Name: 높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 배우세요 ChIP-seq을 위한 고품질 염색질 면역 침전 DNA 템플릿 제작 방법을. 교차결합, DNA 단편화, 면역침전, 역교차결합 단계를 통해 TCF7L2 전사인자의 단백질-DNA 상호작용을 게놈 전체에서 분석하는 기술입니다.

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작품은 필라델피아의 아동 병원에서 연구원 개발 포상에 의해 지원됩니다.

1. 상호 링크 염색질 <ol><li> 100x20mm 세포 배양 접시에 세포를 성장. 세포의 양이 1 세포의 종류에 따라 접시 당 1,000 만 셀에 이르기까지 다양하실 수 있습니다. 약 2 백만 세포는 하나의 면역 침전 충분합니다. </li><li> 가끔 흔들 실온에서 10 분 동안 1 %의 포름 알데히드의 가교 세포. </li><li> 상온에서 5 분 동안 125 mM의 글리신과 부화의 최종 농도를 추가하여 상호 연결을 끄다. </li><li> 1X 인산염과 세포를 씻으은 가만히 따르다 PBS, 두 번 식염수 (PBS)를 버퍼, 그리고 PBS의 0.2 ML를 추가합니다. </li><li> microcentrifuge 관에 플라스틱 셀 스크레이퍼 수확 세포. </li><li> 4에서 5 분간 2,000 rpm으로 세포를 스핀 다운 ° C. </li><li> 뜨는을 대기음. 전체 셀에 대한 SDS 용해 버퍼에있는 세포를 resuspend (1 % SDS, 10MM EDTA의 50mm 트리스 - 염산 산도 8.1) 해물이나 핵 추출 펠렛으로 보관하십시오. </li><li> 세포 ° C 또는 하나의 immediat를 진행할 수 -80 저장할 수 있습니다초음파와 엘리. </li></ol> 2. (전체 세포 파쇄물을 위해 3.5 단계로 진행) 핵을 준비 <ol><li> 1X 단백질 분해 효소 억제제 각 실험로 (5 개 mm 파이프 산도 8.0, 85 MM의 KCl을, 0.5 % NP-40) 세포 용해 버퍼를 보충합니다. </li><li> 약 10 배 세포 용해 버퍼 펠릿 볼륨 해동 세포 펠렛을 resuspend을. </li><li> 유 봉 다운스 - 균질화 10 배는 10 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 4에서 5 분 ° C에 대한 4,000 rpm에서 샘플을 원심 분리기, 상층 액을 버리고, 핵 펠렛을 저장합니다. </li></ol> 3. 초음파 * <ol><li> SDS의 용해 버퍼 및 단백질 분해 효소 억제제로 사용되는 버퍼의 보조 금액을 따뜻하게. </li><li> SDS 용해 버퍼를 Resuspend 핵 펠렛 (1-10000000 세포 당 버퍼의 0.5 ML) </li><li> 10 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 의 microcentrifuge 튜브에 샘플 0.5 ML의 aliquots를 추가합니다. </li><li> 초와 45 초 30로 Misonix의 sonicator를 사용하여 젖은 얼음에 초음파 처리오프 2의 진폭 설정에서. 이상적인 조각의 크기 사이클 수를 먼저 다양한 사이클 번호 (예 : 2, 4, 8, 12, 16, 20 이상주기)을 시도하여 확인할 수 있습니다. sonicator의 다른 브랜드는, 그러나, 조건이 달라집니다 사용할 수 있습니다. 주기에 시간의 금액의 번호와 실험 및 해제는 이상적인 조건을 결정하기 위해 수행해야합니다. </li><li> 초음파 결과를 확인하고, 정량화를 수행하기 위해 각 시료 20 μl를 수집합니다. 샘플의 나머지는 -80 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li><li> 0.1X TE 버퍼 30 μl를 추가하여 샘플의 20 μl를 희석. </li><li> RNase가 1 μL로 샘플을 치료 37 1 시간 동안 ° C는 2 시간 동안 62 ° C에서 단백질 분해 효소 K와 부화의 1 μl를 추가합니다. </li><li> 2 % 아가로 오스 겔에 시료 20 μl를 실행합니다. </li><li> 다음 Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 정량화 QIAquick PCR 정화 키트와 샘플의 남은 양을 정화. </li></ol> * 네이티브 치에 대한P, microccocal 핵산의 소화 전단 DNA를에 선택적으로 사용할 수 있습니다. 4. 차단 아가로 오스 비즈 * <ol><li> 구슬이 이미 차단 된 경우, 5.1 단계로 진행합니다. </li><li> 단백질 또는 단백질 G 아가로 오스를 사용합니다. 5 immunoprecipitations를 들어 IPS (), 50 %의 비드 슬러리 (300 μL 비드 펠렛) 600 μl를 사용 </li><li> 구슬을 씻어, 4 ° C에서 1 분간 800 rpm으로 그들을 회전하고 상층 액을 버린다. 추가 약간 더 2보다 ML 칩 희석 버퍼 (0.01 % SDS, 1.2 mM의 EDTA, 167 mM의 NaCl을 1.1 % 트리톤 X-100, 16.7 MM 트리스 - 염산 산도 8.1) 천천히 반전 튜브 10X로 섞는다. 4 ° C에서 1 분간 800 rpm으로 다시 스핀 다운 및 뜨는을 폐기하십시오. 세척 2 번 이상 반복합니다. </li><li> 솔루션을 차단에 4 ° C에서 하룻밤 회전 구슬을 차단합니다. 차단 솔루션의 조리법은 표 1을 참조하십시오. </li></ol> 5. 