Name: 인간의 피부 생검에서 통각 Intraepidermal 신경 섬유의 3 차원 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 학습하세요 인간 피부 생검에서 통각 표피내 신경섬유의 3차원 형태학적 변화를 면역조직화학법과 공초점 현미경으로 분석하는 방법입니다. 이 기술은 통각성 신경병증 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 건강 보조금 국립 연구소에 의해 지원되었다 K08 NS061039-01A2, 신경 연구 및 발견, 미시간 대학의 A. 알프레드 터 브먼 의학 연구소의 프로그램입니다. 이 작품은 형태와 당뇨병과 소화기 및 신장 질환의 국립 연구소의 건강 그랜트 5P90 DK-20572 국립 연구소에 의해 자금 미시간 당뇨병 연구 및 교육 센터의 이미지 분석 코어를 사용했습니다. 저자는 통각 바이오 마커 면역 기술의 초기 개발을 지원하기 위해 인간의 피부 샘플을 자신의 관대 한 기부에 대한 로빈슨 싱글과 고든 스미스 (유타 대학) 감사드립니다.

부품 번호 : 면역 배경 염색 펀치 피부 생검의 96 - 웰 플레이트 및 예방의 준비는 인간의 과목에서 수집 및 정착액 솔루션에서 12-24 시간 (2 % 0.75 M L-라이신 솔루션 (산도 7.4)와 파라 포름 알데히드와 0.05 mM의 나트륨과 요오드)에 대한 배양하는 4 ° C에서 앞에서 8을 설명했다. 샘플은 다음 다음 설치 미디어를 최적의 절삭 온도 (월), 그라 이오 스탯에 50 μm의 두께 섹션으로 절편에 포함, 최대 1 주일에 대해 4에 20 % 글리세롤 ° C와 생리 식염수 (PBS)를 버퍼 인산염 동결 방지합니다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 하나의 96 - 웰 플레이트에서 자유 부동 면역을 받아야 피부 섹션의 최대 수를 가능한 8 피부 섹션을 위해 설계되었습니다. DAY 1 : 1. 각질층의 비 특정 면역 반응성의 예방 <ol><li> 라벨 96 - 웰 플레이트 그림 1과 같이. </lI&gt; <li> 이미지-IT 96 - 웰 플레이트의 행 1에 각 우물에 배경 염색 11,12을 차단하는 효과 FX 신호 (이미지-IT)의 150 μl를 추가합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트의 행 2와 3의 각 우물에 1X PBS 150 μl를 추가합니다. </li><li> 환자 당 두 개의 50 μm의 섹션을 획득 : DL에서 찍은 생검에서 한 섹션 PT에서 찍은 생검의 한 부분입니다. 접종 루프 (LeLoop)는 형태 학적 손상을 방지하기 위해 다음에 린스 하나에서 섹션을 전송하는 데 사용됩니다. 부드럽게 이미지-IT를 포함,뿐만 행 1의 개인으로, 접종 루프를 사용하여 각 50 μm의 섹션을 전송할 수 있습니다. 플랫 로커에 RT에서 30 분 동안 이미지-IT의 섹션을 품어. </li><li> RT에서 10 분 1X PBS (행 2와 3)로 두 번 절을 씻어. 세정과 플랫 로커에 잘 플레이트를 놓습니다. </li></ol> 2. 5 % BSA 차단 솔루션 1 % 세정 용액의 조제 <ol><li> 생검 섹션 이미지-IT에서 배양하는 동안 솔루션을 차단 5 %를 준비TION (5 % BSA가 완전히 용해 될 때까지 BSA, 0.3 % TX-100, 0.1 M PBS-소용돌이 솔루션). </li><li> 4 행의 각 우물에 5 % BSA 차단 솔루션 150 μl를 추가합니다. </li><li> 접종 루프를 사용하여 5 % BSA 차단 솔루션의 각 우물에 섹션을 전송합니다. 플랫 로커에 1-2 RT의 시간 동안 5 % BSA 차단 솔루션 섹션을 품어. </li></ol> 3. 차 항체의 1 % BSA 세정 용액과 희석의 준비 <ol><li> 섹션 5 % BSA 차단 솔루션 배양하는 동안, 1 % 세정 용액 (1 % BSA, 0.3 % TX-100, 0.1 M PBS-소용돌이 솔루션을 BSA가 완전히 용해 될 때까지) 준비합니다. </li><li> 섹션 5 % BSA 차단 솔루션 배양하는 동안, 1 %는 헹굼 용액에 기본 항체를 희석. <ol><li> 여덟 절 (8 × 150 μL가 = 1,200 μL) 1,200 μL의 총이 필요합니다. 차 항체는 1,500 μL (20 % 추가 볼륨에 대한)에 만들어집니다. </li><li> 차 항체의 희석 : PGP, 1:500, TRK,1:500 1 %의 BSA는 솔루션을 세척. </li></ol></li></ol> 4. 일차 항체의 단면 생검의 배양 <ol><li> 96 - 웰 플레이트의 지정 우물 (5 행)로 희석 일차 항체 150 μl를 추가합니다. </li><li> 지정된 일차 항체 우물 (5 행)에 5 % 차단 용액 (4 행)에서 섹션을 전송합니다. </li><li> 건조 및 빛의 노출되지 않도록 파라 필름 (parafilm) 및 알루미늄 호일로 96 - 웰 플레이트를 밀봉하십시오. </li><li> 플랫 로커에 96 - 웰 플레이트 4에서 O / N ° C를 품어. </li></ol> DAY 2 : 5. 1 % BSA 세정 용액에 생검을 씻어 <ol><li> 각 행 6도, 7, 8에 1 % BSA 세정 용액 150 μl를 추가합니다. </li><li> RT에서 1 시간마다 1 %의 BSA 세정 용액 (행 6, 7, 8)에 절을 세 번 씻어. 세정과 플랫 로커에 알루미늄 호일과 장소에 잘 플레이트를 커버. </li></ol> 6. 