Name: 설치류 중추 신경계에 약물을 직접 심실 배달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: 배우세요 설치류 중추 신경계에 약물을 직접 심실 배달하는 방법을. 카테터 삽입과 단일 주사 기법을 활용하여 항센스 올리고뉴클레오타이드를 효과적으로 전달하고 뇌 영역에서 mRNA 및 단백질 수준을 분석합니다.

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우리는 ASOS 우리의 실험실을 공급 전반적으로 ICV 알약 수술에 관한뿐만 아니라, 이시스 제약 조언을 제공하기 위해 이시스 제약에서 커트 메이져에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한, 우리는이 기사를 검토해 캐리 Shaner에게 감사의 말씀을 전합니다. TMM와 SLD는 NIH 보조금 P50AG005681, K08NS074194 및 R01NS078398에 의해 지원됩니다.

아래의 프로토콜은 세인트 루이스의 워싱턴 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물의 사용을위한 건강 지침의 국립 연구소를 준수하고 있습니다. 이 수술을 수행하는 첫 번째 시간 인 경우에, 우리는 14를 시작하기 전에 도입으로 설치류 수술에 조브 기사를 찾고 좋습니다. ASOS는 삼​​투 펌프 주입하고 하나의 ICV의 알약 주입 양을 마우스 CNS에 전달 될 수 있습니다. 이 때문에 아래에 설명 된 절차는 두 부분으로 나뉩니다. 각 방법의 장단점을 토론 섹션에 감동 할 것입니다. 프로토콜에서 사용되는 좌표는 성인 C57BL6 및 B6C3 쥐위한 것입니다. 해당 쥐의 좌표는 표 1에서 볼 수 있습니다. ALZET 삼투 펌프 1. Alzet 삼투 펌프의 준비 <ol><li> 멸균 DRAP을 규정전자 직접 불임 유지하기 위해 아무것도 만지지 않도록주의하면서 조심스럽게 끌어 다음 항목을 드롭 : 삼투 펌프, 흐름 변조기, 1 ML 멸균 주사기 (들), 메스 블레이드와 튜브의 섹션을 (튜브 = 5 펌프 1 조각). 십사일 28 일, 42 일 (그림 2A) : 마우스의 경우, 펌프를위한 세 가지 옵션이 있습니다. </li><li> 모자를 벗다 15-20 ML 식염수와 멸균 50 ML 원뿔 튜브를 채 웁니다. 최대 6 조립 펌프는 원뿔 관 당 추가 할 수 있습니다. </li><li> 100 % 에탄올로 P60 페트리 접시를 채우십시오. 에탄올로 카테터의 적절한 수를 추가합니다. 마우스의 경우, 카테터의 길이는 2.5 mm이다. </li><li> 필요에 따라 1.5만큼 ML 에펜 도르프 튜브에 각 ASO를 필터링합니다. 와 함께 튜브를 채우기 위해 멸균 0.9 %의 생리 식염수로 가득 에펜 도르프 튜브를 포함합니다. </li><li> 모든 것이 준비되면, 멸균 장갑을 넣어. 멸균되지 않습니다 아무것도 만지지 않도록합니다. 필요에 따라 장갑을 변경합니다. </li><li> 각 ASO를 사용하는 경우, 1 ML의 주사기를 채우그리고 상단 구멍에 바늘을 삽입하고 천천히 때까지 초과 누출을 작성하여 loadpumps. 펌프의 모든 채워질 때까지 계속합니다. </li><li> 흐름 변조기 모자를 벗다 및 펌프에 삽입합니다. 3-5 밀리미터 간격을두고 거의 모든에있는 방법의 흐름 변조기를 누르십시오. </li><li> 메스 블레이드를 사용하여, 5 동일한 세그먼트로 튜브의 각 조각을 잘라. 튜브의 한 조각을 가지고, 1 ML의 주사기를 사용하여 멸균 생리 식염수로 채운 튜브의 한쪽 끝으로 흐름 변조기의 상단을 삽입합니다. 다음 에탄올 정맥을 가지고 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다. 펌프는 이제 완전히 조립되어 있습니다. </li><li> 프라이밍 식염수와 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 완전히 조립 된 펌프를 놓습니다. 프라이밍은 약물 전달을 시작하는 액체를 흡수뿐만 아니라 적당한 온도에 와서 펌프 수 있습니다. 프라이밍 시간 : 14 일간 펌프 : 4-6 시간 28 일 펌프 : 40 시간 42 일 펌프 : 60 시간. 펌프 조립 완료되면, 깨끗 원뿔 튜브와 장소를 캡37 ° 수술까지 C의 물을 욕조. </li></ol> 2. 수술 전 절차 <ol><li> 지역을 소독 및 멸균 필드를 만들 테이블 위쪽과 stereotax에 멸균 커튼 누워 70 % 에탄올로 다 닦아. 그것은 전체 수술을 통해 무균 영역을 염두 것이 중요합니다. 다음 켜십시오 : 비드 살균기, 난방 패드, 빛, 디지탈 해독 및 산소 / isoflurane을 시스템 (그림 1). </li><li> 포셉 한 쌍, 1 곡선 지혈, 작은 가위 1 쌍의 작은 곡선 무딘 가위 1 쌍, 1 쥐의 뼈 절단기 : 하나의 수술 또는 전체 일괄 수술 우리가 일상적처럼 하나를 수행하면 다음과 같은 항목이 필요합니다 1 똑바로 지혈, 5-0 나일론 봉합사, 70 % 에탄올로 1 원뿔 튜브, 95 % 에탄올로 1 원뿔 관, 요오드와 1 원뿔 관, 과산화수소 1 원뿔 관, 멸균 면봉의 패키지, 슈퍼 1 병 접착제, 1 관 항생제 연고, 눈의 1 관윤활유 및 1 전기 면도기. </li><li> 15 초 동안 비드 살균기로 가위, 집게, 그리고 곡선 지혈 두 쌍 팁을 놓습니다. 제거하고 70 % 에탄올에 배치합니다. 하나 이상의 수술을 수행 할 때, 동물 사이에 악기의 끝을 다시 소독. </li><li> 4 %로 isoflurane을하고 O 2-0.4 L / 분, 챔버에 직접 가스의 흐름을 켭니다. 우리는 마취의 적절한 금액을 제공되는 것을 보장하기 위해 일년에 적어도 하나의 교정 우리 isoflurane을 / 산소 시스템이 있습니다. 장소 챔버에 마우스와 호흡 때까지 기다리이 상당히 느려집니다. 마우스를 제거하고 마우스가 완전히 의식하기 위해 발가락 핀치를 수행합니다. </li><li> 최대 눈 사이에 어깨 상단에서 머리를 면도. 마우스가 깨어지기 시작하면 마우스가 발가락 핀치와 확인, 다시 완전히 의식이 될 때까지 의회에 다시 마우스를 놓습니다. stereotax에 마취 마우스를 놓고 코에 코 콘을 누릅니다.치아와 뼈가 허약으로 부드럽게해야합니다. </li><li> 마우스를 마취 유지하기 위해 stereotax에 가스 흐름을 연출합니다. 그것은 가끔 마우스가 수술 내내 발가락 핀치와 완전히 의식이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 귀 막대 머리를 고정합니다. 우리는 뇌실을 대상으로하지만, 귀 막대를 수평 선호 완벽한 수준의 두개골 인해 뇌실의 큰 크기를 할 필요가 없습니다. </li><li> 유지 보수를 위해 2.0 %로 isoflurane을 수준을 낮추십시오. 각각의 눈 위에 덩어리 눈 연고. 영상에서 볼 수 있듯이 목과 머리 만 기초가 노출되도록, 마우스를 통해 멸균 드레이프를 놓는다. 그런 면도 영역의 중앙에서 시작하여 면봉 면봉 요오드에 담근면 그 다음 95 % 에탄올에 담근면 우선 바깥쪽으로 이동 원형 모션에서 머리와 목의 상단을 닦아 수술 영역을 소독. </li><li> 우리는 보장 직장 프로브 피드백 온도 제어 난방 시스템을 사용하는 것이 좋습니다마우스의 온도가 안정 37 ° C.에 남아 마우스의 온도가 수술하는 동안 감소하는 경우, 수술 후 회복 시간이 더 오래 걸릴 수 있으며, 그 결과 저체온증 단백질 타우 15 관련 소관의 hyperphosphorylation 등 비정상적인 단백질의 활동으로 이어질 수 있습니다. 난방 시스템을 설정 한 후, 당신은 지금 수술을 시작할 준비가 된 것입니다. </li></ol> 3. Alzet 삼투 펌프의 주입 <ol><li> 수술을 시작하기 전에, 멸균 장갑 한 켤레에 넣어. 그런 다음, 집게와 가위의 작은 쌍을 사용하여, 두 눈 사이에 최대 동물의 두개골 위에 목의 기지에서 피부 절개를 </li><li> 위로 향 곡선 무딘 가위를 타고 왼쪽 뒷다리으로 목 뒤의 기초에서 피부 아래에 밀어 넣습니다. 저항이 없어야합니다. 이 경우 가위를 제거하고 다시 시도하십시오. 이 삼투 펌프 피하 포켓을 형성한다. </li><li> 무선체육 면봉 다음 멸균 면봉 깨끗한 두개골, 브레 그마을 향상시키기 위해 과산화수소에 담근. </li><li> 펌프의 불임을 유지하기 위해 펌프를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브를 닦아냅니다. 