빠르게 만들고 건조시키고 챔버를 0.5-1시간 동안 1토르 진공 미만으로 펌핑합니다. 미량 용매를 제거합니다. 불활성 가스로 진공을 해제하십시오.

실리콘 개스킷의 양쪽에 실리콘 그리스를 얇게 바르고 개스킷을 슬라이드에 놓습니다. 슬라이드의 한쪽 끝에 최소 5mm의 덮개가 없는 슬라이드를 노출시켜 두십시오. 다음으로, 개스킷 가장자리에 27 게이지 주사기 바늘을 놓아 각 웰에 조심스럽게 수분을 공급하고 완충액을 천천히 바르고 각 개스킷 웰을 3 밀리몰 힙으로 약 10% 채웁니다.

지질에 수분이 공급되면 나머지 단계를 빠르게 진행하십시오. 지질 필름이 박리되기 시작하므로 즉시 멀티미터로 슬라이드의 전도성 면을 확인하십시오. 그런 다음 두 번째 ITO 슬라이드 전도성을 개스킷 상단에 적용합니다.

개스킷 영역 외부와 첫 번째 돌출부 반대편에 최소 5mm의 돌출부가 있는지 확인하고 부드럽게 눌러 밀봉이 잘 되도록 합니다. 에탄올을 사용하여 두 개의 돌출부를 청소합니다. 이제 ITO 슬라이드 샌드위치를 구리 막대 또는 개스킷 폼과 같은 전기 접점에 고정합니다.

이 그래픽은 챔버와 접촉 어셈블리의 분해도를 참조로 보여줍니다. 자세한 계획은 멀티미터를 사용하는 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있습니다. 접점 사이에 전기 단락이 없는지, 접점이 ITO 표면에 제대로 연결되었는지 확인합니다.

다음으로, 전기 형성 챔버를 오븐에 놓고 챔버를 존재하는 지질의 최고 용융 온도보다 섭씨 10도 높게 가열합니다. 두 ITO 코팅 표면 사이의 간격을 측정하여 사인파의 진폭을 결정합니다. 사인파의 진폭은 약 0.7볼트 RMS여야 합니다.ITO 표면 사이의 각 밀리미터 간격에 대해 60-90분 동안 10헤르츠 사인파를 적용합니다.

발전기를 전기 형성 챔버에 연결하고 멀티미터로 전압을 확인합니다. 60분에서 90분 동안 전기가 형성된 후, 거대한 우알 소포(unal vesicles)가 형성되었어야 한다. 텍사스 레드 염료용 필터 큐브가 장착된 도립 현미경을 사용하여 리포좀을 이미지화합니다.

리포솜은 구형이어야 하며, 주로 눈으로 엘라여야 하며, 리포솜에 매달려 있는 끈과 같은 결함이 없어야 합니다. 이전 단계에서는 순수 지질에서 거대 리포좀을 제조하는 고전적인 방법을 다루었습니다. 작은 리포좀을 사용하는 보다 까다로운 제제가 표시됩니다.

다음으로 먼저 섭씨 20도에서 상대 습도 44%의 포화 탄산칼륨 용액을 준비합니다. 플라스틱 요구르트와 그래놀라 용기를 사용하여 위쪽 컵에 구멍이 뚫린 중첩 위쪽 컵이 있습니다. 포화 소금 용액과 여분의 소금을 내부 선반이 있는 단단히 밀봉할 수 있는 용기에 넣습니다.

충전 후 선반을 교체하고 유체가 선반 아래 5-10mm에 있는지 확인하십시오. 용기 측면의 노치에 습도 센서를 놓습니다. ITO 코팅 유리 슬라이드의 양면을 에탄올로 청소합니다.

멀티미터를 사용하여 어느 쪽이 전도성인지 확인하고 비전도성 쪽에 샘플 이름을 표시합니다. 다음으로, 하나 또는 여러 홀드 실리콘 개스킷의 양면에 가볍게 그리스를 바릅니다. 슬라이드의 전도성을 벤치에 놓고 지질이 적용될 각 슬라이드에 실리콘 개스킷을 적용합니다.

전기 형성 장치에 연결하기 위해 한쪽 끝에 최소 5mm의 노출된 슬라이드가 있는지 확인합니다. 양호한 밀봉을 보장하기 위해 개스킷을 매끄럽게 하고 저염 iso modic 완충액의 소포 제제를 밀리리터당 약 1-2밀리그램으로 희석합니다. 지질을 1-10 마이크로 리터 방울로 슬라이드에 적용하십시오.

포화 소금 용액 위의 내부 선반에 슬라이드를 놓고 용기를 단단히 밀봉하십시오. 실온에서 3시간에서 하룻밤 동안 그대로 두십시오. 슬라이드는 이제 이전에 클래식 프로토콜에서 보여준 것처럼 거대 리포좀의 전기 형성에 사용할 수 있습니다.

개별 퇴적물의 무지개 모양에 주목하십시오. 이 이미지는 클로로포름에서 퇴적된 지질로 형성된 전기적 리포솜을 보여주며, 화살표는 거대한 리포솜을 가리킵니다. 이 이미지에는 흐릿한 영역이 거의 없으므로 준비가 양호하다는 것을 나타냅니다.

다음 이미지에는 퍼지 영역이 많으므로 일반적으로 준비가 제대로 되지 않았음을 나타냅니다. 화살표 2는 잘 구별되지 않는 리포좀이 있는 영역을 나타내며 화살표 3으로 표시된 영역에는 리포좀이 초점을 맞출 수 없습니다. 여기에 표시된 것은 작은 리포솜의 탈수에 의해 침전된 지질로부터 성공적으로 전기 형성된 리포좀의 10배 확대입니다.

화살표는 40배 배율에서 약 5-20마이크로미터 크기의 3개의 우수한 품질의 리포좀을 나타냅니다. 리포솜의 가장자리에서 투명한 고리를 볼 수 있으며, 이는 uni 또는 거의 lumal 리포솜을 나타냅니다. 형성된 거대 리포좀에서 절제된 지질막 패치에 기록된 캡사이신 활성화 TR PV 단일 이온 전류가 여기에 설명되어 있습니다.

누출 전류는 캡사이신이 추가되기 전에 500메가 밀봉 저항을 나타냈습니다. 포화 캡사이신은 큰 T, RRP, V, 하나의 전류를 활성화했습니다. 현재 캡사이신이 패치에서 씻겨 나감에 따라 기준선 근처로 복귀하는 동안 이 절차를 시도하는 동안.

많은 요인이 지질이 탈수되고 유리 기판에 균일한 필름을 형성하는 방식에 영향을 미치기 때문에 유연성을 유지하는 것이 중요합니다. 당사의 온라인 문제 해결 섹션을 참조하고 온도, 습도, 지질 농도 및 액적 크기를 변경하여 최상의 결과를 얻으십시오.