Name: 조류 배아 Vestibulocochlear 신경 청각 섬유의 선택적 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 배우세요 조류 배아에서 형광 염료를 이용한 미세주사 기법으로 전정청신경 청각 섬유를 선택적으로 추적하는 방법을. 이 기술은 신경발생학 연구에 유용합니다.

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저자는 초기 embryogenesis 동안 여자는 귀에 해부학 적 구조에 대한 전문 지식을위한 이미징 기술과 박사 도리스 우와 제안과 도움을 박사 캔디스 Hsieh 감사하고 싶습니다. 이 작품은 NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 및 DOE GAANN P200A120165에 의해 지원되었다.

1. 다음 해부 도구와 시약을 준비 <ul><li> 인공 뇌척수 (aCSF, 130 MM NaCl, 3 MM KCl, 1.2 MM KH 2 PO 4, 20 MM NaHCO 3, 3 MM HEPES, 10 MM 포도당, 2 MM CaCl 2, 1.3 MM MgSO 4) 지속적으로 95% O와 함께 주입 실온에서 2 / 5퍼센트 CO 2. 주입의 경우, 2 / 3 뚜껑에 구멍을 뚫었 구멍 500 ML 넓은 입 Nalgene 병에 입력하십시오. 탱크는 병 뚜껑에있는 구멍을 통해 aCSF을 침투 한 잔 줄기 버블에 튜브가 첨부됩니다. 액체의 1 / 3에 대한 접근하지만 림을 통해 splashing 느낄 수있을만큼 힘없는 거품의 일정한 스트림을 얻기 위해 압력을 조정합니다. 서로와 가스 흐름 난류에서 개별 샘플을 분리 할 수​​있는 Nalgene 병에 잠기 5 ML 유리 병 (최대 6). ACSF는 모든 조직 배양하기 전에 최소한 20 분 동안 산소를해야합니다. </li><li> 작은 실리콘 분해 요리 (35mm × 10작은 육각형 폴리스티렌으로 배치이 분해 핀 (47 밀리미터 아래)와 함께) Sylgard Elastomere 키트를 사용하여 mm 페트리 코팅은 보트를 무게. </li><li> 두 미세 팁 포셉 한 곡선 팁 포셉, 50 ML의 비커, 그리고 조직 폐기물에 대한 컨테이​​너입니다. </li><li> 유리 micropipette (1.2 OD / 0.9 ID) 끝에서 열어 약 20-50 μm로 분류하고있는 6.25 %의 용액에 rhodamine dextran 아민 (RDA, MW = 3,000 엔, Invitrogen)로 가득을 뽑아 0.4 % 트리톤 PBS에서 X-100 . micromanipulator에 picospritzer하고 안정화하기 위해 고급 튜브에 연결합니다. </li></ul> 2. 마이크로 해부 E8 4,5에서 뇌 바닥 유두을 나타 내기 위해 <ol><li> 곡선 포셉으로 배를 무게 내에서 실리콘 코팅 분해 음식에 직접 머리를 배치, 그냥 brainstem 아래 E8 배아를 잘라. </li><li> 관심의 측면에 귀를 약간 볼 수 있도록 분해 핀 사용, 복부 전망을 감상 할 수있는 머리를 배치, 머리가 약간 dorsally 기울여서 10-30도 멀리 CE에서 포인팅nter (그림 2A). 즉시 핀으로 머리를 보호합니다. 양국 추적을 원하는 경우, 센터는 0도에서 머리, 또는 전체 복부 전망은되도록 양쪽에 액세스 할 수 있습니다. 왼쪽에 액세스 할 수 있도록 마찬가지로, 왼쪽 양면 분사를 들어, 센터에서 -10에서 -30도까지 머리를 보호합니다. </li><li> 50 ML의 비커를 사용하여 완전히 조직을 잠수, 그릇에 산소를 aCSF의 30 ML을 전송하기 만하면됩니다. </li><li> 부드럽게 파악하고 미세 팁 집게를 사용하여 아래턱 아래로 껍질을 벗기면 후 관심의 측면에 더 낮은 눈꺼풀을 제거합니다. </li><li> 남은 미각과 식도 등 놓인의 혈관 조직을 제거합니다. 이 부드러운 조직은 벗겨 버릴 표면에 특유의 척추 동맥과 chondrocranium을 개발의 원활한 표면을 공개해야합니다. 