Name: 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 배우세요 듀얼 글로우 루시페라제 분석법을 활용한 고처리량 기능 검사로 수천 개의 유전자에 대한 전사 조절인자를 신속하게 식별하는 방법입니다. 이 프로토콜은 293T 세포를 사용하여 비용 효율적으로 기능 데이터를 생성합니다.

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우리는 DNA 검사 라이브러리의 준비를 위해 MGH DNA 코어의 존 Darga 감사합니다. 퍼킨 엘머의 크리스토퍼 Chigas 우리 월락 1420 루미 매우 귀중한 지원을 제공했습니다. 스티븐 Ciacco 및 애질런트의 마틴 Thomae은 브라보 로봇에 대한 지원을 제공했다. 우리는 아낌없이 자신의 이중 글로 루시 페라 제 분석 프로토콜을 제공하기위한 NIH에 론 존슨 (Ron Johnson)과 스티브 디도 감사합니다.

실험 개요는 그림 1을 참조하십시오. 1. 알파 synuclein 발기인을 포함하는 리포터 플라스미드를 준비 알파 synuclein 유전자 (그림 2)의 규정 요소는 인트론 2 ~ 3 상류 NACP (아밀로이드 펩티드의 비 베타 구성 요소) 디 뉴클레오티드 반복 서열 1,2에서 대략 10 킬로바이트, 스팬. 우리는이 지역의 일부를 포함 우리 기자의 구조. 우리는 성장이 필요한 특별한 절차 인트론 포함하는 플라스미드는, 아래에 설명 된대로 나타났습니다. 루시퍼 라제 플라스미드, pGL4.10 및 pGL4.75 (도 3), Promega 사에서 시판하고 종래의 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 전달 될 ​​수있다. <ol><li> 표 1의 제조법과 표 2의 프라이머를 사용한 PCR을 별도의 알파 synuclein 촉진제의 2 성분을 증폭한다. </li><li> VERI기 PCR의 TE (트리스-EDTA)의 50 μL의 용출, 제품, QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 아가 로스 젤 및 청소에 제품. 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 용출 0.9 KB 조각을 저장합니다. </li><li> 를 SacI 및 XhoI에, 전체 3.4 킬로바이트 PCR 단편의 양뿐만 아니라 pGL4.10 5 μg 다이제스트. 송아지 소장 알칼리 포스 파타 아제 (로슈)와 벡터를 처리하고 젤 PureLink의 빠른 젤 추출 키트 (Invitrogen 사)를 사용하여 정제. </li><li> T4의 DNA 리가 제 (NEB)을 사용하여 단편 및 벡터를 결찰. 10 ㎕의 TE 버퍼에 용출 PureLink의 PCR 마이크로 키트 (Invitrogen 사)를 사용하여 완성 된 반응을 청소합니다. </li><li> ElectroMAX Stbl4 능력 세포 (Invitrogen 사) 20 ㎕로 청소 연결 반응의 2 μl를 변환하고, 제조업체의 지침에 따라 electroporate. 90 분 동안 225 rpm에서 30 ° C의 배양기에서 흔들어. 100 ㎎ / ㎖의 암피실린을 포함하는 LB 플레이트에 2 볼륨을 확산하고 2 일 동안 30 ° C에서 알을 품다. </li><li> 이쑤시개를 사용하여, TB 2 ㎖ (좋아요 국물)에 접종 4-6 작은 식민지를 선택합니다. 30 ° C의 셰이커 O / N. 이러한 미니 프렙 문화를 성장 </li><li> PureLink의 HiPure 플라스미드 미니 프렙 키트 (Invitrogen 사)를 이용하여 각각의 미니 프렙 배양 1.5 밀리리터부터 플라스미드 DNA를 정제 하였다. </li><li> 을 BamHI과 minipreps을 소화하고 아가 로스 젤에 electrophorese. 올바른 클론 2.8 KB 4.9 KB의 조각을 생성한다. </li><li> 신선한 LB (루리아 국물) 판의 정확한 복제에 남아있는 미니 프렙 문화를 Restreak 2 일 동안 30 ° C에서 성장한다. </li><li> 작은 식민지를 선택하고 1.5 ML의 TB 스타터 문화를 접종. 30 ° C에서 O / N을 흔들어 스타터 문화가 포화 성장하게하지 마십시오. </li><li> 데워진 TB 150 ㎖로 전체 스타터 문화를 희석하고 2 일 동안 30 ° C에서 흔들. 다음 단계로 진행하기 전에 복제가 replicati 중에 변형되지 않았 음을 확인하기 위해 추가로 미니 프렙 소화이 문화의 1.5 ML를 사용<html> 에. </li><li> PureLink의 HiPure 플라스미드 Maxiprep 키트 (Invitrogen 사)를 이용하여 나머지 배양 물로부터 플라스미드 DNA를 정제 하였다. 