Name: 인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 배우세요 인간 배아 줄기 세포에서 뇌 상부 글루타미너지 뉴런을 분화시키는 방법을. 이 기법은 발달 생물학 및 신경생물학 연구에 활용됩니다.

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저자는 넉넉한 FOXG1 항체를 제공하기 위해 박사 Y. Sasai 감사드립니다. 이 작품은 코네티컷 줄기 세포 연구 기금 (08-SCB-UCHC- 022 및 11-SCB24)과 경직 하반신 마비 재단에 의해 지원되었다.

1. 인간 만능의 줄기 세포 응집체의 세대 (D1-D4) <ol><li> 인간 만능의 줄기 세포는 기본적인 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF, 4 NG / ML)로 보충 hESC 매체의 존재에 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 모이통에 배양되어 있습니다. 문화 5-7일 후, 식민지 큰하지만 여전히 undifferentiated 때, 그들은 다음 단계에 대한 준비가되어 있습니다. </li><li> 효소 솔루션 먼저 준비해야합니다. 50 ML 튜브에 DMEM/F12 중간에 1 MG / ML 농도에서 dispase (또는 collagenase)를 분해. 예열 할 때 다음 솔루션은 최적의 혼합 때문에, 10-15 분을위한 37 ° C 물 목욕으로 매체와 효소를 포함하는 관을 배치하고 Steriflip 필터를 사용하여 소독. </li><li> 세포에서 매체를 대기음, DMEM/F12과 함께 씻어,뿐만 아니라이 기능을 대기음. hESCs 기준 3 ~ 5 분 (iPSCs에 대해 최대 10 분)에 대한 보육의 각 우물과 장소에 dispase 1 ML을 추가합니다. 현미경으로 세포를 봐; 때가장자리가 약간 웅크 / 비트 어두운 모습, 셀은 다음 단계에 대한 준비가되어 있습니다. 이 3 분 후 세포를 확인하고이를 필요한 경우에 다시 넣어하는 것이 가장 좋습니다. 처음이 프로토콜을 사용하는 경우, 그것이 가능한 빨리 dispase에서 세포를 제거하는 것이 중요합니다 같은 시간에 세포의 한 판으로 시작하는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 세포에서 dispase을 대기음. 부드럽게 (세포가이 단계에서 매우 취약하며 비교적 쉽게 판에서 올 것이다) dispase을 씻어하기 위해 각도에 DMEM/F12 매체의 1.5 ML를 추가합니다. DMEM/F12를 기음과 각도에 hESC 매체의 1.5 ML를 추가합니다. </li><li> 세포를 분리하고 헤어지고, (세로)의 하단 오른쪽 구석으로 10 ML 유리 피펫의 팁을 배치 잘 (셀을 터치)과 피펫을 이동 아래 - 위로 불을 지펴이 가까이에 있어야 계속 하향 스트로크합니다. 잘 반대편에 도달하면 수평 곤경에 반복ction. </li><li> 세포의 모든 정지에 한 번, 15 ML 튜브에 넣어 2 분 200 XG에서 그들을 원심 분리기. 관의 맨 ​​아래에있는 세포 펠렛이 있어야합니다. 펠렛 위에서 매체를 대기음. </li><li> 집계에 보관 활용해야 세포 배양 플라스크의 크기는 세포의 원래 수량에 따라 달라집니다. hESC 매체의 50 ML을 활용해야와 hESCs 6 우물 (1 판)를 들어, 하나의 비 조직 문화 T75 휴대용 술병을 취급. 37 단계 1.6에서 술병과 배양에 세포를 전송 ° C. </li><li> 세포 파편을 제거하기 위해 셀 매체와 병은 약 12​​ 시간 후에 교체해야합니다. 이 작업을 수행하려면 (2 분 200 XG) 아래로 세포를 스핀, 50 ML 튜브에 매체 / 셀의 모든을 배치하고, 기존의 매체를 대기음. 다음, 새로운 T75 플라스크에 세포와 장소에 신선한 hESC 매체 50 ML를 추가합니다. 세포는 다음이 동일한 절차 (5 일까지)에 따라 매일 공급 할 수 있습니다. </li></ol><ol><li> 50 ML 튜브에 세포 / 미디어를 전송, 200 X g에서 2 분 동안 세포를 원심 분리기. 다음, 표면에 뜨는을 대기음, 그리고 신경 유도 매체 (님)의 50 ML과 T75 플라스크 새로운 (취급하지 않는 조직 문화)에 세포를 전송합니다. </li><li> 세포 님에되면, 매체의 반이 매일 교체해야합니다. 집계는 몇 분 후에 자신의 50 ML 원뿔 튜브의 아래쪽 (더 원심 분리가 필요하지 않습니다)에 스며들게 곳을만큼 큰 수있게됩니다. 