Name: 마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 배우세요 마우스 척추 요추 후각각에 바이러스 벡터를 스테레오택식 주입하여 공간적으로 제한된 유전자 발현을 달성하는 방법을. 이 기술은 척수 기능 연구와 신경 기전 이해에 활용됩니다.

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우리는 기술 지원을 Bakhos A. Tannous, 박사, rAAV-eGfp 벡터으로 우리를 제공 매사추세츠 종합 병원, 찰스 타운, 매사추세츠,의 신경 과학 센터에서 벡터 개발 및 생산 이사, 존 강타 감사드립니다. 이 작품은 신경 질환 및 뇌졸중의 국립 연구소에서 교부금으로 R01 NS050408을 (JS까지) 지원되었습니다.

설명 수술 절차는 컬럼비아 대학 (Columbia University)의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 1. 장비 및 바이러스 입자 현탁액의 준비 <ol><li> 장비를 청소하고 소독, 수술기구와 척추 뼈의 L1 문제를 해결하는 데 사용됩니다 V 노치 스파이크를 소독. </li><li> 당기 및 베벨 유리 피펫. 우리는 40 μm의 팁 직경이 20 °의 각도로 beveled 아르 피펫을 사용합니다. 유리 피펫 멸균을. </li><li> stereotaxic 프레임을 설정, 머니퓰레이터에 microsyringe 분사기를 장착하고 컨트롤러에 주입기를 연결합니다. </li><li> 압축 피팅 키트를 사용하여 microsyringe에 유리 피펫 중 하나를 첨부합니다. </li><li> microsyringe에서 플런저를 제거하고 미네랄 오일과 주사기를 입력합니다. 오일 레드 O (1 - (2,5 - 디메틸-4-(2,5-dimethylphenylazo) phenylazo) -2 - 나프톨은)는 v를 높이기 위해 미네랄 오일에 추가 할 수 있습니다isibility. 플런저를 다시 삽입하고 팁의 모든 방식을 밀어. 조심스럽게 기포를 생성하지 마십시오. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛의 바이러스 입자 현탁액을 준비합니다. 얼음에 얼어 붙은 바이러스를 해동하고, 단지 사용하기 전에, 원하는 입자 농도에 생리 멸균 인산 버퍼로 희석. </li><li> 주입기의 홀더에 microsyringe를 삽입합니다. </li><li> 작은 플라스틱 시트로 바이러스 정지 피펫 5 μl, 예를 들어 Parafilm. 드롭에 유리 피펫 팁을 절감하고 microsyringe을 채우기 위해 플런저를 당긴다. 막힘 않도록하기 위해 피펫 팁의 작은 기포를 만듭니다. </li></ol> 2. Laminectomy <ol><li> 벤치와 살균제로 소독 가열 패드를 닦고하여 수술 영역을 준비합니다. </li><li> 마우스를 마취. 우리는 isoflurane과 흡입 마취를 사용하여 (3 %를 유도, 유지 보수 기간 동안 2% -3 % 중). </li><li> 동안 건조에서 눈을 보호하기 위해 각 눈에 윤활제를 배치작동. </li><li> 허리에서 마우스의 목에 털을 면도하고 chlorhexidine 또는 povidone-요오드와 70 %의 에탄올과 같은 국소 살균의 잎사귀 교대로 피부를 소독. 수술 드레이프와 무균 준비된 사이트를 격리하고 bupivacaine (0.25 % 생리 식염수에 희석 1시 10분)로 절개 사이트를 침투. </li><li> 중간 선 (2-3 ㎝)을 따라 흉곽의 꼬리 끝에있는 피부를 절개하고 척추를 덮고있는 근막을 분리합니다. </li><li> 척추는 척추 열보다 출생 후의 개발 기간 동안 이전의 성장을 중지하기 때문에, 척추 세그먼트 L4는 첫 번째 요추 척추 (L1) 아래에 자리 잡고 있습니다. 