양이온 성 리포좀을 통해 특정의 siRNA 반복 전달하여 마우스 폐 Intersectin-1의 장기 침묵. 전자 현미경에 의한 넉다운 효과의 평가

다음 실험의 전반적인 목표는 intersecting one s 발현의 장기적 넉다운이 생쥐 폐의 구조와 기능에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 생쥐 폐 혈관을 표적으로 하는 특정 INA 이중 가닥 리포좀 복합체를 준비합니다. 그다음 단계로, intersecting one S의 효율적인 억제를 달성하기 위해 INA 리포좀 복합체를 안와하 정맥 주사로 투여하며, 이를 24일 동안 72시간마다 반복적으로 수행합니다.

다음으로, intersect in one s 단백질 및 mRNA 수준을 평가하고 폐의 광범위한 형태학적 분석을 수행하기 위해, 주입된 마우스의 폐 조직을 채취하여 생화학적 분석 및 EM 조사를 실시합니다. 특정 intersect in one 항체를 이용한 폐 용해물의 western blot 결과와 Q-R-T-P-C-R 분석 결과는 24일 연속으로 intersect in one s가 특이적이고 효율적으로 knockdown 되었음을 보여줍니다. rymers나 렌티바이러스와 같은 기존 방법론과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 이온성 리포좀의 폐 전달이 재현 가능하고 안전하며 독성이 없고 폐 내피세포에서 매우 효과적이라는 점입니다.

우리는 in vivo에서 N-down의 교차 효과를 평가하기로 결정했으나 다른 SRNA 전달 방법들이 효과가 없었을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 이온성 리포좀을 준비하려면 둥근 바닥 플라스크에 dimethyl diod desal ammonium bromide(DOAB) 표준 용액 315 µL를 넣고, 이어서 콜레스테롤 표준 용액 200 µL와 클로로포름 9.5 mL를 넣은 뒤 회전시켜 혼합합니다. 플라스크를 37 °C, 분당 100회 이상의 회전 속도로 설정된 로터리 증발기에 연결합니다.

첫 번째 아르곤 밸브를 시계 방향으로 돌려 완전히 엽니다. 항상 이 밸브를 가장 먼저 열고 닫아야 합니다. 두 번째 밸브는 플라스크 내부로 불어넣는 아르곤 압력을 조절합니다.

완만한 압력을 유지할 수 있도록 부분적으로 엽니다. Argonne 가스 탱크와 roto vapor를 연결하는 튜브 위로 드라이아이스가 떨어지기 시작하면, 플라스크가 완전히 잠기지 않고 물에 닿을 때까지 roto vapor를 수조로 내립니다. 속도 조절 다이얼을 100에서 120 RPM으로 올립니다. 플라스크 내의 모든 클로로포름이 증발하면 장치를 정지시킵니다.

로토베이퍼의 속도 조절 다이얼을 0으로 돌리고 아르곤 탱크 밸브를 닫습니다. 플라스크를 제거합니다. 지질을 재현탁시키기 위해 5% glucose 용액 2 mL를 플라스크에 추가합니다.

1 mL 피펫 팁을 사용하여 플라스크 바닥을 철저히 긁어 모든 지질을 용해시킵니다. 플라스크를 천천히 볼텍싱하면서 얻어진 용액을 42 °C 항온수조에서 1시간 동안 배양합니다. 플라스크를 세운 상태에서 바닥이 초음파 세척기의 찬물에 살짝 닿게 하여 용액을 최소 20~30분 동안 초음파 처리합니다.

다음으로, 라운드 바텀 플라스크를 물에 담근 상태에서 회전 증발기의 항온 수조를 이용해 0 rpm의 속도로 42 °C에서 20분 동안 가열합니다. 리포좀을 0.47 µm 시린지 필터로 여과한 후, 이어서 0.22 µm 시린지 필터로 여과합니다. 소형 압출기를 사용하여 리포좀을 50 nm 멤브레인으로 여과함으로써 균질한 단일층 리포좀 소포 집단을 생성합니다.

리포좀을 에펜도르프 튜브로 옮기고 얼음 위에 둡니다. 리포좀 8몰 당 RNA 2µg의 비율로 리포좀 RNA ITSN 복합체를 준비합니다. 본 예시에서는 50µL의 I-A-I-T-S-N을 사용합니다.