이 중간 플라스미드의 예상 수익률은 문화 150 ㎖ 당 50 ~ 150 μg이다. </li><li> 단계 1.2에 얼어 0.9 KB 조각을 해동. 1.3 1.12에이를 KpnI 및 SacI로와 대신 소화, 중간 플라스미드에 0.9 KB 조각을 복제하는 단계를 반복합니다. 결찰, 선택, 변환, 상기와 같이 maxipreps에 성장. 을 BamHI로 소화 5.8 킬로바이트 및 2.8 킬로바이트의 조각을 얻을 수 있어야합니다. 이는 화면에 사용될 플라스미드이다. </li></ol> 2. 심사 293T 세포, 리포터 플라스미드 및 라이브러리 DNA를 준비 293T 세포는 처음 96 - 웰 플레이트에 접종하고 다음 날 형질 전환됩니다. 리포터 플라스미드 및 라이브러리 DNA를 96 - 웰 플레이트에 희석된다. 우리는 매사추세츠 종합 병원 (Massachusetts General Hospital에서 DNA 코어에서 형질 급 라이브러리 DNA의 판을 얻​​을= &quot;_blank&quot;를 얻을&gt; dnacore.mgh.harvard.edu). 이 프로토콜은 293T 세포의 동일한 2 판 (그림 1)에 하나의 라이브러리 판을 transfects, 세포 따라서 2 판을 상영하는 각 라이브러리 플레이트에 접종해야한다. 참고 :이 루시 페라 제 분석에 방해가 각각 형질 동안 독성을 증가로, 빨간색 또는 항생제 페놀없이 미디어의 세포를 성장. <ol><li> 각 라이브러리 플레이트를 14 % FBS를 함유하는 DMEM에 1.5 × 105 세포 / ml의 농도로 재현 탁 트립신 293T 세포를 상영하는. 멸균 저수지 (Axygen)에 붓는다. </li><li> 로봇 갑판에 저장, 2 명확한 바닥, 96 - 웰 플레이트 (코닝), 및 필터 피펫 팁의 상자 (애질런트)를 놓습니다. 물론 당 1.5 × 10 4 세포의 밀도, 두 플레이트의 각 웰에 세포를 100 μl를 분배. </li><li> 동등한 있도록 낮은 램프 속도를 사용하여, 2 분간 50 XG에서 셀 플레이트를 원심 분리기각 웰에 걸쳐 세포 밀도. 37 품어 ° C와 10 %의 CO 2 O / N. </li><li> 혈청이없는 배지에서 5 NG / μL로 개똥 벌레와 레 닐라 기자 플라스미드를 희석. 15 ML 원뿔 튜브 (부피 기준) 반딧불 레 닐라 플라스미드에 5:3 비율로 희석을 결합합니다. </li><li> 각 웰에, 도서관 접시 당 17 μL, 플러스 2-10 μL 과잉 분배 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 피펫은 결합 플라스미드. </li><li> 위와 같이 형질 등급 DNA 라이브러리 판을 확보하고 독소가없는 물 33.9 NG / μL로 희석. 물론 당 최소 부피는 28 ㎕를해야한다. </li></ol> 3. 형질을 수행 화면의 2 일에서 기자 플라스미드 및 라이브러리 DNA를 293T 세포에 형질 전환됩니다. <ol><li> 각 라이브러리 플레이트를 들어, 폴리스티렌 튜브에 4.3 ㎖의 혈청이없는 미디어 (1시 40분 희석)와 RT Optifect (인비 트 로젠)의 107.5 μl를 섞는다. 5 RT에서 분, 그리고 알을 품다N 96 - 웰, 폴리스티렌 V-바닥 플레이트 (그레이 너)의 각 웰에 (라이브러리 판 기준) 44 μl를 분배. </li><li> 희석 Optifect의 플레이트, 기자 플라스미드 (단계 2.5), 라이브러리의 DNA (단계 2.6), 로봇 갑판에 피펫 팁 상자를 놓습니다. </li><li> 각각의 열망 사이의 5 μL의 에어 갭을 삽입 기자 플라스미드, 희석 Optifect 43 μL, 도서관 DNA의 26 μL의 17 μL를 대기음. 라이브러리 DNA 교차 오염을 방지하기 위해 마지막으로 발음해야한다. 새로운 폴리스티렌 V 바닥 판에 팁의 내용을 분배, 커버를 혼합, 지질 / DNA 복합체를 형성 할 수 있도록 20 분 동안 방치. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 피펫 팁 및 라이브러리 판을 교체하고 반복합니다. </li><li> Optifect / DNA 혼합물 판을 발견하고 293T 세포의 2 판에 로봇 갑판에 놓습니다. 피펫 팁의 하나의 상자, 대기음 Optifect의 80 μl를 사용 : DNA 혼합물을 천천히 세포의 각 판에 40 μl를 분배. 