Name: 마우스 폐 내피 표면 층의 생체 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 학습하세요 마우스 폐 미세혈관 내피 표면층 두께 측정법을 생체 내 현미경으로. 동시 DIC 및 형광 영상 촬영을 통해 움직이는 장기에서 정확한 ESL 측정이 가능합니다. 이 기법은 혈관생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 Drs 감사드립니다. Arata 타 부치와 intravital 현미경에 관한 교육을위한 볼프강 Kuebler (토론토 대학). 우리는 현미경 설계 및 구현에 도움을 앤드류 케이힐 (니콘 인스트루먼트)을 감사드립니다. 이 작품은 NIH / NHLBI 보조금 P30 HL101295와 K08 HL105538 (EPS로)에 의해 재정 지원되었다.

1. 외과 배관, 혈관 카테터, 가슴 벽 창의 작성 <ol><li> Intravital 현미경 단계. 우리는 anesthetized 마우스가 현미경 동안 자리 잡고있는시 플렉시 글라스 단계를 주문했습니다. 이 단계는 10cm 유연한 플라스틱 가공 보드 (마우스를 마취의 유도, tracheostomy 배치, 및 정맥 catheterization 동안 자리 잡고있는시)뿐만 아니라 유사한 크기의 가열 요소 (도마 아래에있는)에 의해 15cm를 모두 수용 할 수 있습니다. </li><li> 마우스 thoracostomy 관 준비 (그림 1). PE 50 튜브 (Intramedic, 내경 0.58 mm, 외경 0.965 mm)의 10cm 길이가 절단됩니다. 한쪽 끝은 곡선 23 게이지 바늘의 무딘 끝으로 연결되어,이 바늘은 가슴 윈도우의 폐쇄하기 전에 가슴 벽 (→ 외부 내부)를 통해 관을 통과하는 데 사용됩니다. 튜브의 말단부 (첨부 된 23 게이지 맞은 편에 길이 1.5 cm,바늘)이 반복적으로 intrathoracic 공기의 효과적인 흡인을 용이하게하기 위해 &quot;쪽의 포트​​를&quot;만들기, 30 게이지 바늘에 구멍이 나고 있습니다. 이 fenestrated 부분은 다음 4시 실크 봉합의 여러 주변 루프에 의해 튜브의 나머지 부분에서 분리되어, 이러한 루프는 궁극적으로 1.5 cm가 흉강 내에 부분을 fenestrated 고정, &quot;스토퍼&quot;로 될 것입니다. </li><li> 경정맥 정맥 카테터는. PE 10 튜브 (Intramedic, 내경 0.28 mm, 외경 0.61 mm)의 두 15cm 길이가 절단됩니다. 메스는이를 venipuncture의 용이성을 증가 베벨 관의 끝을하는 데 사용됩니다. 튜브는 튜브의 비 beveled 끝 부분에 부착 6퍼센트 150 kDa dextran 솔루션을 (PBS)를 포함하는 1 ML의 주사기를 통해 플러싱된다. </li><li> 가슴 벽 창 준비 (그림 2). 투명 염화 비닐 막은 (뉴 구레 랩, Kuresha, 도쿄) 타원형 모양 (주요 축 6cm, 단축 4cm)로 잘라 수 있습니다. 원형 5mm # 1 coverslip (BellcO)은 α-시아 노 아세틸렌 접착제를 사용하여 막 (Pattex flüssig, 헨켈, 뒤셀도르프 (Düsseldorf))에 부착되어 있습니다. </li><li> . pneumothorax 유도 ( &quot;타격 관&quot;) 튜브의 10cm 길이 (내경 3mm, 외경 5mm)에 대한 관은 5 ML의 주사기에 부착되어, 반대쪽은 동물 가슴 케이지에 공기를 도입하는 데 사용됩니다 가슴 벽 창 engraftment 이전. </li><li> 목적의 물 침적에 주사기. 23 게이지 바늘은 증류수를 포함하는 30 ML의 주사기에 부착되어 있습니다. 바늘의 끝은 목표에 손상을 방지하기 위해 (금속 파일을 사용하여) 잘 지내냐이 있습니다. </li></ol> 2. 마우스 마취 <ol><li> 마우스 케타민 (10 MG / ML)과 xylazine (2 밀리그램 / ML), g의 마우스 체중 당 μl 8 복용의 관리 intraperitoneally들에 대한 내용을 담은 anesthetized 있습니다. 