이 시점까지, 특성 흰색 otoconial 질량이 표시됩니다. </li><li> 에 떠있는 동안 외부 meatus, 턱 관절의 연골, 그리고 중간 귀 주위 피부를주의 깊게 해부NER 귀 그대로. 부드럽게 이러한 연골 성의 구조를 떼어 포셉을 사용합니다. </li><li> 고급 집게 팁과 부드러운 한눈에 모션을 사용하여 척추 동맥과 풀링 혈액을 제거합니다. 피가보기를 흐릿하게 할 수 있으며 응고은 주입 피펫 열기를 연결 할 수 있습니다. </li><li> 인접 감각 상피 (뇌 바닥 유두) 및 음향 신경과 달팽이 덕트는 chondrocranium 6 바로 아래에 위치해 있으며, 앞쪽 근처의 말초 - 대부분의 팁 (꼭대기)와, ventrally 내이 (内耳)에서 연장 가늘고 긴 손가락과 같은 프로젝션으로 시각화 할 수 있습니다 중간 선 5. 시각화에 도움이 수있는 달팽이 덕트 (그림 2B)의 꼭대기에있는 해부 및 / 또는 otolithic calcifications (흰색)에서 약간의 피가 풀링 (빨간색)가있을 수 있습니다. 꼭대기에서 lagenar 망막 황반은, 감각 패치 vestibular 기능을 7,8 될 생각. </li></ol> 3. CN VIII 청각 섬유의 선택적 라벨링 <ol><li&gt; 달팽이 덕트 및 뇌 바닥 유두 지역에서 배아 표면 근처의 주입 피펫를 놓습니다. </li><li> 천천히 첫번째 펑크 두개골에 micropipette을 낮 춥니 다. 이 두개의 지역은 주변 지역보다 얇은 적은 힘 침투해야합니다. micropipette 이제 달팽이 덕트 내에 있어야합니다. 선택 사항 : 추적 염료의 작은 주사는 뇌 바닥 유두를 시각화에 도움이 여기를 만들 수 있습니다. </li><li> micropipette를 변경하지 않고, 단지 위반 달팽이 덕트의 깊은 경계 (그림 1)까지 낮추고 계속 진행합니다. 여기 주사를 수행하고 vestibular lagena가있는 대부분의 근위 팁을 제외 뇌 바닥 유두 (그림 2C, 2D)의 길이를 따라 여러 지역에서 반복합니다. 10-30 PSI 사이에 자리 잡고 picospritzer으로 여러 주사가 만들어집니다. 주입 염료 유체의 볼륨은 다양하고, 원하는 라벨의 범위에 따라 달라집니다. 각각의 주입은 형광 염료 라가 될약 200 beled 명소 - 400 μm의 직경 (그림 2D). </li><li> 주입이 완료되면, brainstem 위의 샘플을 가로로 쪼개다 지속적으로 95% O 5분의 2 % CO 2와 perfused되는 aCSF의 컨테이너 내에서 작은 병으로 꼬리 부분을 배치 전송 피펫을 사용하여 집게를 사용합니다. </li><li> 각 배아를 들어, 원하는 중앙 추적의 거리에 따라, 염색 전송을위한 20-30 분 수 있습니다. </li><li> 조직을 제거하고 조직 학적 sectioning를 준비합니다. 여기에 표시된 예에서, 조직은 4 % paraformaldehyde (1X PBS에서) 밤 밤, 30 %의 자당 (1X PBS에서)에 몰두하고 있습니다. </li></ol> 4. Counterstaining 및 분석 <ol><li> Counterstaining는 방향뿐만 아니라 관심의 특정 지역을 파악로 해부학 적 위치에 관찰자 도움 유용합니다. 이 준비 효과적인 counterstain 강력히 리터 neurofilament의 immunolabeling (그림 1, 3B, 3E)입니다abels는 axons과 CNS의 axonal 책자의 경계 할 수 있습니다. </li><li> 예측이 rostrocaudal 축을 따라 수백 미크론 이상을 연장 할 수 있으므로 분석이 표시된 지역에 걸쳐 수행해야합니다. 기본적인 분석의 몇 가지 예는 다음과 같습니다 타겟팅 오류 속도, 타이밍 및 / 또는 프로젝션 패턴의 발산의 변화. RDA - 표시 axons은 고해상도 (인물 3A, 3D)와 주변 장치 및 중앙 신경 시스템의 시각화 수 있습니다. </li></ol>

