Name: 마우스 배아 얼굴 외배엽과 Mesenchyme의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 배우세요 마우스 배아 얼굴 외배엽과 중간엽을 분리하는 방법을 Dispase II 처리를 통해. 이 기술은 발달생물학 연구에서 유전자 발현 및 조직 상호작용 분석에 활용됩니다.

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저자는 그림 1과 도움과 토론 연구소의 다른 회원 배아 헤드를 도시에 아이린 최 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 DE012728 (TW)에 의해 지원됩니다

1. Dispase II 준비 <ol><li> 준비 신선한 Hepes 버퍼 식염 (HBS) (50 밀리미터 Hepes / 코 산도 7.4, 150 MM NaCl).에게 16.8 ML Ultrapure H 2 O.으로 2 ML 0.5 M Hepes / 코 산도 7.4 및 1.2 ML 2.5 M NaCl을 추가 </li><li> 10 MG / ML Dispase II하십시오. 0.2 g Dispase II를 (로슈, 고양이 # 4942078001) 무게 20 ML HBS에 용해. 장기 저장을 위해 -20 ° C에서 각각 Eppendorf 튜브 및 저장소에 1.0 ML의 aliquots를 준비합니다. </li><li> 사용하기 전에 PBS에서 10 MG / ML Dispase II 1시 10분을 희석. 얼음에 희석 Dispase II를 놔. </li></ol> 2. 임신 여성에서 CD-1 E10.5의 태아를 해부 모든 동물 실험은 콜로라도 덴버의 대학 (UCD) 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 프로토콜에 따라 수행되었다. CD-1 (ICR) 마우스는 할란 연구소 (인디애나 폴리스, IN)에서 얻은되었습니다. <ol><li> 70 % 에탄올로 분해 공간 및 도구를 청소하십시오. </li><li> approv을 사용하여 임신 CD-1 여성을 안락사시켜야에드 프로토콜. </li><li> 70 % 에탄올로 복부를 뿌려서하면 다음 복부를 엽니 다. 자궁에서 mesometrium을 멀리 찢어 자궁과 다른 끌어 포셉 한 세트를 사용합니다. 몸에서 자궁을 제거합니다. 복부의 다른 쪽 자궁 뿔에 대해 반복합니다. </li><li> 간단히 피를 씻어 10 cm 배양 접시에 얼음 차가운 PBS로 자궁을 씻어. </li><li> 얼음 차가운 PBS로 새 페트리 접시에 자궁을 전송합니다. 주입 사이트 사이에서 절단하여 한 배아 조각으로 분리합니다. </li><li> stereomicroscope 아래 얼음처럼 차가운 PBS에 하나 배아를 전송합니다. 난황 주머니에 배아를 노출 할 수있는 컷 사이트 중 하나에서 시작 자궁의 근육 벽을 찢어 고급 집게를 사용하십시오. 난황 주머니와 양막 보지. 얼음에 PBS로 6 cm 페트리 접시에 해부하는 배아를 전송합니다. 모든 배아는 이런 방식으로 수집 될 때까지 진행합니다. </li></ol> 3. Dispase II 치료 <ol><li> 6 cm 배양 접시에있는 PBS 모든 배아를 씻으십시오. 교체PBS 10 ML 희석 Dispase II와 PBS. 25 분에 37 ° C에서 페트리 접시 및 배양을 커버 - 세균 배양기 나 따뜻한 방은 충분해야합니다 - 우리는이 단계의 CO 2 조직 문화 인큐베이터를 사용하지 않았습니다. </li><li> 페트리 접시를 타고 stereomicroscope 아래의 배아를 관찰합니다. 외배엽이 느슨되고있는 것,이 조직 계층과 기본 mesenchyme 사이에 명확한 차이가 typified. 그렇지 않은 경우, 37에서 추가로 5 분 ° C.에 품다 그런 다음 얼음에 페트리 접시를 넣어. </li></ol> 4. 그대로 얼굴 프로미넌스 prominences을 해부 <ol><li> (VWR, 고양이 # 14672-380) 일회용 유리 피펫을 사용하여 stereomicroscope 미만 Dispase II는 6 cm 배양 접시에 얼음처럼 차가운 PBS로 배아를 취급 전송합니다. </li><li> 배아를 개최 할 포셉 한 쌍의를 사용하십시오. 머리에 부착 된 얼굴 프로미넌스 prominences의 경계를 (그림 1의 경계를 표시자를주의 깊게 고급 집게의 또 다른 한 쌍의를 사용하여얼굴 프로미넌스 prominences). 하나 MnP의 측면, 다음 MxP, 그리고 마지막으로 FNP에서 시작합니다. 그대로 밖으로 얼굴 프로미넌스 prominences (그림 2A)를 해부하기 위해 반대쪽으로 동일한 작업을 수행. </li></ol> 5. Mesenchyme에서​​ 별도의 얼굴 외배엽 <ol><li> 3 배 작동 거리와 stereomicroscope 아래 얼굴 프로미넌스 prominences을 관찰합니다. 부드럽게 위아래로 5 배 얼굴 프로미넌스 prominences을 피펫하는 긴 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 이 후, 외배엽으로 흩어져 용이합니다. </li><li> 얼굴 프로미넌스 prominences을 보유 할 포셉 한 쌍의를 사용하십시오. 