님 (D7-D8 총)에 2-3일 후, 셀 플레이트 준비가되어 있어야합니다. Laminin 또는 태아 소 혈청 (FBS)은 세포가 플레이트에 부착하기 위해 이용 될 수있다. </li><li> 조직 문화의 수는 각 집계가 다른 중 하나를 밟지 않고 여러 더 많은 일 동안 접시에 성장 할 수 있어야한다로 필요한 6 잘 플레이트는 세포의 밀도에 따라 달라집니다 취급. 평균 하나의 세포T75 플라스크는 세포의 가치가 6월 4일부터 6일까지에 대한 잘 접시를 얻을 수 있습니다. </li><li><ol class="ualpha"><li> laminin를 사용하는 경우, μg / ML 코트 6 잘 플레이트를 (~ 0.5 ML / 잘)에 10-20로 님에 희석. 6 - 잘 접시 (물론 당 ~ 20-30 집계)로 2-3 시간, 판 셀 집계에 코팅 한 후. 집계을 첨부 한 후 님의 1.5 ML를 추가합니다. </li><li> FBS를 사용하는 경우, 90 % 님와 10 % FBS (1.5 ML / 잘)의 혼합물을 준비하고 있습니다. 각도에 셀과 매체의 1.5 ML를 추가 부드럽게 집계를 확산 앞뒤로 판을 흔들하고, 세포 배양기에서 O / N를 첨부 할 수 있습니다. FBS를 제거하려면 다음과 아침 중간 (2 ML / 잘 님의)를 변경해야합니다. </li></ol></li><li> 도금되는의 하루 이틀 후, 각각의 집계는 monolayer를 형성 퍼져 것입니다. 며칠 내에서 이러한 세포의 대부분의 센터는 morphologically 원주 세포 (연장)과 비슷 표시됩니다. 이 기간 동안 매일 님을 변경할 수 있습니다. 일부 PSC 라인 (특별한통증이 iPSC), 덜 효율적으로 원주 세포를 형성 할 수 있습니다. 이 경우 2 단계 동안 BMP와 TGF 억제제 (Dorsomorphin 29, 2 μM에서 SB431542 19)의 추가가 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 일 14-17 주변 주상 세포는 더 컴팩트 나타납니다. 때때로 이러한 세포 안으로 보이는 루멘과 산등성이 나 고리를 형성하고 있습니다. 주상 형태뿐만 아니라,이 단계에서 세포는 PAX6와 SOX1 12,26 등 neuroepithelial 마커를 표현한다. </li><li> 절연 시작하기 전에, 하나는 먼저 현재의 비 neuroepithelial 세포가 있는지 확인하기 위해 세포를 검사해야합니다. 목표 마커는 비 neuroepithelial 식민지를 나타 내기 위해 이용 될 수있다. 이러한 다음 피펫 팁과 그것들을 스크랩하여 제거 할 수 있습니다. </li></ol> 3. Telencephalic Progenitors의 세대 (D17-D24) <ol><li> 식민지의 센터가 neuroepithelial 세포를 포함하고, 식민지의 나머지 부분으로부터 격리해야합니다. 이것은 사용하여 수행 할 수 있습니다micropipette 및 살균 한 ML 필터링 피펫 팁. 압력의 작은 금액은 식민지의 중심 부분에 적용하면 일반적으로 매우 쉽게 해제 올렸 으니까요. 식민지의 바깥 부분은 물론 분리하게하지 않도록주의하십시오. 센터는 고집이 존재하고 자신이 떨어져 오지 않을 경우에는 멸균 동네에서 현미경으로 바늘을 사용하여을 절개하여 제거 할 수 있습니다. 15 ML 튜브에 식민지의 중심 부분을 전송하고 2 분에 대해 200 XG에 스핀. </li><li> 매체는 세포 오프 흡입해야합니다. (비타민 A, 1시 50분 제외) B27를 추가로 님의 10 ML을 포함 T25 휴대용 술병을 취급 세포의 가치를 두 플레이트는 다음 아닌 조직 문화로 전송 될 수 있습니다. 셀 중 하나 접시 당 매체의 5-10 ML을 사용합니다. </li><li> 세포는 다음과 같은 일을 볼 때, 그들은 모양과 같은 영역이 있어야합니다. 가 자주 주변 세포이기 때문에 그것은 새로운 플라스크 (님과 B27, 1시 50분의 존재에)에 셀을 전송 할 필요가 있습니다에 몰래 술병의 바닥에 부착된다. </li><li> neurospheres 그런 다음 B27 (1시 50분)를 보충 님을 사용하여 1 주일 동안 정지 배양해야합니다. 셀 지구력을 홍보하고 확산, 고리 AMP (CAMP, 1 μM)뿐만 아니라 인슐린 성장 인자 (IGF1, 10 NG / ML)하기 위해 정지 문화 중에 중간에 추가 할 수 있습니다. 이 시점에서, neurospheres이 telencephalic progenitors을 포함 (FOXG1 +) 및 단말 차별화를위한 coverslips에 도금 할 준비가 된 것입니다. </li></ol> 4. Telencephalic 뉴런 (D25 +)로 더 차별화 <ol><li><ol class="ualpha"><li> 세포를 도금에 대한 poly-ornithine/laminin 코팅 coverslips을 (24도 판)를 준비합니다. Coverslips 먼저 청소하고 계략-ornithine으로 코팅 (0.1에서 MG / ML, 37 ° C, O / N, 그리고 냉장고에 저장). 