트랜스 경우여러 라이브러리 판을 fecting, 모든 Optifect를 반복 : DNA 플레이트. 세포를 커버. </li><li> 30 분 동안 1,200 XG에서 셀 플레이트를 원심 분리기. 커버 및 인큐베이터로 돌아갑니다. </li><li> 4-6 시간 동안 세포를 품어. 이 부화하는 동안, 각 형질 라이브러리 판에 10 % FBS 및 10 ㎍ / ㎖의 시프로플록사신 (CellGro)를 포함하는 12 ML의 DMEM을 혼합하여 새로운 미디어를 준비합니다. 멸균 저수지에 신선한 미디어를 붓는다. </li><li> 로봇 팁이 상자를 놓고 세포의 단판, 로봇 데크로 신선한 미디어, 폐기물 저장조를 포함하는 저장조. 대기음 100 세포에서 미디어 μL와 부분적으로 70 % 에탄올로 가득 폐기물 저장소에 분배. 신선한 팁, 새로운 미디어의 대기음 100 μl를 사용하여 천천히 세포에 분배. 세포의 모든 판에 대해 반복합니다. </li><li> 48 시간 동안 인큐베이터에 번호판을 반환합니다. </li></ol> 4. 듀얼 루시 페라 제 분석 실험을 수행 화면의 4 일에,개똥 벌레와 레 닐라 루시퍼 라제 분석이 수행된다. 주 :. 표 3에 설명 된 것처럼 이중 루시퍼 라제 분석은 개똥 벌레 및 레 닐라 luciferases은 따라서 세포가 이전에 루시페라아제 활성을 측정에 용해되어야 분비되지 않으며,이 분석 완충제, 3X 반디 분석 완충액 및 3X 레 닐라 분석 완충액의 순차 첨가를 필요 . 반딧불 분석 버퍼 세포를 lyses과 반딧불 루시 페라 제를위한 기판을 제공 레 닐라 분석 버퍼는 반딧불 신호를 꺼 버리는와 레 닐라 루시퍼를위한 기판을 제공한다. <ol><li> 표 3에 설명 된대로 각 라이브러리 판의 경우, 원액의 3 배 개똥 벌레 분석 버퍼 8 ㎖를 준비하고, 96 - 웰 V-바닥 플레이트의 각 웰에 82 μl를 분배. </li><li> 각 라이브러리 판의 경우에도 3 배 레 닐라 분석 버퍼의 12 ML을 준비하고 96 - 웰 V-바닥 플레이트의 각 웰에 122 μl를 분배. 양 옆으로 설정개똥 벌레와 레 닐라 분석 버퍼. </li><li> 로봇 갑판에 (같은 라이브러리 판에서 형질) 피펫 팁 상자, 폐기물 저장 및 셀의 2 판을 놓습니다. </li><li> 대기음 60 각 판의 용지 μL와 부분적으로 70 % 에탄올로 가득 폐기물 저장소에 버린다. 옆 커버 플레이트 및 설정합니다. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 플레이트의 모든 세트를 반복합니다. </li><li> 2 피펫 팁 상자, 배 개똥 벌레 분석 버퍼의 판, 로봇 갑판에 셀 플레이트 세트를 놓습니다. </li><li> 대기음 40 배 개똥 벌레 분석 버퍼의 μL하고 철저하게 혼합, 세포의 제 1 판에 추가합니다. 새로운 피펫 팁으로 전환, 두 번째 셀 플레이트를 반복합니다. 용해를 완료하는 데 10 분 동안 실온에서 세포를 놓습니다. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 팁, 세포 판의 상자를 교체하고 반복합니다. </li><li> 각 셀의 1 초 동안 기록 루미 접시, 당 우물의 각 우물에서 기록 발광. 로봇에 번호판을 반환갑판. </li><li> 2 피펫 팁 상자, 배 레 닐라 분석 버퍼의 판, 로봇 갑판에 셀 플레이트 세트를 놓습니다. </li><li> 대기음 60 3X 레 닐라 분석 완충액의 μL, 철저히 혼합, 세포의 제 1 플레이트에 추가한다. 피펫 팁의 새로운 상자로 전환, 두 번째 셀 플레이트를 반복합니다. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 전지 판의 모든 세트를 반복합니다. </li><li> 위와 같이 1 초 동안 각 웰을 기록 루미의 모든 플레이트에서 기록 발광. 번호판을 폐기하십시오. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 개똥 벌레를 계산 레 닐라 발광 비율 ( &quot;F : R 비율&quot;) 레 닐라 신호의 개수에 의해 반딧불 신호의 수를 분할하여 각 웰에 대한. </li><li> F 나누어 유도 값을 계산 : 잘 평균 F로 각각의 R 비율 : 판의 R 비율, 우물의 최고 및 최저 25 %를 제외합니다. </li><li> 반복 실험을 통해 유도 값을 평균하나의 형질 라이브러리 플레이트. 세 겹 이상의 알파 synuclein 더 유도하거나 억압 유전자는이 화면에서 &quot;히트&quot;으로 간주하고, 검증 및 보조 화면에 근거합니다. </li></ol>

