해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

이 절차의 전반적인 목표는 배아 및 유충 얼룩말 물고기에서 골격근 섬유를 효율적으로 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 폴리 L 라이신으로 코팅된 커버 슬립을 준비하여 수행되며, 수정 후 1-4일 후에 제브라피시 배아를 해리합니다. 그런 다음 해리된 배아에서 분리된 근육 섬유가 폴리리신 커버 슬립에 도금됩니다.

마지막으로, 근육 단백질을 분석하기 위해 myo fibers를 고정, 염색 및 이미지화합니다. 궁극적으로 면역형광 현미경 검사를 통해 근육 단백질의 세포 내 국소화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 전체 배아 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 단일 근육 섬유 형태 및 생리학을 보다 자세히 연구할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 세포 내 단백질 국소화와 관련된 것과 같은 근육 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 살아있는 세포 칼슘 이미징과 결합할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 인간 질병과 관련된 병리학적 구조적 이상을 시각화하는 데 사용할 수 있기 때문에 근육 질환에 대한 제브라피시 모델의 검증으로 확장됩니다. 또한 근육 질환의 새로운 측면을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

발병 기전: 이 방법을 통해 근육 구조와 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 인간 골격 근육 질환과 같은 다른 연구에도 적용할 수 있습니다. 얼룩말 물고기 배아의 해리를 준비하려면 60mm 페트리 접시 바닥에 퍼퓸을 자르고 올려 커버 슬립을 준비하십시오.

그런 다음 유리 커버 슬립을 퍼퓸에 놓고 50-200 마이크로 리터의 폴리 리신 용액을 각 커버 슬립에 피펫으로 넣습니다. 커버 슬립을 섭씨 37도에서 최소 1시간 동안 배양한 후 폴리리신 용액을 제거하고 100마이크로리터의 PBS로 두 번 세척합니다. 커버 슬립을 건조시킨 다음 뚜껑이 있는 접시에 보관하십시오.

배아 해리를 위해. 수정 후 10-23일 후 제브라피시 배아를 표준 1.5ml 원심분리기 튜브에 옮기고 가능한 한 많은 여분의 물고기 수분을 제거합니다. 900마이크로리터의 이산화탄소 독립 매체를 튜브에 피펫으로 넣습니다.

그런 다음 밀리리터 콜라겐 분해 효소 당 3.125 밀리그램의 100 마이크로 리터, 2 개 또는 4 개의 용액을 추가하여 해리를 시작합니다. 실온에서 오비탈 쉐이커에서 배아를 회전시키고 30분마다 P 1000 파이프 Pepin을 사용하여 샘플을 반복하여 전체 배아가 보이지 않지만 단단한 조각이 존재할 때 과잉 소화를 방지합니다. 샘플을 0.8 - 2.3 Gs에서 3 - 5분 동안 펠릿화하여 반응을 중지합니다.

상층액을 제거하고 이산화탄소 독립 매체로 두 번 세척합니다. 서스펜션을 70마이크로미터 필터에 통과시켜 약 50-100마이크로리터의 근섬유 현탁액에서 각 폴리 L 라이신 코팅 커버 슬립에 대한 파편을 제거합니다. myo fibers를 고정 후 실온에서 한 시간 동안 안정화시키고 text protocol mount에 따라 myo fibers를 면역 라벨링합니다.

덮개는 먼저 슬라이드에 Antifa 시약 1-2방울을 바르면 미끄러집니다. 집게를 사용하여 커버 슬립을 조심스럽게 집어 거꾸로 뒤집어 현미경 슬라이드의 퇴색 방지 시약 방울에 놓습니다. 다음으로, 단단하고 단단한 표면에 하나 또는 두 개의 조직을 놓고 슬라이드를 조직에 빠르게 반전시킵니다.

슬라이드 모서리에 가벼운 압력을 가하여 과도한 안티파 시약을 제거하고 슬라이드와 커버 슬립 사이에 단단히 밀봉을 형성합니다. 이미징하기 전에 슬라이드를 실온에서 5-10분 동안 건조시키거나 섭씨 4도에서 보관하십시오. 여기에서 볼 수 있듯이, 아노다인 수용체(anodyne receptor)와 알파 액티닌(alpha actinin)에 대해 형광 표지된 근섬유(myofibers) 면역 섬유는 각각 트라이어드(triad)와 잔드(zand)를 나타냅니다.

우리는 근육 단백질의 세포 내 국소화를 결정하기 위해 이전 연구에서 분리된 근옵 섬유를 활용했습니다. 키메라 발현 전이유전자의 국소화를 연구하고 크기를 포함한 특정 근섬유 매개변수를 정의합니다. 이 그림은 PSKM GCaMP 3 구조를 발현하는 근업 섬유에서 정상적인 카페인 유도 칼슘 방출을 보여줍니다.

텍스트 프로토콜에 요약된 바와 같은 기술은 이 절차에 따라 라이브 이미징을 통해 여기 수축 결합 장치를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 생칼슘 이미징과 같은 다른 방법을 수행하여 다음과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 근육 질환 연구 분야의 연구자들이 새로 확인된 근육 질환 유전자에 대한 검증 연구를 탐구하고 근육 질환 발병의 새로운 측면을 결정할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시 ems에서 개별 경증 FBS를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.