Name: 체외 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 배우세요 인간 말초혈액에서 단핵구를 분리하고 대식세포로 분화시키는 방법을. 밀도 구배 원심분리와 음성 비드 분리를 통해 CD14 양성 세포를 얻고, 특정 조건에서 배양하여 다양한 극성화 유형을 유도합니다.

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우리는 우수한 기술 지원 나딘의 Wambsganss 감사합니다. 이 작품은 CAG에 혁신 기금 FRONTIER (하이델베르크 대학)에서 교부금에 의해 도이치 Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1)에서 부여 의해 부분적으로 지원되었다

1. 프로토콜 <ol><li> 다음과 같이 버퍼를 준비 <ol><li> PBMC 분리를위한 버퍼를 준비 &quot;버퍼를 씻으&quot;PBS에서 = 0.02 % EDTA (사용 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)).에게 </li><li> 단핵 세포 분리를위한 버퍼를 준비 &quot;MACS 세척 버퍼&quot;= 0.5 % BSA (250 MG) + 2 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (200 μL) + PBS (50 ML). 드가 버퍼입니다. </li><li> &quot;FACS 버퍼&quot;PBS의 = 10 % FCS와 &quot;고정 버퍼&quot;PBS에서 = 1 % PFA : 세포의 FACS 염색 및 저장을위한 버퍼를 준비합니다. </li></ol></li><li> 팔뚝 정맥에서 30 ML 전체 혈액을 그립니다. 항응고제로 EDTA를 사용합니다. </li><li> 다음과 PBMC (histopaque)를 분리 : <ol><li> 두 멸균 50 ML 튜브 (노 폴리 스티렌) 준비합니다. </li><li> PBS 1:1 2 단계에서 혈액을 희석. </li><li> + 25 ML 전체 혈액 / PBS 튜브 당 25 ML의 histopaque를 추가합니다. histopaque 혈액이 혼합하지 않도록주의하십시오. </li><li> RT, 아니 브레이크 30 분 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 플라즈마 및 폐기를 대기음. </li><li> 깨끗한 50 ML 욕조에 불투명 인터페이스와 피펫을 대기음전자. </li><li> PBS에 0.​​02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 20 ML을 추가합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 250 XG에 원심 분리기 </li><li> 상층 액을 버린다. </li><li> PBS에 0.​​02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 ML을 추가합니다. </li></ol></li><li> 다음과 같이 셀 수 : <ol><li> 10 초 동안 소용돌이로 교반하여 잘 섞는다. </li><li> 200 μl의 세포 현탁액 + 300 μL PBS에 0.​​02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) + 판 블루 (200-500 cells/10 사각형, 그렇지 않으면 희석 배수를 변경)의 500 μL를 가져 가라. </li></ol></li><li> 다음과 같이 단핵구의 음 분리를 수행합니다 : <ol><li> 10 분, 120 X g에 대해 12 단계 3.10에서 얻은 세포를 원심 분리기. 상층 액을 버린다. </li><li> 10 PBS의 ML + 0.02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 분, 120 X g 용 원심 분리기를 추가하여 세포 펠렛 배를 씻으십시오. </li><li> 1 ML 10X PBS를 추가, 3 초 동안 10 ML 멸균 물을 추가합니다. </li><li> PBS + 0.02 % EDTA로 한번 더 씻어 10 분, 120 X g을 원심 분리기. </li><li> 원심 분리하는 동안 계산합니다. </li><li> 5 × 10 7 / ㎖에서 EasySep 버퍼에 희석. </li><li> 50 ML / μL 단핵구 농축 수탉 추가꼬리. </li><li> 4에서 10 분 동안 품어 ° C. </li><li> 30 초 동안 소용돌이 구슬. </li><li> 50 μL / ㎖ 구슬을 추가합니다. </li><li> 4에서 5 분 품어 ° C. </li><li> 2.5 ML의 볼륨을 완료하기 EasySep 버퍼에 채운다. 이 솔루션은 지금 갈색 나타납니다. </li><li> 자석에 넣습니다. </li><li> RT에서 2.5 분을 기다립니다. 이 시간 동안 자기 비드에 결합 이외의 단핵 세포는 관 벽으로 이동하고 거기 찌를 것이다. </li><li> 신선한 멸균 튜브에 구속력 단핵 세포로 버퍼를 붓는다. 이 솔루션은 하얗게 보인다. </li><li> PBS + 0.02 % EDTA 한 번 씻어 10 분, 120 X g 원심 분리기. </li></ol></li><li> 0.5 × 10 6 / ㎠의 밀도에 플라스틱 접시 또는 다중 벽 플레이트 플레이트 세포. 문화 미디어 / 1 X 10 6 세포의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 6-14일에 대한 관심의 조건 하에서 배양 세포. </li><li> 새로운 미디어 (자세한 내용은 표 1 참조) 미디어의 50 %를 교체하여 3 일 후에 미디어를 변경합니다. </li><li>mRNA의 분리, 유동 세포 계측법, 웨스턴 블롯 등을위한 6 일 수확 세포 후. </li></ol>