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</ol>

이 작품은 라이선스 BacMamreagents (미국 특허 5,731,182)에 의해 얻어진 로열티에 의해 지원되었다.

알파 - 시누 클레인은 루이 기관 4, 질병에 대한 pathognomonic 고려 세포 흠의 구성 요소로 파킨슨 병 (PD)에 연루되어있다. 수많은 게놈 넓은 협회 연구는 산발적 PD 5,6,7에 대한 위험 증가와 알파 synuclein의 단일 염기 다형성을 연결했다. 산발적 PD보다 일반적인 있지만, 가족 PD는 또한뿐만 아니라 복제 및 α-synuclein의 궤적 9,10,11의 삼배로, 알파 synuclein 8 돌연변이에 의해 발생할 수 있습니다, 현상은 산발적 PD (12)의 본. 이와 함께,이 연구는 PD의 병인에 알파 synuclein의 중심성을 강화. 이 화면의 목적은 α-시누 클레인 조절 유전자를 확인하고, 따라서 파킨슨 병의 병인에서 역할을 할 수 있었다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 7,670 인간의 유전자를 선별하고 140을 대표하는, 154 예비 안타 (이상 유도를 3 배) 확인고유 한 유전자. 이러한 ...

키 유전자 규제 요소와 그들에 작용하는 요소를 식별 할 수있는 능력은 다양한 생물학적 과정의 탐사를 위해 필수적입니다. 그러나, 특정 신경 세포의 집단으로 희귀 한 종류의 세포에서 유전자의 발현을 조절 요소를 식별, 도전하실 수 있습니다. 여기서, 우리는 α-시누 클레인 (SNCA)의 신규 한 전사 레귤레이터를 식별하기위한 프로토콜을 제시, 파킨슨 질환과 연관 substantianigra에서 도파민 뉴런에서 발현 유전자의 중뇌 compacta 영역 모양체. 우리는 293T 세포에서 α-시누 클레인의 발현을 재조하기 위해 높은 처리량, 이중 - 루시퍼 라제, 시험 관내 리포터 스크린을 사용하여이를 달성. 알파 synuclein 촉진제 우선 개똥 벌레 루시퍼 라제 유전자를 포함하는 리포터 플라스미드로 클로닝된다. 구성 적으로 활성화 된 프로모터의 조절하에 레 닐라 루시퍼 라제를 함유하는 시판되는 플라스미드는 내부 제어로서 기능한다. 살전E 기자의 구조는 각이 잘 단일 라이브러리 플라스미드로 형질되도록, DNA 발현 라이브러리에서 플라스미드와 마이크로 플레이트에 293T 세포에 공동 형질 전환됩니다. 48 시간, 각 리포터 대해 루시퍼 라제 활성을 듀얼 글로우 분석을 사용하여 순차적으로 측정 한 결과. 플레이트 기반 정상화 : (R 비율 F) 각 잘 레 닐라 루시퍼 활동 : 각 라이브러리 유전자에 대한 응답으로 알파 synuclein의 상대적 발현 반딧불의 비율로 유추됩니다. 이 프로토콜은 최소한의 인력 (1-2 명) 및 최소 비용 (마이크로 분석 당 약 3달러 시약 비용)를 사용하여 리포터 유전자를 전사 할 수있는 능력에 대한 유전자의 다수 (~ 주당 2,500)를 선별하는 기능을 제공한다. 유전자 조작에 불응 배양 신경 세포에서 공부하기 어려운 신경 세포의 유전자의 전사 규제 (예를 들어, 알파 - 시누 클레인)은,이 직접 기능 분석에서 나란히 비교 될 수있다. 우리는 우리에 포함프로토콜 우리가 통상적 인 방법 (토론 참조) 재배 할 때이 영역을 포함하는 플라스미드가 불안정한 것을 발견 이후 복제 및 α-synuclein의 프로모터를 포함하는 플라스미드의 성장을위한 자세한 방법. 우리는 또한 높은 처리량 분석을위한 상용 듀얼 루시퍼 라제 시약에 대한 저렴한 대안이 (가) 있습니다. 이 프로토콜은 쉽게 관심의 다른 규정 요소를, 또는 높은 처리량 과도 형질을 필요로하는 프로세스에 대상으로 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>PureLink 퀵 젤 추출 키트</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-12</td><td></td></tr><tr><td>PureLink PCR 마이크로 키트</td><td>Invitrogen</td><td>K310250</td><td></td></tr><tr><td>PureLinkHiPure 플라스미드 Miniprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-03</td><td></td></tr><tr><td>PureLinkHiPure 플라스미드 Maxiprep 키트</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-07</td><td></td></tr><tr><td>Bravo Robot</td><td>Agilent-Robot</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pipet 팁(필터 포함</td><td>) Agilent</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>로봇 피펫 팁(필터 미포함</td><td>) Agilent</td><td>19477-002</td><td></td></tr><tr><td>투명 바닥 96웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3610</td><td></td></tr><tr><td>Reservoirs</td><td>Axygen</td><td>RES-SW96-HP-SI</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 V-바닥 96-웰 플레이트</td><td>Greiner</td><td>651101</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 V-바닥 96-웰 플레이트</td><td>Greiner</td><td>651201</td><td></td></tr><tr><td>접착 플레이트 커버</td><td>CryoStuff</td><td>#FS100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Phusion DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>BAC 2002-D6</td><td>Invitrogen</td><td>2002-D6</td><td></td></tr><tr><td>송아지 장 알칼리성 포스파타제</td><td>Roche</td><td>10713023001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E6931</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX Stbl4 역량 세포</td><td>Invitrogen</td><td>11635-018</td><td></td></tr><tr><td>서브클로닝 효율 DH5&alpha; 유능한 세포</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>페놀 없는 DMEM 레드</td><td>Invitrogen</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Optifect</td><td>Invitrogen</td><td>12579017</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>CellGro</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hydrochloride 분말</td><td>Sigma</td><td>93287</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base 분말 </td><td>Sigma</td><td>93286</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 순수 액체</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>C&#8211; nzyme A</td><td>Nanolight</td><td>309</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Invitrogen</td><td>L2912</td><td></td></tr><tr><td>h-CTZ</td><td>Nanolight</td><td>301</td><td></td></tr><tr><td>PTC124</td><td>SelleckBiochemicals</td><td>S6003</td><td></td></tr></tbody></table>

