Name: 마이크로 유체 칩 제작 및 인플루엔자을 감지하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 학습하세요 마이크로유체 칩을 제작하고 인플루엔자 A 바이러스를 검출하는 방법을. 이 통합 플랫폼은 핵산 추출, 역전사, PCR 증폭을 하나의 칩에서 수행하여 신속하고 효율적인 분자 진단을 가능하게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 건강의 국립 연구소 (NIH) 보조금 R01 EB008268에 의해 지원되었다.

1. 칩 제조 12 <ol><li> Zeonex 690R 알약에서 두 액자 만들기 : 5 분에 198 ° C에서 가열 언론에 금속 플레이트, 예열의 중심에 균일하게 8~9g Zeonex 알약을 배포 한 다음 다른 5 분에 2,500 PSI로 천천히 압력을 적용 할 수 있습니다. 이 단계를 완료하려면, 우리는 카버 핫 프레스를 사용했습니다. </li><li> 에폭시 몰드와 상패의 마이크로 유체 채널을 양각. 금형 제조에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 12 일 (그림 2B의 채널 디자인) 설명되어 있습니다 : 에폭시 몰드에 한 플라크를 넣어 한 후 157에있는 온수 보도에 앞서 열을 가하다 그 ° 10 분에 C와 다른 10 분 동안 천천히 1,000 PSI에 압력을 적용 . 손으로 금형에서 플라크를 제거하거나 아래로 냉각하기 전에 집게를 사용합니다. (참고 :이 단계에서 열 장갑을 착용하십시오.) </li><li> 입구, 폐기물 포트, 그리고 마이크로 유체 채널의 출구에서 양각 칩에 구멍을 뚫는다. 우리는 1.25 mm의 diam를 사용세 구멍을 만들기 위해 드릴 비트를 eter. </li><li> 본드 다른 플라크 (상단)과 양각 칩은 :; 또 다른 350 PSI에 한 다음 Enter 키를 누릅니다 10 분 동안 131 ° C에서 가열 언론에 공기 건조하고 예열을하고 IPA, RNAse 거리에 있으며 순서에 탈 이온수로 칩을 씻으십시오 10 분. </li><li> 입구, 폐기물 및 별도 JB 용접 에폭시를 사용하여 콘센트 포트에 Nanoports를 첨부, 제조업체의 지시 사항에 따라 15-24 시간에 대한 치료. </li><li> 100 μl nuclease 무료 물 다음에 50 μl RNAse 멀리있는 SPE 채널을 씻어. </li><li> 접목 솔루션 (3 % w / v를 benzophenone과 메틸 메타 크릴 레이트) 4 μl와 SPE 채널을로드 한 다음 365 나노 미터 UV 파장과 2,000 MJ / cm 2 이하 UV 오븐에 10 분 동안 잠복기로 메타 크릴 레이트를 crosslink. 진공과 잔류 접목 솔루션을 제거합니다. 우리는 벽 진공을 사용했습니다. 최상의 결과를 얻으려면 신선한 솔루션을 사용해야합니다. 그것은 일반적으로 수용하지만,를 저장할최대 일주일 4 ° C에서 준비한 솔루션입니다. </li><li> 16 % 에틸렌 dimethacrylate, 24% 부틸 메타 크릴 레이트, 42 % 1-dodecanol, 18 %의 cyclohexanol, 1 % 2 - 디메틸 아미노 -4 - (메틸 phenylamino) 페놀을 추가 SPE 열 솔루션을 (모든 V / V %) 확인 사진 기자로. </li><li> SPE 열 솔루션 (1:1 혼합물을하는)와 같은 실리카 마이크로 솔루션의 동일한 볼륨을 가지고, 완전히 ° C 하룻밤 진공 오븐에 70에서 건조. 폐쇄 뚜껑과 함께 튜브에 활용하여 펠릿을 해봐. 건조 실리카 microsphere 튜브와 혼합 할 소용돌이에 SPE 열 솔루션을 추가합니다. </li><li> 동일한 채널에 SPE 솔루션 4 μl를로드 한 다음 2.5 분 동안 UV 조사하여 crosslink. 그런 다음 위에 칩을 뒤집어 다른 2.5 분에 비추다. polymerized의 SPE 항목은 불투명 한 흰색 고체해야합니다. </li><li> 초과 반응물을 멀리 씻어하기 위해 100 % 메탄올 500 μl와 채널을 씻으십시오. 이 페인트는 내부 폴리머 PO를 제거주위 조건에서 건조 할 때 rogenic 용매는이를 SPE 칼럼의 열린 기공 구조를 만드는 두 가지 방법이 있습니다. </li><li> 열 전도성 테이프 칩의 맨 아래에 두 개의 박막 히터를 부착합니다. 히터의 측면은 변성 및 (그림 1 참조) 별도로 어닐링을위한 다양한 채널의 가장자리를 정렬해야합니다. </li><li> 죽은 통해 칩에 장소 다섯 열전쌍은 각 칩의 열린 쪽 채널을 (그림 2B 참조) 종료했습니다. 열전대는 언론 운동을 통해이 채널에있어. 테이프는 더 열전대의 위치를​​ 수정하는 데 사용되었다. </li></ol> 2. 