진정 작용은 3 이내에 발생 - 6 분, 자발적인 호흡을 방해해서는 안됩니다. </li><li> 전기 면도기를 사용하여 면도목, 가슴, 복부, 그리고 마우스의 오른쪽. </li><li> 테이프를 사용 얇은 플라스틱 절단 보드에 마우스를 고정하십시오. 마우스의 머리 연산자 (그림 3)으로 지정해야합니다. 윗니 아래에 봉합 패스 루프에 의해 제공 젠틀 긴장은 머리 확장을 유지하는 역할을한다. 도마는 tracheostomy과 정맥 카테 테르를 배치하는 동안 마우스 euthermia을 유지, 가열 패드에 배치됩니다. </li><li> 100 % 에탄올로 젖은 면도 공간을 갖추고 있습니다. </li><li> 꼬리 / 앞발로 땅을 차다 핀치와 적절한 마취를 확인합니다. 최소한의 응답하면 진행, 케타민 / xylazine 있지 않은 경우 적절하게 anesthetized의 추가 bolus를 제공합니다. </li></ol> 3. Tracheostomy <ol><li> 1cm 절개는 목으로 구성되어 있습니다. 기본 결합 조직은 해부되고, 침샘이 분리되어 옆으로 반영됩니다. 기관에 즉시 앞 sternohyoid 근육이 resected 수 있습니다. </li><li> 4시 봉합의 루프는 일에서 전진하고 있습니다전자 기관 (그림 4). 루프는 다음 기관의 기반이 봉합의 두 개의 가닥을 만드는, 절단합니다. 꼬리 봉합은 tracheostomy 튜브를 보호하는 데 사용됩니다, 두개골 봉합이 tracheostomy 배치시 기관에 긴장을 제공하는 데 사용됩니다. </li><li> 두 손가락을 사용하여 상부 봉합이 파악되고 부드러운 긴장이 기관에 적용됩니다. 수평 절개는 상부 및 하부 봉합 사이의 기관에서 이루어집니다. 이 절개는 tracheal 주위의 약 2 정도일 교차한다. 플랜지 tracheostomy 관은 (하버드 장치, 1.22 mm 외경) 말초 기관에 삽입하고 꼬리 tracheal 봉합을 사용하여 제자리에 고정된다. </li><li> tracheostomy는 볼륨 제어 작은 동물 환풍기 (영감, 하버드 장치)에 연결되어 있으며, 마우스 40 % 영감을 산소와 9 ML / kg 갯벌 볼륨 (설정의 실험실에서 충분한 산소 / 환기를 유지하기 위해 최적화)와 통풍이 있습니다. Positive 최종 날숨 압력 (따위가 나오기 시작)은이 시점에서 시작되지 않습니다. 참고, 환풍기 설정은 각 실험실 내부의 고유 조건에 최적화해야합니다. 중복 튜브 (환풍기 튜브 Y-커넥터와 tracheostomy 사이에 interposed)의 서로 다른 길이는 어떤 선택 갯벌 볼륨에 대한 안정적인 폐포 환기를 보장, 죽은 공간을 조정하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 4. 정맥 Catheterization <ol><li> 내부 및 외부 경정맥 정맥의 교차점은 proximally 말초 정맥 지점을 추적하여 식별 할 수 있습니다. 바깥목은 반영 침샘 아래에서 발견되며 이는 외부 - 속목 교차로를 찾을 수 proximally 추적 할 수 있습니다. </li><li> 결합 조직을 둘러싼에서 경정맥 연결을 분리하는 부드러운 무딘 절개를 사용하십시오. </li><li> 4시 봉합을 사용하여 경정맥 교차로에 (두개골) 말초 외부 경정맥과 속목 정맥을 묶어. </li><li> 카리나에 작은 절개를합니다경정맥 접합의, 출혈을 최소화해야합니다. </li><li> 두 카테터는 점차적으로 절개 통해 경정맥 트렁크에 진출 할 수 있습니다. 혈액 수익을 보장하는 부드러운 흡인 후 카테터는 4시 봉합을 사용하여 정맥 내에 확보하고 있습니다. </li><li> 테이프 정맥 실수로 dislodgement되는 것을 방지하기 위해 도마에 카테터. </li></ol> 5. Intravital 마우스 폐 현미경 수술 (타 부치 외에서 적응. 18) <ol><li> 나머지 수술 개입이 수행 될 위치 커팅 보드 (억제, anesthetized 마우스뿐만 아니라 녹화 정맥 카테터를 포함), intravital 현미경 단계로 전환됩니다. 