마이크로 유체 칩 제작 및 인플루엔자을 감지하는 방법

다음 실험의 전체적인 목표는 미세유체 칩을 사용하여 인플루엔자 A 바이러스를 검출하는 것입니다. 먼저, 용해 버퍼가 포함된 샘플을 SPE 채널로 흘려 바이러스를 용해하고 RNA를 추출합니다. 추출된 RNA와 R-T-P-C-R 시약을 주입하고 역전사 채널을 가동하여 바이러스 RNA를 cDNA로 전환합니다. 다음으로, 혼합물을 PCR 채널로 흘려 DNA를 증폭합니다. 최종적으로 모세관 전기영동의 형광 신호를 기반으로 앰플리콘의 크기와 농도를 나타내는 결과를 얻습니다.

이 기술의 주요 장점은 환자의 가공되지 않은 시료를 그대로 사용할 수 있으며, 핵산 추출, 정제, 역전사 및 증폭 과정을 단일 칩 내에 통합했다는 점입니다. 두 개의 플라크를 제작하려면, 약 9g의 XN X 펠릿을 금속판 중앙에 고르게 분배한 후 198°C로 가열된 프레스에 5분 동안 둡니다. 그 다음, 2,500 PSI의 압력을 5분 동안 천천히 가합니다. 이제 플라크 하나를 157°C에서 10분 동안 예열한 에폭시 몰드 위에 배치하고, 1,000 PSI의 압력을 다시 10분 동안 천천히 가합니다.

다음으로, 내열 장갑을 착용한 상태에서 핫 프레스에서 플레이트와 몰드를 분리한 후, 플레이트가 식기 전에 몰드에서 제거합니다. 엠보싱 처리된 칩의 마이크로플루이딕 채널 입구, 폐액 포트 및 출구에 각각 하나씩, 총 세 개의 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 IPA로 칩을 세척하고, 이어서 RNAs away와 dianna's water로 세척합니다.

칩을 공기 중에서 건조시킨 후, 칩을 접합하기 위해 먼저 131 °C에서 10분 동안 예열하고, 이어서 350 PSI에서 10분 동안 가압합니다. JB Weld Epoxy를 사용하여 입구 폐기구와 출구 포트에 나노 포트를 각각 부착하고 15~24시간 동안 경화시킵니다. 제조사의 지침에 따라, SPE 채널을 50 µL의 RNAs away로 헹군 후 100 µL의 nuclease free water로 헹굽니다.

이제 SPE 채널에 갓 제조한 그라프팅 용액 4 µL를 로딩하여 메타크릴레이트를 가교시킨 후, UV 오븐에서 10분 동안 배양하고, 진공 장치로 잔류 그라프팅 용액을 제거합니다. 뚜껑을 닫은 상태에서 튜브를 두드려 건조된 마이크로스피어 펠렛을 분쇄합니다. 그런 다음 갓 제조한 SPE 컬럼 용액 100 µL를 첨가하고 볼텍싱하여 혼합합니다.

SPE 용액 4 µL를 로드하고 각 측면에서 2.5분 동안 UV 조사를 통해 동일한 채널을 가교시키면, 불투명한 흰색의 중합된 SPE 컬럼이 생성됩니다. 100% 메탄올 500 µL로 채널을 세척하여 과잉 반응물과 고분자 내부의 발열성 용매를 씻어냅니다. 열전도 테이프를 사용하여 칩 바닥에 두 개의 박막 히터를 부착합니다.

가열기의 측면이 넓은 채널의 가장자리와 일치해야 함에 유의하십시오. Dene 지속 시간과 무릎을 꿇는 동작을 위해, 각 칩 테이프의 막힌 개방형 측면 채널을 통해 칩 내부로 5개의 열전대를 배치하십시오. 열전대의 위치를 고정하려면, 한 튜브에는 70% ethanol 96 µL에 25 XRNA secure 4 µL를 추가하고, 두 번째 튜브에는 100% ethanol에 추가하십시오. 또한, channel buffer 300 µL와 lysis buffer 316 µL를 준비하십시오.

