Name: 닭의 배아 척수 코드 슬라이스 문화 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 배우세요 닭 배아 척수 슬라이스 배양 프로토콜로 운동신경 발달을 연구하는 방법입니다. 면역형광 현미경을 활용해 24시간 동안 정상 신경 발달을 관찰할 수 있습니다.

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우리는 Foxp1에 항체의 종류 선물에 대한 많은 통찰력 토론 및 B. Novitch에 대한 샤론의 자랑을 감사드립니다. KCT 할 수있는 웰컴 트러스트에서 학생이기와 웰컴 트러스트에서 SRP (권한 부여 참조 번호 094399/B/10/Z)에 프로젝트 교부금으로 운용로 작동합니다.

1. 필수 솔루션 만들기 <ol><li> 1 M 인산 버퍼 :. 109.4 g 오세영 2 HPO 4, 32g 아뇨 2 PO 4를 체중 H 2 0, 혼합 1 리터의 총 볼륨에 물에 용해. </li><li> 인산염은 식염 (PBS)를 버퍼 : 0.1 M 인산 버퍼, 0.15 M NaCl을 준비합니다. PBS의 100 ML 10 배아에서 슬라이스의 처리를 위해 충분해야합니다. </li><li> 아가로 오스 : 약 70 열 PBS 솔루션 ° C와 고체 낮은 녹는 온도가 아가로 오스를 추가 천천히 지속적으로 교반하면서. 4퍼센트의 최종 농도 (w / V) 아가로 오스에 대한 솔루션을 확인하십시오. 이 솔루션의 50 ML의 재고를 확인하십시오. 필요한 ° C까지 48 유지 waterbath에서이 솔루션을 둡니다. 실험 후 사용하지 않는 모든 아가로 오스 솔루션은 몇 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 항체 블록 솔루션 : 최종 concentr에 태아 송아지 혈청과 트리톤 Triton X-100을 추가1 %의 ation (V / V) 태아 송아지 혈청, 0.1 % (V / V) 트라이 튼 PBS에서 X-100. 블록 솔루션의 10 ML는 그라 이오 스탯 섹션 5 슬라이드 immunostaining에 충분합니다. </li><li> 정착액 : 0.75 mm NaOH, 4 % (w / V) paraformaldehyde (주의)를 준비합니다. 70 물 정착액 열 필요 금액을 준비하는 ° C, 필요한 최종 농도에 집중 NaOH를 추가 용해 될 때까지 고체 paraformaldehyde와 혼합을 추가합니다. 4 ° C.에 얼음이 차가운 이 솔루션의 10 ML은 배아 슬라이스의 20 우물에 충분합니다. </li><li> 자당 솔루션 : 0.1 M 인산 버퍼를 포함하는 30 % (w / V) 자당 솔루션의 10 ML를 준비합니다. 이 솔루션의 10 ML은 배아 슬라이스의 10 우물에 충분합니다. </li><li> 70 % (V / V) 에탄올은. 물 30 ML과 절대 에탄올의 70 ML을 희석. </li><li> 문화 매체 : 1 % 닭 배아 추출물, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 0.35 % L-글루타민, 0.1 % 2 mercaptoeth의 솔루션을 준비anol, 4퍼센트 닭 혈청, 2% B27 보충제, 100 ML / NG ciliaryneurotrophic의 성장 인자 (CNTF) neurobasal 매체에 희석 모든, 얼음에 준비하고 당일 사용됩니다. 문화 매체의 10 ML은 배아 슬라이스의 20 우물이 필요합니다. </li></ol> 2. 칙의 배아 준비 <ol><li> 장소는 15 24 개최하기 위해 개발 ° C까지 38 강제 통풍 보육에 수평으로 긴 쪽과 암탉의 알을 수정 된. 이 사이트는 보통 부화 약 4 일이 필요합니다. </li><li> 부화의 두 번째 날, 70 % 에탄올에 배어 휴지로 닦고하여 알 껍질을 소독. 주의 깊게 관통 5 ML의 주사기에 부착 알부민의 5 ML을 제거 21 게이지 바늘을 사용하여 알 껍질의 평면 끝. 쉘을 열 때 배아가 손상되지 않도록이 떨어져 쉘에서 배아를 낮 춥니 다. 보육에 계란을 반환하고 추가 2 일을 품다. </li><li> 무딘 뒤몽 # 5 포셉 C를 사용arefully 피어스 쉘의 상단 중간과 쉘의 9cm이 주위를 제거합니다. 배 주위를 잘라 조심스럽게 해부하는 동안 HBSS의 배아와 장소를 올린다. 배아는 햄버거와 해밀턴 (1992) 15에 따라 조작해야합니다. 사용 된 모든 배아 무대 24 가까이에 있어야합니다. 이상의 흔적을 보여 모든 배아는 폐기해야합니다. </li><li> 양막 막, chorio-allantoic 막, 머리와 두 개의 뒤몽 # 5 포셉을 사용하여 allantois를 제거합니다. 모든 내부 장기를 제거하는 배아를 골자를 빼 버리다. 이 작업을 수행하려면, 마이크로 해부 가위로 배의 복부 중간 선을 자르면 포셉 한 쌍의와 함께 뱃 부리 장식이있는 트렁크 지역 주변의 배아를 개최, 창자와 심장의 뱃 부리 장식이있는 부분을 잡아 당겨 caudally. 그것은이이 완전히 완료하는 것이 중요합니다. 당신은 배아 명확하게 somites 볼 수 있습니다. 횡 방향 가슴 몸을 잘라 상부 및 하부 사지 buds.Now 사이에 반으로 배아를 잘라microdissection 가위를 사용하여 벽. </li></ol> 3. 배아 슬라이스 준비 <ol><li> 물 목욕에서 아가로 오스 솔루션을 제거합니다. 