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

우리는 α-시누 클레인 파킨슨 질환과 관련된 유전자의 전사 레귤레이터를 식별하기 위해 신속하고 저렴하게 높은 처리량 선별 프로토콜을 제시한다. 293T 세포는 일시적으로 한 유전자 당 잘 마이크로 포맷, 함께 루시퍼 라제 리포터 플라스미드로, 배열 ORF 식 라이브러리에서 플라스미드로 형질됩니다. 반딧불 루시 페라 제 활동은 내부 통제 구조 (레 닐라 루시퍼를 연출 HCMV 프로모터)의 표현에 표준화 된 알파 synuclein의 전사,시 각 라이브러리 유전자의 효과를 결정하기 위해 48 시간 후 정량된다. 이 프로토콜은 96 - 웰 형식으로 무균 액체 처리를 수행하는 생물 안전 캐비닛에 동봉 된 벤치 탑 로봇에 의해 촉진된다. 우리의 자동화 된 형질 전환 프로토콜은 높은 처리량 렌티 바이러스 라이브러리 생산 conju 고유 라이브러리 플라스미드 많은 수의 트리플 형질을 필요로하는 다른 기능 검사 프로토콜에 쉽게 적응할 수있다도우미 플라스미드의 일반적인 세​​트 nction. 우리는 또한 저렴하고 검증 된 대안을 제시 PTC124, EDTA, 사전 레 닐라 루시퍼의 측정에 반딧불 루시 페라 제의 활동을 억제하는 피로 인산을 사용 시판, 이중 루시퍼 라제 시약을합니다. 이러한 방법을 사용하여, 우리는 7,670 인간의 유전자를 검사 및 알파 synuclein의 68 레귤레이터을 확인했다. 이 프로토콜은 관심의 다른 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

일반 루시퍼 값, F : R의 비율과 하나의 하프 플레이트 유도 값을 그림 4에 나타내었다 아니라 H2, 32 배 유도에 타격을합니다.. 과도한 독성 (예를 들어, 잘 E3), 또는 가난하게 형질 전환 된 우물을 일으키는 유전자는 모두 개똥 벌레와 레 닐라 luciferases 낮은 값을 생성하지만, 평균 유도 값이됩니다. pGL4 백본과의 상호 작용을 통해, 아마도 루시퍼 라제 활성의 비특이적 유도를 일으키는 유전자는 보통 유도 값의 결과와 동등 반디 레 닐라 luciferases 유도 할 것이다. 반복 실험 사이의 유도 값에 큰 차이는 실행 오류에 대한 의혹을 제기해야합니다. 그것은 발현이 증가의 원인이 클론이 증가 루시 페라 제 활동으로 측정 할 수 있도록 화면이 기자의 분석의 선형 범위 내에서 수행되고 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 우리는 선형성을 검증하기 위해 각 리포터 유전자의 양이 증가 형질우리의 실험 조건에서 기자 분석의 <stro...