척추 L1은 갈비뼈의 마지막 쌍을 보유하고있는 척추에 꼬리에 자리 잡고 있습니다. 확인하고 작은 척추 근육과 등쪽 표면에 부착 인대를 제거하여 척추의 L1을 쉽게받을 수 있습니다. </li><li> 약간 Adson의 포셉과 함께 척추 뼈의 L1를 들고십시오. 등쪽의 portio를 제거하는 전용 laminectomy의 집게를 사용하여N 척추 (척추와 얇은 판)와 척수를 노출의. 척수를 손상하지 마십시오. </li><li> stereotaxic 프레임에 가열 플레이트에 마우스를 전송합니다. 후속 작업 중에 마우스의 온도를 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 주입 <ol><li> V 노치 스파이크와 척추 L1 문제를 해결했습니다. 척추 뼈가 호흡하는 동안 움직이지 않도록 스파이크는 척추를 안정화해야합니다. </li><li> 가까이 있으므로 피펫 팁은 laminectomy 사이트 위에있는 microsyringe 가져와. 당신은 피펫을 종료 바이러스 정지가 나타날 때까지 플런저를 낮 춥니 다. 멸균면 팁으로 작은 물방울을 제거합니다. </li><li> 노출 된 척수의 뱃 부리 장식이있는 - 가장 부분에 피펫 팁을 배치합니다. 센터 뒤쪽 중간 고랑 위의 피펫 다음, 500 μm 측면 팁을 이동합니다. 코드와 펑크 경질 한 학교의 표면에 팁을 낮추거나, 당신이 unbeveled 유리 피펫 작업을하는 경우, D에게 주사에 beveled 철강 캐뉼라를 사용하여우라. 척수에 유리 피펫 300 μm의 팁을 낮 춥니 다. </li><li> 200 NL / 분의 속도로 바이러스 정지 1 μl를 삽입. </li><li> 분사의 끝에서 천천히 retracting 피펫을하기 전에 최소한 2 분 정도 기다리십시오. </li><li> 척추 세그먼트 L4에서 바이러스 벡터의 전체 분포를 달성하기 위해 노출 된 척수의 꼬리 - 대부분의 부분에 3.5 단계 3.3를 반복합니다. 두 사출 사이트는 대상 지역의 조직 손상을 방지 할 수 뱃 부리 장식이있는 및 L4 세그먼트의 꼬리에 위치해 있습니다. </li></ol> 4. 상처 폐쇄 <ol><li> 릴리스 척추 V 노치 클램프의 L1하고 stereotaxic 프레임에서 마우스를 제거합니다. </li><li> 5.0 vicryl과 근막을 봉합 해. 폐쇄 근막은 laminectomy 사이트에 대한 커버를 제공합니다. </li><li> 나일론 봉합이나 수술 스테이플로 피부를 닫습니다. </li></ol> 5. 수술 후 관리 <ol><li> 부드러운 nonparticular 침구 복구 케이지에 마우스를 전송합니다. t에 배치그는 편안한 호흡을 위해면. 이 걸을 수있는, 완벽하게 경고하고 술을 시작할 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 우리는 carprofen 매일 피하 주사 (5.0 밀리그램 / kg)와 72 시간에 postsurgical 진통제를 제공합니다. </li><li> 처음 3 일간 매일 검사하여 postsurgical 복구를 모니터링 한 다음 실험까지 매일 3 일에 한 주이 완료됩니다. </li><li> 상처 치유가 완료되면, 7-10일 수술 후 피부 봉합 또는 스테이플을 제거합니다. </li><li> 실험 완료 후 동물을 안락사시켜야. </li></ol>

