Hippocampal 슬라이스 문화의 시냅틱 단백질의 포스트 퍼가기 Immunogold 라벨링

이 절차의 전반적인 목표는 쥐 해마 CA one 파라메탈 뉴런에서 시냅스 단백질의 초구조적 국소화를 결정하기 위해 ImmunoGold 라벨링을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 유기형 절편의 CA 한 영역을 제거하고, 올바른 방향을 기억하기 위해 상단 모서리를 다듬고, 얼음 위에 무오스뮴 고정제에 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 고정된 조직을 탈수하고 수지로 침투하여 굳어지도록 하는 것입니다.

다음으로 초박형 절편을 수지에 내장된 조직에서 절단하여 니켈 그리드에 놓습니다. 마지막 단계는 절편 조직에 대해 면역조직화학을 수행하는 것입니다. 궁극적으로 면역 전자 현미경은 시냅스에서 단백질의 국소화를 결정하는 데 사용됩니다. 그래.

이 방법은 수지상 가시 내 단백질의 국소화가 시냅스 기능에서 단백질의 역할을 이해하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지와 같은 시냅스 가소성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 유기형 해마 절편에 최적화되어 있지만, 급성 뇌 절편 및 1차 신경 세포 배양을 포함한 다른 신경 세포 제제에도 매우 유용할 수 있습니다. 유기형 해마 조각을 신선한 얼음처럼 차가운 sorensen의 인산염 완충액이 들어 있는 폴리스티렌 페트리 접시에 넣어 이 절차를 시작합니다.

슬라이스 바로 위에 1-2ml의 얼음 냉각 버퍼를 추가합니다. CA one의 슬라이스 하위 필드를 분리하기 위해 일회용 메스를 사용하여 CA one cell layer와 평행한 치상회(dentate gyrus) 옆의 슬라이스를 부드럽게 자릅니다. 그런 다음 나머지 슬라이스를 세로로 잘라 CA 3 하위 필드와 sulu를 제거합니다.

다음으로, 조직의 윗면을 식별하는 데 도움이 되도록 CA의 모서리를 한 조각으로 자르고 메스 뒷면을 사용하여 멤브레인에서 조직을 조심스럽게 제거합니다. 조직을 얼음처럼 차가운 sorensen 완충액이 들어있는 12웰 플레이트로 부드럽게 옮깁니다. 완충액을 제거하고 sorensen의 완충액에 희석된 pH 7.3의 얼음 저온 고정제 0.5-1ml를 추가하여 시료를 적절하게 덮도록 합니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 웰에서 정착액을 제거하고 얼음처럼 차가운 sorensen 버퍼에서 20분 동안 샘플을 세 번 세척합니다. 그런 다음 pH6.0에서 0.1 몰 말레이트 완충액에 부피당 1% 탄닌산 중량으로 샘플을 배양합니다.

40분 후, 말레이트 완충액에서 20분 동안 샘플을 두 번 세척하여 탄닌산을 헹굽니다. 다음으로, 샘플을 1% 소변기 아세테이트에서 40분 동안 배양합니다.소변기 아세테이트는 말레이트 완충액 아세테이트는 빛에 민감하고 방사성입니다. 따라서 조심스럽게 다루고 배양 중에는 샘플을 섭씨 4도의 어두운 곳에 두십시오.

배양 후 얼음처럼 차가운 말레이트 완충액에서 샘플을 각각 20분 동안 두 번 헹군 다음 수감자 완충액의 0.5% 백금 염화물에서 20분 동안 배양합니다. 마지막으로 20분 동안 두 번 세척하여 잔류 백금 염화물을 헹굽니다. 각 수감자 완충액은 추가 처리 준비가 될 때까지 샘플을 섭씨 4도의 말레이트 완충액에 보관합니다.

면역조직화학을 시작하기 위해, 이 비디오의 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 니켈 그리드에서 60나노미터 초박형 단면을 얻기 위해 먼저 고정된 CA one 영역을 탈수하고 절단합니다. 다음으로 pH 7.5에서 1% 트윈 20 인산염 완충액을 깨끗한 파라폼 조각에 떨어뜨립니다. 그런 다음 깨끗한 집게로 그리드를 부드럽게 집어 들고 섹션을 아래로 하여 버퍼에 띄우고 배양 후 실온에서 10분 동안 이와 같이 배양하고 단면을 필터 용지에 위로 향하게 놓아 그리드에서 여분의 액체를 배출합니다.

또한 섹션이 완전히 마르지 않도록 하면서 여과지 조각으로 부드럽게 심지를 만들어 EM 집게의 암 사이에 끼인 용액을 제거합니다. 그런 다음 파라 필름에 50밀리몰 글리신 한 방울을 떨어뜨리고 그리드 섹션이 아래를 향하도록 하여 실온의 글리신 용액에 띄웁니다. 샘플이 15분 동안 배양하는 동안 2차 항체의 동물에서 2.5%의 혈청을 2.5%의 BSA 용액에 첨가하고 이 혼합물을 파라 필름에 한 방울 떨어뜨립니다.