사전 맑은 염색질 <ol><li> 해동 얼음에 염색질을 초음파. </li><li> 12,000 RPM의 F에서 스핀 다운또는 4시 10 분 ° C 다음 SDS (흰색 펠렛)를 제거하는 즉시 얼음에 넣어. </li><li> 상층 액을 수집, 펠렛을 폐기하고, 필요한 경우 샘플을 결합합니다. </li><li> 계산 (IP 당 염색질의 1-10 UG)에 따라 실험에 필요한 금액을 꺼냅니다. </li><li> 단백질 분해 효소 억제제와 보완 칩 희석 버퍼에 배 염색질을 희석. </li><li> IP 당 차단 구슬의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 1 시간 동안 4 ° C에서 회전합니다. </li></ol> 6. 면역 침전 <ol><li> 1 분간 800 rpm으로 샘플을 스핀 다운과 신선한 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 1 분 다른 깨끗한 튜브로 전송을 위해 800 rpm으로 상등액 스핀 다운. </li><li> -20 ° C.에서 입력 컨트롤 역할을, 상층 액 20 μl를 저장 </li><li> 실험에서 수행 할 IP의 개수로 나누어지는 염색질합니다. </li><li> 각 샘플에 염색질의 1-10 UG 당 항체의 2 UG를 추가합니다. </li><li> 회전 하룻밤 4 ° C를 품어. </li><li> 각 IP 샘플 차단 비즈 100 μl를 추가합니다. </li><li> ° C 회전 4에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 펠릿 1 분 동안 800 rpm으로 스핀 다운 가능한 한 상층 액만큼을 취소하여 구슬. </li><li> 낮은 소금 면역 복합체 세척 버퍼를 한 번 구슬을 씻으십시오. 각 튜브에 버퍼 1 ML을 추가, 5-8 분 동안 상온에서 회전, 1 분 동안 800 rpm으로 스핀 다운 후 상층 액을 버린다. 높은 소금 면역 복합체 세척 버퍼 LiCl을 면역 복합체 세척 버퍼를 한 번 씻어 반복 회 5 세척 (표 2)의 총 TE 버퍼와 함께. </li></ol> 7. 용출 <ol><li> 전날 해동 입력 샘플 eluants으로 처리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 용출 버퍼 신선한 (표 3)을 확인합니다. </li><li> IP를 및 입력 컨트롤 샘플 플러스 1-2 추가 샘플에 필요한 충분한 용출 버퍼의 마스터 믹스를 확인하십시오. </li><li> 각 IP 샘플 100 μL 용출 버퍼를 추가, 15 m에 대하여 상온에서 배양회전합니다. </li><li> 1 분간 800 rpm으로 스핀 다운과 신선한 튜브에 뜨는을 추가합니다. </li><li> 구슬의 각 튜브에 용출 버퍼의 또 다른 100 μl를 추가하고 회전 15 분간 실온에서 알을 품다. </li><li> 부화 후 15 초 동안 소용돌이, 1 분 동안 5,000 rpm으로 스핀 다운, 다음 첫 번째 용출의 상층 액과 상층 액을 결합합니다. (무 상층 액에있는 구슬을 통해이 남아 있는지 확인합니다. 확실하지 않으면 1 분간 5,000 rpm에서 다시 상층 액을 아래로 회전하고 새로운 튜브에 뜨는를 수집합니다. </li><li> 입력 제어 샘플 20 μL로 용출 버퍼 180 μl를 추가합니다. </li></ol> 8. 상호 링크를 역방향 <ol><li> eluants 및 입력 컨트롤의 200 μL에, 5 M NaCl을 8 μl를 추가합니다. </li><li> 65 ° C 하룻밤 물에 목욕 파라 필름 (parafilm)와 부화와 인감 튜브. </li></ol> 9. DNA 정제 <ol><li> 37 1 시간 동안의 RNase의 1 μL 각 샘플을 치료 ° C. </li><li> 4 μ 추가0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 13 μL 1M 트리스 - 염산, 혼합,의 L는 2 시간 동안 45 ° C에서 각각의 샘플과 부화에 단백질 분해 효소 K 1 μl를 추가합니다. </li><li> QIAquick PCR의 정제 키트를 사용하여 샘​​플을 정화. 샘플은 추후에 수행 할 수 있습니다 -20 ° C와 PCR 검사에 저장할 수 있습니다. </li></ol> * 또한, 칩 고급 자석 구슬은 면역 침전 부분에 대한 아가의 장소에서 사용할 수 있습니다. 10. PCR 검사 <ol><li> PCR 검사에 대한 관심의 단백질에 결합하는 것으로 알려져 지역을 위해 프라이머를 사용합니다. 또한, 음성 대조군으로 구속력이 지역의 프라이머를 사용합니다. </li><li> 반응 시약을 혼합합니다. 1:100 (표 3)에서 입력 샘플을 희석. </li><li> 반응을 실행합니다. PCR 프로그램 : </li></ol> 1 단계 : 94 ° C 3 분 2 단계 : 94 ° C 20 초 59 ° C 30 초 72 ° C 30 초 (적어도 30 CYCL에 대해 2 단계를 반복ES) 3 단계 : 72 ° C 2 분 <ol start="4"><li> 1 % 아가 로스 겔에서 샘플을 실행합니다. </li><li> 농축은 실시간 PCR을 정량적으로 측정 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li>
<li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+STAT+nuclear+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).</li>
<li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li>
<li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+between+IFNgamma+and+TLR+signalling+pathways+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Signal integration between IFNgamma and TLR signalling pathways in macrophages.</a> Immunobiology. 211, 511-524 (2006).</li>