직장 온도 프로브가 배치됩니다,이 인터페이스를 적응 난방 시스템 (도마에 위치)로, 마우스 euthermia의 유지 보수를 수 있도록합니다. </li><li> 한 경정맥 정맥 카테터는 케타민 (10 MG / ML) xylazine (2 MG / ML) 제공하는 주사기 펌프에 부착되어 있습니다시속 200 μl의 혼합. 적절한 마취 다시 꼬리 / 동물의 발자국이 핀치를 사용하여 확인합니다. </li><li> 중간 선 절개는 다음 (그림 5) 오른쪽 측면 진행, xyphoid 프로세스에 목 연장됩니다. </li><li> electrocautery 사용하여 가슴 근육은 가슴 케이지를 노출, 제거됩니다. 주의 전체 지혈을 보장하기 위해 이루어집니다. </li><li> 왼쪽 및 테이프 마우스의 오른쪽 hindleg을 보도록. 그 결과 복부 비틀림가 수술의 편의성을 향상 약간 가슴을 회전합니다. </li><li> 45도 각도 (그림 6)에서 무대를 놓고,이 위치는 pneumothorax가 유도되면 폐는 가슴 벽에서 떨어져 떨어질 수 있습니다. </li><li> 1 리브는 (대부분의 하부 리브) 포셉으로 파악하고 제기된다; 곡선 포셉은 퉁명스럽게 늑골 아래에 밀어 수 있습니다. 이 가슴 벽에서 정수리 늑막을 분리합니다. 늑막은 unpunctured 유지됩니다. </li><li> 타격 튜브 등을 사용주사기가 공기가 강제 정수리 늑막에 대해 소개합니다. 이 기본 폐를 손상시키지 않고 흉막 표면과 pneumothorax의 파열로 연결됩니다. 기본 폐는 폐를 손상시키지 않고 electrocautery 포셉 도입을 허용, 가슴 벽에서 떨어져 감소 할 것이다. 환풍기 갯벌 볼륨에있는 감소는 일반적으로이 단계에서 필요하지 않습니다. </li><li> electrocautery 포셉을 사용하여 가슴 벽 근육을 해부하고 가슴 벽에 ~ 8mm 원형 구멍을 만드는 5 일, 6 일 갈비 / 정수리 늑막을 가로 질러. 출혈의 존재가 현미경 (그림 7)을 가리는 것 같은 그것은 완전한 지혈이 유지하는 것이 중요합니다. </li><li> 바늘 드라이버 사용하여 가슴 벽 구멍에 thoracostomy 튜브를 삽입합니다. 바늘이 찔린 가슴 벽을하고 가슴 창 (그림 7)에 하부와 측면 흉강을 종료해야. 피임기구를 펑 쳐링 않도록 조심해.그 저항은 관의 fenestrated 부분의 가장자리에있는 봉합 &quot;마개&quot;에서 발생할 때까지 튜브가 부드럽게 가슴 벽을 꺼내는 있습니다. </li><li> 단계는 평면 배치합니다. </li><li> 폐 reexpansion 문제를 해결하는 데 많은 도움이 환풍기에 3cm에게 H 2 O의 피프 추가합니다. </li><li> 접착제 (Pattex 젤, 헨켈)은 가슴 창 주위에 원주에 위치해 있습니다. 막이 흉강에 외관이 직면하고있는 유리 커버 슬립과 함께 첨부되어 있습니다. 주의 (및 원주) 대략적인면 작은 주걱을 사용하여 접착제에 막. </li><li> 폐 모집 기동 (관음증 환풍기 포트가 방해되는 동안 세 갯벌 볼륨)을 수행하는 동안, -3 mm HG 흡입은 가슴 튜브에 적용됩니다. 자유롭게 갯벌 환기 (그림 8) 동안 이동하는 동안 폐는 지속적으로 대략 멤브레인를 요구합니다. </li><li> 마우스의 오른쪽 foreleg은 마우스의 왼쪽 측면 decubitus 위치의 결과로, 왼쪽으로 건너되어 있습니다.스폰지 웨지 등을 만들었고는 가슴 창은 현미경 물 침적 목적에 부합 될 수 있도록 마우스를 적절히 배치하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 증류수는 물 침적 목표를 사용하여 폐의 시각화를 위해 수 있도록 현미경하기 전에 커버 슬립에 표시됩니다. 물은 간헐적으로 영상을 통해 보충해야합니다. </li></ol> 6. 폐 내피 표면 레이어 두께 측정 <ol><li> 즉시 가슴 벽 폐쇄 한 후, 500 μl FITC-라벨 150 kDa dextran (PBS에서 6 % 용액)가 두 번째 (비 마취) 경정맥 정맥 카테터를 통해 관리합니다. 