<ol><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+plasticity+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes.</a> European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Ingersoll, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene+expression+profiles+between+human+and+mouse+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets.</a> Blood. 115, 10-19 (2010).</li>
<li>Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+aldose+reductase+during+foam+cell+formation+as+possible+link+among+diabetes%2C+hyperlipidemia%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).</li>
<li>Gleissner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCL4+downregulates+the+atheroprotective+hemoglobin+receptor+CD163+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages.</a> Circ. Res. , (2009).</li>
<li>Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXC+chemokine+ligand+4+induces+a+unique+transcriptome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages.</a> J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).</li>
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<li>Cho, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dendritic+cell-like+phenotype+in+macrophages+during+foam+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation.</a> Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).</li>
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<li>Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+low+density+lipoprotein+exposure+alters+the+transcriptional+response+of+macrophages+to+inflammatory+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).</li>
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<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Martín-Fuentes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+variation+of+scavenger+receptor+expression+in+human+macrophages+with+oxidized+low-density+lipoprotein+is+associated+with+a+differential+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response.</a> The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).</li>
</ol>

저자는 이익 상충을 공개 할 필요가 없습니다.

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 체계의 주요 세포 유형을 나타냅니다. 그들은 죽상 경화증이나 암 2을 (를) 포함하여 많은 염증성 질환에 중요한 역할을한다. 따라서, 대식 세포 생물학을 공부하는 많은 질병의 병태 생리에 대한 우리의 지식을 높이기 위해 필수적이며, 새로운 치료법의 개발을 허용 할 수 있습니다. 많은 연구는 마우스 모델의 과발현으로 적용하거나 관심의 특정 유전자를 결여. 단핵구 유래 대 식세포의 경우,이 쥐와 인간의 단핵구와 단핵구 유래 세포 4 사이에 상당한 차이가 있기 때문에 인간의 질병에 관련된 프로세스를 공부하는 가장 좋은 방법은 보이지 않습니다. 따라서 인간의 기본 셀을 사용하는 유효한 모델은 대식 세포 분화의 질병 관련 메커니즘을 연구 할 수있는 좋은 대안이 보인다. 여기에 제시된 체외 모델의 분명한 장점은 immortali에 의존하지 않는...