<li>Vinkemeier, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+the+message+across%2C+STAT%21+Design+principles+of+a+molecular+signaling+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit.</a> The Journal of Cell Biology. 167, 197-201 (2004).</li>
<li>Brierley, M. M., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stats%3A+multifaceted+regulators+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Stats: multifaceted regulators of transcription.</a> J. Interferon Cytokine Res. 25, 733-744 (2005).</li>
<li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+re-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Whole-genome re-sequencing.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 16, 545-552 (2006).</li>
<li>Grant, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+transcription+factor+7-like+2+%28TCF7L2%29+gene+confers+risk+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 38, 320-323 (2006).</li>
<li>Sladek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+identifies+novel+risk+loci+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes.</a> Nature. 445, 881-885 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wellcome+Trust+Case+Control+Consortium.+Genome-wide+association+study+of+14%2C000+cases+of+seven+common+diseases+and+3%2C000+shared+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li>
<li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li>
<li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li>
<li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li>
<li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li>
<li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations%3A+The+DiaGen+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li>
<li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCF7L2%3A+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li>
<li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+TCF7L2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet.+Med%22%5BJournal%5D)">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li>
<li>Hattersley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+suspect%3A+the+TCF7L2+gene+and+type+2+diabetes+risk%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).</li>
<li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li>
<li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+the+TCF-4+gene+%28TCF7L2%29+to+human+chromosome+band+10q25.3%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li>
<li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li>
<li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li>
<li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+%28TCF7L2%29+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li>
<li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li>
</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

