인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양

이 절차의 전반적인 목표는 인간 발달 과정에서 관찰되는 것과 유사한 체크포인트를 통해 인간 배아 줄기 세포 또는 H ESC에서 두부 뉴런을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 HSC가 HESC 배지의 현탁액에서 자발적으로 분화할 수 있도록 한 다음 신경 유도 배지로 전달하여 보다 선택적으로 분화함으로써 달성됩니다. 다음으로, 배아체 또는 PSC 응집체는 세포가 단층으로 확장되고 분화되는 조직 배양 처리된 플레이트에 부착할 수 있습니다.

중심이 형성되는 신경 상피 세포는 형태학적으로 킬로미터 세포와 유사합니다. 다음으로, 신경 상피 세포를 분리하여 현탁 배양에 넣어 신경구를 형성합니다. 마지막으로, 신경구는 더 분화할 수 있는 커버 슬립에 도금됩니다.

궁극적으로 면역 염색 또는 전기 생리학을 통해 형성된 특정 유형의 뉴런을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술의 의미는 다양한 유전 질환으로 확장되는데, 이는 환자 특이적 뉴런이 유도된 만능 줄기 세포에서 생성될 수 있기 때문에 작용 메커니즘과 잠재적 치료법을 설명할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 만능 줄기 세포에서 발톱 두부 신경 아형의 발달에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

그것은 또한 발톱 두부 뉴런과 관련된 인간 질병과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다 인간 만능 줄기 세포 응집체를 생성하기 위해 5-7 일 동안 기본 FGF가 보충 된 HESC 배지의 마우스 배아 섬유 아세포 공급기에서 인간 만능 줄기 세포를 배양하는 것으로 시작, 군집은 크지 만 여전히 미분화됩니다. 콜로니가 50 밀리리터 튜브에서 올바른 단계에 도달했을 때. 텍스트 프로토콜에 따라 D-M-E-M-F 12 매체에서 디스 베이의 밀리리터당 1밀리그램 용액을 준비합니다.

세포에서 배지를 흡입한 다음 D-M-E-M-F 12로 한 번 헹굽니다. 세척액을 제거한 후 각 웰에 1ml의 디스 베이를 추가하고 섭씨 37도에서 3-5분 동안 배양합니다. 3분 표시에서 현미경 아래에서 약간 더 어둡게 보이는 말리인 가장자리가 있는지 확인합니다.

필요한 경우 세포를 더 오래 배양합니다. 세포가 준비되면 dase 용액을 제거하고 D-M-E-M-F 12로 세포를 한 번 세척한 후 세척액을 1.5ml의 HESC 배지로 교체하여 세포를 분리 및 분해합니다. 셀에 있는 10ml 유리 피펫의 끝을 우물의 오른쪽 하단 벽을 향해 놓고 위아래로 작은 동작으로 우물을 가로질러 반대쪽으로 이동한 후 반대 방향으로 돌아갑니다.

모든 세포가 현탁액에 놓이면 15ml 튜브에 넣고 펠릿에서 배지를 제거하기 전에 200G에서 2분 동안 원심분리합니다. HESC 배지를 사용하여 세포를 배양을 위한 플라스크로 옮깁니다. 예를 들어, 6개의 HSC 웰에서 추출한 세포의 경우 50ml의 HESC가 함유된 T 75 플라스크 1개를 사용합니다. 보통.

세포를 섭씨 37도에서 12시간 동안 배양합니다. 다음으로 세포 파편을 제거하려면 세포와 배지를 50ml 튜브로 옮기고 세포를 한 번 씻은 후 50ml의 새 배지로 새 플라스크로 옮깁니다. 5일째까지 이런 식으로 세포에 계속 먹이를 공급합니다.

5일째에 세포를 스핀다운하여 새로운 T 75 플라스크로 옮깁니다. 50ml의 신경 유도 배지(NIM)를 사용하여 2-3일 동안 배양하여 배양 플레이트 후 매일 NIM의 절반을 교체하고 세포는 라미닌 또는 FBS를 사용하여 플레이트에 플레이트에 부착하는 데 도움을 줍니다. FBS를 사용하여 각각 세포가 있는 배지 1.5ml를 추가합니다.

플레이트를 부드럽게 흔들어 응집체를 펴고 세포가 밤새 부착되도록 합니다. 다음 날 섭씨 37도에서 모든 매체를 웰당 2밀리리터의 NIM으로 교체합니다. 하루나 이틀 동안 배양한 후 각 응집체는 퍼져 단층을 형성하고 며칠 이내에 이러한 세포 대부분의 중심이 형태학적으로 콜럼머 세포와 유사하게 나타날 것입니다.

14일에서 17일쯤에는 열량 세포가 더 조밀하게 보일 것입니다. 때때로 세포는 내부에 눈에 띄는 내강이 있는 융기나 고리를 형성합니다. 세포를 분리하기 전에 비 EU 상피 세포의 존재 여부를 검사하고 피펫 팁을 사용하여 긁어냅니다.

군체의 중심에서 발견되는 신경 상피 세포를 분리하기 위해. 마이크로 피펫과 멸균 1밀리리터 여과 피펫을 사용하여 집락 중앙에 압력을 가하여 집락이 들어 올려지도록 합니다. 군체의 바깥쪽 부분도 분리되지 않도록 주의하십시오.