15분 배양 후 여과지로 그리드를 건조시키고 차단 용액에 30분 동안 띄웁니다. 실온에서 깨끗한 플라스틱 페트리 접시 내부를 따라 말아 올린 Kim 물티슈를 올려 배양실을 준비합니다. 페트리 접시 중앙에 깨끗한 파라마 조각을 놓고 킴 물티슈에 여과수를 추가합니다.

다음으로, 파라폼에 1차 항체 용액 한 방울을 떨어뜨리고 샘플을 실온 또는 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 부유시키면 최적의 배양 시간과 온도, 항체 농도를 실험적으로 결정해야 합니다. 1차 항체로 배양한 후 1%tween 20 phosphate buffer로 각각 2분씩 그리드를 3회 세척합니다. 그런 다음 1 시간 후에 10 나노 미터 금과 결합 된 1-20 개의 안티 토끼 또는 안티 US를 사용하여 2 차 항체로 배양합니다.

실온에서 1% 트윈 20 인산염 완충액으로 각각 2분씩 3회 세척합니다. 그런 다음 완충된 2%글루타르알데히드에 샘플을 5분 동안 접미사로 넣습니다. 1%트윈, 20인산염 완충액으로 3회 헹궈낸 다음 여과수로 3회 헹구고 매번 2분씩 헹구어 과도한 글루아 알데히드를 제거합니다.

헹구면 2% 소변기 아세테이트에서 그리드를 10분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 유리 페트리 접시 중앙에 파라폼 조각을 배치하여 CO2가 없는 챔버를 준비합니다. 그런 다음 파라폼 주위의 접시에 수산화나트륨 펠릿 10-15개를 넣어 공기 중의 CO2를 흡수합니다.

몇 분 동안 상단을 닫아 두십시오. 다음으로, 목초지 피펫을 사용하여 갓 준비한 소량의 Reynolds 납 시트르산염 용액을 파라폼으로 빠르게 옮깁니다. CO2가 챔버로 재유입되는 것을 최소화하기 위해 목초지 피펫을 삽입할 수 있을 만큼만 상단을 엽니다.

세 개의 작은 비커에 갓 끓인 따뜻한 탈이온수를 준비하고 첫 번째 부리에 그리드를 담가 소변기 아세테이트를 씻어낸 다음 30초 동안 부드럽게 휘젓습니다. 다른 두 비커에서 이 단계를 반복합니다. 헹구면 유리 페트리 접시의 상단을 열어 Reynolds 납 시트르산염 용액 한 방울에 그리드를 놓습니다.

가능하면 이 작업을 수행하는 동안 마스크를 착용하여 구연산납에 대한 호흡을 피하고 침전물 형성을 방지하십시오. 10분 후 상단을 약간 열고 그리드를 제거합니다. 따뜻한 증류수를 담은 세 개의 새 비커에 순차적으로 담그어 세 번 씻습니다.

그런 다음 여과지 섹션에서 그리드를 건조시킵니다. 이제 샘플을 전자 현미경으로 볼 준비가 되었으며, 여기에 투과 전자 현미경 사진으로 표시된 해마의 한 영역인 초박막 조직 절편에는 쉽게 구별할 수 있는 초금속 뉴런의 수상돌기와 가시가 포함되어 있습니다. T로 지정된 축삭 말단과 S로 지정된 수지상 가시 사이의 비대칭 시냅스의 식별은 시냅스 후 밀도와 잘 정의된 원형질막의 존재에 의해 촉진됩니다.

수지상 가시에서 neuro Grandin의 분포는 ImmunoGold EM 라벨링의 도움으로 볼 수 있으며 이러한 TEM 이미지에서 화살표로 강조됩니다. 척추 중심에서 척추의 원형질막까지의 neuro grandin의 반경 거리는 정규화된 방사형 거리로 측정할 수 있습니다. 거리 0은 멤브레인 위에 있는 입자에 해당하고 거리 값 1은 척추 중앙에 있는 입자를 나타냅니다.

그런 다음 뉴로 그랜딘에서 수지상 척추까지의 거리를 그래픽으로 표시할 수 있습니다. 여기서 정규화된 방사 거리로서의 분포는 파란색으로 표시되며, 분홍색으로 표시된 무작위 분포와 비교하여 이 그래프는 neuro Grandin이 원형질막에 가깝게 위치함을 보여줍니다. 이 기술은 신경계를 연구하는 연구자들이 피질, 시상, 후각구, 소뇌를 포함한 다양한 뇌 조직에서 수용체, 수용체 상호 작용 단백질, 수송체 및 이온 채널 및 기타 여러 채널의 국소화 및 분포를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

고정제를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 장갑과 실험복을 착용하고 필름 후드의 고정제를 취급하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.