일회용 3 ML 플라스틱 파스퇴르 피펫의 바닥에서 5cm 잘라. </li><li> 부드럽게 건조 배양 접시에 절개 솔루션과 장소의 요람 배아를하는 두 집게를 사용하여 해부 배아의 요추 절반을 제거합니다. 파스퇴르 피펫 사용하여 배아의 상단에, 아가로 오스 2 ML 주위에 피펫 약 0.5 ML를 제거한 다음 피펫으로 배아 슬라이스를 빨아. 거리에 플라스틱 금형은 아가로 오스에있는 거품을 소개하지 돌 껍질로 배와 아가로 오스를 전송합니다. 부드럽게 아래쪽을 향해 가슴 부분에 플라스틱 몰드에서 아가로 오스의 맨 아래에 배아를 낮 춥니 다. 태아는 바로 21 게이지 바늘을 사용 할 위치해야합니다. 조각은 또한 개발 사지의 일부를 포함하고 중요합니다 그 한천에 배의 방향ose이 할 수 있습니다. 아가로 오스를 설정 얼음에 배를 놓으십시오. 배아는이 기간 (2 분 정도) 동안 방향을 변경하지 않는 조심해. </li><li> Leica VT1000S vibratome (속도 3, 주파수 4, 400 μm 두께의 슬라이스)는 HBSS로 가득 썰기 챔버와 설정하고 얼음처럼 차가운 바다로 둘러싸여 있어야합니다. 아가로 오스 블록은 다음 슈퍼 접착제로 vibratome 플랫폼에 붙어 있습니다. 아가로 오스 블록을 주변 아가로 오스 1-3 밀리 배아 조각을 떠날 면도날로 손질합니다. 명확한 꼭대기 ectodermal rigde로 사지 꽃 봉오리 섹션을 포함 슬라이스가 선택되어 있으며이 조각 나서 HBSS에 배치됩니다. 일반적으로, 태아 당 1-2 적합한 조각이 있습니다. 부드럽게 두 바늘을 사용하여 조직 슬라이스 주위 아가로 오스를 제거합니다. 그것은이는 철저하고 신중하게 이루어집니다 것이 중요합니다. </li></ol> 4. 배양의 배아 슬라이스 <ol><li> requir에 문화 솔루션 500 ML을 (위 설명)를 추가24도 초 낮은 첨부 파일 처리 조직 문화 판 우물의 에드 번호입니다. 잘에 HBSS 용액에서주의 깊게 조각을 전송합니다. 일반적으로 우리는 각도에 2-3 조각을하려고합니다. 24 시간에 5 ​​% CO 2와 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에서 24도 판을 놓습니다. </li></ol> 5. Immunostaining의 조각 Sectioning <ol><li> 문화 시대 따라 배아 슬라이스의 각도에 버퍼 수정 500 μl를 추가하고 20 분에 얼음에 출발합니다. 총 솔루션은 다음 조심스럽게 제거 세 PBS 세차는 5 분 간격으로 수행됩니다. 조각 그런 다음 6 시간 주변, 슬라이스 싱크까지, 4 ° C에서 자당 솔루션에 남아되어 있지만 (예 : 야간) 이상에 남아있을 수 있습니다. </li><li> 20 ° C.에 추가 자당 솔루션에서 조각과 소량를 제거하고 약 5 분 근처에 하나 ML 10월에서 평형 거리에 껍질을 벗기면 월 채워진 플라스틱 금형 각 슬라이스 평면를 탑재합니다.장착 후, 더욱 강화하기 위해 드라이 아이스에 수직으로 금형을 배치합니다. </li><li> 그라 이오 스탯에 10월 블록을 탑재하고 약 20 분 동안 -24 ° C에서 블록을 평형. Superfrost 플러스 슬라이드에 장착 15mm 섹션과 각 조각을 잘라 버릴거야. 그들이 필요한 ° C까지 슬라이드는 -80에서 저장 될 수 있습니다. </li></ol> 6. Immunofluorescence <ol><li> 챔버의 하단에 (우리가 압력솥 테이프로 고정 1 개 또는 2 ML 플라스틱 피펫을 사용하여)에서 제기 된 슬라이드를 즐길 수있는 humidified 챔버에서 개최 된 수평 슬라이드에 PBS의 피펫 1-2 ML. 20 5 분을 위해 PBS에있는 절을 길러 ° C를 초과 10월은 슬라이드에서 PBS 솔루션을 제거하고 섹션을 통해 블록 솔루션 500 ML를 추가, 20에서 30 분 동안 배양 제거하는 ° C. 블록 솔루션을 제거하고 즉시 희석 주요 항체 500 ML를 추가 ° C 18-22 시간에 대해 4에서 알을 품다, 슬라이드에 추가됩니다. </li><li> 기본 항체 솔루션을 제거하고 즉시이었다H 20에서 5 분, 세 번이나 PBS 1 ML과 슬라이드 ° 초과 기본 항체 솔루션을 제거 할 수 C. 섹션을 통해 희석 차 항체 500 ML을 추가합니다. 슬라이드 그런 다음 30 분에 20 ° C에서 남아 있습니다. 차 항체 솔루션은 다음 제거 슬라이드 20 ° C.에 PBS에 3 회 5 분을 씻고있다 </li><li> 이 세차 후, 최종 PBS 세척을 가볍게 두드리다 초과 PBS를 제거 할 슬라이드의 가장자리를 제거 슬라이드에 vectashield 두 방울을 추가하고 부드럽게 거품 형성을 피하고 섹션을 통해 유리 coverslip을 마련. 이미징 전에 슬라이드의 가장자리에서 blotting에 의해 초과 Vectashield를 제거합니다. </li></ol> 7. 영상 <ol><li> 이미지 immunostained 섹션. 우리는 Hamammatsu ORCA ER 디지털 카메라 및 10 X, 20X 40 X 객관적인 렌즈가 장착 된 니콘 이클립스 E80i 형광 현미경을 사용합니다. </li></ol>

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</ol>