아주 천천히 외배엽에서 껍질에 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. 그림 2B는 얼굴 외배엽의 분리 시트를 보여줍니다. </li><li> 얼음에 PBS와 1.5 ML Eppendorf 튜브에 얼굴 외배엽를 전송하는 새로운 긴 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 얼음에 PBS와 함께 또 다른 1.5 ML Eppendorf 튜브에 mesenchyme를 전송합니다. </li><li> 각각의 해부를위한 새로운 얼음 차가운 PBS를 사용합니다. 샘플을 수집합니다. </li><li> t을 씻으십시오PBS로 그는 샘플. 4 ° C, 3 분 500 XG에서 원심 분리기. </li><li> 긴 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS를 대기음. 샘플 칩 분석을 위해 사용됩니다 경우, 6.1 단계로 진행합니다. RNA 추출의 경우, 6.2 단계로 진행합니다. 단백질 추출의 경우, 6.3 단계로 진행합니다. </li></ol> 6. 또한 실험에 대한 공정 샘플 <ol><li> 칩 분석을위한 샘플 <ol><li> crosslink에 1 %의 포름 알데히드와 함께 1 ML PBS를 추가합니다. 샘플을 균질화. </li><li> 회전 10 분 동안 실온에서 알을 품다. </li><li> unreacted 포름 알데히드을 해소하기 위해 각 튜브에 1.25 M 글리신의 110 μl를 추가합니다. </li><li> 섞어서 5 분 동안 실온에서 알을 품다. </li><li> 3 분에 대해 4 ° C에서 500 XG에서 봐. 표면에 뜨는 제거합니다. </li><li> 조직을 씻어 한 ML 차가운 PBS를 추가합니다. </li><li> 3 분에 대해 4 ° C에서 500 XG에서 봐. </li><li> PBS를 제거하고 PBS 한 번 씻어 반복합니다. </li><li> 표면에 뜨는 제거, 액체 질소의 조직을 고정 스냅인을 종료합니다. SA를 저장-80 ° C에서 후속 풀링 및 처리를 위해 mples. </li></ol></li><li> RNA 추출을위한 샘플 <ol><li> RNAlater (Ambion)를 포함하는 튜브의 얼굴 외배엽과 mesenchyme를 놓습니다. </li><li> ° C는 조직의 철저한 침투를 허용 할 4에 박 RNAlater 솔루션에 샘플을 품다. </li><li> 이후 풀링 및 처리를 위해 -20 ° C에서 저장합니다. </li></ol></li><li> 단백질 추출을위한 샘플 </li></ol> 후속 처리를 위해 샘플에 용해 버퍼를 추가합니다. 또는 액체 질소의 조직을 동결 이런. -80 ° C에서 후속 풀링 및 처리를 위해 샘플을 저장합니다. 참고 사항 <ol><li> 시간 제약. 을 통해 해부의 시작부터 제 6의 시작 부분에 4-6 시간을 계획합니다. </li><li> 때 실력, 그것은 섹션 4와 5 (명성의 해부 및 외배엽 분리)를 수행하기 위해 배아 당 ~ 10-15 분 정도 소요됩니다. </li><li> 샘플 RNA 분리, 모든 solutio에있는 경우N 먼저 Diethylpyrocarbonate로 치료해야합니다. 또한 포셉과 멀리 RNase있는 작업 공간을 청소. </li><li> Dispase II 처리 및 dissections를 제외한 모든 시간에 얼음에 샘플을 보관. 해부에 사용 된 PBS 감기에 있는지 확인하기 위해 각 절개에 대한 새로운 얼음 차가운 PBS로 변경합니다. </li><li> 샤프 포셉 정확한 절개를 얻을 중요합니다. 모든 오염을 방지하기 위해 완전히 포셉를 청소합니다. </li><li> 다른 프로미넌스 prominences에서 샘플을 수집하기 위해 Dispase II 치료 후 각각 부각을 해부. 그런 다음 외배엽과 mesenchyme 구분합니다. </li><li> Dispase II 치료 후 얼굴 외배엽이 흩어져 쉽게합니다. 다른 외배엽에서 오염에 특별한주의를 기울이십시오. 모든 잠재적으로 오염 된 조직을 폐기하십시오. </li><li> 일단 샘플 제 6 항에서 해당 지점에 도달 할 때까지 멈추지 말고, 시작합니다. 얼굴 외배엽의 분리를 완료하고 최대한 빨리 할 수​​있는 한 모든 배아에 대한 mesenchyme. </li><li> 전자Dispase II의 nzyme 활동은 일괄 및 브랜드 사이에 다를 수 있습니다. 이것은 다른 브랜드와 Dispase II의 배치에 대한 치료 시간을 조정할 필요가 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+craniofacial+development+and+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of craniofacial development and malformation.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).</li>
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</ol>