고체 단계 추출 방법 <ol><li> DEPC - 처리 및 autoclaved 물 (deionized 또는 Millipore-필터링)을 70 % 에탄올의 96 μl를 준비합니다. </li><li> 25X RNA의 추가 4 μl 한 관에 70 % 에탄올의 96 μl를 확보하고, 별도의 관 100 % 에탄올과 같은 혼합물을 중복. </li><li> 300 준비다음을 혼합하여 채널 버퍼의 μl : 6 M 구아니딘의 thiocyanate (GuSCN), 2 - 프로 파놀의 150 μl, nuclease 무료 물의 63 μl, 그리고 보안 25X RNA 12 μl의 75 μl. </li><li> 6 M GuSCN, 2 - 프로 파놀 200 μl 및 보안 12 μl 25X RNA의 100 μl : 혼합하여 용해 버퍼의 312 μl를 준비합니다. </li><li> RNA 보안을 활성화하려면 10-20 분을위한 60 ° C에서 70 %의 에탄올을 가열, 100 % 에탄올, 채널 버퍼와 용해 버퍼. </li><li> 마이크로 유체 채널을 평형하려면, 0.8 ML / 시간의 유량에서 SPE 채널을 통해 채널 버퍼를 실행합니다. </li><li> 물 욕조에서 37 ° C에서 VTM에 테스트 샘플을 빠른 해동하고, 가능한 한 빨리이 해동 될 때 물통에서 즉시 샘플을 제거합니다. </li><li> 10 분에 13,000 rpm으로 샘플을 원심 분리기 및 용해 버퍼 300 μl로 표면에 뜨는 100 μl를 전송합니다. 1 μg / μl 캐리어 RNA의 6 μl를 추가하여 혼합을 완료합니다. </li><li> 혼합 할 수 소용돌이, 그리고에 대한 스핀 후5 초는 Luer - 무사히 다녀 오게 한 CC의 주사기로 전체 lysate를로드합니다. </li><li> 0.8의 유량에서 SPE 채널을 통해 lysate를 실행 ML / 시간. </li><li> 1 ML / 시간 100 μl of100 %의 에탄올에 이어 70 %의 에탄올 100 μl와 SPE 채널을 씻으십시오. (내보냈되지 않습니다 주사기 팁에 50 μl 죽은 볼륨이 있으므로 실제로는 50 μl의 채널을 통해 진행됩니다.) </li><li> 0.5 ML 마크의 빈 주사기를 위치 1에서 건조 할 채널을 통해 공기를 밀어 ML / 시간.주세요 </li><li> 0.5에서 바인딩 된 핵산을 elute ML / 시간 및 폐기물 포트에서 nanoport에서 13.5 μl를 수집하는 채널을 통해 nuclease - 무료 물 67.5 μl를 실행합니다. (유체 손실이 주사기 팁과 SPE 채널에 54 μl 죽은 볼륨 때문입니다.) </li></ol> 3. RT-PCR <ol><li> Qiagen OneStep RT-PCR 키트의 시약을 사용하여 공기 건조 단계 (2.12) 동안 RT-PCR 마스터 믹스의 36.5 μl를 준비합니다. </li><li> RT-PC를로드R은 쓰레기 포트에서 nanoport의 시약 및 RNA와 혼합 다음 50 μl RT-PCR 반응을 얻을 수 : nuclease 무료 물, 4 μl RT-PCR 효소 혼합, 10 μl Q 솔루션, 10 μl1X 하나에 13.5 μl 용출 RNA를 단계 버퍼, 2 μl 25 MM MgCl 2, 1 μl 50 앞으로 μM 프라이머 5&#39;-GAC 미쳤 (다고하더라도) TCC TGT CAC CTC TGA C-3 &#39;, 1 μl 50 μM 역 프라이머 5&#39;-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 &#39;, 2 μl dNTP, 0.75 μl 1.0 % w / V BSA, 0.73 μl PEG8000과 5.02 μl nuclease 무료 물. </li><li> 부드러운 진공으로 RT 채널 (우리가 벽 진공을 사용)에 RT-PCR 혼합물을로드하고 폐쇄 피팅으로 Nanoport을 봉쇄. </li><li> 히터 1-35 V를 적용 할 수 있습니다. 히터 1 50 ° C.에 equilibrates 후 30 분 동안 RT 채널에 시약 보관 95에서 히터 하나 equilibrates 후 15 분 ° C.에 대한 RT 채널에 시약 보관 </li><li> 히터 1과 히터 2-50 V 27 V를 적용, 60 &amp; 드에 3 분 정도 또는 히터 1 equilibrates 때까지 기다리g, C 및 히터 2 95에 equilibrates ° C. </li><li> 0.5 μl / 분의 PCR 채널에 시약을 밀어 넣습니다. 시약은 굴곡 채널을 통해 유동하는 것은 약 20 분 정도 소요됩니다. </li><li> 샘플 굴곡 채널의 끝 부분에 낸다으로 적절하게 크기 pipettor 및 팁을 사용하여 전원 콘센트에서 PCR 제품을 수집합니다. </li></ol> 4. PCR 제품 검색 <ol><li> 우리는 제품을 감지 할 수있는 애질런트 높은 감도 DNA 검사를 사용합니다. 이 테스트는 냉장고에서 테스트하기 전에 30 분 애질런트 높은 감도 DNA 키트를 꺼내 실행하십시오. </li><li> Bioanalyzer 전원을 켜고 2100 전문가 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 테스트에 PCR 제품의 1 μl를로드하고 애질런트 프로토콜 (따라 <a href="http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent%20Manual.pdf" target="_blank">http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent의 %의 20Manual.pdf을</a> ). </li><li> 분석하고 데이터를 기록합니다. </li></ol>