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<li>Pflieger, J. F., Cabana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vestibular+primary+afferents+and+the+vestibulospinal+projections+in+the+developing+and+adult+opossum%2C+Monodelphis+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica.</a> Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).</li>
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</ol>

관심의 충돌이 선포되지 않습니다.

VIIIth 신경의 초기 개발 연구로 인해 여러 별개의 신경절에서 발생하는 배아 axons을 식별하는 어려움의 일부에 제한되어 있습니다. 몇몇 연구는 초기 개발 기간 동안 청각 및 vestibular 감각 세포와 신경 세포의 운명을지도 분자 신호, 5,11,12을 탐험했지만 중앙 innervation을 규제 프로세스는 결정하지 못하고있다. 이하는 주요 핵에 투영 중심 프로세스에 대해 알려진 반면, 음향 신경절 세포 계획의 보고서는 일반적으로 감각 상피 13-15로 주변 프로세스를 설명합니다. embryogenesis 동안 중앙 돌출 VIII의 제트 연료의 파이프의 연구는 포유류의 조직 슬라이스 17 배아 여자의 hindbrain 16 칼슘 이미징의 광학 녹음으로 자주 electrophysiological이지만 이전 신경 회로의 완성을 수행 할 수 없습니다. 라벨 면역 마커의 사용여자 VIIIth 신경의 청각 axons은 현재 적합하지 않을 수 있습니...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 폴리스티렌은 요리를 체중 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 02-202-101 </td><td></td></tr><tr><td> 페트리 접시 35 X 10mm </td><td> 피셔 과학 </td><td> 50820644 </td><td> 실리콘 해부 요리를 만들기 위해 사용 </td></tr><tr><td> Sylgard 실리콘 엘라스토머 키트 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> SYLG184 </td><td> 코트 페트리는 분해 요리를하기 위해 </td></tr><tr><td> 해부 핀 </td><td> 여러 </td><td></td><td> 해부 동안 장소에 배아를 가지고 </td></tr><tr><td> NaCL </td><td> 여러 </td><td></td><td> aCSF 제조법의 일부 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 여러 </td><td></td><td> aCSF 제조법의 일부 </TD&gt; </tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 여러 </td><td></td><td> aCSF 제조법의 일부 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 여러 </td><td></td><td> aCSF 제조법의 일부 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 여러 </td><td></td><td> aCSF 제조법의 일부 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 여러 </td><td></td><td> aCSF 제조법의 일부 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 여러 </td><td></td><td> aCSF 제조법의 일부 </td></tr><tr><td> aCSF에 대한 컨테이​​너입니다. 뚜껑과 반투명 넓은 입 Nalgene 병, 500 ML (16 오즈를) 제안합니다. </td><td> CPLabSafety </td><td> QP-PLC-03717 </td><td> 유리 bubling 줄기에 뚜껑의 상단에 드릴 홀 개구는 액체 침투하는 </td></tr><tr><td> 빈 5 ML의 유리관 또는 유사한 투명 유리 병 </td><td> 미국의 제약 파트너, Inc의 </td><td> 6332300105 </td><tD&gt; 서로와 버블 링 스트림에서 샘플을 별도의 유지 aCSF의 배양시 사용 </td></tr><tr><td> carbogen의 탱크 (95% O 5분의 2 % CO 2) 버블에 튜브로 연결 </td><td> 여러 </td><td></td><td> aCSF에 주입을위한 유리의 줄기 버블에 튜브하여 첨부 </td></tr><tr><td> 유리 줄기 버블 </td><td> 여러 </td><td></td><td> aCSF에 carbogen을 불러 일으킬 수있는 </td></tr><tr><td> 곡선 팁 포셉 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 501008 </td><td> 난자에서 배아의 머리를 제거하려면 </td></tr><tr><td> 두 미세 팁 포셉 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 501985 </td><td> 마이크로 해부에 대한 </td></tr><tr><td> 50 ML의 비커 </td><td> 여러 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine Dextran 아민 (RDA) </td><td> Invitrogen </td><td> 여러 </td><td> 형광 축삭 트레이서 </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> ICN의 Biomedicals </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 (1X PBS), 식염 버퍼 </td><td> 여러 </td><td></td><td> 표준 실험실 시약 </td></tr><tr><td> 얇은 벽 유리 모세 혈관, 1.2 OD, 0.9 ID 4 &quot;(100 ㎜) 길이 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> TW120F-4 </td><td> RDA와 함께로드합니다. 각 모세는 두 유리 micropipettes하게 </td></tr><tr><td> 니들 / 피펫 풀러 </td><td> 데이비드 Kopf 악기 </td><td> 모델 720 </td><td> 사용 설정 : 열 16.4, 솔레노이드 2.2 </td></tr><tr><td> Picospritzer </td><td> 파커 계측 </td><td> 여러 </td><td> 유리 micropipette으로 미세 튜브에 첨부 </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Narishige </td><td> 여러 </td><td></td></tr><tr><td> 형광과 해부 현미경 </td><td> 여러 </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> 4 % Paraformaldehyde </td><td> 여러 </td><td></td><td> 표준 실험실 시약 </td></tr><tr><td> 안티 Neurofilament 항체, 선택 사항 </td><td> Millipore </td><td> AB1991 </td><td> 제조업체에서 권장하는 조직 학적 프로토콜에 따라 </td></tr><tr><td> 그라 이오 스탯과 sectioning에 대한 관련 자료 </td><td> Leica </td><td> 여러 </td><td></td></tr><tr><td> 이미지에 대한 Epifluorescent 현미경 </td><td> 다양한 Zeiss, </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