용액을 60 °C에서 15분 동안 가열합니다. 이는 RNA secure를 활성화하고 마이크로플루이딕 채널을 평형화하기 위함입니다. 0.8 mL/h의 유속으로 SPE 채널에 채널 버퍼를 흘려줍니다.

이제 37°C의 VTM에 있는 fava 테스트 샘플을 빠르게 준비합니다. 샘플이 해동되는 즉시 꺼냅니다. 샘플을 13,000 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다.

상청액 100 µL를 용해 버퍼 300 µL로 옮기고, 1 µg/µL 농도의 carrier RNA 6 µL를 추가한 후 vortex로 혼합합니다. 이어서 5초간 원심 분리하고, 전체 용해물을 루어락(lure lock) 1 CC 주사기에 주입합니다. 0.8 mL/h의 유속으로 SPE 채널에 용해물을 통과시킵니다.

그런 다음 SPE 채널을 100 µL의 70% 에탄올로 세척하고, 이어서 100 µL의 100% 에탄올을 1 mL/h의 속도로 흘려줍니다. 빈 시린지를 0.5 mL 표시선에 맞춘 후, 1 mL/h의 속도로 채널에 공기를 밀어 넣어 건조시킵니다. 이제 67.5 µL의 nuclease-free water를 0.5 mL/h의 속도로 채널에 흘려 결합된 핵산을 용출시키고, 폐기물 포트(waste port)의 나노 포트에서 13.5 µL를 수집합니다.

RT-PCR 마스터 믹스 36.5 µL를 로딩합니다. 웨이스트 포트의 나노 포트에서 템플릿 RNA와 혼합하여 총 50 µL의 RT-PCR 반응액을 만듭니다. 그 후, 완만한 진공 흡입을 통해 RT-PCR 혼합액을 RT 채널로 로딩합니다.

나노 포트를 폐쇄용 피팅으로 밀봉합니다. 히터 1에 35V를 인가합니다. 히터 1이 50 °C에서 평형 상태에 도달한 후, 시약을 RT 채널에 30분 동안 유지합니다.

첫 번째 히터가 95 °C에서 평형에 도달한 후, 시약을 RT 채널에 15분 동안 유지합니다. 다음으로, 첫 번째 히터에는 27 V를, 두 번째 히터에는 50 V를 인가하여 첫 번째 히터는 60 °C, 두 번째 히터는 95 °C에서 평형을 맞춥니다. 시약을 0.5 µL/min의 속도로 PCR 채널에 주입합니다.

약 20분 후 시약이 구불구불한 채널의 끝부분에 도달하면, Agilent high sensitivity DNA test에 적합한 크기의 피펫과 팁을 사용하여 배출구에서 PCR 생성물을 수집하십시오. 테스트 시작 30분 전에 Agilent high sensitivity DNA 키트를 냉장고에서 꺼내십시오. 바이오분석기를 켜고 2, 100 expert 소프트웨어를 실행하십시오.

검사용 PCR 산물 1 µL를 로딩하고 Agilent 프로토콜을 따릅니다. 이 워크플로우에서 데이터를 분석하고 기록합니다. 환자의 비인두 샘플을 용해 버퍼와 혼합하여 칩에 적용합니다.

상용 모세관 전기영동 칩을 사용하여 칩을 가동하고 인플루엔자 바이러스의 PCR 산물을 검출합니다. 각 환자의 검체마다 인플루엔자 바이러스의 양이 다르기 때문에, PCR 산물의 최종 농도는 달라질 수 있습니다. 양성 샘플의 경우, 노이즈가 적고 35 bp 및 10, 380 bp에서 명확한 래더 피크가 나타나며, 설계된 산물 크기인 107 bp에서 단일 산물 피크가 관찰되어야 좋은 결과로 판단합니다.

이 영상을 시청하신 후에는 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 미세 유체 칩의 제작 및 작동 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.