Name: 골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 배우세요 골수 유래 대식세포를 이용한 대식세포 분극 분석 방법을. 마우스 뼈에서 세포를 분리하고 배양하여 M1 및 M2 활성화 반응을 유도한 후 유세포 분석 및 실시간 PCR로 검증합니다.

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이 작품은 미국 심장 협회 (박사 Beiyan 저우에 BGIA 7,850,037)에 의해 지원되었다.

1. 골수 세포의 분리 <ol><li> 6-8주 오래된 마우스에서 대퇴골과 경골 뼈를 분리, 머리를 헹구어 낸 후 뼈를 자르면. </li><li> 차가운 PBS 2 %의 열 비활성화 태아 소 혈청 (FBS) (3-5 ML / 마우스)에 골수를 플러시 21G 바늘과 10 ML의 주사기를 사용합니다. </li><li> 세포를 해리 21G 바늘을 통해 4-6 번 골수를 전달합니다. </li><li> 세포 덩어리, 뼈, 머리 및 다른 세포 / 조직을 제거하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다. </li><li> NH 4 염소 용액 (0.8 % NH 4 망할 CIA 솔루션 스템 셀 기술) 3 볼륨을 추가하고, 적혈구를 제거하는 10 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 4 ° C.에서 5 분 500 XG에서 세포를 스핀 다운 </li><li> 차가운 PBS 2 % FBS (20 ~ 50 ml의 세포의 양에 따라)에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li></ol> 2. 유도 BMDM 형성 <ol><li> BMDM 성장 배지에서 분리 된 골수 세포 (2 × 10 6 세포 / M resuspend을L). </li></ol> BMDM 성장 매체 : Iscove의 수정 된 Dulbecco의 중간 (IMDM) + 10 % FBS + 15 % 여과 (0.2 μm의) L-929 세포 (ATCC, CCL-1) 문화 상층 액 (단핵구 콜로니 자극 인자, M-CSF를 포함) 또는 10 NG / ML M -CSF. 참고 : L-929 세포의 상층 액은 M-CSF 18이 포함되어 있습니다. 에어컨 중간, 5의 효과적인 활동을 보장하기 위해 X 10 5 L-929 세포 6-7일에 대한 T75 cm 2 플라스크에 씨앗을 품고 있으며, 에어컨 매체를 사용하기 전에 필터 0.45 μm의를 통해 수집하고 전달됩니다. 중간 분주은 1-2 개월 동안 즉시 사용할 또는 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. <ol start="2"><li> 6 12 잘 조직 배양 플레이트 (실험 설계에 따라 다름) (코닝 공연자)의 씨앗 세포. </li><li> 3 일 신선한 BMDM 성장 매체를 변경합니다. </li><li> 하루에 7, 성숙 BMDM의 형성은 유동 세포 계측법 분석을 사용하여 평가됩니다및 형광 결합 항체는 CD11b 및 F4/80을 표현하는 세포를 감지합니다. </li></ol> 3. BMDM 편광 활성화 <ol><li> 7 일째에 신선한 자극을 매체로 변경 M1 활성화, IMDM 50 NG / ML IFNγ와 10 % FBS, 100 NG / ML LPS 또는 100 NG / ML LPS를 포함한 사용, M2 활성화와 10 % FBS를 포함 IMDM을 사용 10 NG / ML IL-4 및 / 또는 10 NG / ML IL-13. </li><li> 따뜻한 0.05 % 트립신을 사용하여 요리에서 그들을 분리에 의해 자극 BMDMs를 수집 PBS 10 % FBS를 포함한 두 번 세포를 세척 한 다음. </li></ol> 참고 : 차별화 후 성숙 식세포, 0.05 % 트립신 용액 (0.48 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), Invitrogen의를 포함) 또는 칼슘과 마그네슘이없는 PBS 또는 행크의 균형 버퍼 (HBSS)에 2-5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 분리하고 resuspend을 위해 사용할 수 있습니다. 트립신을 포함하는 소화 매체를 사용하는 경우, 셀 쉬르의 손실을 방지하기 위해보다 10 분 동안 37 ° C에서 처리됩니다얼굴에 소화에 의한 단백질. <ol start="3"><li> CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 또는 표준 유동 세포 계측법 염색 프로 시저를 사용하여 다양한 시간 지점에서 CD86를 포함하여, 세포 표면 항원의 발현을 검출하기 위하여 항체를 사용합니다. </li><li> QRT-PCR을 이용하여 IL-1β, TNF-α와 IL-6 (M1 활성화) 또는 IL-10, IL-13, arginase1 및 PPARγ (M2 활성화) 등의 활성화 M1 및 M2 대식 세포의 특징적인 유전자의 발현을 확인합니다. 웨스턴 블롯 분석에 의한 M1 또는 M2 대식 세포의 활성화에 관련된 세포 신호 전달 경로의 활성화를 결정합니다. </li></ol>

