마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

이 절차의 전반적인 목표는 요추 등쪽 뿔에 바이러스 벡터를 정위 주사로 주입하여 마우스 척수에서 공간적으로 제한된 유전자 발현을 달성하는 것입니다. 절차의 첫 번째 단계는 요추를 찾아 노출시키는 것입니다. 두 번째 단계는 척수를 드러내기 위해 척추뼈의 등쪽 부분을 제거하는 것입니다.

후판 절제술이라고 하는 절차. 다음으로, 마이크로 주사기 펌프에 연결된 유리 피펫을 등쪽 뿔 위에 놓고 척수 안으로 내립니다. 마지막 단계는 벡터 현탁액을 천천히 주입하는 것입니다.

2주 후, 등쪽 뿔 뉴런의 형질 주입은 바이러스의 분포를 추적할 수 있는 녹색 형광 단백질의 발현에 의해 입증되었습니다. 이 방법은 일부 감각 경로에서 뉴런의 기능을 밝히는 데 도움이 됩니다. 우리는 특히 염증성 또는 신경병성 통증의 발달에 초점을 맞춘 연구에서 이를 사용합니다.

시각적 시연은 정위 프레임에 마우스를 배치하는 방법을 배우는 데 중요합니다. 후판 절제술은 매우 섬세한 기술이기 때문에 척추를 적절하게 고정하는 것이 절차의 성공을 위해 필수적입니다. 제 연구실의 대학원생인 Martin Mole이 시연을 할 예정입니다.

연구 조교인 John Wang은 수술 하루나 이틀 전에 그를 도울 것입니다. Pul glass 피펫을 사용하여 40 마이크로 미터의 팁 직경을 얻고 수술 당일 팁을 20도 각도로 경사지게합니다. 수술 장비를 소독하고 멸균 수술 도구를 준비하여 정위 프레임을 설정하는 것으로 절차를 시작합니다.

마이크로 주사기 주입기를 매니퓰레이터에 장착하고 장치를 연결합니다. 압축 피팅을 사용하여 유리 피펫 중 하나를 마이크로 주사기에 부착합니다. 이제 마이크로 주사기에서 플런저를 제거합니다.

주사기에 미네랄 오일을 채운 다음 플런저를 다시 삽입하고 팁까지 끝까지 밀어 넣습니다. 기포가 생성되지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 마이크로 주사기를 주입기의 홀더에 삽입합니다.

다음으로, 냉동실에서 바이러스를 제거하고 사용 직전에 멸균 인산염 완충 식염수로 원하는 입자 농도로 희석하여 바이러스 입자 현탁액을 준비합니다. 5 마이크로 리터의 바이러스 현탁액을 작은 param 조각에 피펫으로 만듭니다. 그런 다음 유리 피펫 팁을 드롭으로 내리고 플런저를 당겨 마이크로 주사기를 채웁니다.

끝에. 피펫 팁이 막히는 것을 방지하기 위해 피펫 팁에 작은 기포를 만듭니다. 이 단계에서는 발열 패드의 벤치를 소독제로 닦아 수술 부위를 준비합니다.

그런 다음 불소 흡입으로 마우스를 마취시킵니다. 다음으로, 수술 중 건조되지 않도록 각 눈에 윤활제를 바르십시오.그 후, 허리에서 마우스의 목까지 털을 면도합니다. 클로르헥시딘 또는 포비돈 요오드와 같은 국소 소독제와 70% 에탄올을 번갈아 가며 물티슈로 피부를 소독합니다.

그런 다음 생리식염수로 1-10을 희석한 0.25%부피바카인을 절개 부위에 침투시킵니다. 그 후 흉곽의 새끼 끝의 피부를 절개하고 정중선을 따라 2-3cm 떨어진 척추를 덮고 있는 근막을 분리했습니다. 척추뼈에 끼워져 있고 마지막 한 쌍의 갈비뼈를 잡고 있는 척추 L 1을 확인하고 등쪽 표면에 부착된 작은 척추 근육과 인대를 제거하여 노출시킵니다.