저자 중 누구도 관심 분야 나 관심의 충돌을 경쟁 없습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 닭 배아 슬라이스가 모터 뉴런이 살아 있도록하고 문화 기간 동안 마이그레이션을 계속하면서 하루 이상 incubated 할 수 있습니다. 모터 뉴런이 살아 유지 조건을 elucidating에서, 우리는 필요한 몇 가지 주요 기능을 확인하고 있습니다. 그것은 최대 4 %의 여자의 혈청은 모터 뉴런과 다른 종의 혈청과의 교환의 생존에 중요 용납되지 않습니다 것 같습니다. 흥미롭게도, 우리는 혈청보다 높은 농도의 존재들이 슬라이스 모양의 총 왜곡로 이어지는 조직의 전면에 자라 난을 추진 같이 ​​조각에 해로운 사실​​을 발견했습니다. 더 중요한 건, cilliary neurotrophic 요인의 존재도 중요이었다. 이 조각은 심지어 척수로 감각 수입 성의 입력의 시각화를 허용, 단 24 시간보다 훨씬 더 기간 동안 배양 할 수있을 수 있다는 독특한 가능성이 남아있다. 또한 막여기 진짜야 조건은 또한 개발 brainstem과 midbrain / 소뇌의 문화를 썰 유용 할 수 있습니다. 아마도 이러한 슬라이스 문화 조건의 사용에서 가장 큰 잠재적 인 혜택은 그러한 마음으로 배아의 나머지 부분에 부정적 영향에 대한 가능성을 최소화하면서 단백질 기능의 약리 조작에 대한 가능성을 촉진한다는 것입니다. 다른 신호 경로의 억제제와 agonists의 많은 수는 다른 척추 신경의 하위 유형의 마이그레이션하고, 잠재적으로, 개발 기간 동안 지역의 척추 회로의 형성에 미치는 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 siRNAs 및 morpholino의 oligonucleotides의 사용을 만든 것과 같은 단백질 표현의 일부 유전자 섭동은, 그들 만 초기 개발에 도입 (비켜 electroporation 절차에의 제한하기 때문에)와에 대한 효과는 마지막으로 할 수있는 사실로 고통 팀의 짧은 기간E (보통 한 일). 우리 슬라이스 문화는 나중에 단계에서 시작하며 슬라이스의 문화의 기간 동안의 효과를 볼 수 썰기 단계에서 나중에 개발에이 기술을 사용할 수있는 가능성을 갖게된다. 슬라이스 문화 프로토콜은 모두 척추 운동 뉴런뿐만 아니라 시간 경과 비디오 현미경을 통해 실시간으로 등쪽 interneuron 이주의 시각화를 허용 할 수 있습니다. 이것은 하얀 빛 아래 또는 형광 이미징을 사용하여 위상 대비 현미경을 사용하여 달성 할 수 있습니다. 후자 기술 한 다음 사용한다면 형광 라벨의 도입이 필요합니다. 이것은 뇌실이나 뉴런의 집합에 형광 단백질을 유도 할 수 구조의 비켜 electroporation에있는 다리 또는 anterograde 라벨에서 역행 라벨 중 하나를 통해 이러한 DiI 또는 디오와 같은 형광 염료의 도입에 의해 하나 달성 할 수 있습니다.

정상적인 배아 발달 동안, 많은 다른 세포 유형은 원산지 자신의 관점에서 그들은 결국 성숙한 유기체에서 작동합니다 위치로 마이그레이션해야하는 생성됩니다. 개발 척수 내 전구 세포는 중간 선에서 심실 지역에 위치해 있으며, 감각 처리와 모터 출력 1 필요한 기능 neuronal 회로로 통합 마이그레이션해야합니다 postmitotic의 뉴런과 glial 세포의 여러 하위 유형을 생성합니다. 사지 근육의 수축을 제어 척수 모터 뉴런은 광범위하게 연구되었으며 대부분 서로 다른 서브 클래스의 형성을 유도 분자 및 메커니즘의 알려져 있습니다. 그러나, 훨씬 덜은 모터 뉴런이, 마이그레이션 분리 및 신경 입력을받을하여 메커니즘을 알려져 있습니다. 모터 신경 세포의 하위 유형의 신원은 계층 적 방식으로 개발되는 동안 획득 한 것입니다. 모터 신경 세포의 하위 유형은 크게 전을 분류 할 수 있습니다n 인물 별개의 열, 그들의 축삭의 계획에 의해 정의 된 부서 및 수영장. 축, 내장 또는 다리 근육 중 하나에 모터 열 프로젝트 axons합니다. 자동차 부문은 복부 나 등쪽 근육에 2를 투영 사람들에 측면 모터 열 (LMC)의 모터 뉴런을 투영 다리를 나눌. 부서 내에서 모터 뉴런의 클러스터는 다리 2, 3에서 개별 근육에 모터 풀 프로젝트를 칭했다. 사업부 신분이 homeodomain 전사 인자 췌장-1 (ventrally 투영) 또는 Lhx-1 (dorsally 예상) 6의 표현을 특징으로하는 반면, 사지 - 돌출 모터 뉴런은 전사 인자 Foxp1 4, 5 자신의 표현에 의해 정의됩니다. 사실, Lhx-1 표현은 모터 뉴런 7 적절한 등쪽의 예측이 필요합니다. 이러한 하위 유형의 각 척수 내에서 독특한 위치를 차지하고, 복부 돌출 모터 뉴런은 dorsally projecti에 안쪽 거주하는 온NG 모터 뉴런. LMC의이 결과는 소위 LMCmedial (LMCm)와 LMClateral (LMCl) 부문으로 분리된다. 사업부 및 모터 수영장 조직은 두 단계 8에 인수되어 있습니다. 첫 번째 단계에서 사업부 분리는 수평 패션에 대한 중간 특성의 모터 뉴런의 마이그레이션을 통해 달성된다. LMCl 세포는 LMCl는 최종 침전 위치를 달성하기 위해 LMCm을 통해 마이그레이션하기 때문에 LMCm 세포와 후 생성됩니다. 두 번째 단계는 모터 뉴런의 등쪽 - 복부 정렬을 통해 추측 컨데, 모터 뉴런 풀에 부서와 클러스터 그들 안에 모터 뉴런이 소요됩니다. catenin에 의존 클래식 cadherin 가족 회원은 모터 신경 조직 8-10의 두 단계에 중요한 것으로 표시되었습니다. 그러나, cadherin 기능은 세포의 움직임을 제어하는​​ 방법을 제대로 이해된다. 