골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

편광 분석을 위한 골수 유래 대식세포를 생성합니다. 대퇴골과 경골 뼈를 생쥐에서 분리하고 골수 세포를 수집합니다. 그런 다음 세포는 대식세포 형성을 유도하기 위해 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양됩니다.

7일간의 배양 후 골수 유래 대식세포는 다양한 자극과 편광 대식세포로 처리됩니다. 활성화 반응은 유세포 분석, real-time PCR로 분석되며, M1 또는 M two에 대한 편광 활성화 반응을 가진 골수 유래 대식세포의 고순도를 보여주는 western blos 분석 결과를 얻습니다. 자극 거짓말.

이 기술의 함의는 인슐린 저항성 및 CRO를 포함한 다양성 관련 질병의 치료 또는 진단에 대한 입장입니다 T 침투 대식 세포가 이러한 맥락에서 주요 플레이어이기 때문에 골수 세포의 가속이 다소 어렵고 수율이 대식 세포 형성을 유도하기 위한 충분한 연구 세포 준비를 얻는 데 중요하기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 조직 배양 접시에서 6주에서 8주 된 마우스에서 분리한 대퇴골 및 경골 뼈로 이 프로토콜을 시작합니다. PBS로 뼈를 헹군 다음 가위를 사용하여 뼈의 양쪽 끝을 자르고 집게로 뼈를 잡고 뼈를 너무 많이 제거하지 않도록 주의합니다.

뼈의 한쪽 끝에 21% 가열 활성화 FBS가 있는 차가운 PBS가 들어 있는 10ml 주사기로 21 on 23 게이지 바늘을 삽입합니다. 플런저를 눌러 골수를 새로운 조직 배양 접시로 씻어냅니다. 다음으로, 같은 바늘에 골수를 4-6회 통과시켜 세포를 해리시킵니다.

그런 다음 세포를 70미크론 세포 여과기에 부어 세포 덩어리, 뼈, 머리카락 및 기타 세포나 조직을 제거합니다. 50ml 원추형 튜브에 흐름을 수집합니다. 용액이 필터를 통과하면 흐름에 0.8%염화암모늄을 3부피 첨가하고 얼음에서 10분 동안 배양합니다.

배양 후 적혈구를 제거하려면 섭씨 4도에서 5분 동안 500배 G로 세포를 회전시킵니다. 스핀 후, 20-50 밀리리터의 차가운 PBS에 2% FBS로 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 혈류 세포 분석기를 사용하여 세포를 계수합니다.

섭씨 4도에서 5분 동안 500배 G로 셀을 스핀다운합니다. supinate를 쏟아 부은 후. 프로토콜의 다음 섹션에 설명된 대로 BMDM 형성 유도를 진행하십시오 Resus를 유도하려면 BMDM 성장 배지에서 분리된 골수 세포를 2배 농도로 현탁시킵니다.

10 배 10 밀리리터 당 6 개의 세포를 6 개 또는 12 개의 우물 조직 배양 플레이트의 각 웰에있는 6 개의 세포에 중앙에 놓고 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 이 농도에서 파종하면 3일 후에 유세포 분석을 위한 박리가 용이해집니다. 7일째에 새로운 BMDM 성장 배지로 변경합니다.

성숙한 BMDM의 형성은 CD 11, B 및 F, four, 80을 발현하는 세포를 검출하기 위해 유세포 분석 및 플루오롤 접합 항체를 사용하여 평가합니다. 성숙한 BMDM의 형성을 확인한 후, 10%FBS 및 LPS 또는 LPS와 인터페론 감마가 M1 활성화를 위해 또는 IL 4 또는 IL 13을 가진 코브의 변형된 에코 매체로 신선하게 변화합니다. 24시간 후 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.

자극된 b MDM을 접시에서 분리하여 수집합니다. 이렇게하려면 세포에서 배지를 제거하고 칼슘이나 마그네슘이없는 PBS로 씻으십시오. 그런 다음 0.48 밀리 몰을 함유 한 따뜻한 0.05 % 트립신을 첨가하고 EDTA는 섭씨 37도에서 10 분 이상 배양하여 과도한 소화로 인한 표면 단백질의 손실을 방지합니다.