조심스럽게 펌프 원뿔 튜브의 측면에 접촉하지 않는 여분의주의하면서 곡선 지혈을 사용하여 원뿔 튜브에서 펌프를 가지고. 집게로 펌프의 기초를 잡고 곡선 지혈과 방법의 나머지 부분의 흐름 변조기를 누릅니다. </li><li> 흐름 변조기와 튜브가 곡선 지혈에 맞는 펌프를 누릅니다. 목의 기초에 피부의 밑에 펌프를 삽입하고 끝까지 저항없이 들어갈 때 왼쪽 뒷다리쪽으로 다시 밀어 넣습니다. 카테터 터치 아무것도시키지 않도록주의해야합니다. </li><li> 곡선 지혈과 함께 상단 받침대를 충족 홈에서 정맥을 잡아. 위치로 정맥 드라이버를 이동하고 제자리에 고정합니다. </li><li> 정맥의 기초에 최고 접착제 한 방울을 넣습니다. 고름H 드라이버와 튜브가 바로 다시 지적 될 수 있도록 위치에 정맥의 상단. </li><li> 브레 그마에 카테터 끝을 터치 디지털 디스플레이의 좌표를 제로. 카테터를 올리고 오른쪽 후방 0.5 mm (그림 2B)로 옆 1.1 mm를 이동합니다. 곡선 지혈과 길에서 피부를 잡아. </li><li> 플라스틱 정맥베이스가 안전하게 두개골의 상단에 누를 때까지 두개골을 통해 얇은 금속 카테터를 운전. 금속 도관은 상대적으로 얇은 두개골에 의한 생쥐의 두개골을 통해 직접 구동 할 수 있습니다. 쥐를 사용하는 경우, 카테터을 낮추는 전에 두개골에 구멍을 뚫습니다. </li><li> 멀리 두개골에서 거기에 접착제가있는 피부를 당겨 빼냅니다. 장소에 정맥 / 카테터를 잡고 정맥 드라이버와, 완전히 건조 접착제 1-2 분 기다립니다. </li><li> 카테터를 평가하기 위해, 연습 할 때, 튜브 (그림 2C)를 통해 2.5 % FastGreen 염료의 20-40 μl를 주입. 2 ~ 3 분, perfus을 기다립니다1X PBS 0.03 % 헤파린 사용하여 전자 마우스를, 그리고 두뇌를 제거합니다. 카테터 사이트에서 coronally 잘라. 카테터가 우심실에 배치 된 경우, 염료 마우스 심실 시스템 (그림 2D)를 통해 관류됩니다. </li><li> 드라이버를 높이면서 곡선 지혈과 장소에 카테터를 잡습니다. 천천히 정맥이 제대로 두개골에 고정되도록 지혈을 놓습니다. </li><li> 면봉으로, 정맥의 정상에 누르십시오. 정맥의 상단과베이스 사이의 숲에 쥐 뼈 어선을 맞 춥니 다. 여전히 면봉으로 누르면서 정맥의 상단을 클립. 가위 수준을 시도하고 유지할만큼 두개골에서 정맥을 분리하지. 정맥는 것은 unglued 올 않는 경우, 신속하게 재 접착제 및 추가 2 분 면봉으로 압력을 적용합니다. </li><li> 오른쪽 정맥에 특별한 관심을 지불, 5-0 봉합 실,​​ 정기적으로 지혈 및 집게, 완전 개방에 따라 봉합사를 사용하여. 우리는 도망을 사용두개골에 큰 절개에 의한 g 수평 매트리스 봉합 (그림 5 참조). </li><li> 머리와 목에 항생제 연고 소량을 적용합니다. 나사를 풀고 귀 바, 코 콘을 풉니 다. 복구를위한 온난 패드 stereotax과 장소에서 마우스를 제거하십시오. 일반적으로 10-30분에 이르기까지, 회복 기간 동안 밀접하게 마우스를 모니터링합니다. 마우스가 걷는 그 자체를 손질 시작할 때까지 2 ~ 3 분 확인합니다. </li></ol> 4. 수술 후 케어 <ol><li> 첫 주에 대한 수술 후 일상 마우스를 모니터링합니다. </li><li> 마우스가 통증이나 고통에 나타납니다 있다면, 우리는 고통을 완화하기 위해 최대 5 일 동안 매일 24 시간 한 번 Carprofen의 5 MG / kg 피하 주사와 마우스를 제공하는 것이 좋습니다. </li><li> 감염이있을 나타나면 아낌없이 매일 영역에 항생제 연고를 적용하고 상처가 제대로 치유되도록 참석 수의사에게 문의하십시오. </li><li> R5-0 나일론 봉합사에게 봉합 스레드에서 자극을 방지하기 위해 수술 후 7-10일를 emove. </li></ol> 5. Alzet 삼투 펌프를 변경하거나 제거 펌프가 적극적으로 ASO를 주입 완료되면, 그것은 하나를 변경하거나 완전히 제거 할 수 있습니다. <ol><li> 다음과 같은 변경 위와 같은 사전 수술 절차를 따르십시오 : 1) 당신이 곡선 가위, 곡선 지혈, 쥐의 뼈 절단기, 또는 디지털 디스플레이를 필요로하지 않습니다, 대신 마우스의 머리를 준비하고, 2), 면도 펌프와 튜브의 교차점에 마우스의 뒷면을 소독. </li><li> 집게와 가위를 사용하여, 수직 펌프 / 튜브 접합부에있어서의 마우스의 뒷면에 1.5 cm의 절개를합니다. 조심스럽게 크게 당겨 / 그것은 카테터를 항아리 수 있으므로 튜브에 누르지 않고 절개 밖으로 펌프를 당깁니다. </li><li> 펌프를 제거하려면 약 0.5 cm 흐름 변조기 위에 튜브를 자르고 튜브 t에 순간 접착제를 만지지O 물개는 종료합니다. 건조 접착제 1-2 분을 기다립니다. 튜브를 다시 절개 및 봉합 종료에 배치합니다. 봉합 피부와 장소 온수 복구 패드에서 마우스를 위에 덩어리 항생제 연고. </li><li> 펌프를 변경하려면, 갓 95 % 에탄올로 가득 10cm 접시와 함께 펌프가 준비 만들었습니다. 카테터는 새로운 펌프 필요하지 않습니다. </li><li> 집게로 새로운 펌프를 잡아. 에탄올에 손가락을 담그고, 펌프의 파악을하고, 흐름 변조기 버린다. 그런 다음, 조심스럽게 천천히 튜브 및 정맥에 연결된 흐름 변조기에서 이전 펌프를냅니다. 마자가 꺼져으로 천천히 흐름 변조기는 마우스의 바깥 쪽을 접촉하지 않는 것이 보장에 새로운 펌프를 밀어 넣습니다. </li><li> 피하 패킷 봉합 피부에 다시​​ 절개를 통해 새로운 펌프를 삽입합니다. 복구 패드에 상처 곳에 마우스 덩어리 항생제 연고. </li><li> 그냥 펌프 주입과 마찬가지로, p를 확인하기 위해 수술 후 일상 생쥐를 모니터링아인 / 불편 및 감염. 필요하다고 인정하는 Carprofen와 항생제로 치료. </li></ol> ICV 알약 6. 수술 전 절차 <ol><li> 2)와 멸균 물과 부하 10 μL 해밀턴 주사기와 바늘을 청소 1) 곡선 가위, 곡선 지혈 또는 쥐 뼈 절단기를 필요로하지 않습니다 다음과 같이 변경 위에서 2 장에서와 같은 사전 수술 절차를 따르십시오 ASO, 3) 정맥 드라이버가 위치한 정위 장치에 주사기와 바늘을 연결합니다. </li></ol> 7. ASO의 알약 주입 <ol><li> 집게와 가위의 작은 쌍을 사용하여, 두 눈 사이의 최대 목의 기지에서 절개를합니다. </li><li> 면봉 브레 그마을 향상시키기 위해 과산화수소에 담근면 다음에 멸균 면봉, 깨끗한 두개골을 닦으십시오. </li><li> 제자리에 주사기 / 바늘을 이동하고 고정합니다. 바늘의 경 사진 부분이 후방에 직면해야합니다. 낮 춥니 다바늘 브레 그마 그것을 닿을 때까지. 좌표를 모두 제로. 오른쪽 1.0 mm와 전방 0.3 mm (그림 3A)에 옆으로 바늘을 이동합니다. </li><li> 바늘 구멍이 두개골의 윗부분과 단지까지 천천히 두개골을 통해서 바늘을 구동한다. 다시 말하지만,이 마우스 두개골의 두께에 따라 수행 할 수 있습니다. Z-좌표를 제로 1mm / 초 (그림 3B)의 속도로 -3.0 mm 바늘을 낮 춥니 다. 바늘 주위를 밀봉하는 두뇌에 대한 2 ~ 3 분을 기다립니다. </li><li> 초 당 1 μL의 비율로 ASO의 전체 10 μl를 제공합니다. 2 ~ 3 분을 기다립니다. 이 비율이 다른 약물에 따라 상이 할 수 있지만 우리는 뇌실에 ASOS 위해 1 μL 주입 속도를 사용합니다. 연습 할 때, 2.5 % FastGreen 염료의 10-20 μl를 제공하여 바늘의 적절한 배치를 확인합니다. 염료 주입 후 즉시 1X PBS 0.03 %의 헤파린 마우스를 붓는다 및 염료 심실 시스템 (그림 3C)에 있는지 확인하기 위해 뇌의 관상 섹션을 확인합니다. </li> &lt;리&gt; 바늘의 기지에서 두개골에 면봉을 잡습니다. 초에 1 mm의 속도로 바늘을 올립니다. 즉시 바늘이 두개골 밖으로이기 때문에, 바늘 구멍에 면봉을 굴려 밖으로 유출하는 ASO을 방지하기 위해 1 분 동안 누르고 있습니다. </li><li> 폐쇄 피부를 봉합 항생제 연고를 적용하고, 가열 복구 패드에 장소 마우스. ASO 농도에 따라, 완전히 복구하는 데 몇 시간에 20 분 정도 걸릴 수 있습니다. </li><li> 그냥 펌프 주입과 마찬가지로, 통증 / 불편 및 감염 확인하기 위해 수술 후 일상 생쥐를 모니터링합니다. 필요하다고 인정하는 Carprofen와 항생제로 치료. </li></ol>