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포 구성 요소를 나타내는 많은 급성 또는 만성 염증 과정 1에 기여한다. 대식 세포는 동맥 경화증이나 암이 같은 여러 염증성 질환에 중요한 역할을한다. 대식 세포 가소성의 높은 수준을 보여주고 지역 micromilieu 3에 따라 서로 다른 표현형을 가정 할 수 있습니다. 따라서, 대식 세포의 분화와 이질성을 연구하는 많은 질병의 병태 생리에 대한 지식을 향상을 위해 필수적이며, 새로운 치료 표적과 새로운 치료법 개발의 식별을 허용 할 수 있습니다. 많은 경우에, 쥐 모델은 특정 질병의 병태 생리를 조사하는 데 사용됩니다. 그러나 마우스 모델을 사용하여 대식 세포 생물학을 공부하는 것은 몇 가지 단점이 수반된다 : (1) perip에서 백혈구 집합 숫자의 비율 (즉, 단핵구와 과립구)쥐 또는 인간의 heral 피가 상당히 쥐와 인간의 병태 생리에서 단핵 세포의 서로 다른 역할을 제안 다릅니다. (2) 건강과 질병 4시 그 기능에 상당한 차이를 제안 쥐와 인간의 말초 혈액 단핵 세포 사이의 유전자 발현에 상당한 차이가 있습니다. (3) 인간의 상황에 마우스 모델에서 연구 결과의 전송은 다소 어렵게, 인간의 골수 세포에서 존재하지 않는 쥐 단핵구와 대식 세포 (F4/80, LYC, 등.)를 식별하는 데 사용되는 마커의 번호입니다. 따라서, 인간의 질병에있는 대식 세포의 분화와 이질성에 대한 우리의 이해를 높이기 위해, 우리는 인간 대 식세포와 협력 모델을 사용하도록해야합니다. 그러므로, 우리는 여기에서 사용하기 쉬운 다른 대식 세포 PO의 결과 다양한 조건 하에서 체외에서 인간의 단핵구 유래 대 식세포의 연구를 할 수 있습니다 인간의 기본 대식 세포 생성의 모델을 설명larization 유형. 여러 연구에서, 우리는 대식 세포 생물학, 5-7 인간의 죽상 경화증에 대한 잠재적 인 관련성을 분석하는 단핵구 파생 된 인간의 기본 대식 세포의 체외 모델을 사용했습니다. 비록 완전히 사후 얻은 동물이나 인간의 조직 실험을 교체하지, 여기에 설명 된 모델은 질병의 메커니즘과 다양한 인간의 질병에 매우 관련이있을 수 치료 표적의 식별 및 유효성 검사를 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>50 ml 원심분리기 튜브(멸균)</td><td>Fisher</td><td>055398</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS(1X), 액체(칼슘 또는 마그네슘 없음)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-8806</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep</td><td>Magnet StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>Fisher</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Macrophage-SFM (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P-4458</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td></td></tr><tr><td>human M-CSF 10 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트 6-well</td><td>Fisher</td><td>07-200-80</td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포 유형을 나타냅니다. 대식 세포 생물학을 공부 마우스 모델 생쥐와 인간 단핵구 유래 대 식세포 사이의 표현형과 기능의 차이에서 고통. 그러므로, 우리는 여기에 인간의 기본 대식 세포를 생성하고 공부하는 체외 모델을 설명합니다. 간단히, 팔뚝 정맥에서 도출 말초 혈액의 밀도 기울기 원심 분리 한 후, 단핵구는 부정적인 자기 비드 분리하여 말초 혈액 단핵 세포에서 격리됩니다. 이 단핵구는 다음 대식 세포의 분화 또는 편광의 다른 유형을 유도하기 위해 특정 조건 하에서 육일 동안 배양한다. 모델은 사용하기 쉽고 마우스와 인간 사이의 종 별 차이로 인한 문제를 우회. 또한, 그것은 불후의 세포 라인의 사용을보다 생체 조건에 가깝다. 결론적으로, 여기에 설명 된 모델은 macrophag 연구에 적합하다전자 생물학, 질병 메커니즘과 새로운 치료 표적을 식별합니다. 비록 완전히 사후 얻은 동물이나 인간의 조직 실험을 교체하지, 여기에 설명 된 모델은 질병의 메커니즘과 다양한 인간의 질병에 매우 관련이있을 수 치료 표적의 식별 및 유효성 검사를 할 수 있습니다.