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</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

Stereotaxic 벡터 주입은 neurodegeneration 11 예방 또는 치료에 대한 상해 9,10, 또는 유전자 치료에서 재생하는 동안 6,7 또는 optogenetic의 해부 8, 축삭 안내를 확산 transsynaptic 바이러스에 따라 이러한 neuronal 네트워크 매핑과 같은 응용 프로그램에 대한 척추의 뉴런을 대상으로 할 수 있습니다 12. 바이러스 벡터는 somatosensory, 모터 및 자율 경로주세요 9,10,13-15을 공부하는 척수의 유전자 조작에 사용되었습니다. 마우스는 가장 널리 뇌 또는 척수에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주사를 포함하는 연구에 사용 된 모델 생물이지만, 기술은 nonhuman 영장류 16 등의 다른 종에 채용되었습니다. 마우스 척수로 Stereotaxic 벡...

마우스 조건부 유전자 조작의 고급 기술은 중추 신경계의 신경 경로와 기능 연결의 탐구에 다각적 인 접근을 가능하게합니다. Transgenes은 에스트로겐 수용체 (1)의 변이 리간드 결합 도메인을 인식 억제 또는 유전자 전사의 활성화, 또는 tamoxifen으로 작동하도록 설계 할 수있는 테트라 사이클린 제어 transactivator에 행동 등 doxycycline와 같은 작은 분자 effectors에 의해 규제 될 수 있습니다 . 돌이킬 수없는 transgene 수정은 일반적으로 데 옥시 리보 핵산 (DNA) recombinases에 의해 달성된다. Cre (원인 재조합) 및 Flp (flippase 재조합 효소)는 절단, 반전 또는 각각 1 loxP (교차로 X의 궤적 이상, P1) 또는 Frt (flippase 인식 대상) 사이트로 둘러싸인 아르 DNA 조각의 translocation을 catalyze. 응용 프로그램은 유전자 활성화 또는 입을과 inducible ribonucleic 산성 (RNA) 간섭을 포함 <sup&gt; 2. 이러한 β-갈 락토 또는 알칼리성 인산 가수 분해 효소와 같은 형광 또는 효소 기자 조건부 표현식은 뉴런에 라벨 및 국소 조직과 연결 심사 3하는 데 사용할 수 있습니다. 북미 (의 대규모 mutagenesis 프로젝트 <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> )와 유럽 ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm가</a> )와 마우스 배아 줄기 세포 클론의 라이브러리를 생산하고 있습니다 결국 전체 마우스 게놈을 충당 할 조건부 유전자 목표 및 트랩. 이 클론에서 생성 된 쥐들이 선택적 유전자 조작에 대한 뉴런의 특정 인구 (에 특정 발기인 또는 loci에서 DNA의 recombinases을 표현하는 마우스 라인의 확장 번호로 교차 될 수 있습니다 <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . PHP</a> ). <p class= &quot;jove_content&quot;&gt; 그러나, 뉴런 또는 관심 분야의 특정 지역의 고유 한 사람들에게 유전자 조작을 제한하는 것은 유전자 관심의 신경 세포 인구에 특정 발기인이 알려져 있지 않은 경우 혼자 타겟팅 또는 지역의 모든 뉴런으로 표현하지함으로써 달성 할 수 없습니다 관심. 척수에서 실험 디자인은 하나 또는 두 개의 craniocaudal 세그먼트에 유전자 조작의 공간적 제한을 요구할 수 있습니다. Cre 또는 Flp을 표현 바이러스 벡터의 Stereotaxic 주입 floxed 또는 flrted 대립 유전자 소위, DNA 조각이 loxP 또는 Frt 사이트으로 둘러싸인되어있는 마우스의 척수에 지역에 유전자 재조합을 제한 할 수 있습니다. 제정 DNA를 다시 정리하기는 달리, 이는 recombinase 표현 생쥐와 이종 교배하는 동물에서 나타날 전략이 또한 유전자 활성화 또는 입을 통해 일시적으로 제어 할 수 있습니다. 인코딩 바이러스 성 벡터는 floxed 또는 transgenes이 correspo을 표현하는 쥐 유전자 조작의 역 옵션을 제공 경솔한 짓을뉴런 특정 발기인의 recombinase의 하류를 nding. 뉴런에 대한 친화력과 여러 재조합 벡터는 4 이용하실 수 있습니다. 높은 용량 (베짱) 아데노 바이러스, adeno - 관련 바이러스, 헤르페스는 바이러스를 단순하고 lentivirus는 일반적으로 neurotropic 벡터를 사용합니다. 연구 질문에 해당하는 바이러스를 선택하면 실험 설계의 중요한 부분입니다. transgene의 크기, 배달 경로, 염증과 독성 부작용 4 간주해야 glial 세포, 감염 효능, 반대로 뉴런에 감염의 특이성. 여기 우리는 척추의 등 뿔, 우리는 고통의 신경 생물학에 대한 우리의 연구에서 조건부 유전자 조절을위한 고용 한 기술로 바이러스 벡터의 stereotaxic 주사를 설명합니다. 등쪽 뿔은 nociceptive 뉴런을 포함한 기본 somatosensory 뉴런에서 수입 성의를 입력받습니다. 프로젝션 뉴런이에서 전달하기 전에 지역 interneurons는 정보를 처리뇌 5 등쪽 뿔. 우리는 constitutively 활성화 사이토 메갈로 바이러스 프로모터에서 더욱 녹색 형광 단백질 (eGfp)를 표현하는 neurotropic 재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAV)와 척추 segmental 수준 L4의 등쪽 뿔 뉴런의 감염을 보여줍니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 재료 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td></td></tr><tr><td> 척추베이스 플레이트 </td><td> 데이비드 Kopf 악기 </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> 작은 동물 stereotaxic 악기 </td><td> 데이비드 Kopf 악기 </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 가스 마취 헤드 홀더 </td><td> 데이비드 Kopf 악기 </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> 조정 기본 장착 </td><td> 데이비드 Kopf 악기 </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> V 노치 스파이크 </td><td> 데이비드 Kopf 악기 </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> 작은 동물 온도 제어 시스템 </td><td> 데이비드 Kopf 악기 </td><td> TCAT - 2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson 포셉 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11006-12 </td><td></td></tr><tr><td> Laminectomy의 포셉 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4 컨트롤러와 UltraMicroPump (한) </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Microsyringe, 65RN </td><td> 해밀턴 </td><td> 7633-01 </td><td></td></tr><tr><td> RN 압축 피팅, 1mm </td><td> 해밀턴 </td><td> 55750-01 </td><td></td></tr><tr><td> 붕규산 유리 모세 혈관 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 stereotaxic 주입