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</ol>

저자는 이시스 제약에서 자신의 안티센스 올리고 뉴클레오티드를받을 수 있습니다.

동영상과 같이 CNS 세계적으로 약물을 전달하는 능력은 모두 배우고 사용하기 쉬운 매우 강력한 기술입니다. 연습으로, 하나의 펌프 주입 또는 ICV 러스가 동시에 처리 할 마우스의 대규모 코호트를 허용, 10 분에 완료 할 수 있습니다. 마우스 동작에 대한 큰 숫자가 큰 차이를 볼 수 있도록하는 것이 중요하다 등이, 행동 판독과 연구에 특히 유용합니다. 펌프 알약 주사를 통해 ASOS을 제공하는 우리의 경험을 바탕으로, 우리는 각각의 방법에 장단점을 관찰했다. 그 다음은 우리의 실험실에서 의견이며 모든 마우스와 쥐 모델에 해당되지 않을 수 있습니다 주목해야한다. 우리는 펌프를 사용하는 장점은 ASO는 시간이 더 긴 기간에 걸쳐 분산되어 있기 때문에 ASO의 높은 금액을 제공 할 수있는 능력 찾을 수 있습니다. 이것은 일반적으로 활성화 된 후 더 이상 지속 최저 또는 접합 동일합니다ASO 주입,하지만 이것은 항상 사건되지 않을 수 있습니다. 펌프는 ASO 전달의 정확한 시간 프레임 (십사일 28 일 42 개 일) 수와 펌프도 더 이상 활성화 ASO 주입을 허용 한 번 변경할 수 있습니다. 그러나, 우리는 두 번 이상 펌프를 변경하는 것이 적절 액체를 흡수에서 펌프를 방지 펌프 주위에 섬유 주머니의 형성으로 인해 변동성을 증가 것으로 나타났습니다. 펌프의 단점은 어떤 마우스뿐만 아니라 다른 사람과 같은 펌프를 용납하지 않을 것입니다. 작업중인 형질 전환 라인이 더 허약 한 경우, 펌프가 너무 복잡 할 수 있습니다. 펌프는 또 다른 수술과 추가 마취 쥐를 복종, 최종 주입 후 제거해야합니다. 행동 작업을 수행하는 경우, 펌프를 제거하고 펌프의 존재는 마우스에있는 어떤 행동에 영향을 미칠 것이기 때문에 복구의 적어도 1 ~ 2 주간 수 있도록하는 것이 특히 중요합니다. ICV 알약 주사 한 장점은 비용입니다. 가초기 투자는 주사기와 바늘을 구입 수 있지만 구입하는 펌프 / 튜브 / 카테터가 없을 있기 때문에 시간이 지남에 따라, 알약 주사보다 비용 효과적입니다. 전반적으로, 캐 뉼러 및 펌프의 부족으로 인해 ICV 알약 주사와 함께 - 유지 적은있다. 우리는 또한 ICV의 알약이 젊은 및 / 또는 그 이상의 깨지기 쉬운 마우스에 ASOS을 제공하는 데 사용할 수 있습니다 찾을 수 있습니다. ICV 알약의 단점은 단 하나 주입 것입니다. 많은 전체 ASO는이 경로를 통해 전달 될 수 있고, 사용되는 ASO의 작용 지속 시간이 짧은 경우, 최저 / 접합 효과는 단명 않을 것이다. 삼투 펌프뿐만 아니라 ICV의 알약 모두 ASOS을 제공 할 수있는 능력을 가지고 할 수있는 최저 단백질 또는 전체 설치류 CNS에있는 유전자의 접합, 여러 신경 과학 관련 분야에서 광범위한 응용 프로그램을 가지고 기술을 변경합니다. 당신이 가장의 적합 투여되는 경로를 모르는 경우, 우리는 배달의 두 가지 방법을 조종하는 것이 좋습니다pecific 연구.