<ol><li>Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microrna+circuitry+links+macrophage+polarization+to+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis.</a> Circulation. , (2012).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+death+and+defective+inflammation+resolution+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-specific+pparg+controls+alternative+activation+and+improves+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance.</a> Nature. 447, 1116-1120 (2007).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+m2+activation+of+kupffer+cells+by+ppard+ameliorates+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance.</a> Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).</li>
<li>Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+metabolism+and+pgc-1%5Bbeta%5D+attenuate+macrophage-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation.</a> Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).</li>
<li>Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ikk-b+links+inflammation+to+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance.</a> Nat. Med. 11, 191-198 (2005).</li>
<li>Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cell-specific+deletion+of+toll-like+receptor+4+ameliorates+hepatic+and+adipose+tissue+insulin+resistance+in+high-fat-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice.</a> Cell Metab. 10, 419-429 (2009).</li>
<li>Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-derived+th2+cytokines+and+myeloid+ppard+regulate+macrophage+polarization+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity.</a> Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).</li>
<li>Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pparg+activation+primes+human+monocytes+into+alternative+m2+macrophages+with+anti-inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties.</a> Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).</li>
<li>Bronte, V., Zanovello, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immune+responses+by+l-arginine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of immune responses by l-arginine metabolism.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).</li>
<li>Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulator+of+macrophage+activation%3A+Mir-223+in+obesity-associated+adipose+tissue+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation.</a> Circulation. 125, 2892-2903 (2012).</li>
<li>Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+and+ultrastructural+analysis+of+alveolar+macrophage+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation.</a> J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).</li>
<li>Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4+potently+enhances+murine+macrophage+mannose+receptor+activity%3A+A+marker+of+alternative+immunologic+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation.</a> J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).</li>
<li>Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+murine+mononuclear+phagocyte+inflammatory+products+by+macrophage+colony-stimulating+factor.+Lack+of+il-1+and+prostaglandin+e2+production+and+generation+of+a+specific+il-1+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor.</a> J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).</li>
<li>Biswas, S. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+interaction+with+lymphocyte+subsets%3A+Cancer+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm.</a> Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+In+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 여기에서 골수 전구 세포에서 유래 대 식세포의 활성화를 유도 할 수있는 간단하고 체외에서 쉽게 적응할 수있는 절차를보고합니다. 이 절차는 대식 세포의 편광에 대한 책임 메커니즘의 연구에 사용할 수 있습니다. 성숙한 대식 세포의 순도는이 프로토콜의 평균에게 95-99%을 사용하여 얻은하고 추가 정제 과정이 필요하지 않습니다. 대식 세포 분극, 자궁외 식 또는 유전자의 특정 최저의 맥락에서 이해 특정 유전자의 기능을 조사하려면 하루 7 세포의 다음과 같은 형질을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 형성, 성숙과 대식 세포의 표현형에 영향을 미치는 특정 요인이나 유전자의 영향을 조사하기 위해 7 일 문화의 창을 제공합니다. 활성화 된 대 식세포는 다양한 자극 3, 9, 19에 대한 응답으로 좋은 가소성을 가진 복잡한 세포 및 분자 프로파일을 표시합니다. 용그러나, 활성 프로파일이 완전히 중복되지 않는 예, LPS는 IFNγ 또는 종...