차 항체의 희석 &lt;OL&gt; <li> 섹션 (행 8) 1 % BSA 세정 용액의 마지막 헹굼 배양하는 동안, 1 % BSA 세정 용액에 이차 항체를 희석 : <ol><li> 여덟 절 (8 × 150 μL가 = 1,200 μL) 1,200 μL의 총이 필요합니다. 이차 항체는 1,500 μL (20 % 추가 볼륨에 대한)에 만들어집니다. </li><li> 차 항체의 희석 : 1 % BSA 세정 용액의 TRK (알렉사 플 루어 647 당나귀 방지 염소, 1:250)에 대한 PGP (알렉사 플 루어 488 당나귀 안티 - 토끼, 1:250)에 대한. </li></ol></li></ol> 7. 이차 항체의 단면 생검의 배양 <ol><li> 96 - 웰 플레이트 자신의 지정된 우물 (행 9)에 희석 차 항체 150 μl를 추가합니다. </li><li> 잘 이차 항체에 1 % BSA 차단 용액 (행 8) (9 행)에서 섹션을 전송합니다. </li><li> 건조 및 빛의 노출되지 않도록 파라 필름 (parafilm) 및 알루미늄 호일로 96 - 웰 플레이트를 밀봉하십시오. </li><li> 지정된 이차 항체 O의 섹션을 품어4시 / N ° 플랫 로커에 C. </li></ol> 8. 1 % BSA 세정 용액에 생검을 씻어 <ol><li> 행 10, 11, 12의 각도에 1 % BSA 세정 용액 150 μl를 추가합니다. </li><li> RT에서 1 시간마다 1 %의 BSA 세정 용액 (행 10, 11, 12)에 절을 세 번 씻어. 세정과 플랫 로커에 알루미늄 호일과 장소에 잘 플레이트를 커버. </li></ol> 9. 현미경 슬라이드 및 설치 단면 생검의 준비 <ol><li> 생검 섹션 1 % BSA 세정 용액 (행 12)의 마지막 헹굼에 배양하는 동안, 현미경 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 한 번에 하나의 슬라이드에 1 % BSA 세정 용액 50 μl를 놓습니다. </li><li> 1 % BSA 세정 용액 (행 12)에서 섹션을 제거하고, 지정된 현미경 슬라이드에 1 % BSA 세정 용액의 50 μL 드롭 놓습니다. 섹션의 위치를​​ 최적화 한 후, 예방 조치, bulbed 유리 피펫과 초과 1 % BSA 세정 용액을 제거시료에 닿지 않도록한다. </li></ol> 참고 : 섹션에 접혀 있지 않은지 확인하십시오, 표본 현미경 슬라이드의 표면에 평평해야합니다. <ol start="4"><li> 장소 1 하락 현미경 슬라이드에 조직 검사 가까운 DAPI와 시약을 장착 골드 antifade을 연장. 22x22 mm 현미경 유리 coverslip을을 부드럽게 생검에 배치하고의 드롭 DAPI의 드롭 골드 antifade 시약을 연장. 각 섹션에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 어둠 속에서 RT에서 O / N 현미경 슬라이드를 건조 시키십시오. </li></ol> 참고 : 피펫 팁을 사용하여 공기 방울을 제거합니다. 골드 antifade 시약을 연장 멀리 초과 닦아냅니다. 파트 B : 공 촛점 이미징 10. 공 촛점 이미징 <ol><li> 40X 기름 침지 (1.3 NA) 목적 및 FluoView 버전 5.0 소프트웨어와 함께 줌 두 번에 촛점 현미경 스캐닝 올림푸스 FluoView 500 레이저를 사용하여 이미지를 형광 신호. </리&gt; <li> 각각 543 nm의 헬륨 네온 녹색 레이저 633 nm의 헬륨 네온 레드 레이저를 자극하는 알렉사 플 루어 488와 알렉사 플 루어 647을 사용합니다. 알렉사 플 루어 488 신호가 빨간색 LUT에 의해 테이블​​ 위로 녹색보기 (LUT)와 알렉사 플 루어 647으로 표시됩니다. </li><li> 신호를 강화하기 위하여 400 μM에서 각각의 검출기 공 촛점 조리개를 설정합니다. 순차적 검사는 신호 분리를 극대화하기 위해 1,024 X 1,024 해상도로 촬영해야합니다. </li><li> 칼만 평균화 (두 프레임)와 1.2 μm의 Z-스텝 간격 (FluoView 소프트웨어에 의해 계산 된 최적의 스캔 장치에 따라)를 사용하여 입체 Z 시리즈를 캡처합니다. </li></ol> 파트 C : 입체 시각화 및 애니메이션 11. 세 가지 차원 (3D) 시각화 및 애니메이션 <ol><li> Imaris 64 소프트웨어에서 오픈 Fluoview 파일 (버전 7.3, 비트 플레인 AG) 3D 이미지 세트를 시각화합니다. </li><li> 조정으로 신경 특정 신호의 선명도를 향상시킬 필요가 표시됩니다. </li><li> SU를 생성피부 표피 경계를 시각화 할 수 rface. 경계를 그리려면 그리기 모드에서 윤곽 도구를 사용합니다. </li><li> 기본 형광 신호를 확인하기 위해 경계 반투명 표면을 할당합니다. </li><li> 3D 영화의 스냅 샷 이미지를 생성하는 3D 형광 신호의 정지 이미지를 캡처합니다. </li><li> 3D 영화를 만들기 위해 애니메이션 기능을 사용합니다. 이미지는 (그림 2, 3, 4) 개별적으로 병합 된 각 신호를 표시하는 360도 여러 번 회전 할 수 있습니다. 초당 15 프레임의 애니메이션을 200 프레임으로 구성된 영화를 만들려면 애니메이션을 설정합니다. 원시 AVI 파일로 각각의 동영상을 저장할 수 있습니다. </li><li> VirtualDub 프로그램 소프트웨어 (버전 1.9.4)를 사용하여 최종 AVI 동영상을 압축합니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다 수 있습니다.