일부 약물은 직접 중추 신경계 (CNS) 납품을 필요로 혈액 뇌 장벽 (BBB)​​을 통과 할 수 없습니다. BBB를 피하기 위해, 약물 설명한 방법을 사용하여 뇌에 직접 전달 될 수 있습니다. 연구실 및 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 용지 상세한 여기에 초점이 (ASOS)와 같은 작은 분자, 항체, 유전자 치료 벡터 등. 같은 다른 약물은 또한 동일한 방법을 통해 제공 될 수 있지만. 특정 단백질이 neurodegenerative 질병의 병인에 쓸모있는 역할을한다. 이러한 단백질들은 결국 신경 세포의 죽음과 이후의 신경 질환 3-4로 이어지는 집계에 유해 종을 형성하고 축적. 이 질병의 진행을 느리게 또는 중지하기위한 노력의 일환으로, 하나의 치료 옵션은 직접 대상과 원인 단백질을 감소시킬 수 있습니다. 그러나, 이러한 단백질은 종종 어려운 전자로 만드는 CNS를 통해 재하 발견<html> ffectively 세계적인 규모에 그들을 대상입니다. 전체 CNS에 걸쳐 유전자를 표적으로하기 위해, 우리는 BBB를 우회하는 측면 뇌실을 통해 마우스 뇌척수액 (CSF)에 ASOS을 관리 할 수 있습니다. 이 특정 방법은 ASOS의 광범위한 유통을 허용, 전체 뇌와 척수를 목욕 마우스 심실 시스템을 활용합니다. 우리는 최저로 이어지는 mRNA의 저하 또는 B) 대체 접합 1을 이동하거나 A) 모집의 RNase-H, ASO 화학 수정에 따라, 직접 대상 mRNA의 순서를 바인딩 18-20 메르 RNA 같은 분자 ASOS를 사용하여 , 2,16,17. 그것은 여러 분자 shRNA를 포함한 생체 내에서 특정 단백질을 노크 존재 주목해야한다. 이러한 분자는이 문서의 초점이 아니므로, 우리는 문서를 검토하려면 독자를 직접 더 나은 세부 최저 행동의 메커니즘과 각 5-6의 장점 / 단점. 이전의 연구에서는 jove_content &quot;&gt;, 우리는 루게릭 병 (ALS) 7 (그림 4)의 형질 전환 쥐 모델에서 단백질 옥사이드에게 불균등 화 효소 1 (SOD1)을 대상으로 ASOS를 사용했습니다. SOD1의 돌연변이 발생하는 모든 ALS의 약 2 %에 사례 8, 그것은 최근 SOD1가 발병이 크게 7 증가 된 후 ALS 유전자 변형 쥐의 생존에 총 SOD1 수준을 감소하여도 9-10. 산발적 인 ALS에 중요한 역할을 할 수 있다는 가설을 가지고 있지만. 이러한 중요한 데이터는 먼저했다 CNS에서 ASO 치료는 신경 질환 모델에 지대한 긍정적 인 영향을 미칠 수 있다고 표시합니다. 그 이후, 인간 SOD1을 대상으로 ASOS 최소한의 부작용 (Clnicaltrails.gov NCT01041222)를 입력하고 성공적으로 I 인간적인 임상 시험 단계를 완료 같은 신경의 2012 년 64 번째 연례 미국 아카데미에서 발표했다. II 시험을 단계로 앞으로 ASOS를 이동하는 계획이 현재 진행되고 있습니다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; SOD1은 신경 질환을 치료하는 ASOS를 사용하는 최초의 데모였다 대상으로하지만, 여러 가지 다른 연구는 이후 다른 질병과 각각의 단백질 표적을보고 수행되었다. 2010 년과 2011 년, 그 ASOS는 운동 신경 세포 2 (SMN2)의 단백질 생존의 이동 접합은 척추 근육 위축 (SMA)의 형질 전환 마우스 모델에 사용되었고, 질병 표현형 11,12에서 상당한 개선 결과. 이러한 접합 ASOS이 단계에서 지금 SMA를 가진 아이들 (Clinicaltrails.gov NCT01494701)에서 I 임상 시험이다. 또한, 최근 huntingtin의 단백질 수치가 기준선 13에 반환 후에도 huntingtin의 유전자에 대한 표적 ASOS의 과도 정부가 극적으로 헌팅턴의 마우스 모델을 구출 할 수 있다고 표시했다. 이러한 연구 모두에서, ASOS는을 통해 전체 유전자의 수준을 감소 시키거나 유전자 접합을 변경하는 측면 뇌실에 전달했다전체 CNS. 삼투 펌프와 하나의 알약 주입 모두 CSF에 ASOS을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 뇌실 (ICV) 알약은 빠르고, 한 번 주입 반면 펌프, 느린, 지속적인 배달 할 수 있습니다. 우리는 하나의 형질 전환 라인 펌프와 알약 간의 직접 비교를보고하지 않은하지만 우리는 성공이 방법을 모두 사용하고 있습니다. CNS에서 ASOS를 사용하여 총 단백질 수준 및 / 또는 여러 단백질의 변화 접합을 감소 할 수있는 강력한 방법입니다. 우리는 신경 질환에 대한 치료로 전용 ASOS를 사용하는 동안, 우리는 다른 분야도이 기술의 혜택을 누릴 수 있다는 것을 인식하고 있습니다. 관심의 단백질만큼이 CNS에 표현 궁극적 인 목표는 증명 기법 ASOS을 사용하여 유전자 발현의 CNS 넓은 변화를 달성하는 것입니다로 매우 유용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS </td></tr><tr><td>Alzet Osmotic Pump 14일</td><td>DURECT</td><td>모델 1002</td><td></td></tr><tr><td>Alzet Osmotic 펌프 28일</td><td>DURECT</td><td>모델 2004</td><td></td></tr><tr><td>Alzet Osmotic 펌프 42일</td><td>DURECT</td><td>모델 2006</td><td></td></tr><tr><td>2.5mm 카테터</td><td>PlasticsOne</td><td>3280PM/SPC</td><td>주문 2.5mm 카테터 길이</td></tr><tr><td>비닐 카테터 튜빙</td><td>DURECT</td><td>7760</td><td>ID : 0.027 ", OD : 0.045 "</td></tr><tr><td>0.9 % 염화나트륨, 관개, USP</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td>펌프 또는 튜브에 사용하지 않음</td></tr><tr><td>0.9 % 염화나트륨, 주입, USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>p60 페트리 접시 (멸균)</td> <td>TRP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>수술 블레이드 (멸균)</td><td>Butler Schein</td><td>#007319</td><td></td></tr><tr><td>라텍스 수술용 장갑 (멸균)</td><td>Micro-Touch</td><td></td><td>CatNo는 필요한 장갑의 크기에 따라 달라집니다</td></tr>. <tr><td>멸균 타월 드레이프</td><td>Dynarex</td><td>4410.2um</td><td></td></tr> <tr><td>주사기 필터</td><td>PALL</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기 (멸균)</td><td>BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS </td></tr><tr><td>Curved Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11001-12</td><td></td></tr><tr><td>Curved Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13009-12</td><td></td></tr><tr><td>Fine Sharp Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Curved Blunt Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Bone Cutter</td><td>Fine Science Tools</td><td>16104-14</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 헤모스탯</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>해밀턴</td><td>7653-01</td><td>10 &mu; l 탈착식 바늘로 기밀</td></tr><tr><td>바늘</td><td>Needles Hamilton</td><td>7758-04</td><td>26 게이지, 포인트 스타일: 2</td></tr><tr><td>5-0 나일론 봉합</td>사 <td>Covidient</td><td>SN-871</td><td></td></tr><tr><td>알코올 패드</td><td>선택</td><td>#521</td><td></td></tr><tr><td>면봉(멸균)</td><td>Puritan</td><td>REF 806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Loctite</td><td></td><td>Longneck Bottles</td></tr><tr><td>주의: FastGreen 염료</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td>이 제품을 취급할 때 아이실드와 장갑을 착용하십시오</td></tr>. <tr><td>항생제 크림</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아이 연고</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>전기 면도기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 프로바돈 요오</td><td></td><td></td><td></td></tr>드 <tr><td>3% 과산화</td><td></td><td></td>수소<td></td></tr><tr><td>온난화 패드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>비드 살균기</td><td>SouthPointe Surgical</td><td>GRM5-1450</td><td></td></tr><tr><td>소동물 입체 Kopf</td><td></td><td>모델 940</td><td></td></tr><tr><td>노즈 콘</td><td>Kopf</td><td>모델 923-B</td><td></td></tr><tr><td>이어 바</td><td>Kopf</td><td>모델 921</td><td>이 모델은 선택 사항입니다</td></tr><tr><td>캐뉼라 드라이버</td><td>Kopf</td><td>모델 1966</td><td></td></tr><tr><td>주사기 홀더</td><td>Kopf</td><td>모델 1972</td><td></td></tr><tr><td>온도 제어 시스템</td><td>Kopf</td><td>모델 TCAT-2LV</td><td>선택적</td></tr><tr><td>산소/이소플루란 시스템</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