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

바이러스 벡터의 Intraparenchymal 주사가 뉴런 또는 중추 신경계의 특정 지역의 독특한 인구에 조건부 유전자 조작을 할 수 있습니다. 우리는 마우스 척추의 등 뿔의 대상으로 유전자 발현이나 입을 수 stereotaxic 분사 기술을 보여줍니다. 수술 절차는 간단합니다. 그것은 동물과 척추 손상되지 않은 운동성의 빠른 복구를 위해 제공하는 하나의 척추 뼈의 laminectomy이 필요합니다. beveled 유리 캐뉼라와 microsyringe의 낮은 속도와 사용의 작은 벡터 정지 볼륨의 조절 주입은 조직 병변을 최소화합니다. 벡터에 대한 현지 면역 반응은 고용 바이러스의 고유 특성에 따라, 우리의 경험으로는, 재조합 adeno - 관련 바이러스가 사용될 때 미성년자 수명이 짧은 것입니다. 이러한 강화 된 녹색 형광 단백질 등의 리포터 유전자는 벡터의 모니터링 공간 배포를 용이하게하고, 효능 및 세포 specitransfection의 ficity.

성공적으로 transfection 수율 contralateral 측면, 배면의 뿔과 등쪽 루트 신경절의 등 뿔을 구해 주신 주입 등쪽 뿔 (그림 1)의 뉴런에 강력한 유전자 표현. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 등쪽 뿔 뉴런의 Transfection. (A) L4 척추, rAAV-eGfp의 stereotaxic 주입 후 2 주 (혈청 형 AAV2 / 8 / 10 9 게놈 사본의 왼쪽 등쪽 뿔에있는 형광 기자 eGfp (녹색)의 표현 ) μl. 뉴런은 neuronal 핵 단백질 (NeuN, 빨간색)을 immunostained되었습니다. 화살표는 등쪽의 항목에 흩어져 transfected glial 세포에 지점을 향합니다. 스케일 바, 150 μm. (B) 내측 등쪽 뿔...