<ol><li>Nicholls, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandemic+Influenza%3A+The+Inside+Story%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Pandemic Influenza: The Inside Story.</a> PLoS Biol. 4, (2006).</li>
<li>WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/">http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/</a> (2009).</li>
<li>WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/">http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/</a> (2009).</li>
<li>Wenzel, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+performance+determination+and+clinical+validation+of+the+novel+roche+realtime+ready+influenza+A%2FH1N1+detection+set%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).</li>
<li>Chan, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+sensitivity+of+rapid+influenza+antigen+detection+tests+for+swine-origin+influenza+virus+%28H1N1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%3A+the%22%5BJournal%5D)">Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1.</a> Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).</li>
<li>Ginocchio, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+multiple+test+methods+for+the+detection+of+the+novel+2009+influenza+A+%28H1N1%29+during+the+New+York+City+outbreak%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak.</a> Journal of. 45, 191-195 (2009).</li>
<li>Aeron, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+influenza+rapid+point-of-care+tests+in+the+detection+of+swine+lineage+A%28H1N1%29+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+and+Other+Respiratory+Viruses%22%5BJournal%5D)">Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).</li>
<li>Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+tests+for+influenza+and+other+respiratory+viruses%3A+determining+performance+specifications+based+on+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).</li>
<li>Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Three+Influenza+A+and+B+Real-Time+Reverse+Transcription-PCR+Assays+and+a+New+2009+H1N1+Assay+for+Detection+of+Influenza+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).</li>
<li>Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNorthrup%2C+MA+%22Transducer%2793%2C+seventh+international+conference+on+solid+state+sensors+and+actuators%22">Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators</a>. , 924-926 (1993).</li>
<li>Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoplastic+microfluidic+device+for+on-chip+purification+of+nucleic+acids+for+disposable+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics.</a> Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).</li>
<li>Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+microfluidic+chip+for+continuous-flow+polymerase+chain+reaction%3A+Simulations+and+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments.</a> Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).</li>
<li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Chip+for+Molecular+Amplification+of+Influenza+A+RNA+in+Human+Respiratory+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens.</a> PLoS ONE. 7, e33176(2012).</li>
<li>Rådström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+PCR-Inhibitory+Components+in+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li>
<li>Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+PCR+Inhibitors+by+Silica+Membranes%3A+Evaluating+the+Amplicor+Mycobacterium+tuberculosis+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).</li>
<li>Andreasen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50, S6-S9 (2010).</li>
</ol>

저자는 경쟁 재정 이익을 선언 없습니다.