고전적인 염증 반응, 조직을 침투 대식 세포의 구별은 종종 호스트 조직 생리 기능 1-8 조절에 중요한 역할을 편광 정품 인증 상태를 표시합니다. 자극에, 대식 세포 활성화는 고전 (M1) 및 대체 (M2) 활성화 2, 4, 9로 정렬 할 수 있습니다. M1 대 식세포의 활성화는 TNF-α와 같은 염증성 사이토 카인의 생산에 이르는 수신자 같은 수용체 (TLR은) 핵 인자 카파 B (NFκB) / C 6 월 N-말단 키나제 1 (JNK1)의 활성화에 따라 IL- iNOS의의 1β 및 활성화하는 등의 질화물 산화물 (NO) 10, 11와 같은 활성 산소 종의 생산 증가의 결과. 반면, M2 대식 세포 활성화 모집 PPARγ, PPARδ, 또는 IL-4-STAT6 경로는 대체 만노오스 수용체 CD206의 상향 조절과 연관되어, 항 염증 (M2) 활성화 및 arginase 1 (이며 Arg1) 6, 12로 이어지는 - 14 &lt;/&gt;을 먹다. 골수 유래 대 식세포 (BMDM)는 활성화 된 대 식세포 15 편광을 제어하는 메커니즘을 이해하는 체외 모델의 이상을 제시한다. M2 대식 세포의 편광은 IL-4 및 / 또는 IL-13에 의해 유도 될 수 있지만, 특히 M1 대 식세포의 활성화는 리포 다당류 (LPS) 자극에 의​​해 유도 될 수있다. 성숙한 골수 유래 대 식세포 활성화 된 대 식세포는 CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 및 CD86 9, 16, 17 등의 표면 항원의 발현 유동 세포 계측법 분석을 통해 식별 할 수 있습니다. 또한, 시토 킨 생산 및 대식 세포 분극과 관련된 세포 신호 전달 경로의 변화는 정량적 RT-PCR 및 웨스턴 각각 내듯 측정 할 수 있습니다. 요약하면, 마우스 골수 유래 대 식세포는 체외에서 대식 세포 분극을 연구하는 중요한 모델이 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30259.01</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Murine GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>StemCell Technologies</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>L-929</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 세포 여과기</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>AP-9009-10</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD11b-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 F4/80-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD69-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0691-81</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD86-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0862-81</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr></tbody></table>

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

이 문서는 대식 세포 분극을 조사하기 위해 체외 모델에서 쉽게 쉽게 적응을 설명합니다. GM-CSF/M-CSF의 면전에서, 골수에서 조혈 줄기 / 전구 세포 M1 또는 M2 자극 한 다음, 단핵구 분화에 연결됩니다. 활성 상태는 세포 표면 항원 유전자 발현 및 세포 신호 전달 경로의 변화에​​ 의해 추적 할 수 있습니다.

BMDM 생성 과정의 개략적 인 설명은 (그림 1) 표시됩니다. 그들은 CD11b + F4/80 + 세포의 95-99% (그림 2)를 나타냅니다 때 성숙한 대식 세포의 순도는 7 일에 관찰 할 수 있습니다. 편광 식세포가 CD11b, F4/80에 대한 항체를 사용하여 검사 할 수 있습니다, CD11c와 CD206는 유동 세포 계측법 분석에 의해 따랐다. 그림 3에서와 같이, M1 대 식세포는 다음과 같이 발견 된 CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-세포 (Q2), M2 대식 세포는 CD11b 반면 + F4/80 + CD11c-CD206 + 세포 (Q4). BMDM 활성화 상태가 증가 세포의 크기 (그림 4A, FSC-A에서 오른쪽으로 이동) 및 표면 항원의 증가 풍부한 CD69, CD80, 또는 대식 세포에서 CD86에 의해 확인 될 수있다 (문 : CD11b + F4/80 +) <stro...