IENFD의 측정은 널리 말초 신경 병증 13,14의 정도를 결정하는 데 사용되었다. 현재 가장 일반적으로 사용되는 프로토콜은 표피의 기저막을 통과 신경 섬유의 밀도를 측정, 그것은 고려 축삭 분기 및 / 또는 신경의 형태 학적 변화를 고려하지 않습니다. 또한, 현재 IENFD 분석 PN 15 고통의 존재와 IENFD 상관 관계를 보여되지 않았습니다. 우리는 이전에 통각 IENFD의 증가 숫자는 DB / DB 생쥐의 통증 행동, 제 2 형 당뇨병 5의 마우스 모델과 연관되어 있다고보고했다. 해당 보고서에서는 먼저 통각 IENF을 연구하는 이중 면역 형광 프로토콜을 적용했다. 현재의 연구에서는, 우리는 PN 환자에서 인간의 피부에 우리의 프로토콜을 확장합니다. 이중 면역 형광 분석 중재 IENFs의 집합 총 IENF 및 통각 IENF 모두 측정을 제공합니다고통. 이러한 통각 IENF는 TRK 및 기타 통각 신경 펩타이드...

현재, 작은 섬유 신경 병증 3, 6-8를 진단하는 데 사용할 수있는 피부 펀치 생검에서 intraepidermal 신경 섬유 밀도 (IENFD)을 정량화하는 의사에 대한 일반적인 방법입니다. 생검은 말초 다리 (DL), 외측 복사뼈 위 10cm, 그리고 근위부 허벅지 (PT), 전방 장골 척추 9 아래 20cm에서 가져옵니다. 모든 IENF는 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP), 팬의 연결 마커 10-12을 사용하여 레이블이 표시됩니다. 현재, 그것은 표준 사용하여 작은 섬유 신경 병증을 진단하는 방법 브라이트 현미경 6 PGP 염색에 의해 결정 IENFD.입니다 또한 여러 연구 그룹은 PGP 면역 7-9에 대한 면역 형광 프로토콜을 사용했습니다. 작은 섬유 신경 병증은 일반적으로 신경 병증 성 통증과 연관됩니다. 또한 통증 처리를위한 필수 IENF의 역할을 이해하기 위해, 우리는 고통을 생성 섬유와 공동 레이블을 총 IENF하는 기술을 개발했다. Nocicep특히 Aδ TIVE IENF 및 C 섬유는, PGP와 IENF의 공동 레이블과 통각 마커, 트로포 마이 오신 수용체 키나제 A (TRK) 5를 통해 공부하실 수 있습니다. TRK A는 통각의 발전을 위해 필수적인 신경 성장 인자에 대한 높은 친화력 수용체이다. TRK 긍정적 인 통각 신경 섬유는 peptidergic 섬유 것을 표현 물질 P (SP) 및 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 (CGRP). 이전 로리아와 동료 PN, 10 통각 마커와 협력 라벨 PGP 양성 IENF를 연구하는 두 배 레테르를 붙이는 기술을 적용했다. 우리의 이전 연구에서, 우리는 TRK 양성 IENF하지만 TRK-음 IENF는 고통스러운 당뇨병 성 신경 병증 5의 동물 모델에서 발현이되었다는 것을 보여 주었다. 이 공동 라벨링 기술은 IENFD 및 PN과 관련된 형태 학적 변화를 연구 할 수있는 능력을 합계하는 통각 IENFD의 ​​정량을 비교하는 기능을 제공합니다. 통각 IENF 및 안돼요을 시각화 할 수있는 능력통각 IENFD에 총 IENFD의 ​​재 정량화 PN과 관련된 통증의 정도에 목표 고통의 존재에 대한 증거, 그리고 아마도 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 기술은 또한 동물 모델의 피부에 적용됩니다. 이전의 연구에 비해, 현재의 프로토콜은 2D 이미지 분석에서 발생할 수있는 오류를 방지 할 수있는 기회를 만들고, 3D 이미지 분석을위한 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td>1X PBS</td></tr><tr><td>Image-IT FX 신호</td><td>Invitrogen</td><td>I36933</td><td>Image-IT</td></tr><tr><td>단백질 유전자 제품 9.5 (다클론 토끼)</td><td>AbD Serotec</td><td>7863-0504</td><td>PGP</td></tr><tr><td>Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)</td><td>R& D 시스템</td><td>AF1056</td><td>Trk A</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 &알파;-토끼</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>AF488 당나귀 &알파;-염소</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 당나귀 &알파;-염소</td><td>Invitrogen</td><td>A21447</td><td>AF647 당나귀 &알파;-염소</td></tr><tr><td>알부민, 소 혈청</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7906-100</td><td>BSA</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T9284</td><td>TX-100</td></tr> 시리즈<tr><td>보정되지 않은 루프</td><td>LeLoop</td><td>MP 199025</td><td>접종 루프</td></tr><tr><td>96웰 분석 플레이트</td><td>Corning Incorporated</td><td>3603</td><td>웰 플레이트</td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리 22x22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td>Coverslips</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher 과학적인</td><td>12-550-15</td><td>현미경 슬라이드</td></tr><tr><td>올림푸스 플루오뷰 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>올림푸스</td><td>FV500</td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>최적 절단 온도</td><td>사쿠라</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>라이카 저온 유지 장치</td><td>라이카</td><td>CM1850</td><td>저온 유지 장치</td></tr></tbody></table>

인간의 피부 생검에서 통각 intraepidermal 신경 섬유의 3 차원 영상

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

피부 펀치 생검은 일반적으로 말초 신경 병증 1,2의 진단 intraepidermal 신경 섬유 밀도 (IENFD)을 정량화하는 데 사용됩니다. 현재, 그것은 말초 다리 (DL) 및 길이에 따라 polyneuropathies 3의 평가를위한 근위 허벅지 (PT)에서 3mm 피부 생검을 수집하는 것이 일반적 관행이다. 그러나 IENFs의 다각적 인 특성으로 인해, 2 차원 (2D) 영상의 분석을 통해 신경 구조를 중복 검사하는 도전이다. 또한, 입체 (3D) 영상이 딜레마에 대한 더 나은 솔루션을 제공 할 수 있습니다. 현재 보고서에서, 우리는 고통스러운 신경 병증 (PN)을 연구하는 3D 이미지를 적용하는 방법을 제시한다. IENFs를 확인하기 위해 피부 샘플은 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP), 팬 신경 세포 마커의 면역 형광 분석을 위해 처리됩니다. 현재, 그것은 IENFD을 억제하여 작은 섬유 신경 병증을 진단하는 표준 방법입니다브라이트 현미경 4를 사용하여 PGP의 면역 조직 화학 염색에 의해 채굴. 현재의 연구에서는, 우리는 PGP를 사용하여 총 IENFD를 식별하기 위해 이중 면역 형광 분석을 적용하고, 통각 IENF, 신경 성장 인자 5 (TRK), 높은 친화력 수용체 트로포 마이 오신 수용체 키나제 인식 항체의 사용을 통해. PGP와 TRK 항체 공동 염색 IENF의 장점은 명확 PGP 양성, 통각 섬유를 염색 PN의 연구를 혜택을 제공합니다. 이 형광 신호는 PN과 관련된 IENF의 통각 IENFD 형태 학적 변화를 확인하기 위해 정량화 할 수있다. 형광 이미지는 공 촛점 현미경에 의해 인수 및 3D 분석을 위해 처리됩니다. 3 차원 영상은 더 PN과 관련된 형태 학적 변화를 분석하는 회전 능력을 제공합니다. 함께 촬영, 형광 공동 염색, 공 촛점 이미징 및 3D 분석은 명확 PN​​의 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다.