진단 방법은 높은 특이성과 낮은 검출 한계가있는 환자 ​​표본에서 인플루엔자 RNA를 증폭 할 수있는 통합 마이크로 플라스틱 칩의 능력을 보여 여기에 제시된 13 우리는 케어 테스트의 잠재적 지점이 칩을 설계 :. (A) 온도와 유체 컨트롤이 간단했다, (b)는 칩은 낮은 비용과 사출 성형을 사용하여 높은 처리량 제조에 적합, 그리고 (c) 칩은 따라서 표본 교차 오염의 우려를 줄이고, 종이 및 한 번에 사용하기위한 것입니다. 3 시간 우리의 현재 온 - 칩 런타임 있지만, 추출 플랫폼은 프로세스 최적화를위한 충분한 공간이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 오른쪽 용출 전에 세척 및 건조 시간은 유량 증가 및 세탁 볼륨을 줄일 수의 조합에 의해 감소​​ 될 수 있습니다. 또한, 비용은 칩 제조 공정을 능률화하고 값 비싼 또는 성가신 아름다운 요정을 대체하여 트리밍 할 수 있습니다이러한 일회용 주사기 주입 펌프와 고체 위상 추출 열 기하학과 다공성을 열기 작은...

수백만 명의 죽음은 20 세기 1 세 인플루엔자 전염병 동안보고되었습니다. 또한, 가장 최근의 인플루엔자 유행은 2009 년에 세계 보건기구 (WHO) 2로 선언되었고, 같은 2010년 8월 1일의, 18,449 사망자는 WHO 3보고되었다. 이 유행은 다시 전염성 질병의 높은 부담, 및 빠른 질병 확인, 적절한 공중 보건 대응하고 효과적인 치료 4 활성화 인플루엔자의 신속하고 정확한 탐지의 필요성을 보여 주었다. 널리 독감을 진단에 사용되는 여러 가지 방법이 있습니다, 이들은 빠른 immunoassays 직접 형광 항원 검사 (DFA) 및 바이러스 성 문화 방법이 포함되어 있습니다. 다른 두 방법은 노동 집약적 인 9 소비 시간이있는 동안 급속한 immunoassays은 극적으로, 감도 5-8가 부족합니다. 분자 테스트는 짧은 턴 - 주위에 시간, 높은 sensit 등의 여러 장점을 제공합니다ivity, 높은 특이성. 여러 상업 기관은 전염병에 대한 빠른 분자 테스트 (또한 핵산 검사 또는 NATs이라고도 함)으로 작업되었으며, 몇은 파이프 라인에서 인플루엔자 assays 있습니다. 그러나 대부분은 오프 칩 샘플 준비가 필요합니다. 분자 검사 검정 카트리지 나 모듈에 샘플 준비를 통합 면제 임상 실험실 개선 개정 (CLIA)의 없음. 랩 - 온 - 어 - 칩 기술은 포인트의 케어 테스트 장치의 개발에 중요한 역할을한다. 1993 10 첫 번째 PCR 칩의 도입 후, 많은 노력 핵산 테스트 칩을 개발에 투입되었습니다. 그러나, 이들의 몇은 하류 증폭과 통합 원유 샘플 준비되어 있습니다. 우리는 이전에 플라스틱 마이크로 칩 11으로 견고한 위상 추출 컬럼 (SPE)의 소형화을 입증하고 개발 한연속 흐름 PCR 칩 12 ment 및 최적화. 여기, 우리는 임상 진단을위한 단일 칩에 RT와 PCR 단계로 SPE를 통합하고 환자 nasopharyngeal (NP) 면봉과 aspirates에서 핵산을 증폭하기위한 능력을 평가하는 이전 작업을 확장합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 1 dodecanol </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td><td> 443816-500G </td></tr><tr><td> 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td><td> 196118-50G </td></tr><tr><td> 2100 Bioanalyzer </td><td> 애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA </td><td> G2943CA </td></tr><tr><td> 2 - 프로 파놀 </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td><td> 19,516 </td></tr><tr><td> Benzophenone </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td><td> 239852-50G </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 온도 피셔 과학, pittsburge, PA </td><td> A7979-50ML </td></tr><tr><td> 부틸 메타 크릴 레이트 </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td><td> 235865-100 ML </td></tr><tr><td> 캐리어 RNA </TD&gt; <td> Qiagen, 발렌시아, CA </td><td> 1017647 </td></tr><tr><td> Cyclohexanol </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td><td> 105899-1L </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td><td> E7023 </td></tr><tr><td> 에틸렌 dimethacrylate </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td><td> 335861 </td></tr><tr><td> 에틸렌 글리콜 dimethacrylate </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td><td> 335681-100ML </td></tr><tr><td> 유리 주사기 250 μl </td><td> 해밀턴, 리노, NV </td><td> 81,127 </td></tr><tr><td> 구아니딘의 thiocyanate </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td><td> 50,981 </td></tr><tr><td> 높은 감도 DNA 키트 </td><td> 애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> 핫 프레스 </td><td> 카버 와바 시가에 </td><td> 4386 </td></tr><tr><td> JB 용접 Epoxies </td><td> Mcmaster-CARR, 허스트, IL </td><td> 7605A11 </td></tr><tr><td> Luer - 무사히 다녀 오게 주사기 </td><td> BD-의료, 프랭클린 호수, NJ </td><td> 309628 </td></tr><tr><td> 염화 마그네슘 </td><td> 온도 피셔 과학, pittsburge, PA </td><td> AB-0359 </td></tr><tr><td> 메타놀 </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td><td> 494437 </td></tr><tr><td> 메틸 메타 크릴 레이트 </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td><td> M55909 </td></tr><tr><td> Nanoport </td><td> Upchurch 과학 </td><td> N-333-01 </td></tr><tr><td> Nanoport 피팅 </td><td> Upchurch 과학 </td><td> F-120x </td></tr><tr><td> Nuclease 무료 물 </td><td> 온도 피셔 과학, pittsburge, PA </td><td> PR-P1193 </td></tr><tr><td> OneStep RT-PCR 키트 </td><td> Qiagen, 발렌시아, CA </td><td> 210210 </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td><td> 41,009 </td></tr&gt; <tr><td> 전원 공급 장치 </td><td> VWR, Radnor, PA </td><td> 300V </td></tr><tr><td> 멀리 RNAse </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO </td><td> 83931-250ML </td></tr><tr><td> RNASecure </td><td> 응용 Biosystems, 포스터 시티, CA </td><td> AM7005 </td></tr><tr><td> 실리카 마이크로 </td><td> Polysciences, 링톤, PA </td><td> 24324-15 </td></tr><tr><td> 주사기 펌프 </td><td> 하버드 장치, Holliston, MA </td><td> HA2000P/10 </td></tr><tr><td> 열 전도성 테이프 </td><td> Mcmaster - 카, 허스트, IL </td><td> 6838A11 </td></tr><tr><td> 열전대 </td><td> 오메가 공학, 스탬 포드, CT </td><td> 5SRTC-TT-J-40-36 </td></tr><tr><td> 박막 히터 </td><td> Minco, 미니애폴리스, MN </td><td> HK5166R529L12A </td></tr><tr><td> 자외선 Crosslinker </td><td> UPV, Upland, CA </td><td> CL-1000 </td></tr><tr><td> Zeonex </td> &lt;TD&gt; Zeon 화학 물질, 루이빌, KY </td><td> 690R </td></tr></tbody></table>

