에 타고난 및 시간주기 규제 Photobehavior을 공부하는 빛 환경의 분석

다음 실험의 전반적인 목적은 명암 선호도 테스트를 통해 초파리 유충의 선천적 및 서카디안 광 반응 행동을 테스트하는 것입니다. 이를 위해 먼저 정의된 명암 조건 하에서 실험 유충을 사육하여 유충 내에 초기 서카디안 리듬을 형성합니다. 그다음, 유충을 지속적인 암흑 상태로 전환하여 유충의 서카디안 리듬이 자유 실행(free run)되도록 합니다.

유충이 L3 섭식 단계에 도달하면, 서로 다른 일주기 시간대별 빛 선호도를 테스트하기 위해 그룹별로 분류합니다. 선호 지수를 계산하고 시간대 및 실험군 간의 비교를 통해, 타고난 빛 선호도와 일주기적 빛 선호도를 보여주는 결과가 도출됩니다. 이 방법은 광감지와 광행동 처리의 선천적 및 일주기적 조절에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 후각, 접촉, 화학 및 열성 주성(taxis)과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

마찬가지로, 학습 및 기억력 테스트를 위해 이를 수정할 수 있습니다. 실험 절차 시연은 제 연구실의 대학원생인 Alina와 BMA가 맡아 진행하겠습니다. 알을 수집하려면, 교배한 성체 파리가 신선한 배지 위에서 12시간 동안 산란하도록 한 뒤 새로운 바이알로 옮기십시오. 12시간 명기 및 12시간 암기 주기에 맞추어 12시간마다 성체를 계속 옮겨 주십시오.

12시간 간격으로 수집한 알을 인큐베이터에 보관하십시오. 실험을 위해 동물을 L3 초기 유충 단계까지 배양하십시오. 이 단계의 유충은 산란 후 84시간에서 108시간 사이에 먹이 공급이 가능합니다.

LAE의 정확한 단계 설정은 실험의 성공에 매우 중요합니다. L3 후기부터 LAE는 시각적 행동의 일주기 성분을 테스트하기 위해 광반응 행동을 변화시켰습니다. 테스트 48시간 전, 유충의 주관적 새벽 직전에 수집한 유충을 판지 상자에 넣으십시오.

그 후 상자를 48시간 동안 암실 인큐베이터로 옮깁니다. 실험이 완료될 때까지 이 유충들은 지정된 공간에서 방해받지 않은 상태로 유지되어야 합니다. 20cm 정사각형을 4등분한 가이드를 사용하여 9cm 페트리 접시의 뚜껑을 준비하십시오.

10cm 크기의 정사각형 알루미늄 박판을 서로 마주 보는 사분면에 붙이고 검은색 테이프로 덮습니다. 이때 뚜껑의 가장자리까지 완전히 덮이도록 합니다. 다음으로, 테이블 위 광원 아래에 4개의 사분면으로 나뉜 20cm 크기의 정사각형 판을 붙입니다.

일관된 변위 기준선으로 활용할 수 있도록 시트에 테스트 접시의 둘레를 표시합니다. 철제 지지대를 사용하여 페트리 접시 상단에 LED 램프를 설치합니다. 전체 테스트 플레이트가 균일하게 조명되도록 높이를 조절합니다.

램프 높이를 추가로 조정하거나 가변 전원 공급 장치를 사용하여 테스트 지점의 빛 강도를 350에서 760 luxe 사이로 조정합니다. 실험실은 적색광 조명이 필요하며, 동물을 사육한 곳과 동일한 온도여야 합니다. 바이알은 이틀 동안 완전한 암흑 상태에서 사육되었습니다.

스패튤러를 사용하여 먹이의 상단 5mm 층에서 라바를 수집하십시오. 수집한 먹이를 페트리 접시 뚜껑의 바깥쪽에 넓게 펴 바릅니다. 먹이에 물을 약간 추가하고 스패튤러로 부드럽게 섞어줍니다.

붓을 사용하여 새 접시에 수돗물을 한 방울 떨어뜨립니다. 유충을 세척하기 위해 해당 물방울로 옮깁니다. 그런 다음, 젖은 붓을 사용하여 유충을 수집합니다.

초기 섭식 단계의 L3 유충만을 선택하고, 후기 방랑 단계의 L3 유충은 제외하십시오. 선택한 유충을 테스트 플레이트 중앙으로 옮깁니다. 섭식 단계의 L3 유충은 전방의 sphericals가 열려 있으며 외부로 돌출되어 있습니다.

손가락 모양의 형태입니다. 후방의 구형 구조에는 각각 3개의 개구부와 4개 그룹의 크고 분지된 털이 있습니다. 타액선은 두 번째 복부 마디까지 뻗어 있습니다.

30마리의 유충을 테스트 플레이트 중앙에 배치한 후, 준비된 덮개로 덮습니다. LED 램프를 켭니다. 타이머를 시작하고 유충이 플레이트 위에서 5분 동안 자유롭게 이동하도록 둡니다.

그런 다음 빠르게 뚜껑을 제거하고 어두운 구역과 밝은 구역에 있는 유충의 수를 셉니다. 각 유충의 위치를 표시하면 계수가 수월해질 수 있습니다. 빠른 촬영 또한 도움이 될 수 있습니다. 벽을 타고 기어오르거나 한천 속으로 파고드는 유충과 같이 빛 선호도가 불분명한 유충은 중립 선호도로 간주하여 계산해야 하며, 빛 선호도 지수를 계산할 때 전체 유충 수에 합산해야 합니다.

유충의 수를 센 후, 플레이트를 폐기하고 다음 실험을 위해 새로운 테스트 플레이트를 사용하십시오. 유전자형당 10~15회의 반복 실험을 수행한 후, 프로토콜에 따라 분석을 진행하십시오. Canton ES 유충의 명암 선호도를 서로 다른 두 가지 서카디언 시간에 걸쳐 비교하였습니다.

주관적인 CT 0과 CT 12 시점에, 유충을 표준 조건에서 48시간 동안 동조시킨 후 3일 동안 지속적인 암흑 상태로 전환하였습니다. 350 luxe 조건에서 광-암 테스트를 수행한 결과, CT 12에서 테스트한 유충에 비해 CT 0에서 테스트한 유충의 빛 민감도가 더 높게 나타났습니다. 이 공식을 사용하여 계산한 결과, CT 0 유충의 암흑 선호도는 0.52였으며, 이는 CT 12 유충의 0.36과 대조되었습니다.

Wilcoxon 검정으로 CT 12 유충의 지수들을 비교한 결과, 0.023의 유의미한 P 값이 산출되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 이러한 목표를 위해 서로 다른 회로 및 시점에서 영양 유충의 빛 선호도를 테스트하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한 F 단계의 3일차 영양 유충을 동조시키고, 광혐오 행동을 테스트하며, 통계적 비교를 위한 빛 선호도 지수를 계산할 수 있게 될 것입니다.