우리는 PN 환자에서 PT와 DL 피부 생검에서 IENF의 형태를 연구하는 현재의 프로토콜을 적용했다. 피부는 3 과목에서 PN과 관련된 pathomorphology을 보여 유타 대학에서 수집되었다. 주제는 다음과 같습니다 : 사례 1 : 제 2 형 당뇨병 (: 15 달; 통증 점수 : 지속 시간 51)의 PN의 역사를 가진 51 세 남자 사례 2 : PN의 역사를 가진 56 세 남성 및 사례 3 : 제 2 형 당뇨병 (: 42 달; 통증 점수 : 지속 시간 46)의 PN의 역사를 가진 66 세 남자, 2 형 당뇨병 (:; 47 통증 점수 1백8개월 기간)의. 정량적 감각 검사와 신경 전도 연구 등의 신경 학적 역사와 검사는 말초 신경 병증을 평가하기 위해 수행되었다. 통증 점수는 0-100 시각 아날로그 통증 척도에 따라 결정되었다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 인간의 피부에 IENFs (그림 2)의 3 차원 구조를 연구 할 수 있습니다. ...

고통스러운 신경 병증 (PN)의 통각 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs)의 변화를 연구하기 위해, 우리는 직접 통각 IENFs에서 관찰 입체 형태 변화를 검사 할 수 프로토콜을 개발했다. IENFs의 3 차원 분석은 PN에 IENF의 형태 학적 변화를 평가하는 잠재력을 가지고있다.