이 bolus는 볼륨 인공 호흡뿐만 아니라 ESL 측정을위한 혈관 추적 역할을합니다. dextran bolus는 호중구 부착 또는 폐 부종 형성이 영향을주지 않습니다. </li><li> 물 침적 목적은 커버 슬립으로 중점을두고 있습니다. 목표의 선택은 필수 -하는 것입니다 ESL 두께의 작은 차이, 높은 numeri를 시각화아직 2을 유지하면서 칼 개구는 (&gt; 0.8)이 필요합니다 - 3mm 작동 거리 (폐 창 흉막 표면을 통해 침투를 허용). 우리는이 목적을 위해 75 LWD 25x (NA 1.1) 목표를 니콘 CFI 75 LWD 16X (NA 0.8)와 CFI를 사용합니다. </li><li> 정확하게 움직이는 장기의 ESL 두께를 측정하기 위해, 그것은 brightfield 및 형광 혈관 폭이 동시에 수행되는 것이 중요합니다. 이것은 동시 반사 된 광 차동 간섭 대비 캡처 (DIC, brightfield)와 FITC 이미지 (그림 9)을 허용 이미지 스플리터 (듀얼 뷰 Photometrics)를 사용하여 수행 될 수있다. </li><li> 5 초 inspiratory의 일시 정지 기간 동안, 연속 영상이 수행하고 기록됩니다. 나중에이 이미지는 포커스에 프레임을 식별하기 위해 검토 할 수 있습니다. </li><li> 포커스에 프레임이, subpleural microvessels가 (&lt;20 μm 직경) 식별을 사용하여, 최소 3 microvessels는 일반적으로 하나의 프레임에서 찾을 수 있습니다. 실험, DIC 완료 후그리고 FITC - dextran 혈관 폭이 microvessel 당 3 수직를 도청의 길이를 평균하여 (눈을 멀게 관찰자에 의해) 측정합니다. 선박의 양쪽 가장자리에 동일한 ESL 두께를 가정, ESL 크기는 DIC 등 대표 결과 섹션에 설명 된 FITC-dextran 혈관 폭, 사이에 반 차이로 정의 할 수 있습니다. </li><li> 일반적으로 intravital 현미경은 폐 부상 또는 저혈압 (2)의 증거없이&gt; 90 분에 수행 할 수 있습니다. 예비 실험 관찰의 기간 동안 마우스 안정성 (혈압, 산소, 환기, 폐 부상)를 확인하기 위해 수행해야합니다. 실험 약물은 절차 중에 시점에서 두 번째 (비 마취) 경정맥 카테터를 통해 유입 될 수있다. </li></ol> 7. 폐 내피 표면 레이어 무결성 대체 측정 그대로 내피 표면 레이어 기능 (일부) circulat를 제외하는 방법내피 표면 2 ING 요소. ESL 무결성 따라서 액세스 세포 표면 부착 분자 (예 : ICAM-1 등)과 상호 작용하는 순환 요소의 능력 (형광 microsphere를 예를 들어)에 의해 측정 할 수 있습니다. <ol><li> 반 (反) ICAM-1이라는 형광 마이크로은 수술 전에 준비가되어 있습니다. Streptavidin-코팅 0.97 μm 형광 마이크로은 실온에서 30 분에 biotinylated 항 ICAM-1 (YN1/1.7.4 복제, 1시 50분, eBioscience) 항체 또는 isotype 제어 incubated 수 있습니다. 마이크로은 세 번 세척하고 ML 당 1 개 10 9 마이크로에서 PBS에 일시 중지됩니다. </li><li> intravital 현미경 동안, microsphere 정지 (100 μl)은 경정맥 정맥 카테터에 주입되어 있습니다. 순환 15 분 후 형광 이미지는 5 분 이상 캡처합니다. &gt; 5 분에 고정되어 마이크로은 자기편 및 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 정량화 간주됩니다. </li></ol> 8. 안락사 &lt;절차의 완료 후 P 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt;, anesthetized 마우스는 직접 심장 구멍을 통해 일어난 과다 출혈에 의해 euthanized 있습니다. 안락사는 폐는 나중에 분석을 위해 수확 및 스냅 - 냉동 된 이후 양국 pneumothoraces를 통해 확인합니다.