위에서 설명한 프로토콜을 사용하여, 우리는 정기적으로 25.1 X 10 6 ± 2.2 × 10 6 monocytes/100 ML의 피를 (26 독립적 인 실험에서 평균 ± 표준 오차, 그림 1A) 구하십시오. CD14에 대한 유세포 염색에 의해 결정 단핵구 순도는 정기적으로 95 % 이상 (97.1 ± 0.4 %, 3 독립적 인 실험 그림 1B에서 평균 ± 표준 오차)입니다. 판 블루 염색에 의해 결정 갓 고립 된 단핵구 세포 생존율은 95 % (데이터 표시되지 않음)보다 일상적으로 큽니다. 처음에는 세포가 둥근 모양과 플로트 있지만, 그들은 일반적으로 몇 시간 내에 고착 시작합니다. 준수는 &quot;달걀 후라이&quot;또는 스핀들 같은 모양 (그림 2)를 향해 형태의 변화와 연관되어 있습니다. 또는 산화 LDL의 추가 (지난 24 시간 동안 100 ㎍ / ㎖)없는 M-CSF (100 NG / ...

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포입니다. 여기, 우리는 사용하기 쉬운 설명<em&gt; 체외에서</em이 세포를 생성하는&gt; 모델. 기울기 원심 분리, 부정적인 비드 격리 및 특정 세포 배양 조건 사용하여 단핵구 유래 대 식세포는 표현형 및 기능 연구에 생성 할 수 있습니다.