설치류 중추 신경계에 약물을 직접 심실 배달

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

혈액 뇌 장벽을 통과 할 수 없기 때문에, 특정 약물에 직접 중추 신경계 (CNS)에 전달해야합니다. 여기에서 비디오에 표시되는 방법도 CNS에 다른 약물의 과다를 제공하는 데 사용될 수 있지만 우리의 실험실, 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (ASOS)에 특별히 초점을 맞추고 있습니다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (ASOS)는 최저 시퀀스 특정 목표 1뿐만 아니라 특정 유전자 2 ​​교대 이소 비율로 기능이있다. 생쥐의 CNS에서 광범위한 유전자 최저 또는 접합을 달성하기 위해, ASOS 우리가 비디오에서 보여 둘 다 관리의 두 개의 분리 된 경로를 사용하여 두뇌로 전달 될 수 있습니다. 첫 번째 용도는 수술 측면 뇌실에 이식 카테터에 연결 삼투 펌프, Alzet. 이 ASOS는 지속적으로 시간의 지정된 기간 동안 CNS에 주입 할 수 있습니다. 두 번째는 첨단의 단일 알약 주입을 포함오른쪽 측면 뇌실로 ASO의 GH 농도. 연구의 필요에 따라 하나의 방법이 다른보다 선호 될 수 있지만 두 방법은 전체 뇌와 척수 ASO를 제공하는 마우스 대뇌 심실 시스템을 사용합니다.