원주, 사업부 및 수영장 정체성의 인수 외부 신호를 필요로하는 패턴 intrinsi전사 인자 11의 C 표현. 또한 모든 모터 뉴런의 50 % 정도는 주로 모터 신경 세포의 생존의 neurotrophic 지원을 통해, 다리에서 외부 신호를 필요로하는 과정에서 정상적인 개발 중에 apoptosis를 통해 죽어. 따라서, 모터 신경 세포 개발은 비교적 긴 timecourse으로 유지 될 수있는 적절한 환경이 필요합니다. 이러한 이유로, 모터 신경 세포의 생존을 유지하기 위해 척추의 슬라이스 문화를 생성하는 practicalities 적절한 문화 조건의 해설을 필요로합니다. 이전 배아 슬라이스 문화는 neuronal 인구에게 12-14를 extrinsically 추가 정화의 동작을 따라하는 데 사용되었습니다. 그러나, 슬라이스 자체 내에서 현장 모터 신경 세포의 생존 및 마이그레이션에 용이하게 지식 문화 조건에 게시되지 않았습니다. 우리는 정화의 생존을 촉진하는 표준 문화 조건을 수정, dissociated 두개골 모터 뉴런이 m을 촉진하기 위해배아 슬라이스 문화 시스템 내의 otor 신경 세포 개발. 우리는 또한 생존 모터 뉴런의 위치를​​ 모니터링하고 모터 뉴런 부서의 대부분이 정상적인 위치는 문화 기간 동안 획득 한 것을 보여줍니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 달걀 </td><td> 헨리 스튜어트 농장, 영국 </td><td></td><td> Fertilised 브라운 Bovan 골드 헨의 알 (헨리 스튜어트 농장, 영국), 14에 저장 ° C까지 배양 </td></tr><tr><td> 21 게이지 바늘 </td><td> BD-Microlance-3 </td><td> 304432 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ML의 주사기 </td><td> BD Plastipak </td><td> 302187 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 뒤몽 포셉 </td><td> Roboz </td><td> RS 5045 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 해부 가위 </td><td> Roboz </td><td> RS 5910SC </td><td> (직진 3.5) </td></tr><tr><td> 배아 퍼가기 금형 : 물러 금형 </td><td> 과학 한천 </td><td> G3764 </td><td> 피라미드 모양의 22mm에 12mm </td></tr><tr><td> 슈퍼 접착제 </td><td></td><td></td><td> 파워 플렉스, Loctite </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 시그마 </td><td> 32,221 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 나트륨 디 - 수소 인산, 모노 - 수화물 </td><td> BDH </td><td> 102454R </td><td></td></tr><tr><td> 디 나트륨 모노 수소 인산 </td><td> VWR / BDH </td><td> 102494C </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> VWR / BDH </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> 낮은 녹는 온도 아가로 오스 </td><td> Invitrogen </td><td> 16,520 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco </td><td> 10500-064 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 시그마 </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 </td><td> FLUKA </td><td> 71,689 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> VWR / BDH </td><td> 28794.295 </td><td></td></tr><tr><td> 플라스틱 일회용 파스퇴르 피펫 </td><td> ElKay 정밀 실험실 소모품 </td><td> 127-P503-000 </td><td> Liquipette 3 ML 볼륨 </td></tr><tr><td> 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14,170 </td><td></td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 시그마 </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 탄산수 소염 </td><td> 시그마 </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> 닭 배아 추출 </td><td> Seralabs </td><td> CE650-J </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션 </td><td> Gibco </td><td> 15,070 </td><td></td></tr><tr><td> L-글루타민 솔루션 </td><td> Gibco </td><td> 25,030 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - 메르 캅토 에탄올 </td><td> Gibco </td><td> 21,985 </td><td></td></tr><tr><td> 말 혈청 </td><td> 남부 그룹 연구소 </td><td> 9028B </td><td></td></tr><tr><td> B27 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> Neurobasal 매체 </td><td> Gibco </td><td> 고양이 ~ 2,103 </td><td></td></tr><tr><td> CilliaryNeurotrophic 요소 (CNTF) </td><td> R과 D 시스템 </td><td> 557-NT-010 </td><td></td></tr><tr><td> 칙 세럼 </td><td> 시그마 </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> 기본 항체 </td><td></td><td></td><td> UCLA의 베넷 Novitch에서 일종의 선물이었다 방지 foxP1 항체를 제외하고 발달 연구 하이 브리 도마 은행에서 구입했다. 기본 항체의 dilutions는 토끼 반 FoxP1 (32,000분의 1), 마우스 방지 Lhx1 / 2 (4F2) (1 / 50), 기니 돼지 백신 FoxP1 (1 / 1000).했다 모든 항체는 4 ° C.에 저장되었습니다 </td></tr><tr><td> 차 항체 </td><td></td><td></td><td> 당나귀 반 기니 돼지 (cy3) (1:1000)은 잭슨 Immunoreseach 랩 주식회사 돈키 안티 - 마우스 (알렉사 형석 488) (1:1000), 동크에서 구입어이 반 토끼 (알렉사 형석 594) (1:1000)는 Invitrogen에서 구입 모든 항체는 4 ° C.에 저장되었습니다 </td></tr><tr><td> 24 잘 판 </td><td> 코닝 COSTAR </td><td> 3473 </td><td> ultralow 첨부 파일 24 잘 판 </td></tr><tr><td> 10월 </td><td> 조직 테크, 사쿠라 </td><td> 4583 </td><td> 최적의 절삭 온도 </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> 벡터 연구소 </td><td> H1000 </td><td> Vectashield 형광 장착 매체 </td></tr><tr><td> 슬라이드 </td><td> 열 과학 </td><td></td><td> Superfrost 플러스 긍정적으로 충전 슬라이드, 25 X 75 X 1.0 mm </td></tr><tr><td> 유리 커버 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> 631-0167 </td><td> 25x60 mm </td></tr><tr><td> 초안 배양기를 강제 : </td><td> 리옹 (Lyon) 전기 회사 </td><td></td><td> 38 ° C로 유지 항상 충분한 물 수준을 보장하여 습기 보관 </td></tr><tr><td> 그라 이오 스탯 </td><td> Brite, 헌팅, 영국 </td><td></td><td> -36 ° C </td></tr><tr><td> 조직 문화 인큐베이터 </td><td> DH Autoflow </td><td></td><td> Nuaire 38 ° C, 5 % CO 2 </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td></td><td> Leica VT1000-S </td></tr><tr><td> 현미경 </td><td> 니콘 </td><td></td><td> 니콘 이클립스 E80i 형광 현미경 </td></tr><tr><td> 디지털 카메라 </td><td> 니콘 </td><td></td><td> 니콘 DS5M 및 Hamammatsu ORCA ER </td></tr></tbody></table>

닭의 배아 척수 코드 슬라이스 문화 프로토콜

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

슬라이스 문화 모두 pharmacologically 및 유전자 조작을 통해 배아 개발의 조작을 용이하게 할 수 있습니다. 이 감소 시스템에서 전신 약물 응용 프로그램으로 인해 잠재적 인 치명적인 부작용을 극복 할 수 있습니다. 그러나, 문화 조건 슬라이스의 감소 환경 내에서 일반적인 개발 진행을 확인해야합니다. 우리는 특히 척추 모터 뉴런의 것을 척수의 개발에 초점을했습니다. 우리는 체계적으로 대부분의 척추 운동 뉴런이 탄생 된 시점에서 닭 배아 슬라이스 문화 조건을 다양한. 우리는 생체에 해당에 비해 문화 기간 및 그 모터 뉴런의 위치 동안 살아 모터 뉴런의 수와 유형을 assayed. 우리는 혈청 유형과 neurotrophic 요인은 문화 기간 동안 필요했다 발견 최소 24 시간에 모터 뉴런이 살아 유지하고있는 모터 뉴런이 적절한 위치로 마이그레이션 할 수 있도록 할 수있었습니다척추. 우리는이 문화 조건 및 아가로 오스에 포함 eviscerated 닭 배아를 사용하여 배아 슬라이스 문화를 준비하는 방법을 제시하고 vibratome를 사용하여 썰어.