아르 폴리 - ornithine 코팅 : <ol><li> coverslips를 검사 :에 coverslips를 삽입비커는 질산을 포함하고 부드럽게 한 시간 동안 연기 후드에 흔들. , 질산을 쏟아 DI 물에 여러 번 헹구고, 적어도 15 분 동안 DI를 ​​흐르는 물에 coverslips 둡니다. 95 % 에탄올에 coverslips을 놓고 어느 RT 30 분 (바로 사용하는 경우) 또는 에탄올에 가게에 흔들. </li><li> 멸균 후드에서 6 잘 접시의 뚜껑에 살균 coverslips를 포함하는 50 ML 튜브의 내용을 부어. 소독 집게를 사용하여 한 번에 하나의 coverslip을 선택하고 단일에 잘 24 잘 접시의 올바른 설정합니다. 각 우물이 coverslip이 너무 반복합니다. </li><li> 그들은 완전히 건조 후 coverslips는 각 우물에 평면 타락 할 때까지, 접시를 누릅니다. 다음 각 coverslip에 100 μl 폴리 - ornithine을 (0.1 밀리그램 / 멸균 DH 2 O의 ML) 추가하고 번호판을 길러 37 번 O / N ° C. </li><li> 다음 날, 인큐베이터에서 접시를 제거하고이를 RT로 냉각 할 수 있습니다. (t의 가장자리에서 각 coverslip의 오프 폴리 - ornithine 대기음그는 coverslip)은 과정에 coverslips을 만지거나 긁히지 않게 확실하게. coverslips는 세척하기 전에 약 30 분 동안 건조 할 수 있습니다. </li><li> 잘 각각 1 ML 멸균 DH 2 O를 추가 10 분 동안 앉아 보자, 각도에서 물을 대기음. 이 페인트는 두 번 단계를 반복합니다. 접시가 완전히 건조 후, (휴가는 후드에 그냥 포함) 알루미늄 호일로 커버에 뚜껑을 배치하고, -20 ° C.에 저장 </li></ol></li><li><ol><li> laminin과 코트 coverslips을 위해, 만 coverslip 자체를 (터치 액체가주의되는 각 폴리 - ornithine 처리 coverslip에 신경 차별화 매체와 laminin (20 μg / ML의 최종 농도)의 혼합물 50 μl를 추가하고 안 불 해제). 첨부 파일의 셀을 준비하기 전에 1-2 시간에 37 ° C에서 그들을 품다. </li></ol></li></ol></li><li> 수집하고 15 ML 튜브에 2 분에 대해 200 XG에서 neurospheres을 원심 분리기. 표면에 뜨는을 대기음. </li> &lt;리&gt; <ol class="ualpha"><li> DMEM-F12로 세포를 씻어 다시 세포를 원심 분리기. neurospheres이 제대로이 너무 커서 첨부 할 수있는 경우,이 단계에서 Accutase과 dissociated 수 있습니다. </li><li> Accutase를 사용하는 경우는 : DMEM-F12로 세포를 세척 한 후 neurospheres는 Accutase을 (~ 2 ML)을 추가, 3 분 동안 37 ° C에서 셀을 잠복기에 의해 작은 클러스터에 dissociated 있습니다. 다음으로, 트립신 억제제 (~ 2 ML)의 동일한 금액을 추가하고 3 분 200 XG에서 세포를 원심 분리기. 세포는 다음 NDM에서 다시 정지 및 P200의 피펫을 사용하여 끊어해야합니다. 작은 클러스터 그런 다음 미리 코팅 coverslips에 도금 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 매체의 대부분을 대기음하고이를 선택하면 쉽게 될 수 있도록 매체의 몇 방울에 6cm 페트리 접시 위에 셀을 배치합니다. 각 미리 코팅 coverslip에 4-5 대한 neurospheres을 추가합니다. 먼저 laminin을 기음 할 필요는 없습니다. </li><li> neurospheres은 적어도 2-4 시간에 첨부 보자. 일단이잘 ttached 더 중간 (0.5 ML / coverslip)을 추가해야합니다. 그것은 신경 B27 (1시 50분)와 보충 차별화 매체, 캠프 (1 μM) 및 neurotrophic 요인 (BDNF, GDNF, 그리고 IGF, 모든 NG / ML 10시)로 구성해야합니다. 이 시점에서 매체의 절반은 매일 변경 될 수 있으며, 이러한 세포는 몇 달 동안 유지 될 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