조류 배아 vestibulocochlear 신경 청각 섬유의 선택적 추적

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

배아 여자가 주변 및 중앙 신경 세포 투영의 연구 널리 사용되는 모델입니다. 청각 시스템에서 VIIIth 뇌신경에서 청각 axons의 선택적 라벨 중앙의 청각 회로 개발 연구를 강화합니다. 내이 (内耳)의 여러 감각 기관에 VIIIth 신경 하나에 기여하기 때문에이 방법은 도전입니다. 또한, 안정적으로 조류 VIIIth 신경 내 axons의 vestibular 그룹 비해 청각을 구분 마커 식별 할하지 못하고있다. 회로가 형성되기 전에 감각 - evoked 응답이 표시되지로 청각 및 vestibular 경로는 초기 배아에서 기능적으로 구별 할 수는 없습니다. 중앙 돌출 VIIIth 신경 axons는 일부 연구에서 추적 된 있지만, 청각 축삭 라벨은 다른 VIIIth 신경 구성 요소 2,3에서 라벨을 동반되었다. 여기, 우리는 선택적으로 labe로 음향 신경절에서 anterograde 추적하는 방법을 설명개발 VIIIth 신경에서 난 청각 axons. 첫째, 산소 인공 뇌척수에 몰두 8 일 여자는 배의 앞쪽 두부 지역의 부분 절개 한 후, 달팽이 덕트는 해부학 적 랜드 마크 식별 할 수 있습니다. 다음, 고급 당겨 유리 micropipette은 음향 신경절 세포이있는 덕트와 인접 깊은 영역으로 rhodamine dextran 아민의 작은 양을 주입하는 위치입니다. 주사 후 30 분 내에, 청각 axons은 hindbrain에 중앙 추적하고 나중에 histologic 준비에 따라 시각화 할 수 있습니다. 이 방법은 중앙 청각 회로 형성에 주변의 개발 연구를위한 유용한 도구를 제공합니다.