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

다음 실험의 전반적인 목표는 인간 말초 혈액에서 단핵구를 분리하고 다른 대식세포 분극 유형으로 구별하는 것입니다. 이는 먼저 밀도 구배 원심분리를 통해 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 순수 CD 14 양성 단핵구를 얻기 위해 음성 비드 분리를 수행합니다.다음으로, 단핵구는 특이적으로 편광된 대식세포를 유도하기 위해 특정 조건에서 배양됩니다. 궁극적으로, 배양 조건에 따른 대식세포 분극 마커의 차등 발현은 정량적 PCR에 의해 결정될 수 있습니다. 이 방법은 대식세포가 서로 다른 편광 유형에 대한 분화를 해부하는 데 도움이 될 수 있습니다.죽상동맥경화증과 같은 염증성 질환에서 매우 중요한 기능입니다. 지원자로부터 팔뚝 정맥에서 30ml의 전혈을 채취한 후 혈액을 두 개의 비폴리스티렌 50ml 원뿔형 튜브로 골고루 나눕니다. 그런 다음 각 튜브의 혈액을 PBS 10ml로 희석합니다.다음으로, 각 튜브에 있는 25ml의 전혈과 PBS에 25ml의 히스토 팩을 추가하고 히스토 팩과 혈액이 섞이지 않도록 주의합니다. 그런 다음 400Gs와 실온에서 휴식 없이 30분 동안 튜브를 원심분리합니다. 스핀 후 먼저 플라즈마 층을 흡입한 다음 불투명한 계면층을 새로운 50ml 튜브로 이동합니다.20ml의 PBS와 CDTA로 계면에서 250G 및 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 세척합니다. 그런 다음 상등액 소생을 버린 후 펠릿을 10 밀리리터의 PBS 플러스 CDTA에 현탁시키고 10 초 동안 와류로 세포를 잘 혼합합니다. 이제 200 마이크로 리터의 세포 현탁액을 300 마이크로 리터의 PBS 플러스 EDTA와 500 마이크로 리터의 트라이 암 블루로 희석합니다.10제곱미터당 약 200-500개의 세포를 얻기 위해 혈구 분석기는 120Gs에서 10분 동안 세포를 3회 회전시켜 음성 분리를 시작합니다.두 번째 세척 후 펠릿을 9ml의 멸균수에 3초 동안 현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 세척하고 한 번 더 세운 후 10 XPBS의 1 밀리리터를 추가하고 밀리리터 당 7 개의 세포의 5 배 10에서 쉬운 세트 버퍼로 희석합니다. 이제 섭씨 4도에서 10분 동안 세포를 단핵구 농축 칵테일 밀리리터당 50마이크로리터로 배양합니다.배양 와류의 마지막 순간 동안 cept monocyte enrichment beads는 30초 동안 구슬을 만듭니다. 그런 다음 비드 1밀리리터당 50마이크로리터를 세포에 추가하고 비드를 세포 현탁액에서 5분 더 배양합니다. 두 번째 배양 후 세포 용액 부피를 최대 2.5ml까지 가져옵니다.더 많은 eep 버퍼를 사용하면 용액이 이제 갈색으로 나타납니다. 다음으로, 튜브를 eep 자석에 넣고 실온에서 2분 30초 동안 사용합니다. 비드 결합 세포가 달라붙을 기회를 가지면 비결합 단핵구가 포함된 버퍼를 새로운 멸균 튜브에 붓습니다.PBS와 EDTA로 결합되지 않은 세포를 한 번 세척하고 세포를 다중 웰 플레이트로 옮긴 다음 배양 플레이트에 6개의 세포에 10을 곱한 1밀리리터의 배양 배지를 배양 플레이트에 추가하면 용액이 희끄무레한 색으로 나타납니다. 마지막으로, 대식세포 분화를 유도하기 위해 관심 있는 실험 조건에서 6일 동안 세포를 배양합니다. 3일 후 미디어의 절반을 6일 후에 새 미디어로 교체합니다.원하는 실험 분석을 위해 세포를 수확합니다. 상술한 프로토콜을 사용하여, 6개의 단핵구 중 약 25배는 100ml의 혈액 단핵구 순도에서 일상적으로 얻어지며, CD14에 대한 유세포 염색에 의해 결정된 바와 같이, 배양에 처음 첨가될 때 95% 이상이다. 단핵구는 처음에는 둥근 모양이며 몇 시간 내에 떠 있습니다.그러나 그들은 접착하여 6일 후에 계란 후라이나 방추 같은 모양을 제공합니다. MCSF를 단독으로 배양하거나 마지막 24시간 동안 산화된 LDL을 첨가한 배양에서 또는 산화된 LDL에 노출되지 않은 세포의 약 80%가 프로피듐 요오드화물에 의해 결정된 대로 생존할 수 있습니다. 반면에 산화된 LDL을 이용한 염색 처리는 6일간의 배양 후 약 70%의 세포 생존율을 나타냅니다.MCSF 흐름을 통해 세포 분석을 통해 세포가 백혈구 마커 CD 45 ro를 계속 발현하는 동안 단핵구 마커 CD 14를 하향 조절하는 것으로 나타났습니다. 세포 배양 중 대식세포 분극을 유발할 수 있는 특정 조건에 따라 성공적인 분극을 보장하기 위해 추가 마커가 필요합니다. 특정 조건은 대식세포 분극을 유발할 수 있습니다.예를 들어, M1 편광 대식세포는 IL 6 및 TNF 알파와 같은 전형적인 마커를 발현하는 반면, M 2 편광 대식세포는 CD 36 및 CD 2 0 6을 발현하는 반면, 대식세포는 기능 실험에서 추가로 연구할 수 있습니다. 예를 들어, 형광 표지된 LDL을 사용하여 산화된 LDL의 흡수를 연구할 수 있습니다. 이 실험에서 세포는 DII로 표지된 산화된 LDL의 밀리리터당 10마이크로그램에 4시간 동안 노출되고 핵을 dpi로 다시 염색했습니다.히스토그램은 MCSF 유도 대식세포에 의한 DII 산화 LDL 흡수의 유세포 분석을 보여주며, 회색 히스토그램은 처리되지 않은 대조 세포를 나타내고 검은색 열린 히스토그램은 나타냅니다. 발달 후 산화된 LDL 처리된 대식세포를 대표합니다. 이 기술을 통해 연구자들은 인간 대식세포의 분화와 이질성을 연구할 수 있습니다.이를 통해 죽상동맥경화증과 같은 염증성 질환을 연구하여 새로운 질병 메커니즘과 새로운 치료 표적을 식별할 수 있습니다.

an-vitro-model-to-study-heterogeneity-human-macrophage

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 일차 단핵구를 대식세포로 프라이밍하는 방법을 보여줍니다. 1차 인간 단핵구는 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF)를 사용하여 M1-like 전염증성 표현형으로 분리 및 분화할 수 있으며, 대식세포 집락자극인자(M-CSF)를 사용하여 M2-like 항염증성 표현형으로 분화할 수 있습니다.