아주 최근에 다른 전사 인자 2,3로 입증되었습니다로서, 지금은 칩 SEQ를 사용하여 단백질 DNA 상호 작용 협회의 게놈 전체 프로필을 수행 할 가능합니다. 성공적으로 시퀀싱 결과의 핵심은 높은 품질의 염색질의 immunoprecipitation의 DNA 템플릿의 세대입니다. DNA 템플릿을 생성하고 적절하게 풍성하게 할 ascertained되면, 하나는 후속 시퀀싱 라이브러리 준비에 걸릴 수 있습니다. 예를 들어, 하나의 공급 업체 일루미나에서 제공하는 시퀀싱 라이브러리 프로​​토콜을 사용할 수 있습니다. 이 라이브러리의 크기 선택은 ~ 200 겔 전기 영동과 DNA의 연속 절단 및 정화하여 수행 할 수 있습니다 - 700 BP의 범위. 크기를 줄이고 젤 정화에서 수집 된 DNA의 크기 범위는 칩 서열의 위치 해상도를 개선하기위한 것입니다 축소. INT의 요소에 바인딩 입력 DNA의 작은 조각에 대한 풍부하여erest, 하나는 해당 사이트의 위치가 해상...

몇 년 동안, 특히 특정 단백질 게놈 넓은 전사 인자 클래스의 사람들에 의해 바인딩 조절 유전자의 집합을 식별하는 unmet 필요가있다. 오돔 등. 1 체계적으로 인간의 간 및 췌장에서 미리 지정된 전사 규제에 의해 점령 유전자를 식별하는 발기인 마이크로 어레이와 함께 염색질의 immunoprecipitation을 (칩)를 사용. 그 후, 존슨 등 2. 종합적으로 전체 포유류의 게놈에 걸쳐 단백질 DNA 상호 작용을 매핑하기 위해 직접 매우 높은 처리량 DNA 시퀀싱 (칩 SEQ)를 기반으로 대규모 염색질 immunoprecipitation의 분석을 개발했습니다. 테스트 케이스로, 그들은 생체 내에서 인간 게놈 1946 년 위치에 신경 제한적인 소음 계수 (NRSF)의 바인딩을 매핑됩니다. 데이터는 내가 모두를 촉진 바인딩 위치 선명한 해상도 (+ 50 염기쌍)를 표시주제 및 NRSF 결합 모티프의 식별 solation. 이 칩 SEQ 데이터는 높은 민감도와 특이도 및 통계적 신뢰도 (P &lt;10 -4), 새로운 후보 상호 작용을 추론에 중요한 특성을 가지고 있었다. 로버트슨 등. 3도 STAT1 대상에 매핑하기 위해 칩 SEQ를 사용하여 인터페론-γ (IFN-γ) 자극 및 생체 내에서 인간의 헬라 S3 세포를 자극받지. 칩 서열, 15.1 및 12,900,000 고유 매핑 순서 읽고, 0.001의 추정 거짓 발견 속도를 사용하여, 그들은 각각 자극과 자극받지 않은 세포에서 41,582 및 11,004 추정 STAT1 결합 영역을 확인했다. STAT1 인터페론 반응 결합 부위 4-8를 포함하는 것으로 알려진 34 유전자 좌의, 칩 SEQ 24 (71 %)를 발견했다. 칩 SEQ 대상은 알려진 STAT1 바인딩 모티프와 유사한 서열에 충실 하였다. 기존의 두 칩 PCR 데이터와 비교 제안 설정이 칩 SEQ 민감도는 70 %와 92 %, 특이도했다 적어도 95 % 사이였다. 또한, 그것은 칩 SEQ 깊이를 연속으로 증가 낮은 분석의 복잡성과 민감성을 모두 제공한다는 것은 분명했습니다. 등 &quot;차세대&quot;게놈 시퀀싱 기술은 9 이전 기술을 통해 생성 된 비용 효율적으로 할 수 순서의 양에 크기가 증가 1-2 주문을 제공하기 때문에. 칩 SEQ 방법은 따라서 직접 포유류 단백질 DNA 상호 작용 3 효과적인 프로파일에 대한 전체 게놈의 범위를 제공합니다. 2006 년 전사 인자 2 7처럼 (TCF7L2) 제 2 형 당뇨병 유전자 변형의 강한 협회는 10 발견되었다. 다른 연구자들은 이미 독립적으로 자연 11,12에 발표 된 제 2 형 당뇨병의 첫 번째 게놈 넓은 협회 연구에서, 흥미롭게도 다른 인종이 발견을 복제하고있다 </s다른&gt; 과학 13 ~ 15 및 16, 17 위로, 강한 협회는 TCF7L2와 참이었다;이 지금은 18 ~ 20 연대를 제 2 형 당뇨병에서 가장 중요한 유전 발견으로 간주됩니다. 또한, TCF7L2은 암 위험 21,22에 연결되었습니다, 대장 암 등 암의 수의 게놈 넓은 협회 연구에 의해 밝혀 8q24 현장은 극도의 상류에 의한 것으로 표시되었을 때 실제로,이 연결은 더 분명되었다 TCF7L2 바인딩 요소는 MYC 23,24의 전사를 운전. 등이 주요 전사 인자에 의해 조절 하류 유전자를 결정에 큰 관심이있다. 방법의 예로 TCF7L2 경험을 바탕으로, 본 논문은 높은 품질의 칩 DNA 템플릿을 생성하는 방법을 설명합니다. 칩은 높은 레솔을 빌드 순서에서 다음 순서를 위해, 대장 암 세포주 HCT116에서 실시되었다복잡한 특성의 병인에있는 그것의 중요한 역할에 추가 통찰력을 얻을 수있는 노력에 TCF7L2 (25)에 의해 구속 유전자의 ution지도.