신경 분화 과정에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 그것은 그렇지 않으면 세포가 이미 비 neuronal 혈통이되는 방향으로 편향 될 수 있기 때문에 인간 PSCs이 만능 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이것은 같은 Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 Tra-1-60 1-3로 pluripotency 마커에 대한 항체와 인간의 PSCs 얼룩으로 확인 할 수 있습니다. 인간 PSCs들을 passaging 후 잘 부착하지 않은 경우, ROCK 억제제 (Y27632)가 도움을 추가 할 수 있습니다. 자신의 세포를 만능를 유지에 문제가있는 경우, 몇 가지 잠재적 인 문제가 품질 / 밀도 MEF 세포뿐만 아니라, 일괄 배치에 변화가있을 수 있으므로 사용되는 KOSR의 많은입니다. MEF 피더 세포는 위의 프로토콜에 PSCs를 유지하는 데 사용 된 있지만,이 방법은 피더 - 무료 시스템을 사용하여 배양 아르 PSCs에 적용됩니다. 세포는 PSC의 응집체를 형성...

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)를 포함한 인간 만능의 줄기 세포 (PSCs)는, 뉴런 1-3을 포함하여 몸의 모든 세포 유형을 생성 할 수있는 능력을 갖추고 있습니다. 인간 PSCs의 다양한 neuronal 하위 유형의 감독 차별화 재생 의료에서​​ 이러한 세포의 응용 프로그램에 대한 키를 보유하고 있습니다. 개발하는 동안 기능 neuronal 하위 유형의 세대는 신경 계통의 유도, rostro - 꼬리 축을 따라 지역 progenitors의 사양, 그리고 4,5 지역 progenitors에서 포스트 mitotic의 신경 세포 유형의 차별화를 포함하는 복잡한 과정이다. 2001 년부터 여러 시스템은 neuronal 하위 유형 6,7의 후속 세대를위한 플랫폼을 제공 hESCs에서 신경 계통을 생성하기 위해 설립되었습니다. 발달 원리, 이러한 척추 모터 뉴런 8-12, midbrain DOP 등 여러 신경 세포 유형에 따라aminergic의 뉴런 13-15, 그리고 신경 망막 세포는 16,17 효율적으로 인간의 PSCs에서 지정된되었습니다. 이것은 생체 개발하는 동안 이러한 신경 세포 유형의 사양에 중요한 중요한 morphogens을 적용하여 이루어졌다. 다른 프로토콜도 차별화 21 홍보하기 위해 같은 작은 분자 또는 다른 세포 유형 공동 배양하여 추가 요소 18-20를 사용하여 뉴런으로 hESCs의 분화를 촉진하기 위해 개발되었습니다. 인간의 네크로은 고도로 발달과 학습, 메모리 및인지 기능 22,23에 중요한 역할을 glutamatergic 뉴런을 포함한 여러 세포 유형을 포함합니다. 문화 glutamatergic 뉴런을 생성하는 첫 번째 단계는 telencephalic 전구 세포를 지정하는 것입니다. Yoshiki Sasai의 그룹은 먼저 혈청 무료 suspensio를 사용하여 마우스 ESCs (mESCs)에서 telencephalic 전구체의 지시 차별화를보고DKK1의 존재 (Wnt 신호를 억제하는)뿐만 아니라 LeftyA (결절 신호를 억제하는) 24의 N 문화. 그 후, 우리를 포함한 여러 그룹은 혈청 무료 매체 25-27에서 인간 PSCs에서 telencephalic 전구체의 사양을보고했습니다. 인간 PSCs에서 telencephalic 전구체의 생성 외인성 morphogens 이러한 전구체를 생성의 효율성의 사용 mESCs 26,27에서보다 훨씬 높은 요구하지 않습니다. 여기 잘 장의 그룹 (7)에 의해 설립 된 신경 유도를위한 화학적으로 정의 된 시스템이 설명되어 있습니다. 외인성 caudalizing 요소의 추가없이,이 프로토콜은 효율적으로 인간의 PSCs 27 일부터 telencephalic 전구체를 생성합니다. 이 progenitors 그런 다음 Wnt와 소닉 고슴도치 (쉬이 잇)의 신호를 조절하여 등쪽이나 복부 progenitors로 구분 될 수있다. 등쪽 progenitors 더 glutamatergic 뉴런 전자로 구분할 수fficiently 27. 또한,이 프로토콜은 또한 질병의 큰 배열에 대한 작업뿐만 아니라 잠재적 인 요법의 메커니즘을 탐구하기 위해 이용 될 수있는 환자 ​​특정 뉴런의 생성을 허용 인간의 iPSCs 28 일에서 glutamatergic 뉴런의 생성을 위해 잘 작동 . 또한, 우리의 시스템은 telencephalon에서 다양한 neuronal 유형의 개발과 사양을 탐험 할 수있는 플랫폼을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco의 변형된 독수리 매체와 F12 영양 혼합물 (DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Non Essential Amino Acids</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt&#8211; 탄올 (14.3 M)</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)</td><td>Sigma</td><td>116K5103</td><td></td></tr><tr><td>Laminin (human)</td><td>Sigma</td><td>L-6274</td><td></td></tr><tr><td>Laminin (mouse)</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제</td><td>줄기</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>줄기 형태</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>도르소모르핀</td><td>줄기</td><td>04-0024</td><td></td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 인자 2 (FGF2, bFGF)</td><td>인비트로젠</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>트립신 억제제</td><td>Gibco</td><td>17075</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 젤라틴</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Foxg1 항체</td><td>Dr. Y. Sasai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoxb4 항체 (1:50)</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank</td><td>I12</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 항체 (1:5000)</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank</td><td>PAX6</td><td></td></tr><tr><td>Nkx2.1 항체 (1:200)</td><td>Chemicon</td><td>MAB5460</td><td></td></tr><tr><td>Tbr1 항체 (1:2000)</td><td>Chemicon</td><td>AB9616</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT1 항체 (1:100)</td><td>시냅스계</td><td>135302</td><td></td></tr><tr><td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>신경교세포 유래 신경영양인자(GDNF)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 성장 인자 1 (IGF1)</td><td>PrepoTech Inc.</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>사이클릭 AMP (cAMP)</td><td>시그마</td><td>D-0260</td><td></td></tr><tr><td>소닉 고슴도치 (SHH)</td><td>R& D</td><td>1845-SH</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 튜브</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td><td>BD</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>BD</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 플레이트</td><td>BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>T25 플라스크 (처리되지 않은)</td><td>BD</td><td>353009</td> T75 플라스크 (처리되지 않은)BD 353133 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Chemiglass Life Sciences</td><td>1760-012</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 페트리 접시</td><td>BD</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>9'' 유리 파이프 Fisher</td><td></td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip 필터 (0.22 &mu; M)</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 필터 1,000 ml (0.22 &mu; M)</td><td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>위상차 현미경 (Observer A1)</td><td>Zeiss</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>이산화탄소 인큐베이터 (Hera Cell 150)</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biosafety hood (Sterilgard III Advance)</td><td>The Baker Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (5702 R)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간 만능의 줄기 세포에서 telencephalic glutamatergic 뉴런의 사양