이 문서는 쉽게 쉽게 적응을 설명<em&gt; 체외에서</em대식 세포 분극을 조사하기&gt; 모델. GM-CSF/M-CSF의 면전에서, 골수에서 조혈 줄기 / 전구 세포 M1 또는 M2 자극 한 다음, 단핵구 분화에 연결됩니다. 활성 상태는 세포 표면 항원 유전자 발현 및 세포 신호 전달 경로의 변화에​​ 의해 추적 할 수 있습니다.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

분극화 분석을 위한 골수 유래 대식세포를 생성합니다. 마우스에서 대퇴골과 경골을 분리하여 골수 세포를 수집합니다. 그 다음, 대식세포 형성을 유도하기 위해 성장 인자가 포함된 배지에서 세포를 배양합니다.7일간의 배양 후, 골수 유래 대식세포에 다양한 자극을 처리하여 대식세포를 분극화합니다. 활성화 반응은 유세포 분석법, 실시간 PCR 및 웨스턴 블롯 분석으로 분석하며, M1 또는 M2로 분극화된 활성화 반응을 보이는 고순도의 골수 유래 대식세포 결과가 도출됩니다. 자극제 라인.이 기술은 인슐린 저항성 및 CRO를 포함하여 다양한 관련 질환의 치료나 진단에 기여할 수 있는데, 이는 T 세포 침투 대식세포가 이 과정에서 주요한 역할을 하기 때문입니다. 골수 세포의 추출 과정이 다소 까다롭고, 대식세포 형성을 유도하기 위해 충분한 연구용 세포 준비물을 얻기 위해서는 수율이 매우 중요하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 필수적입니다. 멸균 후드 내에서 작업을 수행하십시오. 조직 배양 접시에 6~8주 된 생쥐로부터 분리한 대퇴골과 경골을 준비하여 이 프로토콜을 시작합니다. 뼈를 PBS로 헹군 다음, 핀셋으로 뼈를 잡고 가위를 사용하여 뼈의 양 끝단을 절개하되, 너무 많이 제거되지 않도록 주의하십시오.2% 열활성화 FBS가 포함된 차가운 PBS 10ml가 담긴 시린지에 21-23 gauge 바늘을 장착하여 뼈의 한쪽 끝에 삽입합니다. 플런저를 눌러 골수를 새로운 조직 배양 접시로 밀어냅니다. 다음으로, 세포를 분리하기 위해 골수를 동일한 바늘로 4~6회 통과시킵니다.그런 다음, 세포 덩어리, 뼈, 털 및 기타 세포나 조직을 제거하기 위해 세포를 70 micron 세포 스트레이너에 붓습니다. 통과액을 50 milliliter 원뿔형 튜브에 수집합니다. 용액이 필터를 통과하면, 통과액에 3배 부피의 0.8% ammonium chloride를 첨가하고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.배양 후 적혈구를 제거하려면, 4°C에서 500 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 세포 펠릿을 2% FBS가 포함된 차가운 PBS 20~50 mL에 재현탁합니다. 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다.세포를 4°C에서 500 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 따라낸 후, 프로토콜의 다음 섹션에 설명된 대로 BMDM 형성을 유도합니다. BMDM 형성을 유도하려면 분리된 골수 세포를 BMDM 성장 배지에 2배 농도로 현탁합니다.밀리리터당 6 × 10⁶개의 세포를 농도로 맞춘 후, 6웰 또는 12웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 1~2 × 10⁶개의 세포를 분주하고 37 °C에서 배양합니다. 이 농도로 세포를 분주하면 3일 후 유세포 분석을 위한 세포 분리가 용이해집니다. 7일째에 신선한 BMDM 성장 배지로 교체하십시오.성숙한 BMDM의 형성은 유세포 분석과 CD 11 B 및 F four 80을 발현하는 세포를 검출하기 위한 형광 결합 항체를 사용하여 평가합니다. 성숙한 BMDM의 형성을 확인한 후, 10% FBS가 포함된 신선한 is cove's modified do echo's 배지로 교체하고, M1 활성화를 위해서는 LPS 또는 LPS와 interferon gamma를, M2 활성화를 위해서는 IL four 또는 IL 13을 첨가합니다. 세포를 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다.디쉬에서 떼어내어 자극된 b MDM을 수집합니다. 이를 위해 세포에서 배지를 제거하고 칼슘이나 마그네슘이 없는 PBS로 세척합니다. 