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이 프로토콜은 초기 Dispase II 치료 단계에 따라 배아 마우스 얼굴 외배엽과 mesenchyme을 분리 할 수​​있는 간단한 방법을 제공합니다. 이전 연구에서, 우리는 이전 Dispase II 치료에 얼굴 프로미넌스 prominences의 절개를 수행했지만, 우리는 지속적으로 mesenchyme는 &quot;끈적&quot;과 조작이 더 어려워지고있는 것으로 나타났습니다. 새로운 프로토콜은이 문제를 방지합니다. 조합 Dispase II 아래로 pipetting과의 부드러운 물리적 인 힘과 치료 외배엽 쉽게 mesenchyme의 분리를합니다. 또한,이 프로토콜은 또한 짧은 Dispase II 트리트먼트로 사지 꽃 봉오리의 외배엽과 mesenchyme 등의 배아 외배엽과 mesenchyme 샘플의 분리에 적합합니다. 마찬가지로, 그것은 개발의 다른 단계에서 사용할 수 있습니다 - 예를 들어, 더 이상 Dispase II 트리트먼트 단계로 E11.5 얼굴 외배엽과 mesenchyme을 분리하십시오. <p class="j...

<table><tbody><tr><td>Dispase II (중성 프로테아제, 등급 II)</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>HBS에서 10 mg/ml Dispase II 원액을 만듭니다. 부분 표본 및 -20 &deg에 저장; C . </td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>앰비온</td><td>AM7021</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 배아 얼굴 외배엽과 mesenchyme의 분리

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial 갈라진 틈은 1,000 신생아 세계 1,2에서 1.5에 영향을 미치는 가장 자주 craniofacial 결함입니다. Orofacial clefting는 이상 얼굴의 개발 3로 인해 발생합니다. 얼굴의 인간과 마우스, 초기 성장 및 패턴에서 조직의 몇몇 작은 꽃 봉오리, 4,5 얼굴 프로미넌스 prominences에 의존하고 있습니다. 이점 정면 코 프로세스 (FNP), 턱의 프로미넌스 prominences (MxP)와 mandibular의 프로미넌스 prominences (MDP) : 얼굴은 여섯 가지 주요 프로미넌스 prominences에서 파생됩니다. 이러한 프로미넌스 prominences는 놓인 상피으로 쌌다 아르 mesenchyme의 swellings로 구성되어 있습니다. 여러 종의 연구는 얼굴 외배엽과 mesenchyme 사이의 누화 신호를하면 얼굴 6 형성에 중요합니다 것으로 나타났습니다. 그러나,이 신호를 릴레이에 참여 유전자에 관한 기계론의 내용은 부족합니다. 하나의 유전자 표현의 포괄적 인 이해를 얻을 수있는 방법 구속력이 전사 인자 및 develo과 관련된 염색질 마크핑 얼굴 외배엽과 mesenchyme은 분리 조직 구획을 분리하고 특성화하는 것입니다. 여기 배아 일 (E) 10.5 프로미넌스 prominences의 융합을 앞에 마우스 얼굴 형성에 중요한 발달 단계에서 얼굴 외배엽과 mesenchyme를 분리하기위한 방법을 제시한다. 우리의 방법은 우리가 이전에 얼굴 프로미넌스 prominences에게 7 해부에 사용했던 방법에서 구성된다. 이 이전 연구에서 우리는 근친 C57BL을 고용 한 /이 변형 등 6 마우스 유전학, 유전체학 및 얼굴 형태 8에 대한 표준이되었습니다. 여기하지만 가능한 조직의 더 한정된 수량으로 인해, 우리는 축산에 대해보다 강력한를 구입 저렴 outbred CD-1 변형을 활용, 모든 근친보다 쓰레기 당 더 많은 배아 (12-18)를 생산 돌봐 있습니다 마우스 변형 8. 배아 분리 후, 중성 단백 분해 효소 Dispase II는 전체 배아을 치료하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 얼굴 프로미넌스 prominences가 해부했다에드 아웃, 그리고 얼굴 외배엽은 mesenchyme에서​​ 분리되었다. 이 방법은 얼굴 외배엽과 mesenchyme 모두 그대로 유지합니다. 이 방법을 사용하여 얻은 샘플은 단백질 감지, 염색질 immunoprecipitation (칩) 분석, microarray 연구 및 RNA-seq 등의 기술을 사용할 수 있습니다.