우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

이 절차의 전반적인 목표는 간단한 고처리량 transfection 프로토콜과 집에서 만든 dual glow luciferase assay를 사용하여 관심 유전자의 transcriptional regulator를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 고유한 이중 루시퍼라제 리포터 플라스미드 세트를 설계하고 클로닝함으로써 이루어집니다. 이러한 플라스미드는 DNA 발현 라이브러리의 플라스미드를 사용하여 마이크로플레이트에서 2 9 3 T 세포로 cot transfection되며, 각 well은 단일 라이브러리 플라스미드로 transfection됩니다.48시간 후, 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 분석한 후 바닐라 루시페라제 활성을 분석합니다. 마지막 단계는 반딧불이 대 바닐라 루시페라아제 활성 비율을 계산하는 것입니다. 궁극적으로, 각 라이브러리에 대한 반응으로 관심 유전자의 상대적 유도.유전자는 플레이트 기반 정규화 후 각 웰에서 반딧불이 대 바닐라 루시페라제 활성의 비율에 의해 추론됩니다. 기존 리포터 분석 프로토콜에 비해 이 기술의 주요 장점은 최소한의 인력과 비용으로 많은 수의 유전자에 대한 기능 데이터를 신속하게 생성할 수 있다는 것입니다. 스크리닝의 1일째로 지정된 형질주입 하루 전, 2 9 3 T 세포가 96에 안착합니다.웰 플레이트 세포는 크기가 조정되고, 계수되고, 1.5 곱하기 10의 농도로 재현탁되어 밀리리터당 5번째 세포가 됩니다. 14%FBS를 함유한 DMEM에서 세포를 멸균 저장소에 붓습니다. 바닥이 투명한 6개의 웰 플레이트 및 필터 피펫 팁 상자를 자동 액체 분주기의 로봇 데크에 놓습니다.스크리닝할 각 라이브러리 플레이트에 대해 두 개의 셀 플레이트가 장착되어야 합니다. 각 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 세포를 1.5배의 밀도로 웰당 네 번째 셀에 분배합니다. 이 시연에서는 3개의 라이브러리 플레이트가 스크리닝됩니다.따라서 6개의 세포 플레이트를 준비하고 각 웰 전체에서 동일한 세포 밀도를 보장하기 위해 낮은 램프 속도를 사용하여 2분 동안 50배 G에서 세포 플레이트를 원심분리합니다. 이 이미지는 원심분리 후 도금된 셀이 어떻게 보여야 하는지 보여줍니다. 하룻밤 동안 섭씨 37도에서 10%의 이산화탄소로 세포를 배양합니다.반딧불이와 바닐라 리포터 플라스미드를 준비하려면 15ml 원추형 튜브에 내독소가 없는 물에 각각 마이크로리터당 5나노그램으로 희석합니다. 희석액을 5:3 반딧불이와 바닐라 플라스미드의 비율로 부피에 따라 결합합니다. 결합된 플라스미드를 라이브러리 플레이트당 17마이크로리터를 분배하는 96웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고, 각 웰 세포에 2-10마이크로리터를 초과하여 투여하면 스크리닝 2일차에 형질 주입됩니다.각 라이브러리 플레이트에 대해 이 절차를 시작하려면 107.5마이크로리터의 실온 연산 결함을 4.3밀리리터의 무혈청 매체와 혼합하고, 폴리스티렌 튜브에서 1-40 희석을 실온에서 5분 동안 배양하고 라이브러리 플레이트당 44마이크로리터를 96웰 폴리스티렌 v 바닥 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 라이브러리 DNA 플레이트, 희석된 opt effect 플레이트, 리포터 플라스미드 플레이트 및 피펫 팁 상자를 로봇 데크 흡입기에 놓습니다. 17 마이크로리터의 리포터 플라스미드, 43 마이크로리터의 희석된 옵트 효과 및 26 마이크로리터의 라이브러리 DNA는 각 흡인 사이에 5 마이크로리터의 에어 갭을 삽입합니다.교차 오염을 방지하기 위해 라이브러리 DNA를 마지막으로 흡인해야 합니다. 팁의 내용물을 새 폴리스티렌 v 바닥 플레이트 믹스 커버에 분배하고 지질 DNA 복합체가 형성될 수 있도록 20분 동안 따로 보관합니다. 여러 라이브러리 플레이트를 횡단하는 경우 피펫 팁과 라이브러리 플레이트를 교체하고 20분 후에 반복하고 opt effect DNA 혼합물 플레이트를 발견하고 단일 피펫 팁 상자를 사용하여 2 9 3 T 세포의 두 플레이트가 있는 로봇 데크에 놓습니다.opt effect DNA 혼합물을 80마이크로리터씩 흡입하고 각 세포 플레이트에 대해 웰당 40마이크로리터를 천천히 분주합니다. opt 효과 DNA 혼합물이 모든 플레이트의 세포에 추가된 후 세포를 덮습니다. 1, 200회 G에서 30분 동안 플레이트를 원심분리합니다.플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 4-6시간 동안 세포를 배양합니다. 이 배양 중에 10% FBS가 포함된 12ml의 DMEM과 밀리리터당 10마이크로그램의 시프로플록신을 혼합하여 새로운 배지를 준비합니다. 형질주입된 각 라이브러리 플레이트에 대해 새 매체를 멸균 저장소에 붓습니다.다음으로 로봇 팁 상자 2개, 셀 플레이트 1개, 새 매체가 들어 있는 저장소 및 폐기물 저장소를 로봇 데크에 놓습니다. 