펌프 주입 또는 ICV 러스 주사 후 지정된 시간이 지난 후 (우리가 일상적으로 4 주 사용), 그것은 ASOS의 효능을 테스트하는 것이 중요합니다. 우리는 둘 다 서쪽 오점 또는 ELISA를 사용하여뿐만 아니라 단백질 수준으로 정량 실시간 PCR을 사용하여 mRNA의 수준 (간행 예를 들어, 그림 4에서 표적 유전자의 수준 / 아형을 측정하는 두뇌의 여러 지역과 척수를 복용하는 것이 좋습니다 ). 이것은 다른 CNS 지역에 걸쳐 ASO 효능을 결정하는 데 도움이됩니다. 대상 단백질의 반감기가 긴 경우, 우리는 최대 단백질 최저 또는 접합을 평가하기 위해 ASO 주입 한 후 더 이상 기다리고 좋습니다. 그것은 올리고 배포를 테스트하는 것도 중요합니다. 높은 ASO 농도는 종종 가까운 심실 시스템 16 지역에서 볼 수 있지만 펌프 주입은 동측 및 반대측 반구를 통해 배포 될. ICV 알약 주사보다 제복을 산출CNS 16을 통해 올리고의 RM 분배 효과가 오래 지속되지 않을 수도 있지만. 우리는 사우스 외 판독기를 연출합니다. 알약 올리고 분포 16 대 펌프의 직접 비교를 참조 할 수 있습니다. 우리는 또한 각 ASO는 생체 내에서 약간 다르게 동작합니다 때문에 여러 복용뿐만 아니라 ASOS의 작용 지속 시간을 테스트하는 것이 좋습니다. ASOS는 일반적으로 몇 개월 후 ASO 전달을 지속 대상 최저 또는 접합으로, 행동의 비교적 긴 기간이 있습니다. 또한, 일부 ASOS 다른 사람보다 더 잘 작동합니다 및 일부 유전자의 대상은 다른 사람보다 최저 쉬울 것입니다. 이 때문에 심사 리드 후보를 결정하기 위해 ASOS 때, 우리는 N으로 생체 내에서 최소한 3-5 ASOS 테스트를 권장 = 첫 번째 패스로 ASO 당 4-6 성인 마우스. ASOS 이외의 약물을 사용하는 경우, 그것은 또한 조종사 중요 할 것이다 이상적인 약물 농도, 액션의 약 기간, CNS 약물특정 화합물 분포. <img alt="표 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" /> 표 1. 수술은 조정한다. 좌표는 뇌실 (ICV) 알약을 수행 할뿐만 아니라, 삼투 펌프를 이식 할 때 마우스 및 쥐 모두에서 오른쪽 측면 뇌실을 공격하는 데 사용됩니다. 두 좌표는, 펌프 및 ICV의 알약에 대해, 오른쪽 측면 뇌실을 대상으로. 이 우리와 함께 가장 경험이 있고 ASO의 뛰어난 기능을 제공하며 무엇을 알고 있기 때문에 우리는 두 개의 다른 세트를 사용합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" /> 그림 1. 정위 설정. Alzet 펌프 알약 주입 수술에 대한 (A) 필요한 정위 장비. 나) 유리 구슬은 소독R. ⅱ) 디지털 판독. III) 이동 무기와 정위 기초. IV) 온도 제어 난방 패드. V) 산소 시스템 / isoflurane을. VI) isoflurane을 상공 회의소. (B) 코 콘과 귀 막대를 닫습니다. (C) 두 개의 첨부 파일이 필요합니다. 왼쪽 : 주사기 / ICV 러스 주사 바늘 홀더. 오른쪽 : 삼투 펌프 주입을위한 정맥 드라이버. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" /> 그림 2. 삼투 펌프 주입을 Alzet. 마우스에 대한 (A) Alzet 삼투 펌프 옵션을 제공합니다. 14. 일 펌프 (0.25 μL / HR) 28 일 펌프 (0.25 μL / HR) 42 일 펌프 (0.15 μL / HR)는 (B) 브레 그마에서 펌프 착상 위치 : 후방 -0.5 mm, 측면 -1.1 mm를 ( 오른쪽), 그리고 복부 -2.5 mm (카테터의 길이). (C)를 ​​통해 카테터를 구동 한 후두개골과 접착 정맥, 염료는 측뇌실 카테터의 적절한 위치를 평가하기 위해 카테터를 통해 플러시됩니다. 염료 (C)에서와 같이 투여 직후 (D) 관류 뇌. 카테터가 성공적으로 뇌실에있는 경우, 염료 마우스 심실 시스템을 통해 배포됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" /> 그림 3. 뇌실 알약 주입. (A) 브레 그마에서 알약 주입 위치 : +0.3 mm 전방, 측면 -1.0 mm (오른쪽), 그리고 복부 -3.0 mm를 (B) 복부 두개골 -3.0 mm를 통해 바늘을 구동 한 후, 염료를 주사기를 통해 푸시됩니다. 곧 (B)에서와 같이 투여 염색 한 후 나중에 뇌실. (C) 관류 뇌 바늘의 적절한 배치를 평가한다. 바늘이 성공적으로 뇌실,에있는 경우염료 마우스 심실 시스템을 통해 배포됩니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" /> 그림 4. 안티센스 올리고 핵산 (스미스 등 7.에서 직접 찍은 그림) 생체 내에서 쥐 SOD1을 줄일 수 있습니다. (AD) 안티센스 SOD1 올리고 뉴클레오티드는 r146192를 SOD 나 SOD가 100 ㎍ / 일에 정상 쥐의 우측 측뇌실 후 28 일 동안 주입 하였다 스크램블. 뇌와 척수에서 (A) 내생 SOD1 mRNA 수준은 QRT-PCR로 측정. ( B) SOD1과-튜 불린 단백질 수준은 ASO 주입에 따라. tubulin에와 SOD1에 대한 (C와 D) 단백질 수준은 뇌의 다음 주입의 다른 지역에 대한 정량화. presenilin 1, GSK-3 및 베타에 (E) ASOS, 오른쪽 측두엽 / 전두엽 피질에서 평가 비 형질 전환 마우스 및 mRNA 수준의 오른쪽 측면 뇌실에 2 주 주입 하였다. 임상 조사에 대한 미국 사회의 허가를 재현하는. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg"/> 그림 5. 수평 매트리스 봉합을 실행합니다. 5-0 나일론 봉합사 스레드가 피부에 길쌈하고 밖으로 전방 시작 후방 작업 정맥에 더 집중하고있다. 일단 가장 후방 지점에 도달하는 데, 봉합 스레드가 다시 제기 한 번 더 캐 뉼러를 통해 스레드됩니다. 이 적절한 상처 봉합을 보장하고 피부를 통해 작동 정맥 / 튜브를 방지 할 수 있습니다.

우리는 카테터를 이식하거나 마우스의 오른쪽 측면 뇌실에 알약 주입을 수행하여 중추 신경계에 약물을 대상으로하는 방법을 설명합니다. 우리는 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 전달에 특히 초점을 맞 춥니 다. 이 기술은 다른 약물과 쥐에 쉽게 적응할 수있다.