두 개의 플레이트에 해당하는 분리된 세포를 15ml 튜브로 옮기고 200G에서 2분 동안 회전합니다. 배지를 제거한 후, NIM 10 밀리리터를 함유하는 비조직 배양 처리된 T 25 플라스크로 세포를 옮긴다. 다음날 밤새 B 27을 배양하면 세포가 구형과 같은 모양을 가져야 합니다.

때로는 주변 세포도 분리되어 일반적으로 플라스크 바닥에 부착됩니다. 이 경우 구형 세포를 새 플라스크로 옮기고 부착된 세포는 배양 뒤에 남겨둡니다. 신경구와 NIMB 27에서 일주일 동안 현탁하여 세포 지구력과 증식을 촉진합니다.

순환 A MP와 인슐린 유사 성장 인자 1을 추가합니다. 주말이 되면 신경구는 두부 전구세포를 포함하고 말단 분화를 위해 커버 슬립에 도금할 준비가 됩니다. 24에서 폴리우레탄 라미닌 코팅 커버 슬립을 준비하기 위해 웰 플레이트는 깨끗한 커버 슬립을 섭씨 37도의 폴리우레탄 밀리리터당 0.1밀리그램 용액으로 하룻밤 사이에 코팅하고 신경 분화에서 라미닌 20마이크로그램 중 50마이크로리터의 라미닌으로 커버 슬립을 코팅하는 것으로 시작합니다.

각 폴리우레탄 처리된 커버 슬립에 중간. 액체가 커버 자체에 닿기만 하도록 주의하십시오. 섭씨 37도에서 1-2시간 동안 배양합니다.

라미닌 배양 후 D-M-E-M-F 12에서 신경구를 수집하고 세척합니다. 세포가 너무 커서 제대로 부착할 수 없는 경우 약 2ml의 Accutane을 추가하고 섭씨 37도에서 3분 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, 동일한 부피의 트립신 억제제를 첨가하고 200G에서 3분 동안 세포를 원심주입한 후 용액을 NDM으로 교체하고 P 200을 사용하여 작은 클러스터의 세포를 분해합니다.

사전 코팅된 커버 슬립에 놓고 대부분의 배지를 흡인하고 세포를 배지 몇 방울로 6cm 페트리 접시에 옮겨 사전 코팅된 커버 슬립에서 라미닌을 제거하지 않고도 세포를 더 쉽게 선택할 수 있습니다. 약 4-5개의 신경구를 각각에 전달합니다. B 27 cyclic이 보충된 0.5ml의 신경 분화 배지를 추가하기 전에 신경구가 최소 2-4시간 동안 부착되도록 합니다.

MP 및 신경 영양 인자는 격일로 배지의 절반을 대체합니다. 세포는 여기에 표시된 것처럼 몇 개월 동안 유지될 수 있습니다. 이 프로토콜은 몇 가지 중요한 단계를 통해 인간 PSC를 발톱 두부 글루타메이터 뉴런으로 구별하는 방법을 설명합니다.

PSC의 형성은 신경 상피 세포의 유도, 발톱 두부 전구 세포의 생성, 이러한 전구 세포의 발톱 두부 뉴런으로의 말단 분화를 응집합니다. 이 시스템은 예를 들어 두부, 전구 세포 및 글루타메이터 뉴런의 생성에 견고하고 효율적입니다. izing 인자를 추가하지 않고, HSC는 신경 계통으로 분화되었고 분화 후 24일이 지났습니다.

대부분의 신경 전구체는 두부에 의해 발현된 A 전사 인자인 Fox G one에 대해 양성이었지만, 뒷뇌와 척수 세포에 대한 A 마커인 HOK B four에 대해서는 음성이었으며, 이는 텔론 두부 전구세포가 성공적으로 생성되었음을 시사합니다. 이 telon cephalic progenitors는 PAC six의 발현에서 알 수 있듯이 등쪽 표현형을 가지고 있습니다. 배쪽 전구 세포에 의해 발현되지만 NK X 2.1 배쪽 전구 세포에 대한 마커가 아닌 마커.

추가적인 분화에 따라, 이러한 두부 등쪽 전구세포는 글루타메이터성 뉴런으로 분화되었으며, 이는 글루타메이터성 마커에 대해 양성이었습니다. TBR 1에 대해 양성을 유지한 TBR 1 뉴런은 뉴런 마커 베타 3, 튜불린 또는 맵 2에 대해서도 양성이었습니다. 이 세포는 또한 수포성 글루타메이트 수송체 1 또는 V 글루타메이트 1을 발현했는데, 이는 성숙한 글루타메이트 뉴런에 대한 마커로서 배양에서 탈론 두부 글루타메이터 뉴런의 효율적인 생성을 시사합니다.

이 절차에 따라 전기 생리학과 같은 다른 방법을 수행하여 이러한 뉴런이 다른 세포와 시냅스 연결을 만들 수 있는지 여부와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 잘 이해하게 될 것입니다. 몇 가지 중요한 단계를 통해 인간 만능 줄기 세포를 두부 글루타메이터 뉴런으로 분화해야 했습니다.

만능 줄기 세포의 형성은 신경 상피 세포의 유도, 두부 전구 세포의 생성, 이러한 전구 세포의 두부 뉴런으로의 말기 분화를 응집합니다.