그런 다음 세포에서 100마이크로리터의 배지를 흡입하고 부분적으로 70% 에탄올로 채워진 폐기물 저장소로 분배합니다. 새로운 팁을 사용하여 100마이크로리터의 새로운 매체를 흡입하고 세포에 천천히 분배합니다.플레이트를 48시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 반딧불이 및 바닐라 루시페라아제 분석이 수행됩니다. 각 라이브러리 플레이트에 대한 스크리닝 4일차에 transfection한 후 48시간 후, 각각의 원액에서 8ml의 3개의 반딧불이 분석 버퍼와 12ml의 3개의 x 바닐라 분석 버퍼를 준비하고, 분석할 각 라이브러리 플레이트에 대해 96웰 V 바닥 플레이트의 각 웰에 82마이크로리터의 반딧불이 분석 버퍼를 분배합니다.유사하게, 122마이크로리터의 바닐라 분석 버퍼를 다른 96웰 V 바닥 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 분석할 각 플레이트에 대해 두 분석 버퍼를 모두 따로 보관합니다. 피펫 팁 상자, 폐기물 저장통 및 동일한 라이브러리 플레이트에서 형질 주입된 두 개의 셀 플레이트를 로봇 데크에 놓고 각 플레이트에서 60마이크로리터의 매체를 흡입하고 70% 에탄올 커버 플레이트로 부분적으로 채워진 폐기물 저장통에 버리고 따로 보관합니다.다음으로 피펫 팁 두 상자를 놓습니다. 3 x 반딧불이 분석 버퍼의 플레이트와 로봇 데크의 셀 플레이트 세트. 40마이크로리터의 3 x 반딧불이 분석 완충액을 흡입하고 세포의 첫 번째 플레이트에 넣고 완전히 혼합합니다.새로운 피펫 팁으로 전환. 두 번째 세포 플레이트에 대해 반복합니다. 세포를 실온에서 10분 동안 놓아 용해를 완료합니다.각 셀 플레이트의 각 웰에서 나오는 발광을 웰당 1초 동안 기록하여 기록합니다. 플레이트를 로봇 데크에 다시 놓습니다. 피펫 팁 상자 2개, 분석 버퍼 3개 플레이트, 셀 플레이트 세트를 로봇 데크에 놓습니다.60마이크로리터의 3 x 바닐라 분석 완충액을 흡입하고 세포의 첫 번째 플레이트에 추가합니다. 철저히 혼합합니다. 새 피펫 팁 상자로 교체.두 번째 세포 플레이트에 대해 반복합니다. 광도계의 모든 판에서 발광을 기록합니다. 각 웰을 1초 동안 녹음합니다.단일 하프 플레이트에 대한 일반적인 루시퍼라제 값이 이 표에 나와 있습니다. 각 웰에 대한 반딧불이 대 갱신 발광 비율 또는 F2 R 비율은 반딧불이 신호의 개수를 런 갱신 신호의 개수로 나누어 계산되며, 그 결과는 패널 C.Panel D에 나타나 있으며, 웰의 F2 R 비율을 플레이트의 평균 F2 R 비율로 나누어 계산된 각 웰에 대한 유도 값을 보여주며, 우물의 가장 높은 25%와 가장 낮은 25%를 제외합니다. 유도 값은 단일 transfection된 library plate에 대한 반복실험 전반에 걸쳐 평균화되어야 합니다.그리고 알파 시누클레인을 3배 이상 유도하거나 억제하는 유전자는 히트로 간주됩니다. 여기에 표시된 이 대표적인 결과에서 웰 H 2에 있는 32 폴드 인듀서는 웰 H 2가 파란색으로 강조 표시된 단일 플레이트에 대한 유도 값을 그래픽으로 표시한 것입니다. Hi.H 2는 알파 synuclein 표정과 이전에 관련되지 않은 neuronal 전사 인자입니다.리포터 분석의 선형 범위 내에서 스크리닝이 수행되는지 확인하는 것이 중요하며, 이를 통해 발현 증가를 유발하는 클론이 강력한 H-C-M-V-I-E one promoter 및 assay의 제어 하에 증가하는 양의 반딧불이 및 바닐라 루시페라제 플라스미드로 transfection됨에 따라 이 말단에 대한 증가된 luciferase 활성을 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 반딧불이 활동이 광범위한 값을 통해 선형으로 유지되는 것이 관찰되었습니다. 바닐라 활성에 대한 곡선은 웰당 15나노그램 이상으로 평평해집니다.또한 기질 고갈로 인한 비선형성을 방지하기 위해 배양 단계 후에 즉시 분석을 수행하는 것이 중요합니다. 반딧불이 루시페라아제 분석에 대한 붕괴 신호의 시간 경과는 이 프로토콜을 사용하여 시약을 첨가한 후 최대 1시간까지 상당한 반딧불이 루시페라제 활성을 나타냈고, 7,670개의 인간 유전자를 스크리닝하고 알파 시누클레인의 68개의 새로운 조절자가 궁극적으로 여기에 표시된 대표적인 결과에서 확인되었습니다. 각 수평선은 통제된 GFP 중립 유도제와 비교하여 단일 유전자 히트의 유도 비율을 나타냅니다.파란색 선은 양성 유도 인자를 나타내고, 유일한 빨간색 선은 억제 인자를 나타내며, 유도 값은 반딧불이 루시페라제 활성을 유도하는 알파 시누클레인 프로모터와 CMV 프로모터를 구동하는 각 히트의 실행 루시페라제 활성의 비율로서 계산되며, 동일한 루시페라제 구축물 분석으로 정규화되고, GFP 유도제를 사용하여 검정을 구성하고, 이 절차에 따른다. 추가 과발현 및 넉다운 분석과 함께 정량적 PCR과 같은 다른 방법을 수행하여 식별된 유효 물질이 내인성 표적을 조절하도록 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기, 우리는 Promega에서 듀얼 GloTM 루시페라제 분석 시스템을 사용 루시페라제 기반 리포터 유전자 접근 방식과 phagocytosis 유발 유전자 발현의 변화를 공부하고 절차를 설명합니다.