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

여기 효율적으로 인간의 만능의 줄기 세포 (PSCs)에서 telencephalic glutamatergic 뉴런을 생성하기위한 stepwise 절차가 설명되어 있습니다. 차별화 과정은 세포가 정지 문화에 배치 할 때 응집체를 형성하도록 반올림 clumps에 인간 PSCs을 위반하여 시작됩니다. 집계 그 다음 자연 차별화 할 수 있도록하는 일 1-4에서 hESC 미디어에서 재배되어 있습니다. 이 기간 동안 세포는 세 세균 레이어의 될 수있는 능력을 갖추고 있습니다. 일 5-8에서 세포는 신경 계통으로 선택을 강요 신경 유도 매체에 배치되어 있습니다. 일 8 주변 셀은 6 잘 접시에 첨부되는 시간 neuroepithelial 세포 양식을하는 동안 차별화 할 수 있습니다. 이 neuroepithelial 세포는 하루에 17 격리 할 수​​ 있습니다. 그들은 coverslips에 도금 할 준비가 될 때까지 전지 그런 다음 neurospheres로 유지 될 수 있습니다. 어떤 caudalizing 요소없이 기본적인 매체를 사용하여 neuroepithelial 전지는 specifie 아르그리고 더 효율적으로 등쪽 telencephalic progenitors과 glutamatergic 뉴런으로 차별화 할 수 있습니다 telencephalic 전구체,에 D. 전반적으로, 우리의 시스템은 이러한 뉴런의 개발과 그 영향을 미치는 질병을 연구하는 연구자에 대한 인간의 glutamatergic 뉴런을 생성 할 수있는 도구를 제공합니다.

여기 프로토콜은 여러 중요한 단계를 telencephalic glutamatergic 뉴런에 인간 PSCs을 차별화 방법 : PSC 집계의 형성은 neuroepithelial 세포의 유도, telencephalic progenitors의 생성 및 telencephalic 뉴런에 해당 progenitors의 터미널 차별화 (그림 1)이 설명되어. 이 시스템은 telencephalic progenitors과 glutamatergic 뉴런의 생성에 강력하고 효율적이다. 예를 들어 (그림 2)으로 caudalizing 요소의 추가없이 hESCs는 신경 계통 27으로 차별화했다. 24일 게시물 차별화에 신경 전구체의 대부분은 FOXG1 (telencephalon에 의해 표현 전사 인자)에 대한 긍정적 인하지만 telencephalic progenitors이 성공적으로 (그림 2D) 생성 된 제안 HOXB4 (hindbrain와...

이 절차는 인간의 개발 기간 동안 관찰 것과 유사한 대를 이동하여 telencephalic 뉴런을 산출. 세포는 자발적으로 차별화 할 수있는 신경 계통 기수를 밀어 요인에 노출되어 격리되며, 터미널 차별화과 성숙을 할 수 있도록 coverslips에 도금되어 있습니다.