마이크로 유체 칩 제작 및 인플루엔자을 감지하는 방법

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

빠르고 효과적인 진단은 효과적인 환자 관리 및 치료를함으로써 전염병을 제어하는​​ 데 중요한 역할을한다. 여기, 우리는 환자 nasopharyngeal (NP) 면봉과 aspirates의 인플루엔자 바이러스를 증폭 할 수있는 능력을 통합 마이크로 열가소성 칩을 제시한다. 환자 샘플을로드하면, 마이크로 유체 장치는 순차적으로, 온칩 세포 용해, RNA 정화 및 고체 위상 추출 (SPE), 역 전사 (RT) 및 RT-PCR 챔버에서 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 농도 단계를 수행 각각. 엔드 포인트 검출은 오프 칩 Bioanalyzer을 (애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA)를 사용하여 수행됩니다. 이 박막 히터는 RT와 PCR 챔버의 열원으로 사용하는 동안 주변 기기를 들어, 우리는 시약 및 샘플을 늘리기 위해 하나의 주사기 펌프를 사용했습니다. 이 칩은 fabricati을 줄이기 위해 높은 처리량 제조를위한 단일 레이어와 적합하도록 설계되어시간과 비용 있습니다. 마이크로 칩은 관심의 새로운 병원균을 감지하는 데 필요한 시약 디자인의 변화 만 제한 바이러스와 박테리아의 다양한 분석 할 수있는 플랫폼을 제공합니다.