interneuron과 투사 뉴런의 발전을 따르도록 교양 슬라이스의 사용은 피질 16 내 조직의 생성에 대한 우리의 이해를 진행에 영향을했습니다. 척추, 모터 신경 세포의 개발은 전체 zebrafish의 배아의 문화 17를 사용하여 다음되었습니다. 그러나, zebrafish의 척추 모터 신경 조직은 (물고기의 큰 사지 근육의 부족하기 때문에) 상대적으로 간단합니다. 높은 vertebrates의 개발 기간 동안 척추 운동 신경 조직의 계층 구조를 유도 분자 메커니즘은 현재 제대로 이해하고 있습니다. 높은 vertebrates의 배아 슬라이스 문화의 신경 세포의 생존과 전지 본체 마이그레이션을 용이하게 문화 조건에 따라서 필요합니다. 현재, 높은 vertebrates의 척추 슬라이스 문화는 슬라이스 12-14의 상단에 씨앗 dissociated 뉴런에 사용되었으며, 슬라이스의 주변에 휘황 표시 axons을 조사18 일 또는 초기 척추 개발 19 전구 세포의 행동. 특히 나중에 척추 코드, 모터 신경 세포 개발은 현재 부족 유지 사람들에게 문화 조건을 갈라. 척추 모터 뉴런의, 우리는 모터 신경 세포의 생존과 뉴런의 측면 이동을 통해 모터 조직의 초기 주문의 인수를 촉진 할 수 다양한 문화 조건을 조사 특히 것을 척추 neuronal 개발을 수행하려고 시도합니다. 20 여자의 배아 척추 슬라이스를 개최하기 위해 단계 18를 사용하여 초기 시험은 보람 입증, 우리는 몇 시간 이상은 모터 뉴런이 살아있게 할 수 없습니다와 문화 시대 (데이터를 LMCl 세포의 상당한 숫자의 생성을 설명 할 수 없습니다 ) 표시되지 않습니다. 따라서 우리는 무대의 슬라이스 문화 24 배아, LMCl 및 LMCm의 뉴런의 대부분이 생성 된 timepoint를 조사하지만, LMCl 신경 세포 이주는 내가 아직 때nfancy (그림 1a-C). LMCl 뉴런의이 측면 마이그레이션 이후 24-36 시간 (그림 1 DF) 주위 무대 27 일까지 대부분 완료됩니다. 우리 검정 따라서 뉴런이 살아있게하고 복부 뿔에 옆으로의 마이그레이션을 용이하게하는 것을 간소화 할 수있다. 우리는 함께 또는 닭 혈청 또는 닭 배아 추출물없이 행크의 균형 소금 솔루션을 포함하는 비교적 간단한 문화 조건의 실험을 시작했다. 우리가 슬라이스에 LMC의 뉴런을 유지 할 수 있었다하지만, 모든 경우에, 우리는 LMCl 뉴런이 유지되는 작은 증거를 발견 (적어도 Lhx-1의 표현으로). 또한, 우리는 등쪽의 척추 HB9와 같은 유전자의 부적절한 표현, 생체 (데이터 미도시)에 발생하지 않을 상황을 발견했다. 따라서, 다음과 같은 간단한 문화 조건은 모터 신경 조직의 인수의 조사를 위해 적합하지 않습니다. 우리는 따라서 더 복잡한 conditio을 추구NS와베이스 dissociated 배아 닭 두개골 모터 뉴런의 생존을 촉진하기 출판 된 공식을 사용으로. 이 조건은 20 일 (neurobasal 매체의 1 % 여자들의 배아 추출물, 1 % 펜 패 혈성, 0.35 % L-글루타민, 0.1 % 2-메르 캅토 에탄올, 2 % 말 혈청, 2퍼센트 B27 보충 및 50 ML / NG ciliaryneurotrophic의 성장 인자 (CNTF) (여기서 거스리 중간이라고도 함)보다 단순한 미디어보다 살아 더 많은 모터 뉴런을 유지 않았습니다. 또한이 등쪽의 척추 전사 인자의 가짜 표현 될 없습니다. 그러나, LMCl 뉴런의 생존 (그림 1 GI, 가난 했었고 P는). 따라서 우리는 우리가 거스리 매체, 혈청 기원 즉 동물, 혈청의 농도와 매체의 CNTF의 농도의 주요 요소로 간주 하잖 다양한. 우리가 찾은 그 말 혈청에서 혈청을 변경 칙 혈청 50 NG / ML 100에서 CNTF의 농도 증가에 NG / ML은 실질적으로 t 증가그는 LMCl과 LMCm 세포의 생존과도 문화 조건의 24 시간 (그림 1 JL, P)을 통해 복부 경적으로의 마이그레이션을 허용했다. 모터 뉴런, LMCl하고 LMCm의 비율의 총 수는 실제로 복부 뿔에 LMCl 세포의 이주 (그림 비켜에서가 아닌 슬라이스 문화에 발전 할 수 있었다 배아 섹션의 매우 유사 등장 한 코, P). 따라서, 우리는 전사 인자의 발현, 전화 번호 및 모터 뉴런의 위치에 따라, 우리의 슬라이스 문화 조건은 최소한 24 시간의 기간 동안 정상적인 척추 운동 뉴런 개발을 요점을 되풀이하다 생각합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1.jpg" /> 1 그림. - 다. LMC의 세대의 상태 (의 Foxp1 착색B)와 LMCl (단계 24에서)에서 Lhx-1 염색. C는 두 채널의 병합입니다. 중간 선이와 D에 점선으로 표시되어, V는 척추의 dorsoventral (D, V) 축 방향을 보여줍니다 D -. 6. . LMC (D에서 Foxp1 착색)와 LMCl (전자의 Lhx-1 염색) 단계 27에서 조직의 상태 F는 두 채널의 병합이다 g -. 전. Lhx-1 (g)와 Foxp1 (H) (거스리 매체, 우리의 &quot;초기 매체&quot;참조 20 참조) 두개의 모터 신경 세포의 생존을 지원하는 매체에 배양 한 조각의 섹션에 표현. Foxp1 표현으로 입증 LMC 세포의 일부 생존이 있지만 Lhx-1은 더 이상 모터 뉴런으로 표현되지 않습니다. (g)에서 D, V는 척추의 dorsoventral (D, V) 축 방향을 보여줍니다. ML의 s의 mediolateral (M, L) 축의 방향을 보여줍니다pinal 코드 J - 내가. LMCl 세포 (J의 복부 뿔에 Lhx-1)과 일반적으로 LMC는 (K의 Foxp1) 4퍼센트 여자는 혈청과 100 NG / ML CNTF를 포함하는 매체에 배양 조각에서 관찰 할 수 있습니다. 일부 LMCl 세포는 복부 뿔의 측면 위치에 발견됩니다. 에있는 화살표 (J)는 LMCl 세포의 일부 측면 위치를 보여줍니다. (나) 두 채널의 병합입니다 m -. 오. 난 - Lhx-1 (m)와 J에 표시되는 배아의 슬라이스 문화 중에 비켜에 보관 배아의 섹션에서 Foxp1 (n)이 표현의 상태입니다. (O) 두 채널의 병합입니다. P는. LMCl의 비율 (Foxp1 + VE / Lhx1 + VE) LMC 대 세포 (Foxp1 + VE / Lhx1-VE) 다른 조건에서 슬라이스 문화에서 발견 세포의 Quantitation C비켜 (이 100 %를 나타냅니다)에 보관 배아를 제어 할 수 ompared. 학생의 t-테스트 ***는 P &lt;0.01를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50295/50295fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

슬라이스 문화 유전자와 약리 섭동에 의해 배아 개발의 조작을 용이하게합니다. 그러나, 문화 조건은 일반적인 개발 슬라이스의 감소 환경 내에서 수행 할 수 있는지 확인해야합니다. 우리는 최소 24 시간 동안 진행되는 것이 정상적인 척추의 개발을 용이하게하는 프로토콜을 보여줍니다.