그런 다음 한 쌍의 add와 popps로 척추 L 하나를 약간 들어 올립니다. 다음으로, 전용 후판 절제술을 사용하여 척추돌기와 척수를 노출시키는 얇은 판을 포함한 척추의 등쪽 부분을 제거합니다. 이 절차를 수행하는 동안 경막이나 척수를 손상시키지 마십시오.

그런 다음 마우스를 입체 프레임의 가열판으로 옮기고 후속 작업 중에 마우스의 온도를 모니터링합니다. 이제 v 노치 스파이크를 사용하여 척추를 안정화하여 호흡하는 동안 척추뼈가 움직이지 않도록 합니다. 다음으로, 피펫 팁이 후판 절제술 부위 위에 오도록 마이크로 주사기를 더 가까이 가져옵니다.

바이러스 현탁액이 피펫에서 나오는 것을 볼 때까지 플런저를 내립니다. 멸균 거즈로 물방울을 제거하십시오. 그런 다음 피펫 팁을 노출된 척수의 가장 먼 부분에 놓습니다.

피펫을 후방 정중 열구 위의 중앙에 놓고 팁을 측면으로 500마이크로미터 이동합니다. 그 후, 팁을 탯줄 표면으로 내리고 경막에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 유리 끝을 내리고 척수 안으로 300 마이크로 미터 피펫을 넣으십시오.

분당 200나노리터의 속도로 1마이크로리터의 바이러스 현탁액을 주입합니다. 주입이 끝나면 피펫을 천천히 집어넣기 전에 최소 2분 동안 기다립니다. 척추 분절 L 4에서 바이러스 벡터의 완전한 분포를 달성하기 위해 노출된 척수의 가장 많은 부분에서 주입 절차를 반복합니다.

두 개의 주사 부위는 L, 4 개의 분절에 위치합니다. 주입 해제 후 대상 영역의 조직 손상을 방지하기 위해 V 노치의 척추 L one이 고정되고 입위 프레임에서 마우스를 제거합니다. 다음으로, 5 oh Vicryl로 근막을 봉합합니다.

닫힌 근막은 후판 절제술 부위를 덮습니다. 그런 다음 나일론 봉합사나 수술용 스테이플로 피부를 봉합합니다. 수술 후 72시간 동안 진통제를 제공하고 킬로그램당 5mg의 카프로펜을 매일 피하 주사합니다.

마우스를 부드럽고 특별하지 않은 침구가 있는 복구 케이지로 옮깁니다. 편안한 호흡을 위해 마우스를 옆으로 눕힙니다. 그런 다음 동물이 완전히 깨어날 때까지 동물을 모니터링하십시오.

앰뷸런스를 타고 술을 마시기 시작한다. 처음 3일 동안은 매일 검사를 통해 수술 후 회복 상태를 모니터링합니다. 그런 다음 실험이 완료될 때까지 격일 또는 일주일에 3일에 한 번씩 사용합니다.

수술 후 7일에서 10일 사이에 상처 치유가 완료됩니다. 피부 봉합사 또는 스테이플을 제거합니다. 이 그림은 L 4개의 척수의 왼쪽 등쪽 뿔에서 향상된 녹색 형광 리포터 단백질(enhanced green fluorescent reporter protein, EGFP의 발현을 보여줍니다).

R-A-A-V-E-G-F-P 뉴런의 입체주사 2주 후, 뉴런은 뉴런 핵 단백질에 대한 면역염색을 했다. 등쪽 기둥에 흩어져 있는 형질주입된 신경교세포를 가리킵니다. 내측 등쪽 뿔에 있는 뉴런의 약 80%가 연습으로 감염되었습니다.

시술은 30분에서 40분 안에 완료할 수 있으며, 시술 중에는 멸균 상태를 유지하는 것을 잊지 마십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스 척수의 용량 ho에 소나무 내 chimal 주사를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 우리는 유전자 조작을 위해 이 기술을 사용하고 있지만 척추 내 약물 적용과 같은 다른 목적으로 조정할 수 있습니다.