<html> 전형적인 결과는 인플루엔자에 감염된 nasopharyngeal 세척 표본에 대한 그림 3에 표시됩니다. 각 환자 표본에서 인플루엔자 바이러스의 서로 다른 양의로 인해, PCR 제품의 최종 농도는 달라질 수 있습니다. 좋은 결과는 낮은 노이즈, 두 명확 래더 봉우리 (35 10,380 BP)과 긍정적 인 샘플에 대한 설계 제품 사이즈 (107 BP)에서 하나의 제품 피크가 있어야합니다. 제품 피크는 이론적으로 부정적인 컨트롤 결석해야하지만, 우리는 샘플에 프라이머 - dimers 형성에서 독감 별 궤적 ​​근처 가짜 PCR의 봉우리를 관찰 했어요. 여러 제품 봉우리는 시험의 잠재적 인 오염을 반영합니다. 이 경우 샘플의 또 다른 나누어지는이 필적한다. 젤 전기 영동은 시험 결과 13 자세한 확인을 위해 사용할 수 있습니다. 에서 &quot;강한 : SR...

통합 마이크로 열가소성 칩은 분자 진단으로 사용하기 위해 개발되었습니다. 이 칩은 핵산 추출, 역 transcriptase 및 PCR을 수행합니다. 제조 및 칩을 실행하기위한 방법은 설명되어 있습니다.