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

본 실험 절차의 전체적인 목적은 닭 배아 절편을 배양하여 정상적인 신경 발달, 특히 척수 운동 신경세포의 발달을 유지하는 것입니다. 이를 위해 먼저 닭 배아를 해부하여 내장 기관을 제거합니다. 두 번째 단계로는 아가로스 블록에 매립된 배아를 준비하고 절편으로 만드는 과정을 수행합니다.다음으로, 배아 절편을 아가로(agarro)에서 조심스럽게 제거합니다. 마지막 단계는 배아 절편을 배양액으로 옮겨 37 °C에서 24시간 동안 배양하는 것입니다. 최종적으로, 배양 기간 후 배아 절편의 박절편에 대해 면역형광 현미경 관찰을 수행하여 척수 운동 신경세포의 존재와 위치를 확인합니다.따라서 이 방법은 발달 신경생물학 분야의 핵심적인 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 척수 운동 신경세포 이동에 관여하는 기전과 분자 등이 이에 해당합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 프로토콜의 박리 단계에서 세심한 주의가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.수정란 10개를 가장 긴 면이 수평이 되도록 배치하여 38 °C의 강제 대류 배양기에 넣고, 햄버거 단계(hamburger stage) 및 Hamilton 단계 24까지 발달할 때까지 배양합니다. 이는 보통 약 4일간의 배양이 필요합니다. 배양 2일째에 70% Ethanol을 적신 티슈 페이퍼로 달걀 껍데기를 닦아 멸균한 후, 5 mL 주사기에 연결된 21 gauge 바늘을 사용하여 달걀 껍데기의 평평한 끝부분을 조심스럽게 뚫고 알부민 5 mL를 제거합니다.이렇게 하면 배아가 껍질로부터 떨어지게 되어 껍질을 열 때 배아가 손상되지 않습니다. 알을 배양기로 다시 옮겨 2일 더 배양합니다. 2일이 지나면 끝이 뭉툭한 도구를 사용하십시오.다음 단계를 수행합니다. 다섯 번째로, 포셉을 사용하여 껍질의 상단 중앙을 조심스럽게 뚫고 약 9 cm² 크기의 껍질을 제거합니다. 배아 주변을 절개한 후 배아를 조심스럽게 들어내어 HBSS에 넣습니다.해부를 위해 사용합니다. 사용되는 모든 배아는 24단계에 가까워야 합니다. 이상 징후가 보이는 배아는 모두 폐기해야 합니다.배아가 담긴 디쉬를 해부 현미경 아래에 둡니다. 두 개의 5번 듀얼 핀셋을 사용하여 양막을 제거합니다. 융모양막, 난황낭 및 머리 부분을 제거하고, 미세 해부 가위를 사용하여 배아의 복측 정중선을 절개함으로써 모든 내부 장기를 제거하기 위해 배아를 적출합니다.그런 다음 핀셋 한 쌍으로 배아의 주둥이 쪽 몸통 부위를 잡습니다. 장의 앞부분과 심장을 잡고 당깁니다. 4분기별로 수행합니다. 그러면 배아의 체절을 명확하게 관찰할 수 있습니다.이제 미세해부 가위로 흉부 체벽을 다듬습니다. 다음으로, 상지와 하지 싹 사이를 가로 방향으로 절단하여 배아를 절반으로 나눕니다. 두 개의 핀셋을 사용하여 해부된 배아의 요추 부분을 조심스럽게 들어 올려 해부 용액에서 꺼낸 후, 약 5cm 길이의 일회용 파스퇴르 피펫을 이용해 건조한 페트리 접시에 옮깁니다.하단에서 절단한 후, 약 2 mL의 용융된 4% w/v agarose를 흡입합니다. PBS에 희석한 agarose 약 0.5 mL를 배아 위에 분주한 다음, 배아 조각을 피펫으로 빨아들입니다. agarose 내에 기포가 생기지 않도록 주의하며 배아와 agarose를 박리형 플라스틱 몰드로 옮깁니다.배아의 흉부 단면이 아래를 향하도록 하여 플라스틱 몰드 내의 아가로스 바닥으로 조심스럽게 내린 다음, 25게이지 바늘을 사용하여 배아가 일직선이 되었는지 확인합니다. 아가로스에는 발달 중인 사지의 일부도 포함되므로, 이를 위해 배아를 수직으로 배치하는 것이 중요합니다. 플라스틱 몰드를 약 2분 동안 얼음 위에 둡니다. 아가로스를 굳히는 동안 배아의 방향이 바뀌지 않도록 주의하십시오.챔버가 HBSS로 채워지고 얼음물로 둘러싸이도록 VT 1000 S와 유사하게 장치를 설정합니다. 순간접착제를 사용하여 agarose 블록을 Vibram 플랫폼에 고정시킨 다음, 면도날로 블록을 다듬어 배아 조각 주변에 1~3 mm의 agarose가 남도록 합니다.진동 절단기를 작동시키고 배아를 절단하기 시작합니다. 명확한 정단 외배엽 능선(apical ectodermal ridge)이 포함된 사지 싹(limb bud) 부위가 포함된 절편을 선택하여 HBSS가 담긴 디쉬로 옮깁니다. 일반적으로 배아당 적절한 절편은 1~2개 정도입니다.두 개의 바늘을 사용하여 조직 슬라이스 주변의 agarose를 부드럽게 제거합니다. 