<table><tbody><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td>, <td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr>, <tr><td>EZ-ChIP 키트</td><td>, Millipore</td><td>17-371</td><td></td></tr>, <tr><td>GoTaq 핫 스타트 중합효소</td>, <td>Promega</td><td>M5001</td><td></td></tr>, <tr><td>Misonix Sonicator</td><td>, Qsonica</td><td>XL-2000</td><td></td></tr>, <tr><td> NanoDrop 1000, 분광 광도계</td><td>, Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Positive control primer sequences (TCF7L2-1) Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' Negative control primer sequences (CTRL-1) Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3' Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td></tr></tbody></table>

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 dna 템플릿의 생성 (칩 seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

염색질의 immunoprecipitation (칩)을 결합하고 대규모 병렬 염기 서열은 생체 내 전사 인자에 의해 구속 포유류 DNA 서열의 레퍼토리를 식별하기 위해 활용 될 수있는 칩 시퀀싱 (칩 SEQ) 방법은 직접 전체 게놈 범위를 제공합니다. &quot;다음 세대&quot;게놈 시퀀싱 기술은 할 수 순서의 양에 크기가 증가 1-2 순서를 제공하는 비용 효율적 따라서 직접적으로 포유류의 효과적인 프로파일에 대한 전체 게놈의 범위를 제공하는 칩 SEQ 방법을 허용하는 오래된 기술을 통해 생성 단백질 DNA 상호 작용. 성공적인 칩 서열 방식의 경우, 하나는 고품질의 칩 DNA 템플릿 최적의 시퀀싱 결과를 얻기 위해 생성해야합니다. 설명이 가장 강하게 제 2 형 당뇨병, 즉 전사 인자의 전사 인자 2 7처럼 (TCF7L2의 병인에 관여하는 유전자의 단백질 제품과 경험을 기반으로합니다). 이 요소는 각종 암에 연루되어있다. 설명은 병인의 핵심 역할에서 더 통찰력을 제공, TCF7L2 구속 유전자를 확인하는 순서를 통해 고해상도지도를 구축하기 위해 대장 암 세포주 HCT116에서 파생 된 고품질의 칩 DNA 템플릿을 생성하는 방법입니다 복잡한 특성의.