인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

본 절차의 전반적인 목표는 인간 발생 과정 중에 관찰되는 것과 유사한 체크포인트를 거침으로써 인간 배아줄기세포(H ESCs)로부터 머리 부분의 뉴런을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 HSC를 HESC 배지가 담긴 현탁액에서 자발적으로 분화시킨 후, 보다 선택적으로 분화하도록 신경 유도 배지로 옮김으로써 달성됩니다. 그 다음, 배아체(embryo bodies) 또는 PSC 응집체를 조직 배양 처리된 플레이트에 부착시켜 세포가 확장되고 단층으로 분화하도록 합니다.중심부에서는 형태학적으로 키엘로미터 세포(kilometer cells)와 유사한 신경 상피 세포가 형성됩니다. 다음으로, 신경 상피 세포를 분리하여 부유 배양함으로써 신경구(neurospheres)를 형성하게 합니다. 마지막으로, 신경구를 커버슬립 위에 도말하여 추가적인 분화가 일어나도록 합니다.최종적으로 면역 염색이나 전기생리학적 방법을 통해 형성된 뉴런의 특정 유형을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술의 함의는 다양한 유전성 질환으로 확장되는데, 유도만능줄기세포로부터 환자 특이적 뉴런을 생성함으로써 작용 기전뿐만 아니라 잠재적인 치료법을 규명할 수 있기 때문입니다. 또한, 이 방법은 만능줄기세포로부터의 talon cephalic 신경 하위 유형 발달에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.이는 Talon cephalic 뉴런과 관련된 인간 질환과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 인간 만능 줄기세포 응집체를 생성하려면, 먼저 기본 FGF가 보충된 HESC 배지에서 마우스 배아 섬유아세포 피더 세포 위에 인간 만능 줄기세포를 5~7일 동안 배양하십시오. 콜로니의 크기는 커지지만 여전히 미분화 상태를 유지합니다. 콜로니가 적절한 단계에 도달하면, 50 mL 튜브에 텍스트 프로토콜에 따라 D-M-E-M-F 12 배지를 이용한 1 mg/mL 농도의 dis bays 용액을 준비하십시오.세포로부터 배지를 흡입하여 제거한 후 D-M-E-M-F 12로 한 번 헹굽니다. 세척액을 제거하고 각 웰에 dis bays 1 mL를 첨가한 후 37 °C에서 3~5분 동안 배양합니다. 3분이 되었을 때, 현미경 하에서 가장자리가 약간 더 어둡게 보이며 말려 올라갔는지 확인합니다.필요한 경우, 세포를 더 오래 배양합니다. 세포 준비가 완료되면 dase 용액을 제거하고 D-M-E-M-F 12로 세포를 1회 세척한 다음, 세포를 분리하고 덩어리를 깨뜨리기 위해 세척액을 1.5 milliliters의 HESC 배지로 교체합니다. 10 milliliter 유리 피펫의 팁을 웰의 우측 하단 벽면 쪽 세포 위에 위치시키고, 위아래로 짧게 움직이며 웰의 반대편까지 이동한 후 다시 반대 방향으로 되돌아옵니다.모든 세포가 부유 상태가 되면, 15 milliliter 튜브에 넣고 200 G에서 2분 동안 원심분리한 후 펠릿에서 배지를 제거합니다. HESC 배지를 사용하여 세포를 배양용 플라스크로 옮깁니다. 예를 들어, HSC 6개 웰에서 얻은 세포의 경우, 50 milliliters의 HESC 배지가 담긴 T 75 플라스크 1개를 사용합니다.세포를 37°C에서 12시간 동안 배양합니다. 다음으로 세포 잔해물을 제거하기 위해, 세포와 배지를 50 mL 튜브로 옮기고 세포를 한 번 세척한 후 50 mL의 신선한 배지와 함께 새 플라스크로 옮깁니다. 5일 차까지 이와 같은 방식으로 세포에 배지를 공급합니다.5일 차에 세포를 원심 분리하여 새로운 T 75 플라스크로 옮깁니다. 50 mL의 신경 유도 배지(neural induction medium, NIM)와 함께 2~3일 동안 배양하며, 매일 NIM의 절반을 교체합니다. 배양 플레이트의 세포가 플레이트에 잘 부착되도록 돕기 위해 라미닌(laminin) 또는 FBS를 사용하여 세포를 플레이트에 접종합니다. FBS를 사용하여 각 플레이트에 세포가 포함된 배지 1.5 mL를 첨가합니다.플레이트를 가볍게 흔들어 응집체를 분산시킨 후, 세포가 하룻밤 동안 부착되도록 둡니다. 다음 날 37 °C에서 각 웰의 배지를 2 mL의 NIM으로 모두 교체합니다. 하루 또는 이틀 동안 배양하면 각 응집체가 퍼져 단층을 형성하며, 며칠 이내에 대부분의 세포 중심부가 형태학적으로 columer 세포와 유사하게 보일 것입니다.14일에서 17일경이 되면 columnar 세포들이 더 조밀하게 나타납니다. 때때로 세포들은 내부에 가시적인 내강(lumen)이 있는 융기나 링 형태를 형성합니다. 세포를 분리하기 전, 비-EU 상피 세포가 존재하는지 확인하고 피펫 팁을 사용하여 이를 긁어내어 제거하십시오.콜로니 중심부에 위치한 신경 상피 세포를 분리하려면, 마이크로 파이펫과 멸균된 1 mL 필터 파이펫을 사용하여 콜로니 중심부에 압력을 가해 들어올립니다. 