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

다음 실험의 전체적인 목표는 미세유체 칩을 사용하여 인플루엔자 A 바이러스를 검출하는 것입니다. 먼저, 용해 버퍼가 포함된 샘플을 SPE 채널로 흘려 바이러스를 용해하고 RNA를 추출합니다. 추출된 RNA와 R-T-P-C-R 시약을 주입하고 역전사 채널을 가동하여 바이러스 RNA를 cDNA로 전환합니다. 다음으로, 혼합물을 PCR 채널로 흘려 DNA를 증폭합니다. 최종적으로 모세관 전기영동의 형광 신호를 기반으로 앰플리콘의 크기와 농도를 나타내는 결과를 얻습니다.이 기술의 주요 장점은 환자의 가공되지 않은 시료를 그대로 사용할 수 있으며, 핵산 추출, 정제, 역전사 및 증폭 과정을 단일 칩 내에 통합했다는 점입니다. 두 개의 플라크를 제작하려면, 약 9g의 XN X 펠릿을 금속판 중앙에 고르게 분배한 후 198°C로 가열된 프레스에 5분 동안 둡니다. 그 다음, 2,500 PSI의 압력을 5분 동안 천천히 가합니다. 이제 플라크 하나를 157°C에서 10분 동안 예열한 에폭시 몰드 위에 배치하고, 1,000 PSI의 압력을 다시 10분 동안 천천히 가합니다.다음으로, 내열 장갑을 착용한 상태에서 핫 프레스에서 플레이트와 몰드를 분리한 후, 플레이트가 식기 전에 몰드에서 제거합니다. 엠보싱 처리된 칩의 마이크로플루이딕 채널 입구, 폐액 포트 및 출구에 각각 하나씩, 총 세 개의 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 IPA로 칩을 세척하고, 이어서 RNAs away와 dianna's water로 세척합니다.칩을 공기 중에서 건조시킨 후, 칩을 접합하기 위해 먼저 131 °C에서 10분 동안 예열하고, 이어서 350 PSI에서 10분 동안 가압합니다. JB Weld Epoxy를 사용하여 입구 폐기구와 출구 포트에 나노 포트를 각각 부착하고 15~24시간 동안 경화시킵니다. 제조사의 지침에 따라, SPE 채널을 50 µL의 RNAs away로 헹군 후 100 µL의 nuclease free water로 헹굽니다.이제 SPE 채널에 갓 제조한 그라프팅 용액 4 µL를 로딩하여 메타크릴레이트를 가교시킨 후, UV 오븐에서 10분 동안 배양하고, 진공 장치로 잔류 그라프팅 용액을 제거합니다. 뚜껑을 닫은 상태에서 튜브를 두드려 건조된 마이크로스피어 펠렛을 분쇄합니다. 그런 다음 갓 제조한 SPE 컬럼 용액 100 µL를 첨가하고 볼텍싱하여 혼합합니다.SPE 용액 4 µL를 로드하고 각 측면에서 2.5분 동안 UV 조사를 통해 동일한 채널을 가교시키면, 불투명한 흰색의 중합된 SPE 컬럼이 생성됩니다. 100% 메탄올 500 µL로 채널을 세척하여 과잉 반응물과 고분자 내부의 발열성 용매를 씻어냅니다. 열전도 테이프를 사용하여 칩 바닥에 두 개의 박막 히터를 부착합니다.가열기의 측면이 넓은 채널의 가장자리와 일치해야 함에 유의하십시오. Dene 지속 시간과 무릎을 꿇는 동작을 위해, 각 칩 테이프의 막힌 개방형 측면 채널을 통해 칩 내부로 5개의 열전대를 배치하십시오. 열전대의 위치를 고정하려면, 한 튜브에는 70% ethanol 96 µL에 25 XRNA secure 4 µL를 추가하고, 두 번째 튜브에는 100% ethanol에 추가하십시오. 또한, channel buffer 300 µL와 lysis buffer 316 µL를 준비하십시오.용액을 60 °C에서 15분 동안 가열합니다. 이는 RNA secure를 활성화하고 마이크로플루이딕 채널을 평형화하기 위함입니다. 0.8 mL/h의 유속으로 SPE 채널에 채널 버퍼를 흘려줍니다.이제 37°C의 VTM에 있는 fava 테스트 샘플을 빠르게 준비합니다. 샘플이 해동되는 즉시 꺼냅니다. 샘플을 13,000 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다.상청액 100 µL를 용해 버퍼 300 µL로 옮기고, 1 µg/µL 농도의 carrier RNA 6 µL를 추가한 후 vortex로 혼합합니다. 이어서 5초간 원심 분리하고, 전체 용해물을 루어락(lure lock) 1 CC 주사기에 주입합니다. 0.8 mL/h의 유속으로 SPE 채널에 용해물을 통과시킵니다.그런 다음 SPE 채널을 100 µL의 70% 에탄올로 세척하고, 이어서 100 µL의 100% 에탄올을 1 mL/h의 속도로 흘려줍니다. 빈 시린지를 0.5 mL 표시선에 맞춘 후, 1 mL/h의 속도로 채널에 공기를 밀어 넣어 건조시킵니다. 이제 67.5 µL의 nuclease-free water를 0.5 mL/h의 속도로 채널에 흘려 결합된 핵산을 용출시키고, 폐기물 포트(waste port)의 나노 포트에서 13.5 µL를 수집합니다.RT-PCR 마스터 믹스 36.5 µL를 로딩합니다. 웨이스트 포트의 나노 포트에서 템플릿 RNA와 혼합하여 총 50 µL의 RT-PCR 반응액을 만듭니다. 그 후, 완만한 진공 흡입을 통해 RT-PCR 혼합액을 RT 채널로 로딩합니다.나노 포트를 폐쇄용 피팅으로 밀봉합니다. 히터 1에 35V를 인가합니다. 히터 1이 50 °C에서 평형 상태에 도달한 후, 시약을 RT 채널에 30분 동안 유지합니다.첫 번째 히터가 95 °C에서 평형에 도달한 후, 시약을 RT 채널에 15분 동안 유지합니다. 다음으로, 첫 번째 히터에는 27 V를, 두 번째 히터에는 50 V를 인가하여 첫 번째 히터는 60 °C, 두 번째 히터는 95 °C에서 평형을 맞춥니다. 시약을 0.5 µL/min의 속도로 PCR 채널에 주입합니다.약 20분 후 시약이 구불구불한 채널의 끝부분에 도달하면, Agilent high sensitivity DNA test에 적합한 크기의 피펫과 팁을 사용하여 배출구에서 PCR 생성물을 수집하십시오. 테스트 시작 30분 전에 Agilent high sensitivity DNA 키트를 냉장고에서 꺼내십시오. 바이오분석기를 켜고 2, 100 expert 소프트웨어를 실행하십시오.검사용 PCR 산물 1 µL를 로딩하고 Agilent 프로토콜을 따릅니다. 이 워크플로우에서 데이터를 분석하고 기록합니다. 환자의 비인두 샘플을 용해 버퍼와 혼합하여 칩에 적용합니다.상용 모세관 전기영동 칩을 사용하여 칩을 가동하고 인플루엔자 바이러스의 PCR 산물을 검출합니다. 각 환자의 검체마다 인플루엔자 바이러스의 양이 다르기 때문에, PCR 산물의 최종 농도는 달라질 수 있습니다. 양성 샘플의 경우, 노이즈가 적고 35 bp 및 10, 380 bp에서 명확한 래더 피크가 나타나며, 설계된 산물 크기인 107 bp에서 단일 산물 피크가 관찰되어야 좋은 결과로 판단합니다.이 영상을 시청하신 후에는 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 미세 유체 칩의 제작 및 작동 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

microfluidic-chip-fabrication-and-method-to-detect-influenza

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 인터뷰에서 박사 Klapperich는 열가 소성 microfluidic 장치와 새로운 진단 개발을위한 그들의 응용 프로그램의 제조에 대해 설명합니다.

