닭의 배아 척수 코드 슬라이스 문화 프로토콜

이 절차의 전반적인 목적은 닭 배아 절편을 배양하여 정상적인 신경 세포, 특히 척추 운동 신경 세포의 발달을 유지하는 것입니다. 이것은 먼저 닭 배아를 해부하여 내장 기관을 제거함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 아가로 블록에 박힌 배아를 준비하고 자르는 것입니다.

다음으로, 배아 절편을 수혈관에서 조심스럽게 제거합니다. 마지막 단계는 배아 절편을 배양 배지로 옮기는 것인데, 배양 배지는 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양됩니다. 궁극적으로, 배아 절편의 얇은 부분에 대한 면역형광 현미경 검사는 배양 기간 이후 척추 운동 뉴런의 존재와 위치를 보여주는 데 사용됩니다.

따라서 이 방법은 발달 신경생물학 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 척추 운동 뉴런 이동에 관여하는 메커니즘과 분자가 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 프로토콜의 해부 단계에서 많은 주의가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

가장 긴 면이 있는 수정란 10개를 햄버거와 해밀턴 24단계로 발달할 때까지 섭씨 38도의 강제 통풍 인큐베이터에 수평으로 놓습니다. 이것은 일반적으로 약 4일의 부화가 필요합니다. 배양 2일째는 70% 에탄올을 적신 티슈 페이퍼로 닦아 난각을 살균하고 5ml 주사기에 부착된 21게이지 바늘을 사용하여 난각의 평평한 끝을 조심스럽게 뚫고 5ml의 알부민을 제거합니다.

이렇게 하면 배아가 껍질에서 멀어지므로 껍질이 열렸을 때 배아가 손상되지 않습니다. 알을 인큐베이터에 다시 넣고 이틀 더 부화시킵니다. 이틀이 지나면 blunted를 사용합니다.

더 많은 일을 하세요. 다섯 번째, 껍질의 상단 중앙을 조심스럽게 뚫고 약 9cm 정사각형의 껍질을 제거하는 집게. 배아 주위를 자르고 배아를 조심스럽게 들어 올려 HBSS에 넣습니다.

해부용. 사용되는 모든 배아는 24기에 가까워야 합니다. 기형의 징후를 보이는 배아는 모두 폐기해야 합니다.

배아가 들어 있는 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 두 개의 du al number five 집게를 사용하여 양막을 제거합니다. chorio Alan은 막으로, Alan Tous 및 머리는 배아의 복부 정중선을 열기 위해 마이크로 해부 가위를 사용하여 배아를 내장하고 모든 내부 장기를 제거합니다.

그런 다음 한 쌍의 집게로 배아 몸통 부위 주위에 배아를 잡습니다. 장과 심장의 로스트랄 부분을 잡고 당깁니다. 분기별. 배아 소미를 명확하게 볼 수 있어야 합니다.

이제 현저해부 가위를 사용하여 흉부 벽을 다듬습니다. 다음으로, 배아를 위쪽과 아래쪽 다리 싹 사이에서 가로로 반으로 자릅니다. 두 개의 집게를 사용하여 절개 용액에서 배아를 요람으로 만들고 약 5cm의 일회용 파스타 피펫을 사용하여 마른 페트리 접시에 넣기 위해 절개된 배아의 요추 절반을 부드럽게 제거합니다.

바닥에서 잘라 내고 부피 당 약 2 밀리리터의 용융 4 % 중량을 흡입합니다. PBS 피펫의 아로스는 배아 위에 약 0.5 밀리리터의 아로스를 얹은 다음 배아 조각을 피펫으로 빨아들입니다. 배아와 아로스를 아로스에 기포가 생기지 않도록 벗겨낸 플라스틱 틀로 옮깁니다.

흉부 부분이 아래를 향하도록 하여 플라스틱 틀의 배아를 아로스 바닥으로 부드럽게 내리고 25 게이지 바늘을 사용하여 배아가 곧게 펴지도록 합니다. 아그로스에는 또한 발달 중인 팔다리의 일부가 포함되어 있으며, 배아를 아로스에 수직으로 배치하여 플라스틱 주형이 약 2분 동안 얼음 위에 놓일 수 있도록 하는 것이 중요합니다. aros를 설정하려면 이 기간 동안 배아의 방향이 변경되지 않도록 주의하십시오.

VT 1000 S foma와 유사하게 설정하여 챔버가 HBSS로 채워지고 얼음으로 둘러싸이도록 합니다. 차가운 물. 슈퍼 글루를 사용하여 aros 블록을 Vibram 플랫폼에 고정한 다음 면도날로 블록을 다듬어 배아 조각을 둘러싼 1-3mm의 aros를 남깁니다.

비브라토를 시작하고 배아를 자르기 시작합니다. 맑은 정점 전극 융기가 있는 사지 싹 절편을 포함하는 절편을 선택한 다음 HBSS 접시로 옮깁니다. 일반적으로 배아당 적합한 절편은 1-2개에 불과합니다.