<ol><li>Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+degradation+of+matrix+proteoglycans+and+edema+development+in+rabbit+lung%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung.</a> AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).</li>
<li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+regulates+neutrophil+adhesion+and+lung+injury+during+experimental+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis.</a> Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).</li>
<li>Florian, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycan+is+a+mechanosensor+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells.</a> Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).</li>
<li>Chappell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Glycocalyx+of+the+Human+Umbilical+Vein+Endothelial+Cell%3A+An+Impressive+Structure+Ex+Vivo+but+Not+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture.</a> Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).</li>
<li>Potter, D. R., Damiano, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hydrodynamically+relevant+endothelial+cell+glycocalyx+observed+in+vivo+is+absent+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro.</a> Circ. Res. 102, 770-776 (2008).</li>
<li>Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+and+Function+of+the+Endothelial+Glycocalyx+Layer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).</li>
<li>Pittet, M., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li>
<li>Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+tomato+%28Lycopersicon+esculentum%29+lectin+with+its+deglycosylated+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative.</a> Biochem. J. 220, 843-847 (1984).</li>
<li>Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-wall+micro-PIV+reveals+a+hydrodynamically+relevant+endothelial+surface+layer+in+venules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo.</a> Biophys. J. 85, 637-645 (2003).</li>
<li>Vink, H., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules%2C+Erythrocytes%2C+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circ. Res. 79, 581-589 (1996).</li>
<li>Marechal, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+glycocalyx+damage+during+endotoxemia+coincides+with+microcirculatory+dysfunction+and+vascular+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress.</a> Shock. 29, 572-576 (2008).</li>
<li>Presson, R. G. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Imaging+within+the+Murine+Thorax+without+Respiratory+and+Cardiac+Motion+Artifact%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact.</a> The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).</li>
<li>Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ventilation+on+vascular+permeability+and+cyclic+nucleotide+concentrations+in+ischemic+sheep+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs.</a> J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).</li>
<li>Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nitric+oxide+synthesis+enhances+leukocyte+rolling+and+adhesion+in+human+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature.</a> Journal of Inflammation. 9, 28(2012).</li>
<li>Schmidt, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+guanylyl+cyclase+contributes+to+ventilator-induced+lung+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice.</a> AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).</li>
<li>Mead, J., Takishima, T., Leith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+distribution+in+lungs%3A+a+model+of+pulmonary+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity.</a> J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).</li>
<li>Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilator-induced+lung+injury%3A+the+anatomical+and+physiological+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework.</a> Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).</li>
<li>Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Lung+Injury+Causes+Pendelluft+Between+Adjacent+Alveoli+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490(2011).</li>
<li>Roebuck, K. A., Finnegan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1+%28CD54%29+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression.</a> J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).</li>
</ol>