염색질은 초음파되어 RNase의와 단백질 분해 효소로 처리되고 나면, 2 % 아가로 오스 겔에서 실행되는 샘플은 원하는 크기의 DNA 대량으로 얼룩을 제시해야한다. 여러 가지 사이클을 테스트하는 경우 크기가 점차 감소 사이클 수가 증가 (그림 2)로 볼 수 있어야합니다. 프로토콜의 면역 침전 부분을 완료 한 후 농축은 어느 PCR 또는 실시간 PCR 확인할 수 있습니다. 아가로 오스 겔에서 실행 PCR 샘플 입력 및 칩 대역 (이 경우 TCF7L2입니다 관심 단백질에 대한 항체를 사용하여) 샘플 차선 아무것도 또는 대부분에서,에서 매우 희미한 밴드 (잡음)가 있어야합니다 긍정적 인 바인딩 영역에 대한 IgG의 (음수) 제어 레인입니다. 음 바인딩 지역의 매우 희미한 또는 IgG의 제어 및 칩 차선 없음 대역이 있어야합니다. 입력 차선 (그림 3)의 대역이 있어야합니다. <html><p class="jove_c...

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 크로마틴을 통해 단백질 결합 부위를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 단백질을 DNA에 가교 결합시킨 후, 두 번째 단계로 DNA를 전단하여 수행합니다.다음으로, DNA가 결합된 표적 단백질을 면역 침전시킨 후 용출합니다. 마지막 단계는 가교 결합을 해제하고 DNA를 분리하는 것입니다. 궁극적으로, 염색질 면역침전법은 게놈 전체에 걸친 단백질 결합의 위치를 나타내는 데 사용됩니다.이 방법은 특정 조직 또는 세포주에서 단백질-DNA 상호작용을 식별하고 매핑하는 것과 같이 기능 유전체학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 실험을 위한 세포는 100 x 20 mm 세포 배양 접시에서 배양합니다. 세포 수는 세포 유형에 따라 접시당 100만 개에서 1,000만 개까지 다양할 수 있습니다. 세포 내의 단백질과 크로마틴을 가교결합시키기 위한 1회 면역침전에는 약 200만 개의 세포면 충분합니다.포름알데히드를 1%가 되도록 첨가하고, 가끔씩 흔들어주며 상온에서 10분 동안 배양합니다. 글라이신을 최종 농도 125 millimolar가 되도록 첨가하고 5분 동안 배양하여 가교 결합을 중단시킵니다. 상온에서 1 x 인산 완충 식염수로 세포를 2회 세척합니다. 두 번째 세척 후 PBS를 따라내고 신선한 PBS 0.2 milliliters를 첨가합니다. 플라스틱 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확해 미세 원심 분리 튜브에 옮깁니다. 4 °C에서 2000 RPM으로 5분 동안 원심 분리하여 세포를 침전시킵니다.핵 추출을 위해 상층액을 흡입하여 제거합니다. 다음 세그먼트에서 시연할 전세포 용해물(whole cell lysate) 준비를 위해 세포를 펠렛 상태로 유지하십시오. SDS 용해 버퍼로 세포를 재현탁합니다. 가교 처리된 세포로부터 전세포 용해물은 얼음 위에서 초음파 처리를 통해 준비합니다.이상적인 DNA 단편 크기를 얻기 위해, 다양한 초음파 처리 조건을 시도하여 이 절차를 최적화해야 합니다. 모든 시료는 절차 전 과정 동안 얼음 위에 유지해야 합니다. 각 시료를 진폭 설정 2에서 30초 작동 및 45초 정지 설정으로 초음파 처리하십시오.이 예시에서는 이상적인 단편 크기를 얻기 위해 12회의 사이클이 필요합니다. 초음파 처리 결과를 확인하고 정량 분석을 수행하기 위해 각 샘플에서 20 µL를 수집하십시오. 나머지 샘플은 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.20 µL 샘플에 0.1 XTE 버퍼 30 µL를 추가하여 희석합니다. 그 다음, 1 µL의 RNAs A를 넣고 37 °C에서 1시간 동안 처리합니다. 이어서, 1 µL의 proteinase K를 추가하고 62 °C에서 2시간 동안 배양합니다.Proteinase K 처리 후, 샘플 20 µL를 2% agarose 겔에 전기영동합니다. 샘플은 DNA의 대부분이 원하는 크기에 위치한 스미어(smear) 형태로 나타나야 합니다. 여러 다른 사이클을 테스트한 경우, 크기가 점차 감소하는 것이 관찰되어야 합니다.사이클 수가 증가함에 따라, 남은 시료 양을 kaya quick PCR purification kit로 정제하고 NanoDrop spectra of TER를 사용하여 정량한 후 이 절차를 시작합니다. 