인간의 피부 생검에서 통각 Intraepidermal 신경 섬유의 3 차원 영상

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

본 절차의 전반적인 목적은 인간 피부 생검 절편에 대해 면역조직화학 염색을 수행하여, 3차원 이미징을 통해 통증성 신경병증과 관련된 표피 내 신경 섬유의 형태학적 변화를 연구하는 것입니다. 이는 먼저 개별 인간 피부 생검 절편을 대상으로 3일간의 부유 절편 면역조직화학 프로토콜을 수행함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 공초점 현미경을 사용하여 50 µm 두께의 피부 절편을 이미징하는 것입니다.다음으로, MRS 소프트웨어를 사용하여 플로우 뷰 이미지 파일들을 처리함으로써 기존 면역형광 이미지의 3차원 동영상 파일을 생성합니다. 마지막 단계는 vdw 소프트웨어 또는 유사한 프로그램을 사용하여 동영상 파일을 압축하는 것입니다. 결과적으로, 3차원 이미징 결과는 통증성 신경병증과 관련된 형태학적 변화를 연구할 수 있는 기회를 제공합니다.현재 수술 중 표피 신경 섬유 밀도는 신경병증을 진단하기 위한 정량적 방법으로 사용됩니다. 이러한 진피 내 신경 섬유를 통각 수용체 바이오마커와 공동 표지하면, 이 합병증과 관련된 통증을 규명할 수 있는 가능성이 있습니다. 현재의 2차원 영상 프로토콜은 신경 섬유의 중첩을 포함하여 여러 가지 한계점이 있습니다.이와 대조적으로, 3차원 이미징은 축삭 팽창 및 백색화와 같은 신경병증과 관련된 형태학적 변화에 대한 추가 분석뿐만 아니라 축삭 부피 측정이 가능하게 합니다. 통증성 신경병증에 대한 통찰을 제공할 수 있는 유의미한 3차원 애니메이션을 제작하기 위해서는 고품질의 이미지를 얻기 위한 조치가 반드시 이루어져야 한다는 점에 유의해야 합니다. 또한, 이 방법은 두꺼운 장기 배양물이나 3차원 세포 배양물과 같은 다른 샘플에도 적용하여 3차원 형태의 복잡한 변화를 조사하고 측정하는 데 활용될 수 있습니다.본 프로토콜의 서면 부분에 설명된 대로 인간 피부 생검 조직을 고정하고 절편으로 만든 후, 이미지에 표시된 것과 같이 염색에 사용할 96 웰 플레이트에 라벨을 붙입니다. 그런 다음 라벨이 붙은 96 웰 플레이트의 첫 번째 행의 각 웰에 150 µL의 image ITFX signal을 넣고, 두 번째와 세 번째 행의 모든 웰에는 150 µL의 one XPBS를 피펫으로 분주합니다. 접종 루프를 사용하여 환자의 원위 다리 생검 조직에서 채취한 50 mm 절편을 image가 포함된 웰 중 하나로 옮깁니다.그 다음, 동일한 환자의 근위부에서 채취한 50 mm 섹션을 이미지가 포함된 다음 웰로 옮깁니다. 다른 세 명의 환자로부터 얻은 원위부 다리와 근위부 허벅지 섹션에 대해서도 이 절차를 반복합니다. 섹션들을 이미지 장치 내의 플랫 로커(flat rocker)에서 30분 동안 배양합니다. 생검 섹션이 배양되는 동안 이미지 장치에서 5% 차단 용액(blocking solution)을 준비하고, 30분이 경과할 때까지 BSA가 완전히 용해될 때까지 용액을 볼텍싱(vortex)합니다.절편들을 2행의 PBS로 옮기고 10분 동안 흔들어준 후, 3행의 PBS에서 10분 동안 헹굽니다. 다시 흔들어준 다음, 4행의 각 웰에 5% BSA 블로킹 용액 150 µL를 분주하고 절편들을 이 웰들로 옮깁니다. 평면 로커 위에서 실온으로 1~2시간 동안 절편들을 5% BSA 블로킹 용액에서 배양합니다. 배양하는 동안, BSA가 완전히 녹을 때까지 볼텍싱하여 1% 린싱 용액을 준비하고, 이 용액에 1차 항체를 필요한 농도로 희석합니다.그 다음 96-well 플레이트의 5행 well에 희석된 1차 항체 150 µL를 첨가합니다. 배양 시간이 지나면, 블로킹 용액에 있던 절편들을 해당 1차 항체 well로 옮깁니다. 다음으로, 건조와 빛 노출을 방지하기 위해 파라필름과 알루미늄 호일로 플레이트를 밀봉하고, 평평한 로커 위에서 4 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 6, 7, 8행의 각 well에 1% BSA 세척액 150 µL를 첨가하고, 상온에서 로킹하며 1시간 동안 절편들을 이 세척 과정에 통과시키되, 각 세척 단계마다 플레이트가 빛으로부터 보호되도록 합니다. 절편들이 마지막 1% BSA 세척액에서 배양되는 동안, 프로토콜의 서면 지침에 따라 2차 항체를 1% BSA 세척액에 희석합니다.배양 시간이 지나면, 96-웰 플레이트의 9행 지정된 웰에 희석된 2차 항체 150 µL를 첨가합니다. 절편들을 해당 웰로 옮기고 파라필름과 알루미늄 호일로 플레이트를 덮은 후, 평평한 로커(flat rocker) 위에서 4 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 10, 11, 12행의 각 웰에 1% BSA 세척액 150 µL를 첨가하고, 이전과 동일하게 각 절편을 이 용액에서 1시간 동안 세척합니다.