In Vitro Culture and Differentiation of Primary Monocytes into Macrophages

이 비디오에서는 말초 혈액 유래 단핵구를 M1 또는 M2 대식세포로 분화 및 분극을 유도하는 절차를 보여줍니다. 과립구-대식세포 집락자극인자, 지질다당류, 인터페론-감마를 이용한 배양은 전염증성 M1 대식세포를 생성하고, 대식세포 집락자극인자와 인터루킨-4를 사용한 배양은 항염증성 M2 대식세포 생산을 유도합니다.

Differentiation and Polarization of Monocyte-Derived Cells into Macrophage-Like Cells

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

여기에 제시된 프로토콜은 현미경 및 형광 염색을 사용하여 살아있는 세포 배양에서 대식세포 외 트랩(MET) 생산을 검출하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 면역형광 염색에 의해 특정 MET 단백질 마커를 검사하기 위해 더 확장될 수 있다.

분화 한 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출의 시험관 내 자극 및 시각화

이 프로토콜은 인간이 유도한 다능성 줄기 세포로부터의 대식세포의 강력한 생성 및 이들의 후속 특성화 방법을 설명합니다. 세포 표면 마커 발현, 유전자 발현 및 기능성 세포는 이들 iPSC 유래 대식세포의 표현형 및 기능을 평가하기 위해 사용된다.

다능성 줄기 세포에서 인간 대식세포의 생산 및 특성화

본 프로토콜은 MFP 라벨이 부착된 악성 균주 H37Rv에 감염된 대식세포와 말초 혈액 단혈세포의 분화에 기초하여 인간 M1 또는 M2 편광 대식세포에서 진코박테리움 결핵 감염을 연구하고, M1의 마커를 포함한 10색 마커를 사용하여 유동 세포암법으로 분석하는 방법을 제공한다.

M1 및 M2 인간 단세포 유래 세포의 편광 및 진균 결핵 감염에 대한 유동 세포측정을 분석

M2 와 같은 종양 관련 대식세포 (TAM)는 암에서 종양 진행 및 가난한 예후와 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 THP-1 단핵세포와 같은 세포를 14일 이내에 M2와 같은 대식세포로 재현가능하게 분화하고 편광하는 상세한 가이드의 역할을 합니다. 이 모델은 종양 미세 환경 내에서 TAM의 항염증 효과를 조사하는 기초가 된다.

인간 단세포와 같은 THP-1 백혈병 세포선을 사용하여 M2와 같은 표현형으로 대식세포 분화 및 편광

여기에서는 현재 프로토콜의 신뢰성과 재현성을 개선하고 추가 연구를 촉진하는 것을 목표로 in vitro 임플란트 표면의 면역 조절 가능성을 평가하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 분비 사이토카인 프로파일, mRNA 발현 및 세포 표면 마커는 혈액 단핵구 유래 대식세포를 사용하여 모니터링하여 티타늄에서 배양된 대식세포 분극을 조사했습니다.

임플란트 표면의 M1 및 M2 인간 단핵구 유래 대식세포의 분극 및 특성화 

단핵구와 대식세포는 건강과 질병에 중요한 매우 가소성 및 재프로그래밍 가능한 면역 세포입니다. 그들은 특정 분화 프로그램과 표현형을 채택하여 광범위한 자극을 감지하고 반응합니다. 당사는 대식세포 분극 및 재프로그래밍을 연구하기 위해 in-vitro 모델을 표준화하여 연구를 위한 유용한 도구를 제공합니다.

In-vitro assay를 위한 human monocyte-derived Macrophage의 재프로그래밍 모델

배우세요 인간 말초혈액에서 단핵구를 분리하고 대식세포로 분화시키는 방법을. 밀도 구배 원심분리와 음성 비드 분리를 통해 CD14 양성 세포를 얻고, 특정 조건에서 배양하여 다양한 극성화 유형을 유도합니다.

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