VIIIth 신경과 신경 자체의 해부학 적 구조의 구성 요소는 (그림 1, 3) 복잡하고 복잡합니다. 선택적으로 음향 신경절 세포에서 발생하는 섬유를 추적함으로써, VIIIth 신경뿐만 아니라 brainstem 내의 기본 청각 afferents의 세그먼트는 완전히 추적 할 수 있으며, 자신의 vestibular 대응 (그림 2, 3)에서 구별. 마찬가지로,이 기법은 음향 신경절 세포의 주변 계획 (그림 3G)을 연구하는 데 사용, 또는 개인 vestibular 기관에서 발생하는 예측을 공부하도록 수정 될 수 있습니다. axons가 완전히 자신의 전체 길이를 따라 추적하기 때문에 정확한 정량 분석은 또한 청각 섬유 라벨의 이전 방법과는 달리, 초기 innervation의 정확한 타이밍과 패턴 등을 포함하여 개발 기간 동안 vestibular 예측, 타겟팅, 오류 요금 등의 구별 청각을 수행 할 수 있습니다 이 방법은 per...

여기 우리는 신경과 hindbrain의 청각 축삭 섬유의 추적 선택을위한 초기 여자의 태아의 청각 신경에 형광 염료를 주입 한 다음 microdissection 기술을 설명합니다.