루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

Circadian 시계는 개별 세포 내 기능, 즉, 그들은 세포 자율적 있습니다. 여기, 우리는 비 침습적, 루시 페라 기반의 실시간 bioluminescence 기술을 사용하여 셀 자치 클럭 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 리포터 전지는 circadian 생물학을 공부를위한 다루기 쉬운, 기능 모델 시스템을 제공합니다.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

이 비디오에서는 약물의 민감하고 신속한 스크리닝을 위한 생물 발광 분석의 유용성을 강조하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 약물은 단독으로 또는 조합하여 작용 방식의 시너지 효과를 평가할 수 있습니다.

세포 생물 발광 기반 분석법: 조합 약물 스크리닝을 위한 고처리량 방법

이 동영상은 루시페라아제 태그가 지정된 단백질을 정량화하는 데 사용되는 루시페라아제 분석을 보여줍니다. 이 분석은 관심 단백질과 접합된 작은 단편과 결합하는 큰 단편으로 구성된 엔지니어링된 루시페라아제 효소를 사용합니다. 결합된 소단위체는 기질이 있을 때 발광 신호를 방출하는 활성 효소를 형성합니다. 그런 다음 이 신호는 광도계를 사용하여 정량화됩니다.

Luciferase Assay: 엔지니어링된 Nanoluciferase 시스템 기반 바이오리포터를 사용하여 발광 신호를 측정하는 고처리량 분석

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

바이러스 복제를 측정하는 시험 관내 분석에서 크게 루시페라아제 또는 생물 발광 가능한 다른 효소를 발현하는 재조합 RNA 바이러스의 개발에 의해 개선되었다. 여기 세부 홍역 및 화학 도서관에서 폭 넓은 스펙트럼 항 바이러스를 분리하기 Chikungunya의 바이러스와 같은 재조합 균주를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

이 논문은 자동 및 수동 액체 처리기를 사용하여 다양한 RNA 및 DNA 바이러스를 적정하는 고처리량 루시페라제 발현 기반 방법을 제시합니다.

루시 페라 제 발현 재조합 바이러스의 높은 처리량의 적정

여기에서는 세포 기반 리포터 유전자 분석을 3' UTR을 통해 발휘되는 전사 후 제어 메커니즘을 조절하는 화합물에 대한 화학 라이브러리를 스크리닝하는 유용한 도구로 설명합니다.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

전사 인자의 새로운 조절자를 확인하기 위해, 우리는 이중 luciferase 기반 의 전사 기자 분석을 사용하여 배열 된 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 RNAi 라이브러리를 선별하는 접근 법을 개발했습니다. 이 방법은 단일 실험에서 수백 개의 후보를 선별하는 빠르고 비교적 저렴한 방법을 제공합니다.

배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

배우세요 듀얼 글로우 루시페라제 분석법을 활용한 고처리량 기능 검사로 수천 개의 유전자에 대한 전사 조절인자를 신속하게 식별하는 방법입니다. 이 프로토콜은 293T 세포를 사용하여 비용 효율적으로 기능 데이터를 생성합니다.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

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