50 µM 스톡 용액을 RNase/DNase-free EOR 튜브를 사용하여 갓 제조한 리포좀 100 µL에 첨가합니다. 마우스에 주입하기 전까지 혼합물을 얼음 위에 보관하십시오. 본 연구에 사용된 마우스는 약 4~6주령이며 체중은 약 25 g입니다.

주입 전 발가락 꼬집기 테스트를 통해 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 사용하는 주사기는 바늘이 부착된 1mL 투베르쿨린 주사기이며 한 손으로 잡습니다. 마우스의 귀를 잡고 마우스를 옆으로 눕혀 눈의 내안각이 드러나게 하십시오.

PIKA 반달 모양 구조물의 내측을 겨냥하고 안구를 건드리지 않도록 주의하십시오. 약물이 충전된 주사기를 사용하여 세 축 모두 45도 각도로 눈의 누낭에 접근합니다. 혼합액을 천천히 주입한 후, 마우스를 케이지로 옮겨 주입한 측으로 회복하도록 둡니다.

마우스에 ITSN1 유전자를 표적으로 하는 siRNA를 24일 동안 72시간마다 처리합니다. 이 절차를 시작하기 전에, 회피 반사가 없는 것을 확인하여 마우스가 완전히 마취되었는지 검증하십시오. 개복술로 시작하여 횡격막을 적출합니다.

그런 다음 흉강 절개술을 실시하여 폐와 심장을 노출시킵니다. 정확도를 높이기 위해 StereoZoom 현미경을 사용하여 흉선을 제거합니다. 폐동맥에 카테터를 삽입합니다.

다음으로, 기관 절개술을 실시하고 기관 누공을 통해 마우스를 삽관합니다. 인공호흡기를 분당 150회의 속도와 150 µL의 1회 호흡량으로 설정합니다. 배출구로는 분당 1.5 mL로 설정된 연동 펌프와 37 °C로 가온된 Hank's 용액을 사용하여 왼쪽 심방을 개방합니다.

혈액이 없는 상태로 마우스 폐 혈관을 5분 동안 관류한 후, 추적자를 이용하여 10분 동안 관류합니다. 결합되지 않은 추적자를 세척한 다음, 4% formaldehyde, 2.5% glutaraldehyde 및 1% tannic acid를 10분 동안 관류하여 폐의 in situ 고정을 수행합니다. 폐를 수거하고 과도한 조직을 제거합니다.

폐를 작은 블록 형태로 자른 후, 고정액 혼합물 2 mL가 들어 있는 라벨이 부착된 신틸레이션 바이알로 옮깁니다. 전자 현미경 관찰을 위한 폐 조직 처리를 시작하려면, 먼저 폐 블록을 0.1 M sodium Cate 완충액으로 짧게 3회 세척합니다.

다음으로, 0.1 Pipee buffer 내의 4%aldehyde 2.5%glutaraldehyde에서 실온으로 1시간 동안 시료를 고정합니다. Callen burger buffer로 한 번 헹군 후, 후드 내 얼음 위 암소에서 1%Pilate Osmium으로 1시간 동안 후고정합니다. 시료를 Callen burger buffer에 담가 실온에서 2시간부터 하룻밤 동안 배양합니다. 50%ethanol로 한 번 헹군 후, 단계별 에탄올 시리즈를 사용하여 탈수시킵니다.

70% ethanol에서 5분, 95% ethanol에서 5분, 이어서 100% Ethanol에서 15분씩 두 번 처리합니다. 그 후 100% propylene oxide로 교체하여 15분씩 두 번 배양합니다.

프로필렌 옥사이드를 제거하고 50% 프로필렌 옥사이드와 50% epon 혼합물을 첨가합니다. 상온의 회전 휠에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침에 혼합물을 제거하고 신선한 epon을 첨가합니다. 휠 위에서 최소 4~5시간 동안 배양합니다.