바이러스 성 벡터는 타겟 유전자 조작을 위해 수 있습니다. 우리는 등쪽 뿔에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주입, 기본 somatosensory afferents 및 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 접촉의 눈에 잘 띄는 사이트를 사용하여 조건부 유전자 발현 또는 마우스 척추 절제하는 방법을 보여줍니다.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

이 절차의 전반적인 목적은 요수 배측각(lumbar dorsal horn)에 바이러스 벡터를 정위적으로 주입하여 마우스 척수 내에서 공간적으로 제한된 유전자 발현을 달성하는 것입니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 요추를 찾아 노출시키는 것입니다. 두 번째 단계는 척수를 드러내기 위해 척추의 배측 부분을 제거하는 것입니다.laminectomy라고 불리는 절차입니다. 다음으로, 마이크로 시린지 펌프에 연결된 유리 피펫을 후각(dorsal horn) 위에 배치하고 척수로 내립니다. 마지막 단계는 벡터 현탁액을 천천히 주입하는 것입니다.2주 후, 녹색 형광 단백질의 발현을 통해 후각 뉴런의 형질전환이 입증되며, 이를 통해 바이러스의 분포를 추적할 수 있습니다. 이 방법은 일부 감각 경로에서 뉴런의 기능을 규명하는 데 도움이 됩니다. 당사는 특히 염증성 또는 신경병성 통증의 발생에 초점을 맞춘 연구에 이 방법을 사용합니다.마우스를 정위 고정 장치 내에 배치하는 방법을 배우는 데 있어 시각적 시연은 매우 중요합니다. 척추궁 절제술은 매우 정교한 기술이므로, 시술의 성공을 위해서는 척추를 적절하게 고정하는 것이 필수적입니다. 저희 실험실의 대학원생인 Martin Mole이 이 절차를 시연하겠습니다.연구 보조원인 John Wang이 시술 1~2일 전에 그를 도울 예정입니다. 수술 당일에 유리 피펫을 가열하여 끝단 직경이 40 micrometers가 되도록 당기고, 끝단을 20 degrees 각도로 비스듬하게 깎습니다. 수술 기구를 소독하고 멸균된 수술 도구를 준비하여 정위 고정 장치를 설치함으로써 시술을 시작하십시오.마이크로 시린지 인젝터를 매니퓰레이터에 장착하고 장치의 전원을 연결합니다. 압착 피팅을 사용하여 유리 피펫 하나를 마이크로 시린지에 연결합니다. 그런 다음 마이크로 시린지에서 플런저를 제거합니다.시린지에 미네랄 오일을 채운 후, 플런저를 다시 삽입하여 팁 끝까지 완전히 밀어 넣습니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 그 다음, 마이크로 시린지를 인젝터의 홀더에 삽입합니다.다음으로, 냉동고에서 바이러스를 꺼낸 후, 멸균 인산 완충 식염수로 원하는 입자 농도까지 희석하여 사용 직전에 바이러스 입자 현탁액을 준비합니다. 바이러스 현탁액 5 µL를 파라필름의 작은 조각 위에 피펫팅합니다. 그런 다음 유리 피펫 팁을 방울 속으로 내리고 플런저를 당겨 마이크로 시린지를 채웁니다.마지막으로, 피펫 팁이 막히는 것을 방

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Porlan, E., et al. 신경줄기세포 자율 및 비자율 효과 분석을 위한 성체 마우스 V-SVZ 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 마우스 모델에서 바이러스 운반 치료 유전자의 정위 주입을 통해 심실-뇌실하 영역(V-SVZ)에서 신경 줄기 세포(NSC)의 안정적인 유전자 변형을 보여줍니다. 바이러스는 NSC에 들어가 역전사를 거쳐 게놈에 통합되어 신경치료 응용을 위한 안정적이고 효율적인 유전자 변형을 가능하게 합니다.

마우스 모델에서 안정적인 유전자 변형을 위한 바이러스의 정위 주사

출처: Chen, S., et al., 신생아 마우스 뇌의 선조체 세포에서 유전자 조작을 위한 정위 수술. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 Cre 재조합효소와 녹색 형광 단백질 또는 GFP를 암호화하는 바이러스 벡터를 유전자 변형 마우스 새끼의 선조체에 정위 주입하여 loxP 측면 STOP 카세트를 절제하여 적색 형광 단백질 또는 RFP를 리포터로 활성화하여 유전자 조작을 달성하는 방법을 보여줍니다.

마우스 새끼 선조체에서 유전자 조작을 위한 바이러스 벡터의 정위 미세 주입

출처: Tadokoro, T., et al. 성인 마우스에서 연하 아데노 관련 바이러스 9(AAV9) 벡터 전달. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 마우스의 척수에 유전자 전달을 위한 연막하 주입 기술을 보여줍니다. 이 절차에는 경막을 노출시키고, 연막을 천공하고, 형광 단백질 발현 유전자를 운반하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)를 연막하 공간에 주입하는 과정이 포함됩니다. 주사 및 회복 후 바이러스는 척수 세포의 유전자 발현을 촉진하여 표적 유전자 발현을 연구할 수 있습니다.