조류 배아 Vestibulocochlear 신경 청각 섬유의 선택적 추적

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

본 절차의 목적은 배아의 말초 신경계에서 중추 신경계로 이어지는 청각 섬유를 선택적으로 추적하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마이크로도즈 섹션(microdose section)을 수행하여 복측 연골두개골을 노출시키고 조류의 와우관을 식별합니다. 두 번째 단계는 하부의 청신경절 세포와 그 축삭에 마이크로 주입을 수행하는 것입니다.다음으로, DIA 전이를 위해 샘플을 산소가 공급된 인공 CSF에서 20분 동안 배양합니다. 마지막으로, 조직의 조직학적 준비 및 절편 제작을 통해 청신경절 중심 투사 경로를 현미경으로 시각화할 수 있습니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 제8뇌신경의 선택적 추적이 가능하다는 점입니다.고해상도 청각 섬유를 이용하면 살아있는 조직에서 염료를 빠르게 전달할 수 있으며, 초기 발달 단계에서의 실험이 가능합니다. 이 방법은 청각 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 축삭을 중심 표적으로 안내하는 분자는 무엇인가 하는 점입니다.또는 회로가 부상이나 이독성 노출에 어떻게 반응할까요? 먼저, 500 milliliter 광구 Nalgene 용기에 인공 뇌척수액을 용기의 3분의 2가 찰 때까지 추가합니다. 구멍이 뚫린 뚜껑을 용기에 닫습니다.95% oxygen과 5% carbon dioxide 탱크에 연결된 stem bubbler를 뚜껑의 구멍을 통해 A CSF 내부로 삽입합니다. 가스를 켜고 압력을 조절하여, 기포가 액체의 약 3분의 1 높이까지 일정하게 올라오되 가장자리 너머로 튀지 않을 정도의 세기로 유지합니다. 개별 샘플을 서로 분리하기 위해 최대 6개의 5 mL 유리 바이알을 자(jar) 속에 담급니다.또한 가스 흐름의 난류로부터 보호하십시오. A CSF를 최소 20분 동안 산소화합니다. A CSF가 산소화되는 동안 유리 마이크로 피펫을 당겨 제작하고, 0.4% Triton XX가 포함된 PBS 내의 6.25% rhodine Dexteran 면역 용액으로 마이크로 피펫을 채웁니다. 마이크로 피펫을 마이크로 매니퓰레이터에 부착하고, 미세 핀셋으로 팁을 깨뜨려 20에서 50 micron 크기의 개구부를 형성합니다. 미세 튜브를 사용하여 고정된 마이크로 매니퓰레이터를 피코 스프리처(pico spritzer)에 연결하십시오.나머지 설정을 완료하기 위해 피코 스프리처(pico spritzer)를 10에서 30 PSI 사이로 설정하십시오. 두 개의 해부 핀이 작은 육각형 모양으로 배치된 작은 실리콘 해부 접시가 준비되어 있는지 확인하십시오. 미세 팁 핀셋 두 개를 준비합니다.해부 구역에 곡선 팁 핀셋, 50 milliliter 비커 및 조직 폐기물 함을 준비합니다. 달걀에서 닭 배아를 꺼낸 후, 머리 부분을 실리콘 코팅된 해부 접시에 놓습니다. 웨이 보트(whey boat) 내에서 머리를 복측으로 향하게 배치하여, 이번 사례에서 관심 대상인 우측 귀가 보이도록 합니다.조직이 올바른 위치에 놓이면, 후뇌 부위를 피해 해부 핀으로 조직을 고정합니다. 50 milliliter 비커를 사용하여 산소가 공급된 A CSF 30 milliliters를 디시에 옮겨 조직이 완전히 잠기도록 합니다. 그다음 끝이 가는 핀셋을 사용하여 하악골을 부드럽게 잡고 아래로 벗겨냅니다.그런 다음 관심 있는 쪽의 아래 눈꺼풀을 제거합니다. 다음으로, 남아 있는 입천장과 인후를 포함하여 그 위에 덮인 혈관 및 연조직을 제거합니다. 이러한 조직들이 제거되면 복측 두개골의 매끄러운 표면과 뚜렷한 척추동맥이 드러나야 합니다.내이를 손상시키지 않으면서 외이도, 턱관절 연골 및 중이 주변의 피부를 조심스럽게 절개합니다. 핀셋을 사용하여 턱과 중이의 연골 구조물을 부드럽게 잘라냅니다. 이제 미세 핀셋 팁으로 부드럽게 쓸어내듯 움직여 척추 동맥과 고여 있는 혈액을 제거합니다.혈액이 시야를 가릴 수 있고 응고로 인해 주입 피펫의 입구가 막힐 수 있으므로 이 과정은 중요합니다. 이 시점에는 특징적인 흰색 달팽이관 덩어리가 보여야 합니다. 이 그림의 화살표는 인접한 감각 상피 및 청신경절이 있는 와우관을 나타냅니다.이 부위는 chondra cranium 바로 아래에 위치하며, 여기에서 보는 바와 같이 내이에서 복측으로 뻗어 나온 길쭉한 손가락 모양의 돌출부로 시각화할 수 있으며, 그 정점은 청각 섬유를 표시하기 위해 전방 정중선 근처에 위치합니다. 먼저 주입 피펫을 와우관과 baula papular 부위의 배아 표면 근처에 배치하고, 마이크로 피펫을 천천히 내려 먼저 cranium을 천자합니다. cranium의 이 부위는 주변 영역보다 얇아 관통하는 데 더 적은 힘이 필요합니다.이제 마이크로 피펫이 와우관 내부에 위치해야 합니다. 