이때 콜로니의 외곽 부분까지 함께 떨어지지 않도록 주의하십시오.분리된 세포 2 플레이트 분량을 15 milliliter 튜브로 옮기고 200 G에서 2분 동안 원심분리합니다. 배지를 제거한 후, 10 milliliters의 NIM이 들어 있는 비 조직 배양 처리 T 25 플라스크로 세포를 옮깁니다. B 27을 첨가하여 하룻밤 동안 배양하면 다음 날 세포가 구형의 모양을 띠게 됩니다.때때로 주변 세포들이 함께 분리되어 보통 플라스크 바닥에 부착됩니다. 이런 현상이 발생하면, 부착된 세포들은 배양 플라스크에 남겨둔 채 구형 세포들만 새 플라스크로 옮깁니다. 신경구(neurospheres)와 부유액을 NIMB 27에서 일주일 동안 배양하여 세포의 생존력과 증식을 촉진합니다.cyclic AMP와 인슐린 유사 성장 인자 1(insulin-like growth factor one)을 첨가합니다. 일주일이 지나면 뉴로스피어(neurospheres)에 두부 전구세포가 포함되며, 최종 분화를 위해 커버슬립에 도말할 준비가 됩니다. 24-웰 플레이트용 폴리우레탄 라미닌 코팅 커버슬립을 준비하려면, 깨끗한 커버슬립을 37 °C에서 0.1 mg/mL 폴리우레탄 용액으로 하룻밤 동안 코팅한 후, 신경 분화 조건에서 20 µg/mL 라미닌 50 µL를 사용하여 커버슬립을 라미닌으로 코팅합니다.각각의 폴리우레탄 처리된 커버슬립에 배지를 추가합니다. 이때 액체가 커버슬립 자체에만 닿도록 주의하십시오. 이를 37 °C에서 1~2시간 동안 배양합니다.laminin 배양 후, D-M-E-M-F 12에서 뉴로스피어(neurospheres)를 수집하고 세척합니다. 세포가 너무 커서 제대로 부착되지 않는 경우, Accutane 약 2 mL를 첨가하고 37 °C에서 3분 동안 배양합니다. 다음으로, 동일한 부피의 트립신 억제제(trypsin inhibitor)를 첨가하고, 200 ×g에서 3분 동안 원심분리한 후, 용액을 NDM으로 교체하고 P 200 피펫을 사용하여 세포를 작은 클러스터 형태로 분쇄합니다.이를 미리 코팅된 커버슬립 위에 배치하고, 배지의 대부분을 흡입한 후, 람닌이 코팅된 커버슬립에서 람닌이 제거되지 않도록 배지 몇 방울과 함께 세포를 6cm 페트리 접시로 옮겨 선택하기 쉽게 만듭니다. 각 커버슬립에 약 4~5개의 신경구(neurospheres)를 옮깁니다. B 27 cyclic이 보충된 신경 분화 배지 0.5mL를 첨가하기 전, 신경구가 최소 2~4시간 동안 부착되도록 둡니다.격일로 MP 및 신경영양인자가 포함된 배지를 절반 교체합니다. 여기에서 보여주는 바와 같이 세포는 수개월 동안 유지될 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 몇 가지 핵심 단계를 거쳐 인간 PSC를 정점 뇌 글루타메이트성 신경세포로 분화시키는 방법을 설명합니다.PSC 응집체의 형성은 신경상피세포의 유도, 뇌두측 전구세포의 생성, 그리고 이러한 전구세포가 최종적으로 뇌두측 뉴런으로 분화하는 과정을 촉진합니다. 이 시스템은 예를 들어 뇌두측 전구세포와 글루타메이트성 뉴런을 생성하는 데 있어 견고하고 효율적입니다. 분화 유도 인자를 추가하지 않은 상태에서 HSC는 신경 계통으로 분화되었으며, 분화 후 24일이 경과하였습니다.대부분의 신경 전구세포는 뇌두부(cephalon)에서 발현되는 전사 인자인 Fox G1에 대해 양성을 보였으나, 후뇌 및 척수 세포 마커인 HOXB4에 대해서는 음성을 보여 말단뇌(telencephalic) 전구세포가 성공적으로 생성되었음을 시사했습니다. 이러한 말단뇌 전구세포는 배측 전구세포에서 발현되는 마커인 PAX6의 발현으로 확인되는 배측 표현형을 나타냈으며, 복측 전구세포 마커인 NKX2.1은 발현되지 않았습니다.추가 분화 과정을 거쳐, 이 두부 배측 전구세포들은 글루탐산성 마커에 양성 반응을 보이는 글루탐산성 뉴런으로 분화되었습니다. TBR1에 대해 지속적으로 양성 반응을 보인 TBR1 뉴런들은 뉴런 마커인 beta three tubulin 또는 map2에 대해서도 양성 반응을 보였습니다. 이 세포들은 또한 성숙한 글루탐산성 뉴런의 마커인 소포성 글루탐산 운반체 1(vesicular glutamate transporter 1 또는 V glut 1)을 발현하였으며, 이는 배양 시스템 내에서 두부 글루탐산성 뉴런이 효율적으로 생성되었음을 시사합니다.이 절차 이후에는 이러한 뉴런이 다른 세포와 시냅스 연결을 형성할 수 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 전기생리학과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 충분한 이해를 얻으실 수 있을 것입니다. 여기에는 여러 핵심 단계를 거쳐 인간 다능성 줄기세포를 머리 부분의 글루타메이트성 뉴런으로 분화시키는 과정이 포함되었습니다.다능성 줄기세포 응집체의 형성, 신경 상피 세포의 유도, 두부 전구세포의 생성, 그리고 이러한 전구세포의 두부 신경세포로의 최종 분화 과정을 설명합니다.

