닭의 배아 척수 코드 슬라이스 문화 프로토콜

본 실험 절차의 전체적인 목적은 닭 배아 절편을 배양하여 정상적인 신경 발달, 특히 척수 운동 신경세포의 발달을 유지하는 것입니다. 이를 위해 먼저 닭 배아를 해부하여 내장 기관을 제거합니다. 두 번째 단계로는 아가로스 블록에 매립된 배아를 준비하고 절편으로 만드는 과정을 수행합니다.

다음으로, 배아 절편을 아가로(agarro)에서 조심스럽게 제거합니다. 마지막 단계는 배아 절편을 배양액으로 옮겨 37 °C에서 24시간 동안 배양하는 것입니다. 최종적으로, 배양 기간 후 배아 절편의 박절편에 대해 면역형광 현미경 관찰을 수행하여 척수 운동 신경세포의 존재와 위치를 확인합니다.

따라서 이 방법은 발달 신경생물학 분야의 핵심적인 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 척수 운동 신경세포 이동에 관여하는 기전과 분자 등이 이에 해당합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 프로토콜의 박리 단계에서 세심한 주의가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

수정란 10개를 가장 긴 면이 수평이 되도록 배치하여 38 °C의 강제 대류 배양기에 넣고, 햄버거 단계(hamburger stage) 및 Hamilton 단계 24까지 발달할 때까지 배양합니다. 이는 보통 약 4일간의 배양이 필요합니다. 배양 2일째에 70% Ethanol을 적신 티슈 페이퍼로 달걀 껍데기를 닦아 멸균한 후, 5 mL 주사기에 연결된 21 gauge 바늘을 사용하여 달걀 껍데기의 평평한 끝부분을 조심스럽게 뚫고 알부민 5 mL를 제거합니다.

이렇게 하면 배아가 껍질로부터 떨어지게 되어 껍질을 열 때 배아가 손상되지 않습니다. 알을 배양기로 다시 옮겨 2일 더 배양합니다. 2일이 지나면 끝이 뭉툭한 도구를 사용하십시오.

다음 단계를 수행합니다. 다섯 번째로, 포셉을 사용하여 껍질의 상단 중앙을 조심스럽게 뚫고 약 9 cm² 크기의 껍질을 제거합니다. 배아 주변을 절개한 후 배아를 조심스럽게 들어내어 HBSS에 넣습니다.

해부를 위해 사용합니다. 사용되는 모든 배아는 24단계에 가까워야 합니다. 이상 징후가 보이는 배아는 모두 폐기해야 합니다.

배아가 담긴 디쉬를 해부 현미경 아래에 둡니다. 두 개의 5번 듀얼 핀셋을 사용하여 양막을 제거합니다. 융모양막, 난황낭 및 머리 부분을 제거하고, 미세 해부 가위를 사용하여 배아의 복측 정중선을 절개함으로써 모든 내부 장기를 제거하기 위해 배아를 적출합니다.

그런 다음 핀셋 한 쌍으로 배아의 주둥이 쪽 몸통 부위를 잡습니다. 장의 앞부분과 심장을 잡고 당깁니다. 4분기별로 수행합니다. 그러면 배아의 체절을 명확하게 관찰할 수 있습니다.

이제 미세해부 가위로 흉부 체벽을 다듬습니다. 다음으로, 상지와 하지 싹 사이를 가로 방향으로 절단하여 배아를 절반으로 나눕니다. 두 개의 핀셋을 사용하여 해부된 배아의 요추 부분을 조심스럽게 들어 올려 해부 용액에서 꺼낸 후, 약 5cm 길이의 일회용 파스퇴르 피펫을 이용해 건조한 페트리 접시에 옮깁니다.

하단에서 절단한 후, 약 2 mL의 용융된 4% w/v agarose를 흡입합니다. PBS에 희석한 agarose 약 0.5 mL를 배아 위에 분주한 다음, 배아 조각을 피펫으로 빨아들입니다. agarose 내에 기포가 생기지 않도록 주의하며 배아와 agarose를 박리형 플라스틱 몰드로 옮깁니다.

배아의 흉부 단면이 아래를 향하도록 하여 플라스틱 몰드 내의 아가로스 바닥으로 조심스럽게 내린 다음, 25게이지 바늘을 사용하여 배아가 일직선이 되었는지 확인합니다. 아가로스에는 발달 중인 사지의 일부도 포함되므로, 이를 위해 배아를 수직으로 배치하는 것이 중요합니다. 플라스틱 몰드를 약 2분 동안 얼음 위에 둡니다. 아가로스를 굳히는 동안 배아의 방향이 바뀌지 않도록 주의하십시오.

챔버가 HBSS로 채워지고 얼음물로 둘러싸이도록 VT 1000 S와 유사하게 장치를 설정합니다. 순간접착제를 사용하여 agarose 블록을 Vibram 플랫폼에 고정시킨 다음, 면도날로 블록을 다듬어 배아 조각 주변에 1~3 mm의 agarose가 남도록 합니다.

진동 절단기를 작동시키고 배아를 절단하기 시작합니다. 명확한 정단 외배엽 능선(apical ectodermal ridge)이 포함된 사지 싹(limb bud) 부위가 포함된 절편을 선택하여 HBSS가 담긴 디쉬로 옮깁니다. 일반적으로 배아당 적절한 절편은 1~2개 정도입니다.