두 개의 바늘을 사용하여 조직 조각 주위의 아가로스를 부드럽게 제거합니다. 이것은 철저하고 신중하게 수행되는 것이 중요합니다. 500 마이크로리터의 배양 용액을 24 웰 초저 부착 조직 배양의 필요한 웰 수에 추가합니다.

HBSS 용액에서 웰로 슬라이스를 조심스럽게 옮기고 각 웰에 2개 또는 3개의 슬라이스를 배치한 다음 24웰 플레이트를 5% 이산화탄소와 함께 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에 24시간 동안 배치하고 배아 슬라이스의 각 웰에 완충되지 않은 고정 500마이크로리터에서 20분 동안 얼음 위에 둡니다. 그런 다음 총 용액을 조심스럽게 흡입하고 5분 간격으로 PBS에서 3회 세척합니다. 그런 다음 PBS의 자당 30%를 웰에 넣고 슬라이스가 가라앉을 때까지 약 6시간 동안 접시를 섭씨 4도에 놓습니다.

조각이 가라앉은 후 조각을 깨끗한 10cm 페트리 접시로 옮기고 여분의 자당 용액을 두드리십시오. 그런 다음 OCT 1ml를 넣고 섭씨 20도에서 5분 동안 평형을 이룹니다. OCT로 채워진 각 슬라이스를 평평하게 장착하고 장착 후 플라스틱 금형을 벗겨냅니다.

드라이아이스 위에 주형을 수직으로 올려 굳히고, OCT 블록을 저온 유지 장치에 장착한 다음 약 20분 동안 섭씨 영하 24도에서 블록을 평형을 이룹니다. 그런 다음 각 조각을 15미크론 섹션으로 자르고 슈퍼 프로스트와 슬라이드에 장착합니다. 슬라이드는 프로토콜의 텍스트 부분에 설명된 대로 면역 형광 염색에 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있으며, 이 이미지는 햄버거와 해밀턴 스테이지 24에서 측면 운동 컬럼의 생성 상태를 보여줍니다.

측면 운동 기둥의 측면 분할은 왼쪽 패널에서 LH X one staining으로 시각화됩니다. 측면 모터 기둥은 중앙 패널에서 Fox P 1로 염색하여 시각화하고 오른쪽 패널은 두 채널의 병합입니다. 정중선은 점선으로 표시되고 DV는 여기에서 등쪽 복부 축을 나타냅니다.

측면 운동 기둥의 측면 분할 상태는 LH X, 왼쪽 패널에 하나의 염색, 측면 모터 기둥에 의해 다시 표시되며, Fox P에 의해 1 개의 염색, 중간 패널에 하나의 염색, 오른쪽에 병합 된 이미지가 있습니다. 이 이미지는 27 단계의 발달을 보여줍니다. 이 이미지는 왼쪽의 LH X 1개 발현과 해리된 두개골 운동 뉴런 세포 생존을 지원하는 배지에서 배양된 슬라이스 섹션의 중간 패널에 있는 Fox P 1개의 발현을 보여줍니다.

LH X 1은 더 이상 운동 뉴런에서 발현되지 않지만, Fox P one 발현에 의해 입증된 LMC 세포의 일부 생존이 있습니다. DV는 척수의 배쪽 배쪽 축의 방향을 나타내고 ML은 척수 외측 운동 기둥의 매체 측면 축의 방향을 나타냅니다. 왼쪽 패널의 복부 뿔에서 LH X 1로 다시 염색된 측면 분열 세포와 중앙 패널에서 Fox P 1에 대해 일반적으로 염색된 LMC는 4%chick serum 및 밀리리터 CNTF당 100나노그램을 함유하는 배지에서 배양된 슬라이스에서 관찰할 수 있습니다.

일부 lateral motor column lateral division cell은 왼쪽 패널의 화살표로 표시된 것처럼 복부 뿔의 측면 위치에서 발견됩니다. 이 이미지는 이전에 표시된 배아의 절편 배양 동안 OVO에 보관된 배아의 단면에서 LH X one 및 Fox P one의 발현 상태를 보여줍니다. 이 히스토그램은 FOX P 1 양성 및 LHX 1 양성 염색 및 측면 운동 열 세포 염색 (FOX P 1 양성 및 LHX 1 염색)과 FOX P 1 양성 염색 및 LHX 1 염색 Lateral Motor Column Cells 의 백분율 정량 분석 결과를 보여줍니다.

난자에 보관된 대조 배아와 다른 조건에서 절편 배양에서 발견된 세포에 대한 음성 데이터가 표시되었으며, 이는 100% 데이터를 나타내며 학생 T-test를 사용하여 분석했습니다. 삼중 별표는 이 프로토콜을 시도하는 동안 0.01 미만의 유의 수준을 나타냅니다. 배아를 해부할 때와 절편에서 아그로스를 제거할 때 주의하는 것이 중요한데, 이는 사지 싹에 있는 운동 축삭돌기의 무결성을 유지하는 것이 중요하기 때문입니다.