형질 전환 생선의 본래 뇌에서 발견 뉴런의 전기적 활동을 기록

본 실험 과정의 전반적인 목표는 온전한 물고기 뇌 표본에서 뉴런의 전기적 활동을 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 MS 2 22에서 4~6개월 된 형질전환 zebrafish를 마취시킨 후 뇌를 적출합니다. 다음으로, GFP로 표지된 관심 뉴런 중 하나에 기록 전극을 접촉시키고, loose patch 또는 whole cell patch clamp 전기생리학 기법을 통해 해당 뉴런의 전기적 활동을 기록합니다.

최종적으로, 결과는 온전한 뇌에서 서로 다른 처리에 반응하여 나타나는 활동 전위의 발화 빈도 변화 또는 막 전위의 변화를 보여줄 수 있습니다. 세포 전기생리학이나 배양 또는 뇌 절편 표본과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 온전한 신경 회로를 가진 전체 뇌 표본에서 뉴런의 전기적 특성을 규명할 수 있다는 점입니다. 이러한 측정값은 생식 신경내분비학에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 동기 부여와 정서적 행동을 조절하는 뉴런과 같은 다른 신경계에도 제브라피쉬 등을 이용하여 적용될 수 있습니다.

본 시연에서는 GnRH3 뉴런이 GFP로 유전적으로 표지된 형질전환 제브라피시를 사용합니다. 먼저 성체 제브라피시를 5 mL의 MS-222에 침지시켜 마취시키십시오. 아가미 운동이 멈춘 후 몇 분 뒤에, 물고기를 어류 식염수가 담긴 60 mm 페트리 접시로 옮깁니다. 이제 가위로 물고기의 가슴지느러미 끝부분에서 머리를 절단하십시오.

어류 식염수가 절반 정도 채워져 있고 yl guard가 깔린 직경 35 mm 페트리 접시에 머리를 옮깁니다. 접시 중앙에는 머리를 배치하고 곤충 핀과 미세 가위를 사용하여 등 쪽이 위로 향하도록 고정할 수 있는 오목한 부분이 있어야 합니다. 두개골 등 쪽의 가장자리를 따라 조심스럽게 절개하여 엽니다.

그 다음, 포셉을 사용하여 두개골을 조심스럽게 제거하여 척수의 전단부를 포함한 뇌의 배측 부분을 노출시킵니다. 이제 미세 팁 포셉으로 척수를 조심스럽게 들어 올린 후, 미세 팁 가위를 사용하여 양측의 연결 신경을 절단합니다. 여기에는 뇌신경, 척수신경, 복측 시신경 및 전방 후각신경의 절단이 포함됩니다.

완전히 해부된 뇌를 신선한 어류 식염수가 채워진 새 페트리 접시에 담아 현미경 아래에 둡니다. 뇌 전체와 뇌하수체가 손상되지 않았으며 절단되거나 천공되지 않았는지 주의 깊게 확인합니다. 손상된 뇌는 폐기하고 바늘을 사용하여 다시 시작합니다.

시아노아크릴레이트와 같은 속건성 접착제를 기록 챔버 중앙에 소량 떨어뜨립니다. 접착제 방울을 1 cm² 면적으로 넓게 폅니다. 그 다음, 뇌 조직을 접착제 위로 빠르게 옮깁니다.

복측이 위를 향하도록 고정하십시오. 이제 뇌가 잠길 정도로 기록 챔버에 어류 식염수를 약 1 mL 채웁니다. 미세 팁 핀셋을 사용하여 뇌의 기록 영역 표면 위에 있는 뇌수막을 앞쪽으로 조심스럽게 제거하십시오.

공기가 포화된 어류 생리식염수를 분당 최소 200 µL의 속도로 뇌에 지속적으로 관류합니다. 6~10 MΩ의 유리 미세 전극을 제작하고, 루즈 패치 기록 용액을 전극의 약 절반 정도까지 채웁니다. 냉각 CCD 카메라가 장착된 정립 형광 현미경을 사용하여, 10배 대물렌즈부터 시작해 GFP가 발현된 말단 신경절 RH3 뉴런을 찾습니다.