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생체 현미경에서의 확장 사용과 일치, ESL의 상당한 크기뿐만 아니라 혈관 기능에 수많은 공헌을 모두 증가 감사가 있습니다. 이 새로운 데이터는하지만, 주로 전신 vasculature의 연구에서 파생됩니다. 사실, 폐에 생체 현미경의 사용 기술적으로 주어진 중요한 폐와 심장 모션 유물은, 도전하고 있습니다. 여러 최근의 기술 진보는 폐 microcirculation 12, 13에 intravital 기술의 더 나은 응용 프로그램을 affording, 이동 마우스 폐의 안정화를 사용할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 그러나, 잠재적으로 폐 부동의 physiologic 파급 효과에 의해 실마리를 못 찾고 있습니다. 폐는 teleologically 지속적으로 운동하기위한 기관으로, 폐 스테이 시스는 직관적으로 폐 생리를 변경합니다. 사실, 폐 스테이 시스는 내피 N의 변경과 관련된itric 산화 신호, 건강하고 부상당한 폐 <s...

내피 glycocalyx은 혈관 intima 릴 proteoglycans 및 관련 glycosaminoglycans의 세포 층입니다. 생체에서 glycocalyx는 호중구 - 내피 유체 투과성 1 등의 내피 기능의 다양한 규제 상당한 내피 표면 층 (ESL)을 형성, 높은 수화입니다 접착 2, 유체 전단 응력의 ​​3 mechanotransduction. 역사적으로, glycocalyx 인해 표준 조직 고정 및 처리 6시 배양 세포 준비 4, 5 및 저하에서의 aberrance에 무시받는되었습니다. 증가 사용 intravital 현미경의 7 (생체 현미경에 IVM) 건강과 질병 중 혈관 기능에 ESL의 중요성에 상승 과학적 관심과 일치하고 있습니다. ESL은 빛 현미경에 보이지 않는과 쉽게 표시 할 수 없습니다적혈구 응집 8 치명적인 폐 emboli (게시되지 않은 관찰)을 일으킬 수있는 형광 glycocalyx 바인딩 lectins의 성향에 주어진 생체. 여러 간접적 인 방법 따라서 예를 cremasteric과 창 자간 막 microcirculations 같은 비 이동 혈관 침대에서 ESL 두께 (및, 확장하여, glycocalyx 무결성)을 추론하기 위해 개발되었습니다. 이 기술은 내피 표면에서 내피 막 (microparticle 이미지 velocimetry 9)뿐만 아니라 부피가 큰, 휘황 - 라벨 혈관 마커 (예 : dextrans)의 배제의 측정에서 거리의 함수로 microparticle 속도를 순환의 차이의 측정을 포함 (dextran 제외 기술 10, 11). 이러한 기술 중 단 dextran 제외 시간에 하나의 시점에서 만들어진 측정에서 ESL의 두께를 추정 할 수 있습니다. 동시에에 brightfield 현미경 (폭을 사용하여 혈관 폭을 측정하여&quot;눈에 보이지 않는&quot;ESL)과 ESL에서 제외 혈관 추적의 형광 현미경의 clusive, ESL 두께는 혈관 폭 2 ~ 한 반 차이로 계산 될 수있다. ESL 두께의 순간 측정의 사용은 폐 glycocalyx 연구에 적합합니다. 폐의 Intravital 현미경은 크게 폐와 심장 모션 아티팩트 주어진 도전입니다. 최근 진보 생체 12, 13에 마우스 폐의 고정을 허용하지만, 문제는 폐 정지 physiologic 미치는 영향에 관한 존재합니다. 폐 부동는 14 신호 감소 내피 질소 산화물, 호중구 부착 15 폐 부상 16에 모두 영향을 신호 경로와 연결되어 있습니다. 또한,의 고전 physiologic 개념에 따라 폐 유해한 전단 세력 ( &quot;atelectrauma&quot;소위)에 모바일 폐포를 둘러싼 노출의 지역의 고정,폐포 상호 의존성 17. 2008 년 Arata 타 부치, 볼프강 Kuebler와 동료는 자유롭게 움직이는 마우스 폐 18 intravital 현미경을 허용하는 수술 기술을 개발했다. 이 기법에서 발생하는 호흡기 유물은 brightfield과 형광 현미경의 동시 측정 등의 고속 이미지의 사용에 의해 무효가 될 수 있습니다. 순간 dextran 제외 이미징은 생체에서 자유롭게 움직이는 마우스 폐의 subpleural microcirculation에서 ESL의 두께를 측정하는 고용 할 수있는 방법을이 보고서에서, 우리는 자세히 설명합니다. 이 기술은 쉽게 함수 구체적으로 glycocalyx를 결정하기 위해 내피 표면에서 요소를 순환 제외 할 수 ESL 그대로의 능력을 수정할 수 있습니다. 우리는 최근에는 패혈증이 같은 전신 염증 질환 중 급성 폐 손상의 발전에 폐 ESL 무결성의 중요성을 결정하기 위해 이러한 기술을 사용했습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약의 이름 </td></tr><tr><td> FITC-dextran (150 kDa) </td><td> 시그마 </td><td> FD150S </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-dextran (150 kDa) </td><td> 시그마 </td><td> T1287 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-코팅 형광 마이크로 </td><td> 앞머리 연구소 </td><td> CP01F/10428 </td><td> 드래곤 녹색 형광 (FITC와 유사) </td></tr><tr><td> 케타민 </td><td> 무어 의료 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> 무어 의료 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 반 (反) ICAM-1 biotinylated 항체 </td><td> eBioscience </td><td> YN1/1.7 복제.4 </td><td> 1시 50분 희석 </td></tr><tr><td> biotinylated 항체를 Isotype </td><td> eBioscience </td><td> IgG2b eB149/10H5 </td><td> 1시 50분 희석 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 기계 환풍기 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 영감 </td><td></td></tr><tr><td> Tracheostomy 카테터 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 730028 </td><td></td></tr><tr><td> Electrocautery 장치 </td><td> 드레 의료 </td><td> Valleylab SSE-2L </td><td></td></tr><tr><td> 양극성 소작 포셉 </td><td> 올슨 의료 </td><td> 10 1200I </td><td> 9.9cm 맥 피어슨이 </td></tr><tr><td> 온도 contro리터 시스템 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> ATC1000 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 펌프 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 펌프 (11) 엘리트 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 (widefield) </td><td> 니콘 </td><td> LV-150 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 (공 촛점) </td><td> 니콘 </td><td> A1R </td><td></td></tr><tr><td> 이미지 스플리터 </td><td> Photometrics </td><td> DV2 </td><td></td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> Photometrics </td><td> CoolSNAP HQ2 </td><td></td></tr><tr><td> 이미지 처리 소프트웨어 </td><td> 니콘 </td><td> NIS 요소 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 염화 비닐 막 </td><td> 구레 WRAP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 원형 커버 슬립 </td><td> Bellco </td><td> 5CIR-1-BEL </td><td> 5mm, # 1 두께 </td></tr><tr><td> 접착제 (막에 슬립을 커버) </td><td> Pattex </td><td> Flussig (액체) </td><td> 막에 커버 슬립을 affixing에 대한 </td></tr><tr><td> 접착제 (마우스 슬립을 커버) </td><td> Pattex </td><td> 젤라틴 </td><td> 마우스 멤브레인을 부착 </td></tr><tr><td> 외과 튜브 </td><td> Intramedic </td><td> PE50, PE10 </td><td></td></tr><tr><td> 상처의 봉합 </td><td> 어부 </td><td></td><td> 4시 실크 </td></tr><tr><td> 전기 면도기 </td><td> Oster </td><td> 78,997 </td><td></td></tr><tr><td> 구부러진 외과 포셉 </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 스트레이트 외과 포셉 </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 외과 가위 </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 외과 microscissors </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 외과 바늘 드라이버 </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 외과 테이프 </td><td> 어부 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 주방 스폰지 (웨지로 잘라) </td><td> 여러 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 폐 내피 표면 층의 생체 측정