생검 절편이 1% BSA 세척액의 마지막 헹굼 단계에서 배양되는 동안, 슬라이드 한 장당 1% BSA 세척액 50 µL를 피펫으로 분주하여 현미경 슬라이드를 준비합니다. 마지막 헹굼액에서 절편을 꺼내 지정된 현미경 슬라이드 위의 1% BSA 세척액 50 µL 방울 속에 놓습니다. 절편의 위치를 최적화한 후, 표본에 닿지 않도록 주의하며 벌브 글라스 피펫을 사용하여 과잉의 1% BSA 세척액을 제거합니다.현미경 슬라이드의 생검 조직 근처에 DPI가 포함된 Prolonged Gold anti-fade 마운팅 용액 한 방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음 22 by 22 millimeter 현미경 유리 커버슬립을 사용하여 생검 조직과 마운팅 용액 방울 위에 조심스럽게 덮습니다. 피펫 팁을 사용하여 기포를 제거하고 과도하게 도포된 Prolonged Gold를 닦아냅니다.Antifa 시약. 각 섹션에 대해 이 과정을 반복하고, 현미경 슬라이드를 암실 내 실온에서 하룻밤 동안 건조시킵니다. 공초점 현미경을 사용하여 형광 신호를 촬영하며, 여기서는 40 x 오일 침수 대물렌즈와 2배 줌이 장착된 Olympus flow view 500 레이저 스캐닝 공초점 현미경 및 flow view version 5.0 소프트웨어가 사용되었습니다.Alexa floor 4 88과 Alexa floor 6 47을 사용하여 각각 543 nm 헬륨-네온 녹색 레이저와 633 nm 헬륨-네온 적색 레이저를 여기시킵니다. 신호를 강화하기 위해 각 검출기의 공초점 조리개를 400 µm로 설정합니다. 순차적 스캔은 10 24 by 10 24 해상도로 수행해야 합니다.신호 분리도를 극대화하기 위해, MRSX 64 소프트웨어 또는 유사 소프트웨어에서 Kalman 2프레임 평균화(two frames averaging)를 통해 먼저 오픈된 flow view 파일들을 바탕으로 flow view 소프트웨어가 계산한 최적 스캔 단위를 기준으로 1.2 micron Z step 간격의 3차원 Z 시리즈를 캡처하십시오. 3D 이미지 세트를 시각화하려면 신경 특이적 신호의 대비를 높이도록 디스플레이를 적절히 조정하십시오. 진피-표피 경계(dermal epidermal boundary)를 시각화하기 위한 표면(surface)을 생성하십시오.그리기 모드에서 contour 도구를 사용하여 경계를 그립니다. 하단의 형광 신호를 확인하고 3D 형광 신호의 정지 영상을 캡처할 수 있도록 경계에 반투명 표면을 할당합니다. 3D 동영상의 스냅샷 이미지를 생성하려면, 애니메이션 기능을 사용하여 초당 15프레임으로 애니메이션화된 200프레임 구성의 3D movie set 애니메이션을 만들어 동영상을 생성하십시오.각 영상을 raw AVI 파일로 저장하고, VirtualDub 소프트웨어 또는 유사한 프로그램을 사용하여 최종 AVI 영상을 압축하십시오. 이 영상은 통각성 표피 내 신경 섬유의 3D 이미지를 보여줍니다. 첫 번째 이미지는 전체 표피 내 신경 섬유를 나타내는 녹색으로 표지된 PGP 양성 표피 내 신경 섬유와, 통각성 표피 내 신경 섬유를 나타내는 빨간색으로 표지된 track a 양성 표피 내 신경 섬유를 보여줍니다.마지막으로 사례 1의 피부 샘플에서 PGP 양성인 통각 수용성 표피 내 신경 섬유를 보여주는 이미지가 나타났으며, 스케일 바는 20 microns를 나타냅니다. 다음 영상은 통증성 신경병증의 표피 내 신경 섬유에서 나타나는 축삭 팽대(axonal swellings)의 3D 이미지를 보여줍니다. 피하 신경총 내에서 녹색 신호로 표시된 PGP 라벨링된 표피 내 신경 섬유를 따라 화살표 머리로 표시된 축삭 팽대를 확인할 수 있습니다.사례 2의 피부 샘플에서 스케일 바는 10 microns를 나타냅니다. 이 3D 이미지는 통증성 신경병증의 표피 내 신경 섬유에서 나타나는 축삭 분지를 보여줍니다. 사례 3의 피부 샘플에서 초록색 신호의 PGP로 표지된 표피 내 신경 섬유를 따라 화살표 머리로 표시된 축삭 분지를 확인할 수 있습니다.스케일 바는 20 microns를 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면, 면역조직화학 염색에 매일 3시간 30분씩 4일, 공초점 이미징 및 3D 애니메이션에 샘플당 35분이 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때, 검체 샘플이 찢어지거나 손상되지 않도록 주의하며 조직을 적절하게 옮기고 마운팅하는 것이 중요합니다. 이 절차를 마친 후, 피부 혁신 평가를 위한 3차원 tric 분석과 같은 다른 방법들을 통해 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.복부 신경 섬유의 분지(branching)가 통증성 신경병증의 발달에 중요한 역할을 하는가?

