집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

이 절차의 전반적인 목표는 간단한 고처리량 transfection 프로토콜과 집에서 만든 dual glow luciferase assay를 사용하여 관심 유전자의 transcriptional regulator를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 고유한 이중 루시퍼라제 리포터 플라스미드 세트를 설계하고 클로닝함으로써 이루어집니다. 이러한 플라스미드는 DNA 발현 라이브러리의 플라스미드를 사용하여 마이크로플레이트에서 2 9 3 T 세포로 cot transfection되며, 각 well은 단일 라이브러리 플라스미드로 transfection됩니다.

48시간 후, 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 분석한 후 바닐라 루시페라제 활성을 분석합니다. 마지막 단계는 반딧불이 대 바닐라 루시페라아제 활성 비율을 계산하는 것입니다. 궁극적으로, 각 라이브러리에 대한 반응으로 관심 유전자의 상대적 유도.

유전자는 플레이트 기반 정규화 후 각 웰에서 반딧불이 대 바닐라 루시페라제 활성의 비율에 의해 추론됩니다. 기존 리포터 분석 프로토콜에 비해 이 기술의 주요 장점은 최소한의 인력과 비용으로 많은 수의 유전자에 대한 기능 데이터를 신속하게 생성할 수 있다는 것입니다. 스크리닝의 1일째로 지정된 형질주입 하루 전, 2 9 3 T 세포가 96에 안착합니다.

웰 플레이트 세포는 크기가 조정되고, 계수되고, 1.5 곱하기 10의 농도로 재현탁되어 밀리리터당 5번째 세포가 됩니다. 14%FBS를 함유한 DMEM에서 세포를 멸균 저장소에 붓습니다. 바닥이 투명한 6개의 웰 플레이트 및 필터 피펫 팁 상자를 자동 액체 분주기의 로봇 데크에 놓습니다.

스크리닝할 각 라이브러리 플레이트에 대해 두 개의 셀 플레이트가 장착되어야 합니다. 각 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 세포를 1.5배의 밀도로 웰당 네 번째 셀에 분배합니다. 이 시연에서는 3개의 라이브러리 플레이트가 스크리닝됩니다.

따라서 6개의 세포 플레이트를 준비하고 각 웰 전체에서 동일한 세포 밀도를 보장하기 위해 낮은 램프 속도를 사용하여 2분 동안 50배 G에서 세포 플레이트를 원심분리합니다. 이 이미지는 원심분리 후 도금된 셀이 어떻게 보여야 하는지 보여줍니다. 하룻밤 동안 섭씨 37도에서 10%의 이산화탄소로 세포를 배양합니다.

반딧불이와 바닐라 리포터 플라스미드를 준비하려면 15ml 원추형 튜브에 내독소가 없는 물에 각각 마이크로리터당 5나노그램으로 희석합니다. 희석액을 5:3 반딧불이와 바닐라 플라스미드의 비율로 부피에 따라 결합합니다. 결합된 플라스미드를 라이브러리 플레이트당 17마이크로리터를 분배하는 96웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고, 각 웰 세포에 2-10마이크로리터를 초과하여 투여하면 스크리닝 2일차에 형질 주입됩니다.

각 라이브러리 플레이트에 대해 이 절차를 시작하려면 107.5마이크로리터의 실온 연산 결함을 4.3밀리리터의 무혈청 매체와 혼합하고, 폴리스티렌 튜브에서 1-40 희석을 실온에서 5분 동안 배양하고 라이브러리 플레이트당 44마이크로리터를 96웰 폴리스티렌 v 바닥 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 라이브러리 DNA 플레이트, 희석된 opt effect 플레이트, 리포터 플라스미드 플레이트 및 피펫 팁 상자를 로봇 데크 흡입기에 놓습니다. 17 마이크로리터의 리포터 플라스미드, 43 마이크로리터의 희석된 옵트 효과 및 26 마이크로리터의 라이브러리 DNA는 각 흡인 사이에 5 마이크로리터의 에어 갭을 삽입합니다.

교차 오염을 방지하기 위해 라이브러리 DNA를 마지막으로 흡인해야 합니다. 팁의 내용물을 새 폴리스티렌 v 바닥 플레이트 믹스 커버에 분배하고 지질 DNA 복합체가 형성될 수 있도록 20분 동안 따로 보관합니다. 여러 라이브러리 플레이트를 횡단하는 경우 피펫 팁과 라이브러리 플레이트를 교체하고 20분 후에 반복하고 opt effect DNA 혼합물 플레이트를 발견하고 단일 피펫 팁 상자를 사용하여 2 9 3 T 세포의 두 플레이트가 있는 로봇 데크에 놓습니다.

opt effect DNA 혼합물을 80마이크로리터씩 흡입하고 각 세포 플레이트에 대해 웰당 40마이크로리터를 천천히 분주합니다. opt 효과 DNA 혼합물이 모든 플레이트의 세포에 추가된 후 세포를 덮습니다. 1, 200회 G에서 30분 동안 플레이트를 원심분리합니다.

플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 4-6시간 동안 세포를 배양합니다. 이 배양 중에 10% FBS가 포함된 12ml의 DMEM과 밀리리터당 10마이크로그램의 시프로플록신을 혼합하여 새로운 배지를 준비합니다. 형질주입된 각 라이브러리 플레이트에 대해 새 매체를 멸균 저장소에 붓습니다.

다음으로 로봇 팁 상자 2개, 셀 플레이트 1개, 새 매체가 들어 있는 저장소 및 폐기물 저장소를 로봇 데크에 놓습니다. 그런 다음 세포에서 100마이크로리터의 배지를 흡입하고 부분적으로 70% 에탄올로 채워진 폐기물 저장소로 분배합니다. 새로운 팁을 사용하여 100마이크로리터의 새로운 매체를 흡입하고 세포에 천천히 분배합니다.