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

내피 glycocalyx은 혈관 내강을 늘어서 proteoglycans 및 관련 glycosaminoglycans의 층이다. 생체에서 glycocalyx은 내피 기능의 유지에 기여 상당한 내피 표면 층 (ESL)을 형성, 매우 충분한 것입니다. 내피 glycocalyx가 자주 체외에서 탈선 및 표준 조직 고정 방법 중에 손실 된 바와 같이, ESL의 연구는 intravital 현미경의 사용이 필요합니다. 폐포 microvasculature의 가장 대략적인 복잡한 생리에, 폐 intravital 영상은 이상적으로 자유롭게 움직이는 폐에 수행됩니다. 이러한 준비는하지만, 일반적으로 광범위한 운동의 유물로 고통 받고 있습니다. 우리는 자유롭게 움직이는 마우스 폐의 폐 가슴 intravital 현미경은 내피 표면에서 휘황 - 라벨 고분자 체중 dextrans의 ESL 제외 통해 glycocalyx 무결성을 측정하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 필요이 아닌 복구 수술 기법,동시 brightfield와 마우스 폐의 형광 이미징은 혼란 폐 부상을 일으킬 증거도없이 subpleural microvasculature의 길이 방향 관찰 할 수 있습니다.

단계 1-6에 설명 된 실험 방법은 동시 DIC (brightfield) 및 형광 이미지의 여러 프레임 캡처를 할 수 있습니다. ESL 두께를 확인하려면 녹음 이미지는 실험 프로토콜의 완료 후에 눈을 멀게 관찰자에 의해 검토됩니다. 포커스에 프레임이, subpleural microvessels가 (&lt;20 μm 직경) 식별을 사용하여, 최소 3 microvessels는 일반적으로 하나의 프레임 (그림 10)에서 찾을 수 있습니다. 이미지 분석 소프트웨어 (NIS 요소, 니콘)를 사용하여 혈관 폭이 microvessel 당 3 수직를 도청의 길이를 평균하여 (눈을 멀게 관찰자에 의해) 측정합니다. ESL은 DIC 이미지에 보이지 않는 바와 같이, DIC 혈관 폭은 내피 막에 내피 막에 걸쳐 따라서 ESL의 두께 9, 10의 포함되어 있습니다. 반면, FITC-dextran (150 kDa)은 ESL에서 제외됩니다. 따라서, FITC 혈관 폭은 ESL 두께를 포함하지 않습니다....

내피 내피 / glycocalyx 표면 층은 이상적인 intravital 현미경을 사용하여 공부하고 있습니다. Intravital 현미경은 기술적 같은 폐 등 움직이는 장기에 도전하고 있습니다. 우리는 동시 brightfield 및 형광 현미경은 자유롭게 - 이동에 내피 표면 층의 두께를 추정하는 데 사용할 수 있습니다 방법을 보여줍니다<em&gt; 생체 내</em&gt; 마우스 폐.

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

다음 실험의 전반적인 목적은 형광 표지된 고분자 덱스트린이 혈관 표면에서 배제되는 정도를 측정하여, 폐 미세혈관 내피 표면층(endothelial surface layer, ESL)의 두께를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 생체 내(intra vital) DIC 현미경 관찰을 수행하여 움직이는 마우스 폐 내 흉막하 미세혈관의 내피세포 막을 식별합니다. 그다음, 마우스에 고분자 형광 표지 덱스트린을 주입하며, 이 덱스트린은 평소에는 보이지 않는 내피 표면층에 의해 혈관벽으로부터 배제됩니다.그 후, 단일 초점 프레임에서 DIC 및 형광 이미지를 동시에 캡처하여, ESL 두께를 각각 포함하거나 제외한 혈관 너비를 측정합니다. DIC 혈관 너비와 형광 혈관 너비의 차이를 이용하여 흉막하 미세혈관 ESL의 두께를 추론합니다. 마이크로입자 속도 대칭법(microparticle velo symmetry)과 같은 기존 방법보다 이 기술이 가진 주요 장점은 폐와 같이 움직이는 장기에서도 정확하게 수행할 수 있다는 점입니다. 이 절차를 시연할 사람은 제 실험실의 선임 연구원인 Dr.IMU Yang이며, 마우스 개흉술을 위한 튜브를 준비하겠습니다.PE 50 튜빙을 10 centimeter 길이로 자른 후, 한쪽 끝을 곡선형 23 gauge 바늘의 뭉툭한 끝부분에 부착합니다. 30 gauge 바늘을 사용하여 튜빙의 원위단(distal end)을 반복적으로 찔러 측면 포트를 생성함으로써, 4-0 silk 봉합사로 흉강 내 공기를 효과적으로 흡인할 수 있도록 합니다. 튜빙에 구멍을 낸 부분과 나머지 부분을 분리하기 위해, 스토퍼 역할을 하며 흉강 내에 구멍 난 부분이 고정될 수 있도록 원주 방향으로 여러 번 루프를 만들어 줍니다.투명한 poly vanil 막을 타원형으로 잘라 흉벽 윈도우를 준비하고, alpha cyanoacrylate 접착제를 사용하여 직경 5 mm의 1번 커버 슬립을 부착합니다. 마우스를 마취시킨 후 수술 부위를 제모 및 소독하고 절삭 보드에 고정합니다. 해부 현미경 하에서 목 부위에 1 cm 절개를 가합니다.하부의 결합 조직을 절개하고 타액선을 외측으로 분리하여 젖힙니다. 4-0 봉합사 루프를 기관 아래로 통과시킵니다. 그런 다음 이를 절단하여 두 개의 분리된 봉합사 가닥을 만듭니다.두 손가락을 사용하여 상단 봉합사를 잡고 기관에 부드럽게 장력을 가합니다. 그런 다음 상단과 하단 봉합사 사이에서 기관 둘레의 약