그런 다음 40 x 대물렌즈로 전환하여 두부 바로 앞쪽의 후각구 복측 표면 또는 그 근처에 있는 뉴런을 찾습니다. 이제 현미경으로부터 실시간 영상을 제공하는 비디오 모니터로 화면을 전환합니다. 뉴런 군집에는 8~10개의 GnRH 뉴런이 포함되어 있습니다.

마이크로 전극을 기록 챔버 욕조에 배치하여 전극의 팁이 표적 뉴런 위에 오도록 합니다. 마이크로 전극이 막히지 않도록 일정한 약양압을 가합니다. 전극 팁을 표적 뉴런에 조심스럽게 접근시키며, Axo graft 소프트웨어를 통해 전극 저항을 확인하고 모니터링합니다.

전압 클램프 모드에서 씰 테스트(seal test)를 사용할 때, 전극의 팁이 뉴런 표면에 닿으면 이 지점에서 전극 저항이 약간 변합니다. 필요한 경우 양압을 해제하여 저항이 낮은 씰을 형성하고 가벼운 음압을 가합니다. 양호한 기록을 위한 가장 중요한 단계는 깨끗한 뉴런 팔을 선택하는 것이며, 이는 전극과 세포막 사이에 이상적인 씰을 형성하는 데 도움이 됩니다.

이제 전류 클램프 모드로 전환하십시오. PowerLab 프로그램인 Chart를 실행하고, 전류 입력을 주지 않은 상태에서 막 전압을 연속적으로 기록하기 시작하십시오. 필요한 경우 전압 스케일과 기록 속도를 조정하고, 처리를 적용하기 전 약 5분 동안 일반 어류 식염수에서 기저 전기 활동을 기록하십시오. 약물, 호르몬, 펩타이드 등의 목욕 관류액은 200 µL/min의 유량으로 뇌 표본에 투여해야 합니다.

그 다음, 세포 확인 후 세척 기간 동안 일반 어류 생리식염수를 사용하고 전압 클램프 모드에서 전극 저항을 확인 및 모니터링하십시오. 전극 팁이 뉴런 표면에 닿아 전극 저항이 약간 변화하면, 양압을 해제하고 음압을 약간 가하여 뉴런에 고저항 씰(high resistance seal)을 형성하십시오.

입으로 가볍게 흡입합니다. 패치된 세포막을 파열시킵니다. 막이 파열되면 저항이 즉시 약 120 to 250 mega ohms로 떨어집니다.

이제 전류 클램프 모드로 전환하고, 전류 입력 없이 차트를 사용하여 막 전압을 연속적으로 기록합니다. 다시 한번 필요에 따라 전압 스케일과 기록 속도를 조정하십시오. 일반 어류 식염수에서 약 5분 동안 전기적 활성의 기선 기록을 수행한 후, 처치를 적용하고 이어서 세척 기간을 갖습니다. moca 말단 신경 GNRH three 뉴런의 자발적 전기 활성을 전류 클램프 모드에서 기록하였습니다.

전형적인 발화율은 0.5에서 6 Hz의 활동 전위입니다. 활동 전위는 일반적으로 상당히 규칙적인 스파이크 간 간격을 가진 토닉(tonic) 또는 박동형 패턴으로 발화하며, 스파이크 간 막전위는 평균 약 -48 mV입니다. 이러한 실험적 접근 방식은 성체 형질전환 마우스의 전뇌에 위치한 GFP 표지 GNRH 뉴런의 기록에서도 성공적입니다.

형질전환 제브라피시의 적출된 온전한 뇌에서 뉴런의 전기적 활성을 측정하였습니다. 제브라피시의 기록은 루즈 패치(loose patch)를 이용한 DACA 기술과 유사한 방식으로 수행되었습니다. 동일한 기술을 통해 세포 전체 기록(whole cell recording) 또한 가능하였습니다.

meca 말단 신경 GnRH 뉴런과 달리, 전시각 영역, 복측 뇌와 시상하부에 있는 제브라피시 GnRH 뉴런의 자발적 활동 전위 발화 패턴은 종종 불규칙하게 나타납니다. 이 기술을 숙달하면, 적절히 수행했을 때 15분간의 기록을 위해 1시간 내에 완료할 수 있습니다. 행운을 빕니다.