the-specification-telencephalic-glutamatergic-neurons-from-human

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

만능 인간 줄기 세포의 neuronal 차별화 (hPSCs)에 대한 프로토콜은 종종 시간이 소요되어 있으며 상당한 세포 배양 기술을 필요로합니다. 여기, 우리는 통제 된 방식으로 인간의 뉴런의 간단 신속하고 효율적인 생성을 허용하는 multititre 판 형식으로 작은 분자 기반의 차별화 절차를 적응하고 있습니다.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

이 비디오는 배아체(EB)를 신경 상피 응집체로 분화하고 이후 신경 세포와 신경교세포로 분열하는 과정을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 in vitro에서 신경 세포 및 신경교세포를 효율적으로 생성할 수 있으며, 이는 독성 테스트를 위한 테스트 시스템 역할을 할 뿐만 아니라 신경 독성과 관련된 다양한 경로를 평가할 수 있습니다.

Generating Neurons and Glial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Embryoid Bodies

이 비디오는 테트라사이클린 반응성 요소의 제어 하에 신경인성 전사 인자 유전자를 운반하는 엔지니어링된 렌티바이러스로 인간 만능 줄기세포를 형질 주입하여 뉴런으로 분화하도록 유도한 후 테트라사이클린 유도체 및 성숙 배지로 처리하는 과정을 보여줍니다.

조작된 렌티바이러스를 사용한 뉴런의 인간 만능 줄기세포 분화

우리는 발달 생물학의 지식과 발표된 연구를 바탕으로 인간 배아 줄기 세포와 인간 유도 만능 줄기 세포 모두에서 A9 중뇌 도파민 뉴런을 효율적으로 생성할 수 있는 최적화된 프로토콜을 개발했으며, 이는 파킨슨병에 대한 질병 모델링 및 세포 대체 요법에 유용할 것입니다.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 약물 및 화학 스크리닝 및 신경 독성을 포함한 독성 시험을위한 새로운 시험 관내 모델 개발을위한 강력한 도구로 간주됩니다. 여기, hiPSCs의 뉴런과 glia 로의 차별화에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

이 프로토콜에서 결합 해리 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 뉴런에 대 한 재현 방법에 설명 하 고 이다 3D에 범위 cocultures, 무료 부동 조건, 그리고 이후 이러한 분야를 유지 하 immunoanalysis와 multielectrode 배열 녹음 분야의 측정 시 냅 스 회로 활동.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

손상된 미토콘드리아 수송 및 형태는 각종 신경 퇴행성 질환에 관여합니다. 제시된 프로토콜은 유전 경직 성 하반신 마비에서 미토콘드리아 수송 및 형태를 평가하기 위해 유도 된 다능성 줄기 세포 유래 전뇌 뉴런을 사용합니다. 이 프로토콜은 축축을 따라 미토콘드리아 인신 매매의 특성화와 신경 퇴행성 질환의 연구를 용이하게하는 형태학의 분석을 허용합니다.

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 장 신경계(ENS) 계통을 추출하면 ENS 발병 및 질병을 연구하고 재생 의학에 사용할 수 있는 확장 가능한 세포 소스를 얻을 수 있습니다. 여기에서는 화학적으로 정의된 배양 조건을 사용하여 hPSC에서 장 뉴런을 유도하기 위한 자세한 in vitro 프로토콜이 제시됩니다.

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells(인간 만능줄기세포와 장 신경계 계통의 분화)

배우세요 인간 배아 줄기 세포에서 뇌 상부 글루타미너지 뉴런을 분화시키는 방법을. 이 기법은 발달 생물학 및 신경생물학 연구에 활용됩니다.

인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양

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