얼음 위에서 초음파 처리한 chromatin 시료를 4°C에서 12,000 RPM으로 10분 동안 원심 분리합니다. 즉시 얼음 위에 둡니다.흰색 침전물로 나타나는 SDS를 제거합니다. 각 샘플에서 상층액을 수집하고 침전물은 폐기합니다. 필요에 따라 샘플을 합치고, 이전 계산을 바탕으로 실험에 필요한 양을 따로 보관합니다.면역침강당 1~10 µg의 크로마틴이 필요합니다. 단백질 분해 효소 억제제가 첨가된 희석 완충액으로 크로마틴을 1:10으로 희석하십시오. 면역침강당 100 µL의 블로킹된 항체 비즈를 추가하고 4 °C에서 1시간 동안 회전시키십시오.샘플을 4°C에서 800 RPM으로 1분간 원심 분리하여 상층액을 새로운 튜브로 옮김으로써 염색질 면역침강법 절차를 시작합니다. 상층액을 800 RPM으로 1분간 다시 원심 분리하고 또 다른 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 입력 대조군(input control)으로 사용하기 위해 상층액 20 µL를 -20°C에서 보관합니다.그 후, 실험에 필요한 면역침전 횟수에 맞추어 남은 크로마틴을 분분취합니다. 각 샘플에 크로마틴 1~10 µg당 2 µg의 항체를 첨가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 회전시키며 배양합니다. 다음 날 아침, 각 면역침전 샘플에 블로킹 처리된 aros 비즈 100 µL를 첨가합니다. 4 °C에서 1시간 동안 회전시키며 배양합니다.800 RPM에서 1분간 원심분리하여 비드를 펠렛화합니다. 상층액을 가능한 한 많이 제거합니다. 비드를 세척합니다.저염 면역 복합체 세척 버퍼를 사용하여 각 튜브에 버퍼 1 mL를 추가합니다. 실온에서 5~8분 동안 회전시킨 후 800 RPM에서 1분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후, 고염 면역 복합체 세척 버퍼로 1회, 염화 리튬 면역 복합체 세척 버퍼로 1회, 그리고 TE 버퍼로 2회, 총 5회 세척합니다. 이어서, 각 면역침전 시료 및 입력 시료로부터 DNA를 용출합니다.교차 결합을 해제하려면, 각 용출액(elu)과 입력 대조군(input control) 200 µL에 5 M NaCl 8 µL를 첨가하십시오. 튜브를 파라필름으로 밀봉하고 65 °C 항온 수조에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 각 샘플을 RNase A 1 µL로 37 °C에서 1시간 동안 처리하십시오.1시간 후, 각 샘플에 0.5 molar EDTA 4 µL와 1 molar tris HCL 8 µL를 첨가하고 혼합합니다. 그다음 proteinase K 1 µL를 첨가하고 45 °C에서 2시간 동안 배양합니다. kaya quick PCR purification kit를 사용하여 샘플을 정제합니다.샘플은 PCR로 분석하기 전까지 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 크로마틴 면역침전(chromatin immunoprecipitation)을 통한 농축 여부는 PCR 또는 실시간 PCR(real-time PCR)로 확인할 수 있습니다. PCR 샘플의 경우 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동을 통해 확인하며, 관심 단백질(본 실험의 경우 전사 인자인 TCF7L2)에 대한 항체를 사용했을 때 input 및 chip 샘플 레인에 밴드가 나타나야 합니다. 이와 대조적으로, 양성 결합 부위에 대한 IgG 음성 대조군 레인에서는 밴드가 없거나 기껏해야 매우 희미한 밴드만 나타나야 합니다.음성 결합 영역의 경우, IgG 대조군 및 칩 레인에서는 밴드가 매우 희미하거나 전혀 나타나지 않아야 합니다. 입력(input) 레인에서는 밴드가 나타나야 합니다.이 그림은 실시간 PCR로 분석한 동일한 샘플의 결과를 보여줍니다. 이전 결과와 마찬가지로, 칩 샘플의 양성 결합 영역은 IgG 대조군에 비해 유의미한 배수 농축(fold enrichment)을 보여야 합니다.또한, 음성 결합 영역에서의 농축은 거의 없거나 매우 적어야 합니다. 이 영상을 시청하신 후에는 조직이나 세포주에서 결합 단백질을 염색질에 가교 결합시키는 방법, 즉 표적 단백질을 침전시킨 후 추가 분석을 위해 DNA를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