선택한 표본을 신선한 100% Epon 82로 절반 정도 채워진 이중 테이퍼 몰드에 넣습니다. 표본을 가장자리에 배치하고, 몰드를 60 °C 인큐베이터로 옮겨 48~72시간 동안 경화시킵니다. ITSN1 siRNA 리포좀 복합체를 반복적으로 투여하여 21일 연속으로 ITSN1 발현을 만성적으로 억제하면, 여기 대표적인 결과에서 보는 바와 같이 생쥐 폐의 ITSN1 단백질 수준이 유의하게 낮아집니다. 처리되지 않은 대조군과 처리된 생쥐의 폐 용해물을 준비하여, 표시된 siRNA 투여 후 여러 시점에서 ITSN1 및 actin에 대한 항체로 블로팅하였습니다.

대표적인 high blot CL 필름의 밀도 분석과 I TSN one s mRNA의 정량적 R-T-P-C-R 결과는 I TSN one s siRNA 리포좀 복합체 처리가 마우스 폐 내의 I TSN one s 단백질을 효율적으로 하향 조절함을 추가로 확인시켜 줍니다. intersect in one 수치의 감소는 엔도사이토시스 결핍과 T 내피 수송 장애를 유발하여, 내피 간 장벽의 붕괴 및 폐부종으로 이어집니다. 폐 조직의 이러한 대표적인 전자현미경 사진은 8 nm 금 알부민 입자로 전체 길이에 걸쳐 표지된 개방된 내피 간 접합부 또는 IJs를 보여줍니다.

패널 A1은 패널 A의 확대도로, 화살표 머리는 동일 평면상에 서로 가깝게 위치한 3~4개의 골드 알부민 입자를 가리킵니다. 이는 IEJ의 넓은 개구부를 나타냅니다. 골드 입자는 패널 A1과 B의 화살표로 표시된 IJ의 abluminal 출구와도 연관되어 있습니다. 또한 패널 A의 별표로 표시된 제한된 수의 CVE A 및 pericapillary 공간의 확장에 주목하십시오. intersectin-1 발현의 급격한 하향 조절은 결핍된 내세포 작용을 보완하기 위해 대체 수송 경로를 상향 조절하였습니다.

이 EM 이미지들은 패널 A와 A1의 막성 고리, 패널 B의 다형성 세관, 그리고 패널 C의 전형적인 cve LA와 융합되어 금 알부민의 섭취 및 운송에 활발히 관여하는 확장된 엔도솜을 보여줍니다. 혈관 주위 공간의 심한 확장과 단백성 부종 또한 관찰됩니다. Intersectin 1 발현을 24일 동안 지속적으로 억제하면 내피 세포 장벽의 무결성이 부분적으로 회복되어 마우스의 폐부종이 감소합니다.

EM 형태학적 연구 결과, 8 nm 금-알부민 추적자는 이 시점에서 IEJ를 투과하지 못했으며, 대신 화살표로 표시된 접합부의 루멘 입구에 여과 잔해를 형성하는 것으로 나타났습니다. 그러나 혈관주위공간(PVS)에서 일부 확장과 가벼운 부종이 관찰되었는데, 이는 접합부가 이 크기의 입자에 대해 불투과성임을 시사하지만, 혈장막에 인접한 누출성 다소포체(MVB) 내의 일부 작은 소포들은 8 nm 금-알부민 입자에 의해 표지되었음을 보여줍니다. 이 표는 대조군 및 결핍 마우스 폐 내피세포 내의 엔도시토시스 trans cyto 구조의 수를 보여줍니다.

주요 발견 사항은 ITSN1 결핍 마우스 폐 내피세포에서 caveolae 수가 감소했다는 점입니다. ITSN1 발현의 만성적 억제는 대체 내포 작용 경로의 활성화를 유발했으며, 금-알부민 입자로 표지된 막 형태의 고리 또는 관 구조인 caveolae 수를 부분적으로 감소시켰습니다. ITSN1 만성 결핍 마우스 폐 내피세포에서는 대조군과 비교했을 때 14배 증가한 수치도 관찰되었습니다.

이 절차 이후, 마우스 폐 용해물을 이용한 ELISA와 같은 다른 방법들을 적용하여 다양한 hnic 추적자의 혈관 내피 세포 통과 수송을 정량적으로 추정할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 표적 단백질을 넉다운하고 그 기능을 평가하기 위해 onic 리포좀과 SRNA 복합체를 마우스 폐 내피 세포에 특이적으로 전달하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.