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

다음 실험의 전반적인 목표는 본 프로토콜에서와 같이 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 같은 약물을 외측 뇌실을 통해 설치류의 중추신경계로 직접 투여하는 것입니다. 이는 두 가지 서로 다른 방법으로 수행됩니다. 첫 번째 방법은 마우스의 우측 외측 뇌실에 제트 삼투압 펌프와 연결된 금속 카테터를 외과적으로 이식하는 것입니다.펌프를 통한 약물 투여가 완료되면, 치료를 중단하기 위해 펌프를 완전히 제거하거나, 활성 치료를 지속하기 위해 펌프를 교체할 수 있습니다. 약물을 투여하는 두 번째 방법은 우측 외측 뇌실에 단일 볼루스(bolus) 주사를 하는 것입니다. 이 방법을 통해 정해진 양의 약물을 전체 중추신경계로 빠르게 주입함으로써, 설치류의 전체 중추신경계에 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotides)가 성공적으로 전달되었음을 입증할 수 있습니다.본 프로토콜에서 입증된 바와 같이, 올리고(oligo) 주입 후 여러 서로 다른 뇌 영역의 mRNA 및 단백질 수준을 측정해야 합니다. 이 방법은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 중추신경계에 직접 투여하는 방법에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 항체, 유전자 치료제, 벡터 및 저분자 화합물을 포함한 다른 약물에도 적용될 수 있습니다.모든 수술 절차는 멸균된 장비와 용액을 사용하여 멸균 상태에서 수행되어야 하며, 기관 및 정부 지침을 준수해야 합니다. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜과 기관의 iacuc 지침에서 확인할 수 있습니다. 유도 챔버에서 isof fluorine으로 마우스를 마취시킨 후, 마우스를 꺼내 발가락 꼬집기 테스트를 수행하여 마우스가 완전히 의식을 잃었는지 확인하십시오.어깨 상단부터 양눈 사이까지의 털을 빠르게 제모합니다. 그 후 마취된 마우스를 실체 현미경 스테이지 위에 조심스럽고 부드럽게 놓습니다. 코 콘을 코 위로 밀어 넣고 가스 흐름이 실체 현미경 스테이지 쪽으로 향하게 합니다.마우스의 마취 상태를 유지하기 위해 이어 바(ear bars)로 머리를 고정합니다. 여기서는 레벨링 이어 바를 사용하지만, 측뇌실은 크기가 크기 때문에 뇌실을 타겟팅할 때 두개골을 완전히 수평으로 맞출 필요는 없습니다. 마취 유지를 위해 이소플루란(isoflurane) 농도를 2%로 낮추고 안연고를 도포합니다.각 눈 위, 머리 윗부분과 목을 95% Ethanol에 적신 면봉으로 닦아낸 후, 요오드에 적신 면봉으로 다시 닦아 수술 부위를 멸균합니다. 또한, 생쥐 위에 멸균 드레이프를 덮습니다. 생쥐의 체온이 37 °C로 유지되도록 합니다.여기서는 직장 프로브 피드백 기반의 온도 조절 가열 시스템이 사용됩니다. 그런 다음 zat 펌프의 삽입을 진행하십시오. 필요한 주입 일수에 따라 적절한 펌프를 선택하고, 프로토콜의 텍스트 부분에 기재된 지침에 따라 펌프를 준비하십시오.목 기저부에서 양 눈 사이 영역까지 절개한 후, 끝이 뭉툭한 가위를 곡선 부분이 위를 향하게 하여 목 기저부 피부 아래로 부드럽게 삽입합니다. 가위를 왼쪽 뒷다리 방향으로 밀어 넣고 가위를 약간 벌려 피하 포켓을 형성합니다. 멸균 면봉으로 두개골을 깨끗이 닦아낸 후, 과산화수소에 적신 면봉으로 다시 닦아냅니다.bgma를 강화하려면, 곡선형 지혈집게를 사용하여 원추형 튜브에서 펌프를 조심스럽게 꺼내되, 펌프가 원추형 튜브의 벽면에 닿지 않도록 주의하십시오. 핀셋으로 펌프의 바닥 부분을 잡고 유량 조절기를 끝까지 밀어 넣으십시오. 곡선형 지혈집게를 사용하여 유량 조절기와 튜빙이 만나는 지점에서 펌프를 고정하십시오.목 기저부의 피부 아래에 펌프를 삽입하고, 저항이 느껴지지 않는 범위까지 왼쪽 뒷다리 방향으로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 곡선형 지혈鉗(hemostat)을 사용할 때 카테터가 다른 부위에 닿지 않도록 주의하십시오. 상단과 받침대가 만나는 홈 부분에서 캐뉼라를 잡습니다.캐뉼라 드라이버를 위치에 맞게 이동시킨 후 단단히 고정합니다. 그다음 캐뉼라 하단에 순간접착제를 한 방울 떨어뜨리고, 캐뉼라 상단을 드라이버 안으로 밀어 넣어 튜빙이 직선으로 뒤를 향하도록 배치합니다. 신속하게 카테터 팁을 bgma에 접촉시킨 뒤, 피부가 닿지 않도록 잡은 상태에서 디지털 디스플레이의 좌표를 0으로 맞춥니다.곡선형 지혈집게를 사용하여 카테터를 들어 올린 후, 오른쪽으로 1.1 millimeters, 후방 방향으로 0.5 millimeters 이동시킵니다. 이 도식에 표시된 대로, 캐뉼라 베이스가 두개골에 단단히 밀착될 때까지 카테터를 두개골을 통해 빠르게 삽입합니다. 마우스의 두개골은 상대적으로 얇기 때문에 카테터를 두개골과 마우스 몸체에 직접 삽입할 수 있습니다.접착제가 묻은 피부를 두개골에서 떼어냅니다. 그 다음 캐뉼라 드라이버로 캐뉼라를 고정한 상태에서, 접착제가 완전히 마를 때까지 1~2분 동안 기다립니다. 이어서 곡선형 지혈鉗(curved hemostat)으로 캐뉼라를 고정한 상태에서 드라이버를 들어 올립니다.지혈鉗(hemostat)를 천천히 풀어 캐뉼라가 두개골에 제대로 고정되었는지 확인합니다. 면봉을 사용하여 캐뉼라의 윗부분을 누릅니다. 멸균된 쥐 뼈 절단기(rat bone clippers)를 캐뉼라의 상단과 하단 사이의 홈에 맞추고 절단기를 수평으로 유지합니다.면봉으로 계속 누른 상태에서 캐뉼라 상단을 살짝 집어 캐뉼라가 두개골 클립에서 분리되지 않도록 합니다. 5-0 나일론 봉합사와 일반 지혈鉗 및 포셉을 사용하여 개구부 전체를 봉합하되, 캐뉼라 윗부분에 특히 주의를 기울입니다. 머리와 목 부위에 항생제 연고를 소량 도포합니다.이어 바(ear bars)의 나사를 풀고 노즈 콘(nose cone)을 헐겁게 합니다. 스테레오택스(stereo attacks)에서 마우스를 꺼내어 회복을 위해 워밍 패드 위에 놓습니다. 수술 후 매일 마우스를 관찰하여 통증, 불편함 또는 감염 여부를 확인하고, 승인된 프로토콜에 따라 카프로펜(carprofen)과 같은 진통제로 필요시 처치합니다.사용한 펌프를 제거하려면, 튜빙을 과도하게 당기거나 밀지 않도록 주의하면서 마우스 등 쪽의 펌프 접합부와 수직으로 낸 1.5 centimeter 절개창을 통해 펌프를 조심스럽게 끌어냅니다. 다음으로, 유량 조절기(flow modulator) 상단 약 0.5 centimeters 지점에서 튜빙을 자르고, 튜빙 끝에 순간접착제를 묻혀 밀봉합니다. 접착제가 마를 때까지 1~2분 동안 기다립니다.튜브를 절개 부위에 다시 넣고 절개 부위를 봉합합니다. 봉합된 피부에 항생제 연고를 바르고 마우스를 가열 회복 패드 위에 놓습니다. 펌프를 교체하는 경우, 95% ethanol이 채워진 10 centimeter 디쉬와 함께 새 펌프를 준비합니다. 포셉을 사용하여 새 펌프를 잡습니다.그 다음 반대쪽 손의 손가락을 95% ethanol에 담근 후 펌프를 잡습니다. 새 펌프 유량 조절기를 제거하고, 기존 펌프를 유량 조절기로부터 조심스럽게 당겨 분리합니다. 튜브와 캐뉼라에 연결하십시오. 기존 펌프가 제거되는 즉시, 유량 조절기가 마우스의 외부에 닿지 않도록 주의하며 새 펌프를 천천히 밀어 넣습니다.새 펌프를 절개 부위를 통해 피하 포켓으로 다시 삽입하고 피부를 봉합합니다. 이전과 동일하게 피부를 봉합한 후, 상처 부위에 항생제 연고를 바르고 마우스를 회복 패드 위에 놓습니다. 수술 후 다시 매일 마우스를 관찰하여 통증, 불편함 및 감염 여부를 확인하고, 필요에 따라 진통제를 투여하여 뇌실 내 볼루스를 투여합니다. 이전과 동일하게 두피 절개를 수행하고, 동물의 두개골을 깨끗이 닦아낸 후 과산화수소로 처리합니다.그런 다음 약물이 들어 있는 주사기를 해당 위치로 이동시킵니다. 바늘의 사면(beveled portion)이 후방을 향하도록 조절하여 고정합니다. 바늘이 bgma에 닿을 때까지 내립니다.모든 좌표를 0으로 설정한 다음, 바늘을 오른쪽으로 1.0 millimeters, 전방으로 0.3 millimeters만큼 측면으로 이동시킵니다. 바늘 베벨의 상단이 두개골 상단과 수평이 될 때까지 바늘을 두개골을 통해 천천히 삽입합니다. 다시 말하지만, 이는 생쥐의 두개골이 매우 얇기 때문에 가능합니다.Z 좌표를 설정하고 바늘을 초당 1 mm의 속도로 -3.0 mm까지 내립니다. 뇌 조직이 바늘 주위로 밀폐될 때까지 2~3분 동안 기다립니다. antisense oligonucleotide 10 µL 전체를 초당 1 µL의 속도로 투여합니다.2~3분 동안 기다립니다. 올리고뉴클레오타이드를 뇌실에 주입할 때는 초당 1 µL의 주입 속도를 사용합니다. 이 속도는 약물마다 다를 수 있으나, 바늘 하단부의 두개골 지점에 면봉을 대고 고정하십시오.초당 1 mm의 속도로 바늘을 들어 올립니다. 바늘이 두개골에서 빠져나오자마자 면봉으로 바늘 구멍을 굴리듯 누르며 1분 동안 유지하여 약물이 누출되지 않도록 합니다. 피부를 봉합하고 항생제 연고를 바른 후, 마우스를 가열 회복 패드 위에 놓습니다.올리고 농도에 따라 완전히 회복되기까지 20분에서 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 수술 후에는 매일 생쥐를 관찰하여 통증, 불편함 또는 감염 여부를 확인하고 필요에 따라 진통제를 투여하십시오. 이 이미지는 뇌실 투여를 위한 zet 삼투압 펌프 삽입 좌표를 테스트하기 위해 fast green 염료를 투여한 직후의 관류된 뇌를 보여줍니다.이 동영상에서 보여주듯이, 카테터가 뇌실에 성공적으로 삽입되면 여기에서 보는 것처럼 염료가 마우스 뇌실 시스템 전체로 퍼지게 됩니다. 이 이미지는 뇌실 내 볼루스 주입 좌표와 절차를 테스트하기 위해 fast green 염료를 투여한 직후 관류시킨 뇌의 모습입니다. 바늘이 뇌실에 성공적으로 삽입되었다면, 염료는 다시 마우스 뇌실 시스템 전체로 퍼지게 됩니다.다음 이미지들은 rat의 So D one을 감소시키기 위한 in vivo antisense oligonucleotide 실험 결과를 보여줍니다. So D one oligonucleotide를 정상 rat의 우측 외측 뇌실에 하루 100 micrograms씩 28일 동안 주입하였습니다. 이 이미지는 뇌와 척수에서 내인성 OD one mRNA 수준이 감소했음을 보여줍니다.Q-R-T-P-C-R로 측정한 OD one 올리고 주입 결과, 이 이미지는 SOD one 단백질 수준 또한 감소했음을 보여줍니다. 여기서 OD one 안티센스 올리고뉴클레오타이드 주입 후, 뇌의 서로 다른 영역에서 tubulin과 OD one의 단백질 수준을 정량화하여 so D one 올리고가 so D one 넉다운에 특이적임을 보여줍니다. 또한, presenilin one 또는 GSK three beta에 대한 올리고를 비형질전환 마우스의 우측 외측 뇌실에 2주 동안 주입하고 mRNA 수준을 평가하였습니다.이 결과는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 조절할 수 있는 광범위한 표적들을 보여줍니다. 이러한 기술들을 숙달하면, 펌프 및 플랜테이션 방식과 일시 주사 방식 모두 적절히 수행될 경우 10분 이내에 완료할 수 있습니다.