이 과정은 철저하고 세심하게 수행하는 것이 매우 중요합니다. 24 well 초저부착(ultra low attachment) 조직 배양 플레이트의 필요한 수의 well에 500 µL의 배양액을 첨가합니다.슬라이스를 HBSS 용액에서 웰로 조심스럽게 옮겨 각 웰에 2~3개의 슬라이스를 넣은 후, 24웰 플레이트를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 조직 배양 인큐베이터에 24시간 동안 둡니다. 배양 기간이 끝나면 각 배아 슬라이스 웰에 500 µL의 비완충 고정액을 넣고 얼음 위에서 20분 동안 둡니다. 그다음 전체 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 PBS로 5분 간격으로 3회 세척합니다. 이후 웰에 PBS 내 30% sucrose를 추가하고, 슬라이스가 가라앉을 때까지 4 °C에서 약 6시간 이상 둡니다.절편들이 가라앉으면, 절편들을 깨끗한 10 centimeter 페트리 접시로 옮기고 과도한 sucrose 용액을 닦아냅니다. 그런 다음 1 milliliter의 OCT를 첨가하고 20 degrees Celsius에서 5분 동안 절편들을 평형 상태로 둡니다. 각 절편을 OCT가 채워진 박리형 플라스틱 몰드에 평평하게 고정시킨 후, 고정이 완료되면 몰드를 제거합니다.드라이아이스 위에 몰드를 수직으로 배치하여 OCT 블록을 응고시킨 후 크라이오스탯(cryostat)에 장착하고, 약 20분 동안 -24 °C에서 블록을 평형화합니다. 그다음 각 슬라이스를 15 µm 두께로 절단하여 SuperFrost Plus 슬라이드에 부착합니다. 슬라이드는 프로토콜의 텍스트 부분에 설명된 면역형광 염색 단계 전까지 -80 °C에서 보관할 수 있으며, 본 이미지는 Hamburger 및 Hamilton stage 24에서의 외측 운동 신경 기둥(lateral motor column) 생성 상태를 보여줍니다.왼쪽 패널의 LH X one 염색을 통해 외측 운동 신경주(lateral motor column)의 외측 분할을 시각화하였습니다. 중앙 패널에서는 Fox P one 염색으로 외측 운동 신경주를 시각화하였으며, 오른쪽 패널은 두 채널을 병합한 영상입니다. 점선은 중앙선을 나타내며, DV는 여기서 배측-복측(dorsal ventral) 축을 의미합니다.왼쪽 패널의 LH X one 염색으로 외측 운동 신경세포 기둥의 외측 분할 상태를, 중간 패널의 Fox P one 염색으로 외측 운동 신경세포 기둥을 다시 보여주며, 오른쪽에는 병합된 이미지가 제시되어 있습니다. 이 이미지들은 27단계의 발달 과정을 보여줍니다. 이 이미지들은 해리된 두개 운동 신경세포의 생존을 지원하는 배지에서 슬라이스 배양된 단면의 LH X one 발현(왼쪽)과 Fox P one 발현(중간 패널)을 보여줍니다.Fox P one 발현으로 확인되는 LMC 세포의 일부 생존이 있음에도 불구하고, LH X one은 더 이상 운동 뉴런에서 발현되지 않습니다. DV는 척수의 배측-복측 축의 방향을 나타내며, ML는 척수 외측 운동 컬럼의 내측-외측 축의 방향을 나타냅니다. 왼쪽 패널의 복측 뿔에서 LH X one으로 염색된 외측 분할 세포와 중앙 패널에서 Fox P one으로 염색된 일반적인 LMC를 4% 닭 혈청과 100 nanograms per milliliter CNTF가 포함된 배지에서 배양한 절편을 통해 관찰할 수 있습니다.왼쪽 패널의 화살표로 표시된 것과 같이, 일부 외측 운동 신경핵 외측 분할 세포들이 복측 뿔의 외측 위치에서 발견됨에 유의하십시오. 이 이미지는 앞서 보여준 배아의 절편 배양 동안 OVO 상태로 유지된 배아 절편에서 Lhx1 및 Foxp1의 발현 상태를 보여줍니다. 이 히스토그램은 Foxp1 양성 및 Lhx1 양성으로 염색된 외측 운동 신경핵 외측 분할 세포의 비율을 Foxp1 양성 및 Lhx1 양성으로 염색된 외측 운동 신경핵 세포와 비교하여 정량 분석한 결과를 나타냅니다.대조군으로 사용된 in ovo 배아(100%로 표시)와 비교하여 서로 다른 조건의 슬라이스 배양 세포에서 나타난 음성 데이터가 제시되었으며, 데이터 분석에는 students T-test를 사용하였습니다. 별표 세 개(***)는 유의 수준 0.01 미만을 나타냅니다. 본 프로토콜을 수행할 때, 사지 싹(limb bud) 내 운동 신경 축삭의 무결성을 유지하는 것이 중요하므로 배아를 해부하고 슬라이스에서 agros를 제거할 때 주의해야 합니다.

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Neuroscience

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