압력 Myography를 사용 쥐과 저항 동맥의 기능을 평가

다음 실험의 전반적인 목표는 거의 생리적인 조건의 in vitro 환경에서 마우스 저항 동맥의 실시간 혈관 반응성을 측정하는 것입니다. 이는 혈관의 작은 분절을 두 개의 마이크로 캐뉼라에 고정하고 생리적 내강 압력을 유지함으로써 이루어집니다. 그 후, 알파 1 수용체 작용제인 phenylephrine으로 혈관을 수축시켜, 특정 약물이 혈관을 확장시키는 능력을 연구합니다.

수축된 혈관에 acetylcholine을 처리하여 내피 세포 의존적 기전을 통한 실시간 확장 능력을 평가합니다. 결과는 acetylcholine에 반응한 내강 직경의 백분율 변화를 나타내며, SGC alpha one 결핍이 내피 세포 의존적 혈관 확장의 손상을 초래함을 입증합니다. wire manometry와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, pressure manometry를 통해 혈압 항상성 유지에 더 중요한 역할을 하는 소형 미세 혈관의 특성을 분석할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 거대 저항 혈관이 중요한 역할을 하는 고혈압과 같이 심혈관 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 펜토바르비탈로 마우스를 안락사시키는 것으로 시작하십시오. 이제 복강을 열고 장간막 조직의 박리를 시작하십시오.

이제 3차 장간막 동맥을 찾아 결합 조직 및 지방 조직으로부터 분리하십시오. 미세혈관 수준에서는 혈관 내에 혈액이 없을 때 동맥과 정맥을 구분하는 것이 어렵습니다. 따라서 온전한 상태의 동물에서 이 작업을 수행하는 것이 바람직합니다.

다음으로, 2~3 mm 길이의 3차 장간막 동맥 분절을 절단하여 HEPES PSS 완충액이 담긴 디쉬에 넣습니다. 이때 동맥 분절에는 분지점이 없어야 합니다.

10 mL 주사기를 사용하여 유입 및 유출 밸브를 통해 캐뉼라를 HEPES PSS 용액으로 조심스럽게 채워 myo chamber를 준비하십시오. 이때 과도한 압력이 가해지면 캐뉼라에 연결된 취약한 트랜스듀서가 손상될 수 있으므로 주의하시기 바랍니다. 캐뉼라를 가득 채운 후 두 밸브를 모두 닫으십시오. 이제 분리된 동맥 분절을 챔버로 옮기고 혈관의 한쪽 끝을 오른쪽 캐뉼라에 고정하십시오.

주사기 플러시를 사용하여 미세한 나일론 봉합사로 조심스럽게 묶은 다음, 유입 밸브를 통해 혈관에 HEP solution을 채웁니다. 이제 혈관의 반대쪽 끝을 왼쪽 캐뉼라에 장착하고 나일론 봉합사로 캐뉼라를 혈관에 고정합니다. 챔버에 HEP solution을 최대 10 milliliters까지 채웁니다.

주사기를 사용하여 유입 밸브를 통해 힙 용액을 천천히 밀어 넣어 누출 여부를 확인하십시오. 이제 챔버를 비디오 카메라 아래에 배치하십시오. 유입 밸브를 닫은 상태에서 산소를 공급하고 챔버를 37 °C로 가열하며, 이때 밸브는 첫 번째 힙 용액 저장조에서 나오는 P one 튜브에 연결되어 있어야 합니다.

튜브에 기포가 더 이상 없을 때까지 기포와 용액이 튜브를 통해 흐르게 하십시오. 그런 다음 밸브를 엽니다. 튜브 P two를 사용하여 챔버의 왼쪽 밸브에 연결하십시오.

압력 조절기에서 시작하여 전체 시스템에 기포나 누출이 없는지 확인하십시오. myo 인터페이스 패널 또는 소프트웨어의 압력 메뉴로 이동하여 유량을 끈 상태에서 펌프를 켜십시오. 프로그램을 열고 collect를 클릭하십시오.

이제 혈관 내강의 직경과 벽 두께의 모니터링 및 분석이 가능합니다. 내강압을 점진적으로 높이려면 P1 압력을 선택하고 상승 압력 시퀀스를 입력하십시오. 5에서 60 mmHg 사이의 값에서 압력이 증가함에 따라 혈관이 때때로 뒤틀리거나 굴곡질 수 있으므로, 수직 또는 종방향 마이크로 포지셔너를 사용하여 장력이나 변형을 적절히 조정하십시오.

압력이 60 millimeters가 되고 배스(bath) 온도가 37 °C가 되면, 평형화 기간 동안 혈관 용기를 최소 45분에서 최대 1시간 동안 평형화합니다. 예열된 용액으로 배스 용액을 한 번 교체합니다. 동맥 절편의 평형화가 완료되면, 37 °C의 KCl 탈분극 용액 10 milliliters를 처리합니다.

평활근이 완전히 탈분극되어 최대 수축에 도달하게 됩니다. 안정적인 수축 상태가 되면, 10분 간격으로 3회 HEP solution으로 배스를 헹굽니다. 이제 혈관의 생존능과 내피세포의 온전성을 확인하십시오.

먼저, phenylephrine을 10⁻⁵ M 농도가 되도록 첨가하여 혈관을 사전 수축시킵니다. 안정적인 수축이 이루어지면, acetylcholine을 10⁻⁹ M에서 10⁻⁵ M까지 순차적으로 증량 투여하여 누적 농도 혈관 확장 반응 곡선을 작성합니다. 마지막 acetylcholine 투여 후, HEPES 용액으로 10분 간격으로 3회 세척합니다.

이제 기록된 트레이싱에서 리터당 2 millimoles의 EGTA가 포함된 칼슘 제거 PSS를 적용하여 수동 루멘 직경을 결정합니다. 각 용량 반응에 따른 루멘 직경을 측정하며, 이는 모든 파라미터를 계산하는 데 사용됩니다. 아세틸콜린 이완 반응은 작용제 처리군과 칼슘 제거 버퍼 처리군이 페닐에프린으로 유도된 수축 상태의 루멘 직경을 각각 얼마나 변화시켰는지 비교하여 나타냅니다.

S6 및 Black6 배경의 야생형 및 SGC alpha one 녹아웃 마우스에서 분리하여 phenylephrine으로 사전 수축시킨 장간막 저항 동맥의 acetylcholine에 대한 혈관 이완 반응을 연구하기 위해 정압 마이오그래피(State pressure Myography)를 사용하였습니다. SGC alpha one 결핍은 연구된 마우스의 유전적 배경과 관계없이 acetylcholine의 혈관 이완 유도 능력을 감소시키는 것과 관련이 있었습니다. 그러나 SGC Alpha one null 마우스의 내피 세포 의존성 이완은 Black6 배경보다 S6 배경에서 더 현저하게 손상되었습니다.

종합적으로 이러한 결과들은 혈관 내피 세포 의존성 이완에 대한 혈관의 민감도 감소가 SGC Alpha one 결핍 생쥐의 변형 특이적 고혈압의 원인이 될 수 있음을 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 1~2시간 내에 완료할 수 있습니다. 본 절차 외에도, 살아있는 혈관에 대해 공초점 현미경과 같은 다른 방법을 동시에 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 이를 통해 세포 내 철 농도를 측정함으로써 기저에 있는 신호 전달 메커니즘을 규명하는 데 도움을 얻을 수 있습니다.