그 후 0.48 millimolar EDTA가 포함된 따뜻한 0.05% trypsin을 첨가하고 37 °C에서 10분 이내로 배양하여 과다 소화로 인한 표면 단백질의 손실을 방지합니다.그런 다음 10% FBS가 포함된 PBS로 세포를 2회 세척하고 1.2 mL 샘플 튜브로 옮깁니다. 다양한 시간대에서 CD 11 BF four 80, CD 11 C, CD 2 0 6, CD 69, CD 80 또는 CD 86을 포함한 세포 표면 항원의 발현을 검출하기 위해 항체를 사용합니다. 정량적 PCR을 이용한 표준 유세포 분석 염색 절차를 사용합니다.M1 활성화를 평가하기 위해 IL 1β, TNF α 및 IL 6의 발현 수준을 측정하거나, M2 활성화를 평가하기 위해 IL 10, IL 13, arginase 1 및 PPAR γ를 측정합니다. 마지막으로, M1 또는 M2 대식세포 활성화에 관여하는 세포 신호 전달 경로의 활성화를 평가하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행하여 성숙한 BMDM의 순도를 확인합니다. 유도 후, CD 11b, F4/80, CD 11c 및 CD 206b에 대한 항체를 사용하여 유세포 분석을 수행하였습니다. BMDM은 먼저 FSC와 SSC를 기준으로 게이팅하여 잔해(debris) 및 응집체를 제거하였습니다.성숙한 b MDM은 CD11b 양성 F4/80 양성 하위 집단으로 정의되었으며, 이는 이 플롯의 우측 상단에서 확인할 수 있고 대식세포 분극을 평가하기 위해 게이트 내 집단의 95~99%를 차지했습니다. 추가 분석이 수행되었습니다. 먼저, CD11b 양성 F4/80 양성 세포인 조직 침윤 대식세포를 식별하기 위해 게이팅을 수행했습니다.이러한 M1 대식세포 중 CD 11 C 양성 및 CD 2 0 6 음성인 세포는 2사분면에 나타나는 반면, CD 11 C 음성 및 CD 2 0 6 양성인 M2 대식세포는 4사분면에 나타납니다. 대식세포의 활성화를 평가하기 위해, 세포를 LPS와 함께 배양하여 M1 활성화를 유도하거나 IL four와 함께 배양하여 M2 활성화를 유도했습니다. 활성화 후, M0 미처리군과 비교하여 자극 24시간 후 M1 또는 M2 대식세포의 FSCA 이동을 통해 확인한 결과 대식세포의 크기가 증가했습니다.자극 후 대식세포 활성화와 관련된 표면 마커 또한 분석되었습니다. 조기 반응 마커인 CD 69는 자극 후 5시간 또는 24시간에 평가되었으며, CD 80 및 CD 86 마커는 자극 후 48시간에 분석되었습니다. 여기에 나타난 바와 같이, 대식세포의 전형적 및 대체 활성화를 평가하기 위해 자극된 대식세포에서 표면 CD 69, CD 80 및 CD 86의 발현 증가가 확인되었습니다.LPS 또는 IL-4로 24시간 동안 자극한 세포를 수집하고, 여기에서 보여주는 것과 같이 정량적 실시간 PCR 분석을 위해 총 RNA를 추출하였습니다. 처리하지 않은 대식세포와 비교했을 때, M2 대식세포에서 arginase 1 및 PPAR gamma 발현의 증가가 검출되었습니다. M1 대식세포에서는 전염증성 사이토카인인 Interleukin 1 beta 및 TNF alpha의 발현이 증가하였습니다. LPS에 의한 NF kappa B 경로의 활성화를 평가하기 위해, 여기에서 보여주는 것과 같이 P65 및 phospho-P65에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였습니다.LPS 처리를 통해 인산화된 P 65에 대해 더 강한 밴드가 관찰됩니다. 종합적으로, 이러한 데이터는 골수 유래 대식세포가 M1 또는 M2 자극에 대해 분극화된 활성 반응을 보임을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후, 귀하는 골수 유래 대식세포를 생성하고 분극화된 활성 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 절차를 수행할 때는 반응을 테스트하기 전에 분화된 대식세포의 순도를 평가하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 절차 이후에는 대식세포 활성화 조절에 유전자가 어떻게 관여하는가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 유전자의 일시적 형질전환(transient transfection)이나 SHRA와 같은 방법을 수행할 수 있습니다.