두 개의 바늘을 사용하여 조직 슬라이스 주변의 agarose를 부드럽게 제거합니다. 이 과정은 철저하고 세심하게 수행하는 것이 매우 중요합니다. 24 well 초저부착(ultra low attachment) 조직 배양 플레이트의 필요한 수의 well에 500 µL의 배양액을 첨가합니다.

슬라이스를 HBSS 용액에서 웰로 조심스럽게 옮겨 각 웰에 2~3개의 슬라이스를 넣은 후, 24웰 플레이트를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 조직 배양 인큐베이터에 24시간 동안 둡니다. 배양 기간이 끝나면 각 배아 슬라이스 웰에 500 µL의 비완충 고정액을 넣고 얼음 위에서 20분 동안 둡니다. 그다음 전체 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 PBS로 5분 간격으로 3회 세척합니다. 이후 웰에 PBS 내 30% sucrose를 추가하고, 슬라이스가 가라앉을 때까지 4 °C에서 약 6시간 이상 둡니다.

절편들이 가라앉으면, 절편들을 깨끗한 10 centimeter 페트리 접시로 옮기고 과도한 sucrose 용액을 닦아냅니다. 그런 다음 1 milliliter의 OCT를 첨가하고 20 degrees Celsius에서 5분 동안 절편들을 평형 상태로 둡니다. 각 절편을 OCT가 채워진 박리형 플라스틱 몰드에 평평하게 고정시킨 후, 고정이 완료되면 몰드를 제거합니다.

드라이아이스 위에 몰드를 수직으로 배치하여 OCT 블록을 응고시킨 후 크라이오스탯(cryostat)에 장착하고, 약 20분 동안 -24 °C에서 블록을 평형화합니다. 그다음 각 슬라이스를 15 µm 두께로 절단하여 SuperFrost Plus 슬라이드에 부착합니다. 슬라이드는 프로토콜의 텍스트 부분에 설명된 면역형광 염색 단계 전까지 -80 °C에서 보관할 수 있으며, 본 이미지는 Hamburger 및 Hamilton stage 24에서의 외측 운동 신경 기둥(lateral motor column) 생성 상태를 보여줍니다.

왼쪽 패널의 LH X one 염색을 통해 외측 운동 신경주(lateral motor column)의 외측 분할을 시각화하였습니다. 중앙 패널에서는 Fox P one 염색으로 외측 운동 신경주를 시각화하였으며, 오른쪽 패널은 두 채널을 병합한 영상입니다. 점선은 중앙선을 나타내며, DV는 여기서 배측-복측(dorsal ventral) 축을 의미합니다.

왼쪽 패널의 LH X one 염색으로 외측 운동 신경세포 기둥의 외측 분할 상태를, 중간 패널의 Fox P one 염색으로 외측 운동 신경세포 기둥을 다시 보여주며, 오른쪽에는 병합된 이미지가 제시되어 있습니다. 이 이미지들은 27단계의 발달 과정을 보여줍니다. 이 이미지들은 해리된 두개 운동 신경세포의 생존을 지원하는 배지에서 슬라이스 배양된 단면의 LH X one 발현(왼쪽)과 Fox P one 발현(중간 패널)을 보여줍니다.

Fox P one 발현으로 확인되는 LMC 세포의 일부 생존이 있음에도 불구하고, LH X one은 더 이상 운동 뉴런에서 발현되지 않습니다. DV는 척수의 배측-복측 축의 방향을 나타내며, ML는 척수 외측 운동 컬럼의 내측-외측 축의 방향을 나타냅니다. 왼쪽 패널의 복측 뿔에서 LH X one으로 염색된 외측 분할 세포와 중앙 패널에서 Fox P one으로 염색된 일반적인 LMC를 4% 닭 혈청과 100 nanograms per milliliter CNTF가 포함된 배지에서 배양한 절편을 통해 관찰할 수 있습니다.

왼쪽 패널의 화살표로 표시된 것과 같이, 일부 외측 운동 신경핵 외측 분할 세포들이 복측 뿔의 외측 위치에서 발견됨에 유의하십시오. 이 이미지는 앞서 보여준 배아의 절편 배양 동안 OVO 상태로 유지된 배아 절편에서 Lhx1 및 Foxp1의 발현 상태를 보여줍니다. 이 히스토그램은 Foxp1 양성 및 Lhx1 양성으로 염색된 외측 운동 신경핵 외측 분할 세포의 비율을 Foxp1 양성 및 Lhx1 양성으로 염색된 외측 운동 신경핵 세포와 비교하여 정량 분석한 결과를 나타냅니다.

대조군으로 사용된 in ovo 배아(100%로 표시)와 비교하여 서로 다른 조건의 슬라이스 배양 세포에서 나타난 음성 데이터가 제시되었으며, 데이터 분석에는 students T-test를 사용하였습니다. 별표 세 개(***)는 유의 수준 0.01 미만을 나타냅니다. 본 프로토콜을 수행할 때, 사지 싹(limb bud) 내 운동 신경 축삭의 무결성을 유지하는 것이 중요하므로 배아를 해부하고 슬라이스에서 agros를 제거할 때 주의해야 합니다.