Dispase II 치료 후, 배아의 외배엽이 늘어 경향이있다. 얼굴 프로미넌스 prominences는 절개 (그림 2A) 후 그대로 있어야합니다. 격리 된 얼굴 외배엽는 명확하고 mesenchyme 조직 (그림 2B)은 무료입니다. 프로토콜의 효능을 결정하기 위해 우리는 forebrain에 대한 assayed 교차 오염을 감지 할 수 Zic3 9 ectodermal 특정 cdh1 5 역 transcriptase PCR을 사용하여 중간 엽 특정 sox10 10 표명했다. 우리의 연구는 얼굴 외배엽과 mesenchyme 모두 예상 유전자를 표현하고 교차 오염 (그림 3) 무료 있다고 확인했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/5...

태아 얼굴 외배엽과 mesenchyme의 분리를위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 우리는 먼저 전체 배아를 취급하는 전체 얼굴 프로미넌스 prominences을 해부하기 위해 Dispase II를 사용하고 얼굴 외배엽과 mesenchyme 구분합니다.

마우스 배아 얼굴 외배엽과 Mesenchyme의 분리

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 배아, 안면 외배엽 및 기계체를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 CD one E 10.5 배아를 분리함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 dys가 있는 전체 배아를 치료하는 것입니다.2단계. 효소 치료 후 안면 돌출부를 분리하고 마지막 단계는 안면 진피와 간엽을 조심스럽게 분리하는 것입니다. 그런 다음 분리된 안면 진피와 간엽은 추가 실험을 위해 준비됩니다.절개된 안면 돌출부의 디스 공간 처리와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 DYS 공간으로 전체 배아를 처리하면 안면 사고와 온전한 상태가 모두 유지된다는 것입니다. 이 방법은 포유류 발생 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 차등 유전자 발현, 후성유전학적 변형 및 전사 인자 결합이 어떻게 안면 진피와 중간엽 사이의 분자 누화를 조절할 수 있는지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 배발생 기간 동안 지금부터 조직 격리까지 4-6시간을 계획하고 70% 에탄올에 대해 해부 영역과 도구를 청소합니다.샘플이 RNA 분리용인 경우 RNA를 사용하지 마십시오. 집게가 날카로워야 합니다. 또한 RNA 분리를 위해 용액을 과탄산에틸로 처리해야 합니다.이제 E 10.5 배아를 채취하기 위해 승인된 프로토콜을 사용하여 임신한 CD 한 마리를 안락사시킵니다. 복부에 70 % 에탄올을 뿌리고 복부를 엽니 다. 한 쌍의 집게를 사용하여 자궁을 당기고 다른 한 쌍을 사용하여 자궁에서 중영양을 떼어냅니다.몸에서 자궁을 제거하고 반대쪽 자궁 뿔에서 이 과정을 반복합니다. 10cm 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 PBS로 자궁을 짧게 헹구어 혈액을 씻어냅니다. 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 자궁을 새 접시에 옮깁니다.착상 부위 사이를 잘라 하나의 배아 조각으로 분리합니다. 그런 다음 실체 현미경으로 배아 하나를 얼음처럼 차가운 PBS로 이식합니다. 절단 부위 중 한 곳에서 시작합니다.가는 집게를 사용하여 자궁의 근육벽을 뜯어내고 난황 자루로 배아를 노출시킵니다. 그런 다음 노른자 자루와 양막을 벗겨냅니다. 절개된 배아를 PBS가 얼음 위에 올려진 6cm 페트리 접시에 옮기고 모든 배아가 채취될 때까지 절차를 반복합니다.배아를 dys paste two로 처리하기 전에 6cm 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 PBS로 씻으십시오. PBS를 10 밀리리터의 얼음으로 차갑게 희석된 dys로 교체하고

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

postimplantation - 무대 배아의 격리는 한 유전자 patterning을 연구하고 개발하는 동안 배아 프로세스를 만드는 세포 혈통 결정을 분석할 수 있지만, 초기 배아의 적절한 절개 도전하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기 원시 - 연속 단계의 배아를 분리하는 방법을 설명합니다 (~ 6.5 일 이후 coitum [DPC]).