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

기술은 통증과 염증을 중재 biochemicals의 측정을위한 관련 조직 사이트 (여기서, 실험적으로 염증 피부)에서 중간 액체 샘플에서 - 생체내 수집 제공됩니다.

Nociceptive 및 염증성 중재자의 조직 특정 측정을위한 인간 - VIVO의 Bioassay

인간의 학습 과목의 실험적 염증 피부에 열 및 기계적 통증 임계값을 평가 알고리즘이 표시됩니다. 두 통증 테스트 패러다임이 독립적으로 통증을 전달하는 두 가지 주요 말초 신경 섬유 집단에 의해 nociceptive 처리를 검토, 즉 비 myelinated C 섬유와 작은 A - 델타 섬유를 myelinated.

열과 인간 주제에 염증이 피부에 기계적 통증 임계값 결정

말초 감각 신경 섬유 subtypes의 Immunocytochemical 식별 (과 그 안의 단백질의 표현 감지)는 주변 센세이션을 기본 분자 메커니즘을 이해하는 데 열쇠입니다. 여기 주변 감각 신경 섬유의 특정 immunostaining 위해 이러한 피부 및 사지 ​​뼈와 같은 주변 기기 / 내장 조직 샘플,의 준비를위한 방법을 설명합니다.

피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining

이 비디오는 쥐의 C 섬유 신경 전도에 대한 단일 섬유 기록을 보여줍니다. 마취된 쥐는 하지에 감각 및 운동 공급을 제공하는 좌골 신경을 노출시키기 위해 절개됩니다. 그런 다음 개별 C-섬유가 노출됩니다. 발에 이식된 자극 전극을 사용하여 전기 자극이 제공되며, 단일 신경 섬유에서 반응이 기록됩니다.

쥐에서 좌골 신경 C-섬유의 생체 내 단일 섬유 기록

출처: Hamid, H. S., et al. 인간 표피내 신경 섬유 내 미토콘드리아의 3차원 이미징 및 분석. J. Vis. Exp. (2017) 이 비디오는 3차원 이미징을 사용하여 신경 특이적 미토콘드리아를 시각화하는 방법을 보여줍니다. 사전 라벨링된 표피내 신경 섬유의 순차적 스캔을 획득하고 3D 표면 이미지를 생성하여 신경 구조와 관련된 미토콘드리아를 분리하고 표시하는 프로세스를 간략하게 설명합니다.

Intraepidermal Nerve Fibers 내 미토콘드리아의 시각화

동적 길이 이미징 및 기자 형질 전환 생쥐의 신경 종말의 선택적 레이저 병변에 대한 프로토콜은 제공됩니다.

피부의 단일 신경 종말의 생체 두 광자 현미경에서

이러한 모낭과 신경 엔딩으로 - - 공간 조직의 독특한 패턴을 전시 포유류의 피부 구조의 다양한 배열을 포함합니다. 플랫 마운트로 피부를 분석하는 것은 피부 구조의 전체 두께의 고해상도 이미지를 생성하기 위해이 조직의 2 차원 적 형상을 이용한다.

마우스의 피부와 모낭 패터닝 및 감각 축삭 형태학의 분석에의 응용의 평면 마운트 이미징

이 프로토콜을 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 3 차원 (3D) 영상 및 분석 기법을 사용 합니다. 기술 한 형광 신호를 다른 형광 신호에서 데이터의 하위 집합을 분리 하는 데 사용은 다른 상황에 적용 됩니다.

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

단일 섬유 기록은 중추 및 말초 신경계에 적용할 수 있는 효과적인 전기 생리학적 기술입니다. 부착 된 동골 신경과 함께 손상되지 않은 DRG의 준비와 함께 전도 실패의 메커니즘을 검사합니다. 두 프로토콜 모두 말초 신경계의 통증과의 관계에 대한 이해를 향상시킵니다.

전도 실패의 메커니즘을 검사하기 위해 연결된 Sciatic 신경을 가진 생체 내 단일 섬유 기록 및 손상되지 않은 등철 루트 신경절의 사용

조직 절편의 두께는 피부 신경과민의 형태학적 연구를 제한하였다. 본 프로토콜은 공초점 현미경 검사 하에서 두꺼운 300 μm 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 시각화하는 독특한 조직 제거 기술을 기술한다.

여러 형광 염색 및 조직 제거 접근법을 사용하여 3D 패턴으로 털이 많고 글래브러스 한 피부 신경을 보여줍니다.

본 연구는 생 체 내 2광자 영상 접근법을 통해 쥐의 앞발 피부에서 저역계 기계수용체(LTMR) 축삭 말단 구조를 시각화하는 방법을 제시합니다. 개별 축삭의 반복적이고 고해상도 영상을 사용하여 이 방법은 발달 과정과 성인에서 피부 감각 회로의 구조와 기능을 연구할 새로운 플랫폼을 제공합니다.

마우스 피부의 촉각 감각 축삭 형태의 생명체 내 2광자 영상

학습하세요 인간 피부 생검에서 통각 표피내 신경섬유의 3차원 형태학적 변화를 면역조직화학법과 공초점 현미경으로 분석하는 방법입니다. 이 기술은 통각성 신경병증 연구에 활용됩니다.

인간의 피부 생검에서 통각 Intraepidermal 신경 섬유의 3 차원 영상

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