일회용 진단을위한 Microfluidic 응용

Virochip 동시에 보존 순서 상동에 기초하여 모든 알려진 바이러스뿐 아니라 소설의 바이러스를 검출하기위한 판 - 바이러스 microarray입니다. 여기 알려진 알려지지 않은 두 바이러스의 존재에 대한 임상 샘플을 분석 Virochip 분석을 실행하는 방법을 보여줍니다.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 microarrays에 대한 형광 검출하는 저렴한 대안으로 제공됩니다. photopolymerization에 따라 ampliPHOX 단지 몇 분 이내에 육안으로 보이는 고체 고분자 명소를 생산하고 있습니다. 결과는 간단하면서도 강력한 소프트웨어 패키지로 다음 몇 군데 자동으로 해석됩니다.

인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

그들은 kHz에서 속도 저렴 picoliter, 자기들에게만 혈관을 생성할 수 있기 때문에 비말 기반 microfluidic 플랫폼은 높은 처리량 실험을위한 유망한 후보자 있습니다. 빠르고, 민감하고 고해상도 형광 spectroscopic 방법과의 통합을 통해 이러한 시스템 내에서 발생하는 정보의 다량은 효율적으로 추출 무력화하고 이용하실 수 있습니다.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화.

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

우리는 DNA 혼성화 검출을위한 미세 유체 기반 전기 바이오칩을 제시한다. ssDNA를 프로브 작용에 따라, 특이도, 민감도 및 검출 한계 보완 및 비 보완 ssDNA를 목표로 공부하고 있습니다. 결과는 3.8 nm의 검출 한계와 함께, 전기 화학적 시스템의 DNA 혼성화 이벤트의 영향을 예시한다.

라벨없는 DNA의 혼성화 분석 용 미세 유체 기반 전기 바이오칩

인쇄된 글라이칸 마이크로어레이 전략을 사용하여 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 열성 및 시알산 함유 수용체에 대한 특이성을 분석하기 위해 기존의 96웰 플레이트 분석을 소형화했습니다.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

미세 바이오 센서 플랫폼 설계 및 다양 한 analytes의 신속 하 고 민감한 정량화에 대 한 낮은 비용 드라이 필름 포토 레지스트 기술을 사용 하 여 조작. 이 단일 사용 시스템 중지 흐름 기술에 의하여 효소 연결 된 분석 실험에-칩-움직일의 전기 판독을 허용합니다.

드라이 필름 포토 레지스트 기반 전기 화학 미세 바이오 센서 플랫폼: 장치 제작, 온 칩 시험 준비 및 시스템 운영

미세 유체 공학은 진단 테스트 개발을위한 강력한 도구입니다. 그러나 값비싼 장비와 재료, 힘든 제조 및 취급 기술이 필요한 경우가 많습니다. 여기에서는 저비용 및 사용이 간편한 환경에서 자성 마이크로 및 나노 입자 기반 면역 분석을위한 아크릴 미세 유체 장치의 제조 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

컴퓨터 수치 제어 자기 나노 입자 기반 면역 분석에 대한 엇갈린 제한이있는 미세 유체 아크릴 장치의 마이크로 밀링

다양한 박테리아 병원체는 호흡기 감염을 일으킬 수 있으며 정확하게 감지하고 신속하게 치료하지 않으면 심각한 건강 문제를 초래할 수 있습니다. 루프 매개 등온 증폭을 통해 이러한 병원체를 빠르고 정확하게 검출하면 임상 환경에서 호흡기 감염을 효과적으로 관리하고 제어할 수 있습니다.

Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

학습하세요 마이크로유체 칩을 제작하고 인플루엔자 A 바이러스를 검출하는 방법을. 이 통합 플랫폼은 핵산 추출, 역전사, PCR 증폭을 하나의 칩에서 수행하여 신속하고 효율적인 분자 진단을 가능하게 합니다.

마이크로 유체 칩 제작 및 인플루엔자을 감지하는 방법

더 많은 동영상 탐색