6.5 DPC 마우스 태아의 해부

이 문서는 craniofacial 개발 중에 신호 및 표면 두부 ectoderm의 patterning 속성을 테스트하도록 설계되었습니다 조직 이식 기술을 설명합니다.

Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

두개골 mesenchyme 가능성이 신경 주름 상승을위한 원동력을 제공 극적인 morphogenic의 움직임을...

두개골 Mesenchyme의 셀룰러 행동을 평가하기위한 Explant 분석

개인 배아 세포의 운명은 상속 분자 및 / 또는 주변 세포의 신호에 의해 영향을받을 수 있습니다. 절단 단계 Xenopus의 배아의 운명지도 활용 한 blastomeres는 세포 세포의 상호 작용 비해 상속 분자의 공헌을 평가하기 위해 격리 문화 식별 할 수 있습니다.

Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

배아 신경 세포는 신경 튜브의 심실 영역에서 태어 났지만, 적절한 목표에 도달하기 위해 마이그레이션됩니다. 얼굴 branchiomotor (FBM) 신경 세포는 신경 세포의 이동을 연구하기위한 유용한 모델이다. 이 프로토콜은 FBM 이동을 조절하는 메커니즘을 조사하기 위해 마우스 배아 hindbrains의 wholemount 생체 문화를 설명합니다.

마우스 후뇌<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 문화 얼굴 Branchiomotor 신경 세포의 마이 그 레이션을 연구하는

여기, 우리는 공 촛점 현미경을 사용하여 마우스 보조 입천장 융합의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 형광 기자 마우스 라인과 기계적 통찰력을위한 경로 억제제와 함께 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 발달 시스템의 라이브 이미징에 적용 할 수 있습니다.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

이 프로토콜은 주로 세포 이동 연구를 위해 마우스 모델에서 두개골 신경 문장 세포의 해부 및 배양을 설명합니다. 우리는 사용된 살아있는 화상 진찰 기술 및 속도 및 세포 모양 변경의 분석을 기술합니다.

신경 문장 세포 박리 및 이동의 연구를 위한 마우스에서 1 차적인 두개골 신경 문장 세포의 해부, 문화 및 분석

우리는 2차원 (2D) 성장 및 상처 복구 분석의 시간 경과 화상 진찰을 위한 1 차적인 마우스 배아 성 구형 중간엽 세포의 격리 그리고 문화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 세포 스트림 형성 및 방향 운동성을 결정하기 위하여 시간 경과 화상 진찰 데이터의 분석을 위한 방법론을 제공합니다.

집단 운동 특성을 분석하기 위해 1차 마우스 배아 성 성 메센키메 세포의 격리 및 시간 경과 이미징

우리는 배아와 성인 마우스 혀의 상피 및 중간/ 결합 조직에서 대량의 고품질 단일 세포를 해리시키는 일반화 프로토콜을 개발했습니다.

배아의 날 12.5 및 8 주 된 마우스의 혀 상피 및 메센키메 / 결합 조직에서 세포 해리

상기 프로토콜은 해부된 마우스 배아 안면 과정 또는 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포로부터 전체 세포 단백질 용해물을 단리하고 인산화된 단백질 수준을 평가하기 위해 후속 웨스턴 블롯팅을 수행하는 방법을 제시한다.

마우스 안면 과정으로부터 전체 세포 단백질 용해물을 분리하고 포스포단백질 분석을 위해 배양된 팔라탈 중간엽 세포

여기서, 배아의 고정, 면역 염색 및 절편화를 위해 최적화된 단계별 프로토콜이 제공되어 마우스 조직에서 사이토네임(cytonemes)이라고 불리는 특수한 신호전달 필로포디아(filopodia)를 검출한다.

사이토네메 분석을 위한 배아 마우스 조직의 고정

배우세요 마우스 배아 얼굴 외배엽과 중간엽을 분리하는 방법을 Dispase II 처리를 통해. 이 기술은 발달생물학 연구에서 유전자 발현 및 조직 상호작용 분석에 활용됩니다.

마우스 배아 얼굴 외배엽과 Mesenchyme의 분리

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