그런 다음 10%FBS가 함유된 PBS로 세포를 두 번 세척하고 1.2ml 샘플 튜브로 옮깁니다. 항체를 사용하여 다양한 시점에서 CD 11, BF four 80, CD 11 C, CD 2 0 6, CD 69, CD 80 또는 CD 86을 포함한 세포 표면 항원의 발현을 검출할 수 있습니다. 정량적 PCR을 사용한 표준 유세포 분석 염색 절차 사용.

M1 활성화를 평가하기 위해 IL 1, 베타 TNF 알파 및 IL 6의 발현 수준을 결정하거나 M 2 활성화를 평가하기 위해 IL 10, IL 13, 아르기나제 1 및 PPAR 감마의 발현 수준을 결정합니다. 마지막으로, 웨스턴 블로팅(western blotting)을 수행하여 M1 또는 M 두 개의 대식세포의 활성화와 관련된 세포 신호 경로의 활성화를 평가하여 성숙한 BMDM의 순도를 평가합니다. 이후 CD 11 BF 4개, 80, CD 11 C 및 CD 2 0 6 B에 대한 항체를 사용하여 유도 유세포 분석을 수행했습니다.MDM을 먼저 FSC 및 SSC에서 게이트하여 DRI 및 접합체를 제거했습니다.

성숙한 b MDM은 CD 11 B 양성 F 4개의 80 양성 하위 모집단으로 정의되었으며, 이는 이 플롯의 오른쪽 상단에서 볼 수 있으며 대식세포 분극을 평가하기 위해 게이트 모집단의 95-99%를 손상시켰습니다. 추가 분석이 수행되었습니다. 첫 번째 게이팅은 CD 11 B 양성 F 4개의 80 양성 세포인 조직에 침투한 대식세포를 확인하기 위해 수행되었습니다.

그 중 CD 11 C 양성 및 CD 2 0 6 음성 인 M1 대식 세포는 2 사분면에 나타나는 반면, M 2 개의 대식 세포는 CD 11 C 음성 및 CD 2 0 6 양성 인 4 사분면에 나타납니다. 대식세포 활성화를 평가하기 위해 M1 활성화를 유도하기 위해 LPS로 세포를 배양하거나 M 2 활성화를 위해 IL 4로 배양했습니다. 활성화시, 대식세포의 크기는 자극 후 24시간에 M1 또는 M 2개의 대식세포의 FSCA의 이동에 의해 입증된 바와 같이 M의 크기가 증가했으며, 이는 치료되지 않은 M과 비교되었습니다.

대식세포 활성화 관련 표면 마커도 자극 후 분석했습니다. 조기 반응 마커 CD 69는 자극 후 5시간 또는 24시간 후에 평가되었고, CD 80 및 CD 86 마커는 자극 후 48시간에 분석되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 자극된 대식세포에서 표면 CD 69, CD 80 및 CD 86의 풍부함이 증가하여 대식세포의 고전적 및 대안적 활성화를 평가하는 것이 관찰되었습니다.

24시간 동안 LPS 또는 IL four로 자극된 사람들을 수집하고 여기에 표시된 바와 같이 정량적 real-time PCR에 의한 분석을 위해 총 RNA를 추출했습니다. 전염증성 사이토카인의 치료되지 않은 대식세포 발현과 비교하여 M 2개의 대식세포에서 상승된 아르기나아제 1 및 PPAR 감마 발현이 검출되었습니다. P65 및 포스포 관련 P 65에 대한 LPS 항체에 의한 NF 카파 B 경로의 활성화를 평가하기 위해 M1 대식세포에서 증가한 인터루킨 원 베타 TNF 알파를 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다.

인산화된 P 65에 대한 더 강한 밴드는 LPS 치료를 통해 볼 수 있습니다. 이러한 데이터는 M1 또는 M 두 가지 자극에 대해 편광 활성화 반응을 보이는 골수 유래 대식세포를 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 골수 유래 대식세포를 생성한 다음 편광 활성화 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안, 반응을 테스트하기 전에 분화된 대식세포의 순도를 평가하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 유전자의 일시적 형질주입 또는 SHRA와 같은 방법을 수행하여 유전자가 대식세포 활성화 조절에 어떻게 관여하는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.