필요한 경우, 마이크로 피펫을 다시 위치시키지 않고도 기저막 기둥(basilar per pillar)의 시각화를 돕기 위해 이곳에 소량의 추적 염료를 주입할 수 있습니다. 와우관의 깊은 경계에 도달할 때까지 계속해서 낮추십시오.이 이미지는 청각 신경절의 적절한 영역 내 피펫의 이상적인 위치를 보여줍니다. 이 지점에서 주입을 수행한 후, 기저 유두(basilar papilla)의 길이를 따라 여러 영역에서 반복하십시오. 원하는 표지 범위에 따라 수행하며, 전정 신경절(vestibular legina)이 위치한 가장 근위단 팁 부분은 제외합니다.pico spritzer를 10에서 30 PSI 사이로 설정하면, 여기서 보는 바와 같이 각 주입 시 직경 약 200에서 400 microns의 형광 DIA 표지 지점이 생성되어야 합니다. 주입이 완료되면, 여기에서 보여주는 것과 같이 포셉을 사용하여 뇌줄기 위쪽에서 샘플을 절단하고, 이송 피펫을 사용하여 척수 부분을 인공 뇌척수액(CSF)이 담긴 용기 내의 작은 병 중 하나에 넣으십시오.중앙 추적(central tracing)을 원하는 거리에 따라 배아당 20분에서 30분 동안 염료 전이를 진행합니다. 배양 시간이 경과하면 조직을 꺼내어 조직 절편 제작을 준비합니다. 이때 조직을 1X PBS에 희석된 4% 파라포름알데히드(paraldehyde)에 하룻밤 동안 담가 고정한 후, 다시 1X PBS에 희석된 30% 수크로스(sucrose)에서 하룻밤 동안 탈수 과정을 거칩니다.조직을 30% sucrose에서 하룻밤 동안 평형화한 후, 관상면으로 동결 절편을 제작합니다. 절편 제작 후, 적절한 항체를 이용한 면역 표지를 통해 관찰자는 해부학적 위치를 파악하고 특정 관심 영역을 식별할 수 있습니다. 이 이미지는 양측 청신경절이 온전하게 보존된 E 6 뇌줄기의 관상면 뷰를 보여줍니다.도식화된 빨간색 피펫 S는 등외측 진입 지점으로부터 청신경절 세포를 정확하게 타겟팅하는 모습을 보여줍니다. 절편은 축삭 돌기를 강조하기 위해 항-뉴로필라멘트로 면역 표지되었습니다. 전정 기관은 표시된 절편의 머리 쪽에 위치합니다.전정와우신경과 청신경절 및 전정신경절이 표시되어 있습니다. 등쪽이 위쪽이며 스케일 바는 300 microns입니다. 다음은 25 micron 절편의 E8 배아에서 선택적 청각 섬유 추적을 나타낸 대표적인 저배율 및 고배율 이미지입니다.동일한 배아에서 수집한 관상면 절편들은 여기 보이는 것처럼 서로 다른 평면을 나타냅니다. 화살표 머리로 표시된 주입 지점에서 시작하여 화살표로 표시된 뇌신경을 통해, 그리고 이중 화살표 머리로 표시된 일차 청각 핵 표적을 향해 4분기 방향으로 RDA 표지 축삭을 추적할 수 있으며, 스케일 바는 300 microns에 해당합니다. 항-뉴로필라멘트 항체를 이용한 면역 표지는 모든 축삭 투사를 강조하며, 이전 이미지에서 RDA로 추적된 섬유들은 청각 투사 경로 내에 위치합니다.AP와 VP는 각각 신경 진입점 주변의 청각 및 전정 성분을 나타냅니다. 병합된 컬러 이미지는 RDA로 라벨링된 축삭이 국소 해부학적 구조에 어떻게 배치되어 있는지를 보여줍니다. 동일한 배아의 더 척수 쪽 위치를 촬영한 고배율 이미지는 화살표로 표시된 신경 진입점과 이중 화살표 머리로 표시된 중앙 경로를 따라 섬유들이 고해상도로 나타남을 보여줍니다.모든 축삭의 뉴로필라멘트 염색을 통해 P-N-S-C-N-S뿐만 아니라 추정되는 청각 및 전정 투사 경로를 구분할 수 있습니다. 앞서 언급한 바와 같이, AP와 VP는 각각 신경 진입점의 말단 쪽에 위치한 청각 및 전정 성분을 나타내며, AC와 VC는 각각 신경 진입점의 중추 쪽에 위치한 청각 및 전정 투사 경로를 나타냅니다. 마찬가지로, 개별 채널의 중첩은 컬러 머지로 표시됩니다.청신경절의 조직학적 검사를 통해 이전 추적 단계에서 표지된 청신경절 세포의 위치와 별표로 표시된 주변 돌출부를 확인할 수 있으며, A 추적 결과는 기저유두까지 광범위하게 이어집니다. 여기서 AG는 청신경절, bp는 기저유두, lm은 반고막선을 나타냅니다. 스케일 바는 100 microns입니다.마지막으로, 이 도식은 E8 단계에서 청각 특이적 제8뇌신경 표지 시 예상되는 700 micron 추적 경로를 보여줍니다. 빨간색 원으로 표시된 주입 부위는 신경 진입점의 등쪽에 위치하며, 중앙 투사 경로는 주둥이 쪽과 뒤쪽으로 이동합니다. 여기서 후뇌에 도달하면, 스케일 바는 300 microns와 같습니다.이 절차를 수행할 때, 분석 기준에 가장 적합하도록 주입 조건을 조정하십시오. 또한, 샘플 간에 추적 축삭의 정확한 수와 위치에 어느 정도 변동성이 있을 수 있음을 유념하시기 바랍니다.

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조류 배아 Vestibulocochlear 신경 청각 섬유의 선택적 추적

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