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

엑기스의 관찰을위한 새로운 다양한 방법을 제시합니다. 이것은 장기 관찰에 적합 간주하고, pharmacophysiological 또는 분자 생물 학적 중재와 함께입니다.

내부 핵심 현미경에 의해 골격근의 생체내 미세 순환 측정

<em&gt; 생체 내</em혈관 투과율을 테스트하려면&gt; 분석

고립 된 혈액 관류 폐 준비는 폐 표면에 미세 혈관의 네트워크를 시각화하는 것이 가능합니다. 여기에서 우리는 실시간 형광 이미징을 사용하여 격리 된 폐의 단일 미세 혈관의 투과성을 정량화하는 방법을 설명합니다.

고립 된 혈액 관류 쥐 폐 준비에 단일 미세 혈관 투과성의 양을

이 프로토콜의 목표는 COPD의 쥐 모델에서 만성 폐 병리학을 정량화하는 자동화된 방법을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜에는 생쥐를 담배 연기(CS)에 노출시키고, 폐 기능을 측정하고, 폐를 팽창시키고, 형태 측정 방법을 사용하여 생쥐의 폐기종 및 소기도 재형성을 측정하는 것이 포함됩니다.

담배 연기에 노출 된 마우스의 폐 폐기종 및 작은기도 리모델링 자동 측정

여기에서는 마우스의 폐압-부피 곡선을 간단하고 안정적으로 측정할 수 있는 프로토콜을 제시하며, 두 가지 일반적인 폐 병리학인 폐 섬유증과 폐기종에서 표현형 실질 변화를 감지할 수 있을 만큼 충분히 민감하다는 것을 보여줍니다. 이 지표는 병리학의 발달에 따른 폐의 구조적 변화를 정량화할 수 있는 수단을 제공합니다.

마우스 폐의 압력 볼륨 곡선의 측정

우리는 매트릭스 겔 플러그 혈관 분석의 변형을 사용하여 마우스에서의 인간 내피 주연 세포의 상호 작용을 연구하는 프로토콜을 제시한다.

마우스의 매트릭스 젤 플러그 분석을 사용하여 인간의 내피 - 주연 세포 상호 작용의 생체 내 연구에

많은 비전을 위협 눈 질병 장애 망막 microvessels와 연결 됩니다. 따라서, 망막 되 응답의 측정은 기본 병 태 생리 기계 장치를 조사 하는 것이 중요. 이 문서에서는 마우스 망막 되 격리와 혈관 직경에 vasoactive 물질의 효과 평가 하기 위해 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

마우스 망막 Arterioles Ex Vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계

여기서, 우리는 마우스 대인의 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 다른 흐름 패턴에서 내피 세포의 세포 및 분자 표현형을 연구하고 동맥 경화증의 발달에 유용합니다.

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이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.

일차 마우스 폐 내피 세포의 분리

본 프로토콜에서, 턱밑샘(SMG)의 내피 장벽 기능은 이광자 레이저 스캐닝 현미경 하에 생체 내에서 시험 동물 모델의 각 정맥에 상이한 분자 가중 형광 추적자를 주입함으로써 평가되었다.

생체 내 마우스 턱밑샘의 혈관 투과성 검출

여기에서는 Isolectin B4의 단일 염색을 사용하여 전체 마우스 폐 조직에 대한 폐 미세혈관 밀도의 편향되지 않은 정량화를 수행하는 간단하고 경제적인 프로토콜을 설명합니다.

소엽에 걸친 생쥐의 폐 미세혈관 밀도 정량화

학습하세요 마우스 폐 미세혈관 내피 표면층 두께 측정법을 생체 내 현미경으로. 동시 DIC 및 형광 영상 촬영을 통해 움직이는 장기에서 정확한 ESL 측정이 가능합니다. 이 기법은 혈관생물학 연구에 활용됩니다.

마우스 폐 내피 표면 층의 생체 측정

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