investigation-macrophage-polarization-using-bone-marrow-derived

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Macrophages는 항상성의 중심 역할을하고 여러 조직의 병리. 여기에 제시된 프로토콜은 macrophages를 파괴하는 방법을...

마우스의 Macrophages의 고갈과 Reconstitution

이 비디오에서는 말초 혈액 유래 단핵구를 M1 또는 M2 대식세포로 분화 및 분극을 유도하는 절차를 보여줍니다. 과립구-대식세포 집락자극인자, 지질다당류, 인터페론-감마를 이용한 배양은 전염증성 M1 대식세포를 생성하고, 대식세포 집락자극인자와 인터루킨-4를 사용한 배양은 항염증성 M2 대식세포 생산을 유도합니다.

Differentiation and Polarization of Monocyte-Derived Cells into Macrophage-Like Cells

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포입니다. 여기, 우리는 사용하기 쉬운...

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

대사 재프로그래밍은 M1 및 M2 대식세포 분극의 특성이자 전제 조건입니다. 이 원고는 마우스 골수 유래 대식세포에서 해당작용 및 미토콘드리아 기능의 기본 매개변수를 측정하기 위한 분석을 설명합니다. 이 도구는 특정 요인이 대식세포의 대사와 표현형에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

실시간 세포 외 유출 분석을 사용하여 편광 M1과 M2 골수 유래 대 식세포의 대사 특성

우리는 인간의 세포의 proteomic 서명을 macrophage 분극에 낮은 산소 환경 영향의 결정에이 적용 하는 프로토콜을 제시.

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

본 프로토콜은 MFP 라벨이 부착된 악성 균주 H37Rv에 감염된 대식세포와 말초 혈액 단혈세포의 분화에 기초하여 인간 M1 또는 M2 편광 대식세포에서 진코박테리움 결핵 감염을 연구하고, M1의 마커를 포함한 10색 마커를 사용하여 유동 세포암법으로 분석하는 방법을 제공한다.

M1 및 M2 인간 단세포 유래 세포의 편광 및 진균 결핵 감염에 대한 유동 세포측정을 분석

M2 와 같은 종양 관련 대식세포 (TAM)는 암에서 종양 진행 및 가난한 예후와 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 THP-1 단핵세포와 같은 세포를 14일 이내에 M2와 같은 대식세포로 재현가능하게 분화하고 편광하는 상세한 가이드의 역할을 합니다. 이 모델은 종양 미세 환경 내에서 TAM의 항염증 효과를 조사하는 기초가 된다.

인간 단세포와 같은 THP-1 백혈병 세포선을 사용하여 M2와 같은 표현형으로 대식세포 분화 및 편광

본 프로토콜은 마우스에서 골수 유래 대식세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

여기에서는 현재 프로토콜의 신뢰성과 재현성을 개선하고 추가 연구를 촉진하는 것을 목표로 in vitro 임플란트 표면의 면역 조절 가능성을 평가하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 분비 사이토카인 프로파일, mRNA 발현 및 세포 표면 마커는 혈액 단핵구 유래 대식세포를 사용하여 모니터링하여 티타늄에서 배양된 대식세포 분극을 조사했습니다.

임플란트 표면의 M1 및 M2 인간 단핵구 유래 대식세포의 분극 및 특성화 

배우세요 골수 유래 대식세포를 이용한 대식세포 분극 분석 방법을. 마우스 뼈에서 세포를 분리하고 배양하여 M1 및 M2 활성화 반응을 유도한 후 유세포 분석 및 실시간 PCR로 검증합니다.

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

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