direct-intraventricular-delivery-drugs-to-rodent-central-nervous

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

중추 신경계의 행동 약물의 철저한 잠복기 테스트는 종종 평가 및 관리의 구체적인 노선과 공동으로 마약 biodistribution을 비교를 포함합니다. 여기 세 일반적으로 사용되는 체계 배달 방법 (정맥 intraperitoneal, 그리고 구두)뿐만 아니라 로컬 배달하는 방법 (대류 향상된 전송)은 생쥐에서 증명하고 있습니다.

쥐 모델에서 중추 신경계의 질병 치료를위한 체계와 지역 마약 배달

신생아 생쥐의 중추 신경계에 치료 요원들을 소개하는 뇌 (intracerebroventricular)와 (정맥 주사) 2) 체계로 : 1)이 문서 분사의 두 가지 방법을 보여줍니다.

마우스에 Intracerebroventricular을 통해 치료 대리점 납품 (ICV)과 정맥 (IV) 사출

출처: Poland, R. et al. 동기 부여된 행동의 분자 기질을 연구하기 위한 설치류 뇌 미세 주사. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오에서는 주사기와 마이크로인젝터 튜브로 구성된 물로 채워진 미세 주입 설정이 정확한 약물 전달을 위해 사용됩니다. 사전 이식된 가이드 캐뉼라가 있는 쥐는 표적 뇌 미세 주사를 받아 조직 손상을 최소화하면서 깨어 있는 동물에게 치료제를 정확하게 투여할 수 있습니다.

깨어 있는 설치류 뇌에 치료제의 미세 주입 기반 전달

이 비디오는 마우스 모델에서 옴마야 매개 뇌실 내 주사를 보여줍니다. 이 방법은 잠재적인 약물 후보의 국소 전달을 가능하게 하고 혈액-뇌 장벽을 회피합니다.

쥐의 Intracerebroventricular Injection: 마우스 뇌의 뇌실에 약물을 전달하기 위한 Ommaya 매개 직접 약물 투여 방법

출처: Chen, Y., et al. 쥐 중추신경계에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 척수강내 전달. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 쥐 모델의 요추 척추에 이식된 카테터를 통해 테스트 화합물을 뇌척수액(CSF)으로 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 화합물은 CSF를 따라 뇌와 척수로 순환하고 뉴런으로 들어가 치료 가능성을 제공합니다.

쥐 중추신경계에 대한 테스트 화합물의 척수강내 전달

소아 질환의 동물 모델은 초기 발병과 적극적인 질병의 진행을 경험할 수 있습니다. 임상 어린 마우스 모델에 관련된 치료 전달 기술적 어려울 수있다. 이 프로토콜은 생후 두 생후 일 이내 신생 쥐 비 침습적 정맥 주입 방법을 설명한다.

신생아 마우스의 정맥 주사

여기서, 우리는 척추의 요추 내 공간에 카테터를 이식하여 쥐 중추 신경계에 약물을 전달하는 방법을 설명합니다. 우리는 안티 센스 올리고 뉴클레오티드의 전달에 초점을 맞추고, 이 방법은 뿐만 아니라 다른 치료 양식의 전달에 적합 하지만.

쥐 중추 신경계에서 안티 센스 올리고 뉴클레오티드의 내 전달

신경 줄기 세포를 전달하는 방법, 용액 또는 현탁액을 주입하기 위한 적응성, 일반적인 경동맥을 통해 (마우스) 또는 외부 경동맥 (쥐) 허혈성 뇌졸중 후보고된다. 주입된 세포는 뇌 의 자당종 전체에 광범위하게 분포되며 전달 후 최대 30d까지 검출될 수 있다.

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

여기에서, 자유형 접근법(즉, 입체적 장치 없이)을 사용하여 마우스에서 뇌내주사를 수행하기 위한 간단하고 신속한 접근법이 설명된다.

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

우리는 쥐에서 직접 미주신경 주사를 위한 프로토콜을 제시하여 주사 후 합병증 없이 신경으로 직접 약물을 전달할 수 있도록 합니다. 이 방법은 자율신경계 조작과 관련된 전임상 신경학적 연구에 적용됩니다. 필요한 수정을 통해 쥐 및 다른 종의 다른 신경에 대한 직접 신경 주입에 사용할 수 있습니다.

쥐를 위한 직접 미주신경 주사 프로토콜

배우세요 설치류 중추 신경계에 약물을 직접 심실 배달하는 방법을. 카테터 삽입과 단일 주사 기법을 활용하여 항센스 올리고뉴클레오타이드를 효과적으로 전달하고 뇌 영역에서 mRNA 및 단백질 수준을 분석합니다.

설치류 중추 신경계에 약물을 직접 심실 배달

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