유전자 발현을 평가하기 위한 마우스 척수에서 연막하 유전자 전달

출처: Pereira, M. et. al., 바이러스 벡터의 뇌내 주사에 의한 상주 신경교세포를 인터뉴런으로 생체 내 직접 재프로그래밍. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 형질전환 마우스의 대뇌 피질에 아데노 관련 바이러스를 정위 주사하여 Cre 의존성 뉴런 재프로그래밍 및 형광 리포터 유전자를 신경교세포에 전달하는 방법을 보여줍니다.

마우스 모델에서 신경교세포 재프로그래밍을 위한 바이러스 벡터의 정위 주입

출처: Fricano-Kugler, CJ, et al. 정위 주사를 통한 고역가 CRISPR 레트로 및 렌티바이러스의 설계, 포장 및 전달. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 마우스 뇌에서 정밀한 신경 유전자 편집을 위한 정위 바이러스 주입을 보여줍니다. 이 프로토콜은 치상회로의 정확한 바이러스 전달을 보장하여 형광 표지 및 CRISPR 매개 유전자 녹아웃을 가능하게 하여 생체 내에서 신경 회로, 유전자 기능 및 질병 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

마우스 뇌에서 표적 신경 유전자 편집을 위한 정위 바이러스 주사

출처: Li, D., et al. 성인 마우스에서 재조합 아데노 관련 바이러스의 직접 척수강내 주사. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 깨어 있는 마우스의 뇌척수액(CSF)에 아데노 관련 바이러스(AAV)를 척수강내 주사하는 절차를 보여주며 주사기 준비, 척추 정렬 및 정확한 바늘 삽입을 다룹니다. 이 방법은 표적 유전자 전달을 검증하여 CNS 치료의 잠재력을 뒷받침합니다.

중추신경계 질환 치료를 위한 마우스 모델에서 바이러스의 척수강내 전달

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

Intraspinal 주입 recombinase 종속 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV)의 척수에서 모든 유전자 이라는 셀 형식을 조작 하 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 transduce 요 추 척수의 등 쪽 뿔에 신경 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조작된 신경 하위의 기능 심문 수 있습니다.

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

이 프로토콜에서는 쥐 척수 조직으로 retrogradely 운송할 수 있는 바이러스 성 벡터의 주입을 보여 줍니다. 벡터는 시 냅 스에서 찍은 이며 대상 뉴런의 세포 체에 이송. 이 모델은 중요 한 척추 경로 또는 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 대상 셀의 역행 추적에 적합 합니다.

직접 분사 Lentiviral 벡터의 하이라이트 쥐 척수에서 여러 모터 통로

이 프로토콜은 전방 화학 유전 변형제를 체성 운동 피질에 주입하고 역행 수송 가능한 Cre 재조합 효소를 자궁 경부 척수에 주입하여 출생 후 5-10 일에 신생아 쥐의 세포 하위 집단에 유전자 요법을 적용하는 새로운 방법을 보여줍니다.

뇌 및 척추 결합 수술을 사용하여 이중 바이러스 벡터로 신생아 쥐의 피질척수관 표적화

요추 척추내 주사는 중추 신경계에 유전자 요법을 전달하기 위한 번역적으로 관련된 투여 경로를 나타냅니다. 신생아, 청소년 및 성인 마우스와 쥐의 요추 척추 내 주사에 대한 이 포괄적이고 표준화된 프로토콜은 연구자들이 전임상 유전자 치료 연구에 이 기술을 채택하도록 안내하는 것을 목표로 합니다.

마우스와 쥐에서 중추 신경계 표적화를 위한 유전자 치료 벡터의 요추 내 주입

배우세요 마우스 척추 요추 후각각에 바이러스 벡터를 스테레오택식 주입하여 공간적으로 제한된 유전자 발현을 달성하는 방법을. 이 기술은 척수 기능 연구와 신경 기전 이해에 활용됩니다.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

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