플레이트를 48시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 반딧불이 및 바닐라 루시페라아제 분석이 수행됩니다. 각 라이브러리 플레이트에 대한 스크리닝 4일차에 transfection한 후 48시간 후, 각각의 원액에서 8ml의 3개의 반딧불이 분석 버퍼와 12ml의 3개의 x 바닐라 분석 버퍼를 준비하고, 분석할 각 라이브러리 플레이트에 대해 96웰 V 바닥 플레이트의 각 웰에 82마이크로리터의 반딧불이 분석 버퍼를 분배합니다.

유사하게, 122마이크로리터의 바닐라 분석 버퍼를 다른 96웰 V 바닥 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 분석할 각 플레이트에 대해 두 분석 버퍼를 모두 따로 보관합니다. 피펫 팁 상자, 폐기물 저장통 및 동일한 라이브러리 플레이트에서 형질 주입된 두 개의 셀 플레이트를 로봇 데크에 놓고 각 플레이트에서 60마이크로리터의 매체를 흡입하고 70% 에탄올 커버 플레이트로 부분적으로 채워진 폐기물 저장통에 버리고 따로 보관합니다.

다음으로 피펫 팁 두 상자를 놓습니다. 3 x 반딧불이 분석 버퍼의 플레이트와 로봇 데크의 셀 플레이트 세트. 40마이크로리터의 3 x 반딧불이 분석 완충액을 흡입하고 세포의 첫 번째 플레이트에 넣고 완전히 혼합합니다.

새로운 피펫 팁으로 전환. 두 번째 세포 플레이트에 대해 반복합니다. 세포를 실온에서 10분 동안 놓아 용해를 완료합니다.

각 셀 플레이트의 각 웰에서 나오는 발광을 웰당 1초 동안 기록하여 기록합니다. 플레이트를 로봇 데크에 다시 놓습니다. 피펫 팁 상자 2개, 분석 버퍼 3개 플레이트, 셀 플레이트 세트를 로봇 데크에 놓습니다.

60마이크로리터의 3 x 바닐라 분석 완충액을 흡입하고 세포의 첫 번째 플레이트에 추가합니다. 철저히 혼합합니다. 새 피펫 팁 상자로 교체.

두 번째 세포 플레이트에 대해 반복합니다. 광도계의 모든 판에서 발광을 기록합니다. 각 웰을 1초 동안 녹음합니다.

단일 하프 플레이트에 대한 일반적인 루시퍼라제 값이 이 표에 나와 있습니다. 각 웰에 대한 반딧불이 대 갱신 발광 비율 또는 F2 R 비율은 반딧불이 신호의 개수를 런 갱신 신호의 개수로 나누어 계산되며, 그 결과는 패널 C.Panel D에 나타나 있으며, 웰의 F2 R 비율을 플레이트의 평균 F2 R 비율로 나누어 계산된 각 웰에 대한 유도 값을 보여주며, 우물의 가장 높은 25%와 가장 낮은 25%를 제외합니다. 유도 값은 단일 transfection된 library plate에 대한 반복실험 전반에 걸쳐 평균화되어야 합니다.

그리고 알파 시누클레인을 3배 이상 유도하거나 억제하는 유전자는 히트로 간주됩니다. 여기에 표시된 이 대표적인 결과에서 웰 H 2에 있는 32 폴드 인듀서는 웰 H 2가 파란색으로 강조 표시된 단일 플레이트에 대한 유도 값을 그래픽으로 표시한 것입니다. Hi.H 2는 알파 synuclein 표정과 이전에 관련되지 않은 neuronal 전사 인자입니다.

리포터 분석의 선형 범위 내에서 스크리닝이 수행되는지 확인하는 것이 중요하며, 이를 통해 발현 증가를 유발하는 클론이 강력한 H-C-M-V-I-E one promoter 및 assay의 제어 하에 증가하는 양의 반딧불이 및 바닐라 루시페라제 플라스미드로 transfection됨에 따라 이 말단에 대한 증가된 luciferase 활성을 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 반딧불이 활동이 광범위한 값을 통해 선형으로 유지되는 것이 관찰되었습니다. 바닐라 활성에 대한 곡선은 웰당 15나노그램 이상으로 평평해집니다.

또한 기질 고갈로 인한 비선형성을 방지하기 위해 배양 단계 후에 즉시 분석을 수행하는 것이 중요합니다. 반딧불이 루시페라아제 분석에 대한 붕괴 신호의 시간 경과는 이 프로토콜을 사용하여 시약을 첨가한 후 최대 1시간까지 상당한 반딧불이 루시페라제 활성을 나타냈고, 7,670개의 인간 유전자를 스크리닝하고 알파 시누클레인의 68개의 새로운 조절자가 궁극적으로 여기에 표시된 대표적인 결과에서 확인되었습니다. 각 수평선은 통제된 GFP 중립 유도제와 비교하여 단일 유전자 히트의 유도 비율을 나타냅니다.

파란색 선은 양성 유도 인자를 나타내고, 유일한 빨간색 선은 억제 인자를 나타내며, 유도 값은 반딧불이 루시페라제 활성을 유도하는 알파 시누클레인 프로모터와 CMV 프로모터를 구동하는 각 히트의 실행 루시페라제 활성의 비율로서 계산되며, 동일한 루시페라제 구축물 분석으로 정규화되고, GFP 유도제를 사용하여 검정을 구성하고, 이 절차에 따른다. 추가 과발현 및 넉다운 분석과 함께 정량적 PCR과 같은 다른 방법을 수행하여 식별된 유효 물질이 내인성 표적을 조절하도록 할 수 있습니다.