히 - C 방식은 염색질 상호 작용 (1) 편견, 게놈 차원의 식별이 가능합니다. 히 - C의 커플 근접 결합 및 대규모 병렬 시퀀싱합니다. 그 결과 데이터가 여러 스케일에서 게놈 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 : 초기 결과는 같은 염색체 지역, 개방적이고 닫힌 염색질의 분리 및 megabase 규모의 염색질 구조와 같은 기능을 확인.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

이 비디오에서는 단백질 결합 염색질 단편의 선택적 면역침전을 통해 희소돌기아교세포 전구체 세포의 게놈 DNA의 특정 영역에서 단백질 결합 부위를 식별하는 염색질 면역침전 기술을 보여줍니다. 이 방법은 유전자 조절에 관여하는 전사 인자를 포함한 여러 조절 단백질의 상호 작용을 연구하는 데 도움이 됩니다.

게놈 DNA의 표적 단백질 결합 부위를 확인하기 위한 크로마틴 면역침전(chromatin immunoprecipitation)

생체 내 단백질-DNA 상호 작용 매핑 방법은 게놈 연구의 모든 측면에서 중요해지고 있지만 힘들고 비용이 많이 들며 시간이 많이 걸립니다. 여기에서는 제한된 양의 세포와의 생체 내 단백질-DNA 상호 작용을 매핑하기 위해 염색질 면역침전을 자동화하는 상업적으로 이용 가능한 로봇 액체 처리 시스템이 제시됩니다.

칩 서열 실험을 자동화하면 10,000 헬라 세포에 성적인 프로필을 생성합니다

선물이 nucleosome 밀도 칩 seq 분석 프레임 워크를 통합 하는 micrococcal nuclease (MNase) 접근에 대 한 적합 한 시퀀스 데이터 집합의 세대에 대 한 (칩 seq) 방법론을 시퀀싱 수정된 네이티브 chromatin immunoprecipitation 히스톤 수정 측량와.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

여기에 우리가 현재 낮은 셀 chromatin immunoprecipitation (칩)를 수행 하 여 분석 하는 게놈 넓은의 바인딩을 oligodendrocyte 녹음 방송 요인 2 (Olig2) 심하게 정화 뇌 oligodendrocyte 선구자 세포 (OPCs) 하도록 설계 된 프로토콜 도서관 준비, 높은 처리량 시퀀싱 및 bioinformatic 데이터 분석.

PDGFRα + 셀 낮은 셀 Chromatin Immunoprecipitation 시퀀싱 분석에 의해 정화에 녹음 방송 요인 Olig2 게놈 바인딩 사이트를 심하게 식별

탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

이 논문은 ChIP 액체 처리기 플랫폼을 사용하여 특정 히스톤 수정(H3K27ac)과 관련된 DNA 영역의 반자동 마이크로스케일드 ChIP-Seq 프로토콜을 설명하고 태그를 사용하여 라이브러리 준비를 수행합니다. 이 절차는 품질 및 수량 목적에 대한 제어 평가를 포함하고 다른 히스톤 수정 또는 전사 요인에 채택 될 수있다.

대규모 후생유전학 연구를 위한 반자동 ChIP-Seq 절차

이 프로토콜은 위상 연관 도메인(TAD)의 경계 및 조절 및 기타 DNA 서열 요소 간의 장거리 염색질 상호 작용을 포함하여 고해상도에서 메가 기반 크기의 표적 게놈 영역의 3D 조직을 특성화하는 데 사용되는 Capture Hi-C 방법을 설명합니다.

Capture Hi-C를 통한 고분해능 3D 염색질 조직 해독

배우세요 ChIP-seq을 위한 고품질 염색질 면역 침전 DNA 템플릿 제작 방법을. 교차결합, DNA 단편화, 면역침전, 역교차결합 단계를 통해 TCF7L2 전사인자의 단백질-DNA 상호작용을 게놈 전체에서 분석하는 기술입니다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

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